CN109477819A - 通过质谱法鉴定和定量抗体药物缀合物中的缀合肽 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种用于对来自抗体药物缀合物(ADC)化合物中的缀合肽进行定性和定量分析的流线型完整工作流程。

Description

通过质谱法鉴定和定量抗体药物缀合物中的缀合肽
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月2日提交的美国临时申请No.62/302,333的权益和优先权，该申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及一种用于对来自抗体药物缀合物(ADC)化合物中的缀合肽进行定性和定量分析的流线型完整工作流程。
背景技术
抗体药物缀合物(ADC)化合物代表一类不断增长的免疫缀合物疗法。ADC化合物是由单克隆抗体构成的复合分子，所述单克隆抗体经由可裂解接头(例如，酸不稳定接头、蛋白酶可裂解接头和二硫化物接头)或不可裂解接头连接到具有生物活性的高细胞毒性药物上。有效药物与单克隆抗体的缀合使得能够将毒性有效载荷靶向递送到肿瘤表面，同时使对健康组织的全身毒性作用最小化，从而改善这类癌症治疗方式的治疗窗口。
缀合过程不完全可产生游离或非缀合药物、药物-接头或药物相关杂质。另外，降解产物可随时间在制剂中以及在体内出现。因此，对ADC进行结构表征和定性分析都具有挑战性。
传统上，使用UV方法完成了缀合肽的定量和位点占用比率测定。UV定量的缺点包括灵敏度低、选择性不足以及分析时间相对长。与基于UV的方法相比，基于MS的定量可提供更高的选择性和灵敏度。然而，迄今为止，生物制药行业仍然缺乏能够有效鉴定和定量ADC肽的完整工作流程。
发明内容
本公开涉及一种用于对来自抗体药物缀合物(ADC)化合物中的缀合肽进行定性和定量分析的流线型完整工作流程。
因此，本文提供了用于分析抗体药物缀合物中的位点占用比率的方法。该方法的一个实施例包括两个步骤。一个步骤涉及电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。电离的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。另一个步骤涉及检测与自由基离子片段相关联的质荷比。
该方法的另一个实施例包括至少三个步骤。一个步骤涉及提供包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。另一个步骤涉及将样品暴露于脱盐中。另一个步骤涉及将样品暴露于多酶消化中。然后电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。电离的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。随后，检测与自由基离子片段相关联的质荷比。
该方法的又一个实施例包括三个步骤。一个步骤涉及电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。电离的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。另一个步骤涉及检测与自由基离子片段相关联的质荷比。另一个步骤涉及选择自由基离子片段的两组独立的质荷比。第一组质荷比可与缀合肽的自由基离子片段相关联。第二组质荷比可与未缀合肽的自由基离子片段相关联。
该方法的再一个实施例包括三个步骤。一个步骤涉及电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。电离的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。另一个步骤涉及检测与自由基离子片段相关联的质荷比。另一个步骤涉及监测自由基离子片段的两组独立的质荷比。第一组质荷比可与缀合肽的自由基离子片段相关联。第二组质荷比可与未缀合肽的自由基离子片段相关联。
本文提供的方法使得能够分析自由基离子片段的质荷比，以确定抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率。
本文提供的方法的上述实施例具有以下一个或多个优点。例如，某些实施例提供了一种流线型工作流程，其消除了用于鉴定和定量ADC肽的复杂步骤。某些其他实施例提供了比之前的工作流程更高的选择性和灵敏度。
附图说明
图1是示出本发明的方法的一个实施例的示意图。
图2是示出本发明的方法的替代实施例的示意图。
图3是T-DM1缀合的示意图，其中曲妥珠单抗上的赖氨酸被SMCC接头修饰，并且随后与DM1药物的巯基反应。MCC-DM1表示MCC-DM1，MCC表示接头。MCC-DM1＝956.3644，MCC＝219.0895。
图4是去糖基化原创药ADC和去糖基化生物仿制药候选ADC之间的完整质量比较：(A)组合原始质谱，m/z范围为2200-3600；以及(B)解卷积质谱(UNIFI 1.8使用MaxEnt1处理)，两种ADC都用PNGFase处理。标记0、1、…、n对应于通过接头与n个DM1分子连接的Tmab。计算DAR并在图上显示。
图5表示用于胰蛋白酶消化的原创药和生物仿制药的LC-MSE胰蛋白酶肽图谱的镜像图。(A)LC/MS基峰强度色谱图(BPI)。(B)LC/UV 252nm。
图6是含有赖氨酸位点K65的肽的解卷积MS/MS谱。(A)胰蛋白酶肽HC60-67。(B)Asp-N肽HC62-72。
图7示出了与含有来自原创药和生物仿制药ADC的Asp-N消化物中的位点K65的DM1的(A)未缀合的CDR肽和(B)缀合的肽的提取离子色谱图(XIC)的镜像图。计算缀合肽的相对峰面积并在图上标记。
图8A示出了比较原创药和生物仿制药ADC的来自胰蛋白酶消化物中的缀合肽的相对峰面积。赖氨酸缀合的位点在X轴上标记。
图8B示出了每个区域中缀合肽即可变Fab、恒定Fab、CH2和CH3的强度总和。
图9描绘了ADC样品的DSC热谱图。
图10A示出了ADC样品的聚集体含量的SEC-HPLC分析。
图10B示出了在还原条件下ADC样品的CE-SDS分析。
图11示出了ADC样品的游离药物含量。
图12A是ADC样品的细胞毒活性的图。
图12B是ADC样品与HER2蛋白的结合活性的图。
具体实施方式
现在将详细参考本发明的某些实施例，这些实施例的示例在附图中示出。虽然将结合列举的实施例描述本发明，但是应当理解，它们并不旨在将本发明限制于那些实施例。相反，本发明旨在涵盖所有替代型式、修改型式和等同型式，这些型式可包括在由权利要求限定的本发明的范围内。本领域技术人员将认识到许多类似于或等同于本文所述的方法和材料的方法和材料，这些方法和材料可用于本发明的实践中。本发明决不限于所述的方法和材料。
定义
除非另有说明，否则本文使用的以下术语和短语旨在具有以下含义：
如本文所用，“抗体药物缀合物”或“ADC”是通过具有不稳定键的化学接头附接到具有生物活性的药物上的单克隆抗体(mAb)。
“抗体”在本文中以最广泛意义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的或可来自其他物种。抗体是由免疫系统产生的蛋白质，其能够识别并结合特定抗原。(Janeway等人，(2001)“Immunobiology”，第5版，Garland Publishing，New York)。靶抗原通常具有许多结合位点(也称为表位)，由多个抗体上的CDR识别。特异性结合不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可具有一种以上的相应抗体。
抗体还指全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合感兴趣靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，所述靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文公开的免疫球蛋白可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。免疫球蛋白可来源于任何物种。然而，在一个方面，免疫球蛋白来源于人、鼠或兔。
术语“接头单元”是指抗体与药物的直接或间接连接。接头与mAb的附接可以多种方式完成，诸如通过表面赖氨酸、还原偶联到氧化的碳水化合物以及通过经由还原链间二硫键而释放的半胱氨酸残基。本领域已知多种ADC连接系统，包括基于腙、二硫化物和肽的连接。
“药物”是指具有生物或可检测活性的任何物质(例如，治疗剂、可检测标记、结合剂等)以及在体内代谢成活性剂的前药。术语药物和有效负载可互换使用。
如本文所用，术语“质谱”或“MS”是指通过其质量鉴定化合物的分析技术。MS是指基于其质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般包括(1)电离化合物以形成带电化合物；以及(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比。可通过任何合适的方式电离并检测化合物。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。一般来讲，电离一个或多个感兴趣的分子，随后将离子导入质谱仪中，其中，由于磁场和电场的组合，离子沿循空间中取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径。
如本文所用，术语“MSE”是指使用交替的低能碰撞诱导解离和高能碰撞诱导解离来进行串联质谱数据采集的方法，其中前者用于获得前体离子精确质量和强度数据以进行定量，后者用于获得产物离子精确质量。
如本文所用，术语“电离”或“电离的”是指产生具有等于一个或多个电子单元的净电荷的分析物离子的过程。负离子为具有一个或多个电子单元的净负电荷的那些，然而正离子是具有一个或多个电子单元的净正电荷的那些。
如本文所用，术语“色谱法”是指其中由于化学实体在其在固定液体或固相周围或上方流动时的不同分布，由液体或气体携带的化学混合物被分离成各组分的方法。
如本文所用，术语“液相色谱”或“LC”是指在流体均匀渗过细分物质的柱，或通过毛细管通道时，选择性延迟流体溶液中的一种或多种组分的方法。所述延迟由于在该流体相对于固定相运动时，混合物的各组分在一个或多个固定相和体相流体(即，移动相)之间的分布。“液相色谱”的示例包括反相液相色谱(RPLC)、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC或UHPLC)、湍流液相色谱(TFLC)(有时被称为高湍流液相色谱(HTLC)或高通量液相色谱)。
如本文所用，术语“高效液相色谱”或“HPLC”(有时被称为“高压液相色谱”)是指其中通过迫使移动相在压力下通过固定相(通常为密集填充柱)来增加分离度的液相色谱。如本文所用，术语“超高效液相色谱”或“UPLC”或“UHPLC”(有时被称为“超高压液相色谱”)是指在比传统HPLC技术高得多的压力下进行的HPLC。
术语“LC/MS”是指与质谱仪接合的液相色谱(LC)。
如本文所用，“HER2阳性乳腺癌”是指测试被称为人表皮生长因子受体2(HER2)的蛋白质呈阳性的乳腺癌，该受体促进癌细胞的生长。在每5例乳腺癌中约有1例，其癌细胞具有产生过量HER2蛋白的基因突变。
术语“人表皮生长因子受体2”或“HER2”(也称为HER2/neu和ErbB-2)旨在包括HER2的变体、同种型和物种同源物。优选地，本发明的抗体与HER2的结合通过抑制HER2和其他ErbB家族成员之间的异聚复合物的形成(例如，与EGFR或HER3的异源二聚化)来抑制表达HER2的细胞(即，通常为肿瘤细胞)的生长。
发明方法
本公开提供了使用于对来自ADC中的缀合肽进行定性和定量分析的流线型完整工作流程成为可能的方法。该方法能够进行全面的缀合位点鉴定，并提供样品之间或各个缀合位点之间的位点占用比较。
图1中示出了本发明的方法的实施例。其中，所公开工作流程100用于ADC肽定量，并结合多酶消化、MSE和数据依赖采集(DDA)数据采集、质谱鉴定(肽图谱工作流程)、科学库和质谱定量(精确的大规模筛选工作流程)。
图2中示出了本发明的方法的替代实施例。详细工作流程200举例说明了该方法的质谱鉴定步骤，以及该方法的涉及ADC肽的质谱定量的步骤。
通过UPLC-QTOF仪器进行的MSE和DDA数据采集使用相同的UPLC分离梯度并行完成。通过所开发的算法进行质谱鉴定，该算法使用前体离子质量匹配和碎片离子匹配作为肽ID的手段。该算法处理MSE以及DDA数据，以找到缀合肽并确认各个缀合位点。通过该过程，获得所鉴定的具有或不具有缀合药物的肽的列表，每个肽与肽的中性质量和相应的保留时间相关联。将该信息存储在科学库中，通过该库产生与肽相关联的所有可能质量/电荷(即多个质子化离子、金属加合物和内源碎片离子)的新列表。该算法随后使用精确的保留时间和保存的质量/电荷列表来鉴定与未缀合肽和缀合肽相关联的所有MS峰，以获得肽的定量测量结果(峰面积)。然后将属于所鉴定的肽序列的所有峰面积合并，并作为感兴趣肽的定量测量结果进行处理。通过缀合肽的总峰面积(包括与缀合肽相关联的所有信号)与属于肽(缀合和未缀合)的所有MS峰的总峰面积的比率来确定缀合肽的各个位点占用。
本发明的方法解决了生物制药行业中确定抗体药物缀合物的位点占用时存在的挑战。获得抗体药物缀合物的位点占用的现行实践通常基于紫外(UV)测量进行。通过在裸抗体和缀合抗体样品之间确定未缀合肽的UV峰面积的减少(在一个波长处)和相应缀合肽的UV峰面积的增加(在药物具有更高吸光度的不同波长下)来定量每个位点处的缀合水平。UV定量的缺点包括灵敏度低、选择性不足以及分析时间相对长。为了获得肽的UV响应的精确测量结果，需要将每种组分色谱分离至其均匀。共洗脱峰会在定量过程中引入误差。
本方法利用质谱响应作为定量肽丰度的手段，这通常比UV响应灵敏2至3个数量级。另外，本工作流程首先鉴定目标组分，并在单独的步骤中定量相关组分。使用提取离子色谱图获得用于定量的峰面积。
相应地，工作流程100举例说明了所公开方法的一个实施例。在工作流程100的一个实施例中，在步骤130中电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。该电离过程的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。此外，检测与自由基离子片段相关联的质荷比。
在工作流程100的另一个实施例中，在步骤110中提供包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。在步骤120中将样品暴露于多酶消化中。步骤120还可包括脱盐步骤。然后，在步骤130中电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。该电离过程的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。此外，检测与自由基离子片段相关联的质荷比。
工作流程200举例说明了所公开方法的替代实施例。工作流程200可包括工作流程100的一些或所有步骤。例如，在步骤130中电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。该电离过程的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。此外，在步骤220中检测并收集与自由基离子片段相关联的质荷比。然后，在步骤210中选择自由基离子片段的两组独立的质荷比。第一组质荷比可与缀合肽的自由基离子片段相关联。第二组质荷比与未缀合肽的自由基离子片段相关联。
在工作流程200的另一个实施例中，在步骤130中电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品。该电离过程的作用是形成抗体药物缀合物化合物和肽的自由基离子片段。随后，在步骤210中检测并收集与自由基离子片段相关联的质荷比。然后在步骤220中监测自由基离子片段的两组独立的质荷比。第一组质荷比可与缀合肽的自由基离子片段相关联。第二组质荷比与未缀合肽的自由基离子片段相关联。
本文提供的方法使得能够分析自由基离子片段的质荷比，以确定抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率，例如工作流程200的步骤252和253。
所公开方法的一些实施例还包括步骤230，该步骤包括鉴定样品中的肽。另选地，所公开方法还可包括步骤250，该步骤包括定量样品中的肽。在某些实施例中，样品包含缀合和未缀合肽。
所公开方法的一些实施例还包括选择自由基离子片段的两组独立的质荷比。在某些实施例中，第一组质荷比与缀合肽的自由基离子片段相关联。在其他实施例中，第二组质荷比与未缀合肽的自由基离子片段相关联。在具体实施例中，选择两组独立的质荷比基于已知离子片段化模式进行。任选地，已知离子片段化模式可存储在库中，步骤260。
在一些实施例中，该方法还包括通过确定缀合肽与未缀合肽的比率来定量样品中的位点占用比率这一步骤。在其他实施例中，该方法还包括定量不同样品之间的单个位点的位点占用比率，步骤252。在其他实施例中，该方法还包括定量同一样品中一个或多个位点的位点占用比率，步骤253。
一些所公开方法利用两种酶进行样品制备，其中一种酶在缀合位点裂解，另一种在非缀合位点裂解(步骤120)。在一些实施例中，多酶消化分别包括胰蛋白酶/lysC和AspN消化蛋白样品(步骤122)。在一个实施例中，胰蛋白酶/Lys C与样品的比率为约1:100。在另一个实施例中，Asp N与样品的比率为约1:25(w/w)。多酶消化为本方法提供了若干优点。首先，多酶消化促进了缀合位点的最大覆盖。多酶消化还允许增加分配的置信度，因为可以比较来自两种酶的所鉴定缀合位点。最后，多酶消化使得能够进行来自胰蛋白酶/LysC数据集的样品之间的位点占用比较以及来自AspN数据的抗体内的位点与位点比较。
应当注意，本文讨论的多酶消化仅仅是示例性的，可以使用替代酶、酶的组合和其比率。因此，本发明的工作流程可用于鉴定和定量蛋白质化学中常见的氨基酸修饰。
示例
引言
抗体药物缀合物(ADC)或免疫缀合物是生物治疗剂的一个亚类，其被设计用于促进将有效细胞毒性药物靶向递送到癌细胞的位点。作为治疗方式产生ADC分子在一定程度上实现了“神奇子弹”的古老梦想，即可利用靶向剂将细胞毒性疗法直接递送到疾病源。1ADC由通过化学接头与单克隆抗体(mAb)连接的细胞毒性药物构成。该组合利用靶向癌症特异性抗原的mAb的增强选择性来提高药物递送效果，并且同时通过最小化全身毒性来利用一些高效细胞杀伤剂，这些细胞杀伤剂本身过于毒性而不能用作治疗剂。ADC最近在治疗各种癌症方面展现出前景。2,3事实上，许多新型ADC目前处于治疗实体和血液肿瘤的临床前、早期临床或晚期临床研发阶段。最近美国食品和药物管理局(FDA)批准了两种ADC药物：本妥昔单抗(商品名：Adcetris，Seattle Genetics)和ado-曲妥珠单抗(T-DM1，商品名：Kadcyla，Genentech)。ADC的商业成功再次引发了生物制药行业对研发新型和生物仿制药ADC的兴趣。
根据缀合化学过程，可以构建不同类型的ADC，诸如半胱氨酸缀合的、赖氨酸缀合的或位点特异性的ADC。值得注意的是，ADC的异质性程度随用于将接头药物缀合到抗体的策略而变化。在分子水平上，所有ADC分子都具有复杂的化学结构，结合了小分子药物的分子特征以及大分子mAb的分子特征。另外，用于合成ADC的缀合反应由于产生在以下两个方面异质的ADC分子的混合物而将ADC样品的复杂性增加到更高水平：首先，产物群包含不同药物与抗体比率(DAR)范围内的缀合物。例如，在赖氨酸残基处进行缀合时，已经报道了0至7种药物的DAR分布。4其次，DAR相同的任何两种缀合物都可能是位置异构体，因为缀合反应是随机过程，并且mAb中存在许多表面可接近的赖氨酸残基(以及轻链和重链的N末端)作为用于修饰的潜在候选物。例如，一项研究发现DAR范围为0至6的赖氨酸缀合的ADC样品可能含有超过450万个独特分子[Protein Science:A Publication ofthe ProteinSociety.2005；14(9):2436-2446]。在那些可接近的赖氨酸残基处进行部分修饰产生缀合位点不同的产物群。相比之下，半胱氨酸缀合的ADC样品的异质性显著较小，因为只有最多八个半胱氨酸缀合位点是可用的。因此，物理/化学性质随ADC的异质性程度而变化，这决定了用于表征ADC和确保ADC产品质量的分析策略。
鉴于常规ADC制造方法的结果，临床上批准的ADC必须作为异质混合物研发和施用。这种异质性给ADC结构分析、产品质量和制造一致性带来了挑战。为了深入了解ADC结构和产品质量，从而建立对最终药物产品更好的质量控制，已经研发了各种分析技术。例如，用于在完整蛋白质水平[Protein Science.2015；24(8):1210-1223,2:J Am Soc MassSpectrom.2015年10月；26(10):1791-4]、亚结构域水平[MAbs.2015；7(6):1036-1044]和各个肽水平[Protein Science 2005；14(9):2436-2446]上研究ADC的液相色谱-质谱(LC-MS)方法在文献中广泛报道。虽然这些分析技术与其他生物制药(例如，mAb)技术相同，但是由于ADC的结构复杂性及其细胞毒性剂的存在，需要开发一些特定的方法。因此，用于物理化学表征ADC的独特特征的大量方法(包括用于表征药物负载曲线和分布、平均DAR、未缀合mAb的量和未缀合有效负载相关物种的那些方法)已被不断开发和报道[MAbs.2015Dec 14:1]。这强调了没有单种技术可以令人满意地提供有关ADC分子的足够信息这一事实。另一方面，虽然物理化学技术可以产生有关结构和组成的信息，并且用于监测ADC的含量、纯度和化学稳定性，但是现有物理化学技术还不能预测ADC的生物活性。因此，为了解释任何ADC样品的特性、纯度、浓度和活性(效力或强度)，似乎需要组合物理化学、免疫学和生物学方法。
生物制药行业越来越关注开发生物仿制药(包括mAb和ADC)，以便将更便宜的生物治疗剂推向全球市场。5Kadcyla和Adcetris的临床和商业成功一方面证实了ADC可以作为治疗方法；其也引发了他们对研发生物仿制药产生巨大的兴趣。由于缀合的异质性导致ADC样品复杂性的水平增加，与缀合过程相关的关键质量属性(CQA)似乎是这类分子所独有的，并且在评估ADC生物仿制药时应考虑并密切关注。举例来说，这些CQA包括药物分布、抗体上药物的平均数量(药物与抗体比率)、药物相关杂质、效力、未缀合mAb、缀合位点和位点占用。ADC产品的这些CQA与靶位点特异性、结合特性、接头和药物的体外和体内稳定性直接相关，这又决定了ADC的临床效果和安全性。6由于ADC固有的复杂性，这些CQA只能通过组合物理化学、免疫学和生物学方法来对ADC进行广泛表征而获得。建立CQA对于研发生物仿制药ADC以确保其与原创药和产品安全性的可比性至关重要。
美国食品和药物管理局(FDA)于2013年批准了T-DM1以品牌名Kadcyla用于治疗HER2+乳腺癌[http://www.fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ApprovedDrugs/ucm340913.htm]。T-DM1由通过接头与美登素衍生物(DM1)共价连接的治疗性抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗(Tmab)组成，如图3所示。与T-DM1一样，赖氨酸缀合物ADC利用赖氨酸残基的溶剂暴露的ε-氨基来附接药物。Tmab含有可通过缀合步骤进行修饰的88个赖氨酸和4个氨基末端基团。由于赖氨酸缀合化学过程具有异质性，所得的缀合物由所附接的药物数量以及药物连接的位置不同的亚群组成。先前利用T-DM1或其他抗体-DM1缀合物进行的研究已经对缀合物的缀合位点的药物分布、负载和位置给出了一些见解。关于该特定ADC药物的报道表明，平均约3.5个DM1分子与每个Tmab抗体缀合，并且Tmab上至少70个赖氨酸位点与药物部分地缀合。然而，尚未描述缀合位点和相对位点占用的列表，并且赖氨酸缀合位点和相对位点占用对T-DM1的各种属性的影响是未知的。
本文提出了通过组合分析方法对T-DM1进行广泛表征的结果。本文示出了一组特定且灵敏的分析方法，用于确定由两家不同的公司生产的T-DM1的结构；用于比较分析结果以评估T-DM1样品的结构相似性，并评价T-DM1的生物活性和细胞毒性，从而有助于监测ADC及其生物仿制药的研发的分析策略。报道并比较了ADC样品的一级氨基酸序列、药物与抗体比率(DAR)、缀合位点和位点占用的LC/MS结果。此外，对热稳定性、游离药物含量和杂质进行了分析，以进一步确定两种ADC的可比性。最后，使用细胞毒活性试验和HER2结合试验对原创药和生物仿制药ADC之间的生物活性进行了比较。
实验1是本文公开的发明的实施例。实验1被设计用于使用如图1和图2中所公开的工作流程来分析某些ADC样品的位点占用比率。
实验1
样品和材料
原创药和候选生物仿制药抗体药物缀合物T-DM1由中国制药公司提供。碘乙酰胺(IAM)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素、三-盐酸盐(tris-HCl)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。测序级修饰的胰蛋白酶和Asp-N购自Promega Corporation(Madison,WI,USA)。甲酸、乙腈(ACN，Optima LC/MS级)和H2O(Optima LC/MS级)以及三盐酸盐溶液(1M，pH7.5)得自Fisher Scientific(Pittsburg,PA,USA)。Illustra NAP-5柱购自GE Healthcare(Pittsburg,PA,USA)。
肽图谱分析
将Tmab(1mg/ml)和T-DM1(1mg/ml)在6.5M氯化胍(0.25M Tris，pH7.5)中变性。将变性的抗体溶液与500mM DTT混合至最终浓度为3mM，并在室温下温育45分钟，然后通过加入500mM碘乙酰胺储备溶液至最终浓度为7mM进行烷基化，并在室温下在黑暗中温育40分钟。使用NAP-5柱(GE Healthcare)进行缓冲液交换(0.1M Tris，1M尿素，pH7.5)。将测序级修饰的胰蛋白酶或Asp-N加入每个样品中(酶与蛋白质的比例为1:25，w/w)，并在37℃下温育5小时。将消化后的肽混合物稀释至0.45μM。将亮氨酸脑啡肽(LeuEnk，序列为YGGFL)以0.05μM的最终浓度加入混合物中。每次LC/MS运行的进样体积为5.0μl。
LC/MS仪器和生物信息学
使用ACQUITY UPLC H-Class Bio System和配备有锁定喷射离子源的Xevo G2-XSQToF质谱仪(Waters Technologies Corporation,Milford,MA)一式三份地分析Tmab和T-DM1的完整蛋白质和酶消化物。利用ACQUITY UPLC蛋白柱(2.1mm×50mm BEH300 C4 1.7μmWaters Technologies Corporation,Milford,MA)，使用10分钟线性梯度以0.200mL/min的流速分离完整蛋白质样品。利用ACQUITY UPLC肽柱(2.1×100mm BEH300C181.7μm,WatersTechnologies Corporation,Milford,MA)，使用60分钟线性梯度以0.200mL/min的流速分离蛋白质消化物中的肽。流动相A为含0.1％甲酸的水，而流动相B为含0.1％甲酸的乙腈。对于肽分析期间的数据采集，Xevo G2XS QToF质谱仪在MSE或FastDDA模式下操作。对于MSE模式，仪器在低能和高能扫描(每次扫描0.5秒)之间交替，分别用于产生完整的肽离子和肽产物离子。使用20V和45V之间的碰撞能量阶梯来在高能扫描中片段化肽。通过锁定喷射通道以10μL/min的流速连续输注浓度为100fmol/μL(m/z 785.8426)的Glu-纤维蛋白肽标准物(Waters Technologies Corporation,Milford,MA)，并且每30秒采集锁定质量信号(0.5秒的信号)以提供外部质量校准物。
使用UNIFI科学信息系统(第1.8版)处理用于肽分析的LC/MS原始数据，以产生前体质量以及相关的产物离子质量(电荷状态减少并去同位素峰)，以便随后进行蛋白质鉴定和定量。在电流分析中，使用以下标准来鉴定缀合肽：(i)匹配前体的质量准确度在5ppm的质量误差内；(ii)每种鉴定肽有至少3个匹配的初级片段离子；(iii)观察到缀合肽的对应于药物有效负载的标记片段(m/z,547.2)。
对于肽定量，将对应于所有电荷状态的提取离子色谱(XIC)峰面积和每种肽的所有指定加合离子组合为单一量度，来定量肽及其缀合同种型的丰度。将所有峰面积相对于加标内标物的峰面积归一化，并对每个样品进行三重进样。使用下式计算相对位点占用：
位点占用＝峰面积(缀合肽峰)/[面积(未缀合肽峰)+面积(未缀合肽峰)] (1)
结果
通过肽图谱方法鉴定缀合位点
分别用胰蛋白酶或Asp-N处理赖氨酸缀合的ADC和未缀合的mAb。通过RP色谱法分离消化物，然后通过串联UV和MS分析进行肽鉴定。对于每种消化物，在数据非依赖采集在MSE模式或者数据依赖采集(DDA)模式下收集片段化数据，以获得有关观察到的肽的序列信息。对于低丰度的缀合肽，MSE和DDA光谱共同用于鉴定缀合肽以及定位缀合位点。图5在(A)MS基峰色谱图或(B)252nm处的UV吸光度色谱图中示出了来自原创药和生物仿制药ADC消化物中的LC-MSE胰蛋白酶肽图谱的比较(镜像)图。所有的缀合肽稍后梯度洗脱并且出现在色谱图中的30分钟到52分钟，这是由于有效负载部分引起它们的疏水性增加。缀合后，修饰的赖氨酸残基不再是胰蛋白酶可裂解的。因此，大多数具有缀合有效负载的胰蛋白酶肽是包含一个缺失胰蛋白酶裂解位点的肽，后面是脯氨酸的赖氨酸除外；而来自Asp-N消化的肽通常不包含缺失裂解。因此，来自胰蛋白酶消化的大多数缀合肽仅包含单一的缀合赖氨酸(除非它靠近C末端脯氨酸)，而Asp-N消化可产生具有多个(最多9个)赖氨酸残基的肽，从而产生序列相同但缀合位点不同的Asp-N肽(位置异构体)的混合物。这些位置异构体可使缀合Lys残基的特定位点测定复杂化，并且在高能片段化谱中需要更完整的序列覆盖。因此，需要来自两种酶消化物的组合片段化数据来提供两种ADC样品的轻链和重链的完整序列覆盖。对于所有鉴定的缀合位点，仅观察到药物有效负载的部分修饰，即在实验中发现了修饰的和未修饰的肽。总之，通过两种酶消化鉴定的赖氨酸缀合位点是一致的。
要注意的是，生物仿制药ADC中的缀合位点与原创药ADC中的位点是一致的。表1示出了在原创药和生物样品ADC中的T-DM1中鉴定的缀合位点的汇总表。对于T-DM1，有92个可能的赖氨酸缀合位点(88个赖氨酸残基和4个N-末端胺基)，其中82个位点被确认是部分缀合的。此外，鉴定了仅包含缀合接头的3个位点，如表2所示，这些位点位于重链K136、K213和K225，每个位点对应于具有一个未用DM1修饰的MCC接头的位点。
曲妥珠单抗的CDR区包含一个赖氨酸残基，其位于重链K65。胰蛋白酶和Asp-N肽图谱分析均确认了重链K65位点被DM1有效负载部分地占用。图6中示出了来自包含缀合K65位点的胰蛋白酶肽和Asp-N肽的MS/MS光谱。缀合肽的CID片段化光谱示出了m/z为547.2、485.2、453.2和437.2的一系列标记片段。这些标记片段峰均示出了由含卤素元素的化合物产生的典型同位素模式，从而表明这些峰来源于含氯的DM1药物。Tmab-DM1缀合肽还示出了对于鉴定缀合肽十分重要的另一种特征色谱行为。成对洗脱具有缀合DM1药物的肽，这归因于通过马来酰亚胺进行抗体药物连接产生不同的立体化学构型。图7示出了来自原创药和生物仿制药的缀合或天然形式的Asp-N消化的CDR区肽(62DSVKGRFTISA72)的提取离子色谱图比较。缀合肽的非对映异构体分别在40.13和40.55分钟处显示出两个峰，如图7(B)所示。对于原创药和生物仿制药ADC，缀合肽相对于未缀合肽和缀合肽总和的面积百分比分别为24±0.04％和19±0.01％。
定量缀合肽
为了获得各个位点处原创药和生物仿制药ADC的缀合水平，对每种缀合胰蛋白酶肽的强度进行了比较。将已知量的肽(亮氨酸脑啡肽，序列为YGGFL)掺入每个样品中作为内标物，以将缀合肽的强度归一化。图8示出了鉴定的胰蛋白酶缀合肽的相对强度。根据抗体的不同域对定量结果进行分组和呈现。图6A和图6B分别呈现了可变域(VH、VL)、恒定区(CH1、CL)和Fc(CH2和CH3)区。由于大多数胰蛋白酶缀合肽仅具有一个有效负载，因此可使用胰蛋白酶缀合肽来定量各个位点的缀合水平。生物仿制药比原创药的缀合水平低的位点是VH中的H30(重链上的第30个残基)、L188(CL)、H216(CH1)、H323、H363、H417(CH2+CH3)。另一方面，L145(CL)和L169(CL)和H337(CH2)在生物仿制药候选ADC中表现出略高的缀合水平。
讨论
基于LC-MS的方法已经成功应用于定义原创药mAb和生物仿制药之间的分子相似性。5,10由于缀合会引起额外的异质性，因此与抗体相比，ADC表现出增加的复杂性水平。为了证明ADC生物仿制药与原创药的分子和产品等效性，需要在现有技术水平上采用先进且更灵敏的分析技术。在本文讨论的技术和方法中，现在可以进行详细的结构表征，包括完整质量分析、DAR测量、缀合位点鉴定和位点占用，以确定原创药和生物仿制药ADC的分子相似性。为了检验候选生物仿制药和原创药ADC之间的其他产品属性，应用一系列物理化学和生物学方法来比较高阶结构、产品杂质、游离药物含量和生物活性。
首先，完整质量分析可以快速检验和比较质量、一般药物负载/分布模式以及原创药和生物仿制药ADC之间的平均DAR值。DAR是ADC最重要的产品质量属性之一。它决定了可以递送到靶细胞的药物量，这直接影响安全性和功效。根据缀合化学过程和ADC的类型，已经实施了用于DAR测量的不同策略，包括UV/VIS、MALDI-TOF-MS、LC/UV、毛细管IEF、UV-MALDI、HIC、IMMS[mAbs.2011；3(2):161-172,Protein Science.2015；24(8):1210-1223,JAm Soc Mass Spectrom.2015年10月；26(10):1791-4]。基于MS的分析来分析ADC的一个优点是其不依赖于接头和有效负载的光谱性质[,J Am Soc Mass Spectrom.2015年10月；26(10):1791-4]。赖氨酸缀合的ADC由于具有高度异质性而对于DAR测定是最具挑战性的。到目前为止，关于对赖氨酸缀合的ADC进行DAR表征报道的研究数量有限[Protein Science2005；14(9):2436-2446,Bioconjugate Chemistry.2014；25(7):1223-1232]。完整质谱清楚地证明了T-DM1是具有范围为0至7的不同DAR的物种的混合物。在完整质量分析中观察到的DAR差异表明，生物仿制药和原创药T-DM1之间每个抗体的平均有效负载量略有不同。发生这种变化的原因可能是由于缀合位点或/和位点占用的差异。DAR值由缀合抗体和未缀合抗体的相对MS强度计算。不考虑裸抗体和缀合抗体之间的电离效率的差异，MS获得的DAR可不同于真正的DAR。因此，通过RP-LC/MS测定的DAR可用于赖氨酸缀合物的批次间比较。但是，需要通过正交技术来验证DAR值。
肽图谱通常用于确认氨基酸序列并表征抗体和其他重组蛋白的翻译后修饰。11它还用于确定ADC的化学缀合位点。12文献中很少有研究报道赖氨酸缀合的ADC的缀合位点。Wang等人报道了人N901-DM1(另一种人源化IgG1抗体，其具有通过相似的接头化学过程与赖氨酸残基缀合的类美登素)的缀合位点。在86个赖氨酸残基中，鉴定出IgG1抗体上有40个不同位点具有共价连接的DM1。鉴定出Tmab上有八十二(82)个缀合的DM1位点，包括可能被DM1药物修饰的总共92个Lys位点中的4个N末端胺基。另外，鉴定出仅具有接头的三个位点，并且所有位点都位于重链上。通过完整质量分析(图2)也证明了包含一些仅MCC接头位点的ADC物质的存在，其中在每个主要峰旁边观察到具有额外219Da的峰。在两步缀合过程的第二缀合步骤中的不完全缀合(其中接头修饰的中间体与DM1反应)可能有助于在抗体上存在仅接头位点。4另外，早期研究表明，酪氨酸和组氨酸残基也可以被琥珀酰亚胺酯修饰。13
CH2域中的所有赖氨酸残基都用各种水平的药物修饰。该观察结果与先前的研究一致，显示出IgG1的CH2域中的赖氨酸残基表现出高度的溶剂可及性和柔韧性。12铰链区中有两个赖氨酸残基，K221和K225。没有观察到K221被接头或连接的有效负载修饰，这可归因于修饰的K225在其附近形成空间位阻。没有证据表明半体(包含一条轻链和一条重链)上有5个赖氨酸残基缀合。在这5个位点中，VL中有1个(轻链K39)，CH3区中有2个(重链K373和K412)，CH1中有1个(重链K150)，铰链区中有1个(重链K221)。未能从5个位点中检测出缀合肽，其最可能表明这些位点的缀合水平显著低于其他鉴定的位点。
结论
总的来说，提出了T-DM1的详细结构表征，包括建立药物负载曲线、定位和分析各个药物缀合位点。在生物仿制药候选ADC和原创药之间比较了这些结构特征以定义分子相似性。观察到的差异可能影响抗体的结合特性。对于ADC的临床疗效至关重要的是，需要严密评估这些属性以便研发生物仿制药。此外，还比较了其他产品属性，包括高阶结构、单体含量、游离药物含量和生物活性。在生物仿制药的研发过程中，了解这些关键质量属性并选择合适的分析和生物分析技术，以更好地表征和评估产品的相似性，从而确保制造过程中的产品质量是非常重要的。
实验2使用各种分析技术详述了本文讨论的ADC样品的进一步分析。实验2中详述的分析也被认为是本文公开的发明的实施例。
实验2
完整质量
将未缀合的曲妥珠单抗(Tmab)和T-DM1溶液在100μl 1M三-HCl缓冲液(pH＝7.5)中稀释至1mg/mL的浓度。将2μl PNGase F(Waters Technologies Corporation,Milford,MA)溶液加入每个样品中，并且反应混合物在37℃下温育20小时。将温育后的溶液用3％乙腈、97％H2O、0.1％甲酸稀释至最终浓度为0.5mg/mL。每次LC/MS运行进样总共0.5μg Tmab或T-DM1。
差示扫描量热法(DSC)
使用MicroCal VP-Capillary DSC进行ADC样品的热分析。通过加入PBS将每个ADC样品稀释至1.0mg/ml。仪器在25至110℃的温度范围内以？？℃/min的速率扫描每个样品。使用Origin 7进行数据分析。
游离药物分析
用冷的100μl甲醇处理ADC样品(各50μl)并在冰浴中温育30分钟。然后以13,000rpm将样品离心30分钟，并使用反相液相色谱对上清液进行进一步分析。使用DM1标准储备溶液的系列稀释度生成标准曲线。通过下式计算游离DM1量：
游离DM1％＝游离DM1/(DAR×摩尔ADC)的摩尔(2)
尺寸排阻色谱(SEC)
使用TSK G3000SWXL(300×7.8mm，5um)在Waters2690系统上进行SEC实验。流动相为0.2M磷酸三钾、15％异丙醇，流速为0.5ml/min。在280nm的波长下测量UV吸光度。
毛细管十二烷基硫酸钠凝胶电泳(CE-SDS)
使用Beckman PA800plus系统，利用Beckman毛细管(50um ID×65cm)进行CE-SDS，以分析ADC样品。用水将所有样品稀释至1.0mg/ml。将50μl每种ADC样品与100μl SDS样品缓冲液和5μl 500mM碘乙酰胺混合。在进样之前，将混合物在70℃下加热10分钟。仪器在15kV的电压下操作进行蛋白质分离，并且在220nm下记录UV检测。
细胞增殖抑制试验
用0.25％胰蛋白酶-EDTA处理对数生长期的BT-474细胞。将细胞以1.5×105/ml的细胞密度重悬于10％FBS-DMEM/F12培养基中，并接种于96孔细胞培养板中(每孔100μl)。使用10％FBS-DMEM/F12培养基进行1:2倍的系列稀释，至最终浓度为0.039μg/ml。将该系列稀释样品转移到已经接种的BT-474细胞培养板中(每孔50μl)。将板在潮湿的5％CO2培养箱中在37℃下温育5天。温育后，用10μl CCK-8溶液处理每个孔，然后温育4小时。使用SpectraMax M5酶标仪记录450nm处的吸光度。
表面等离子体共振
使用Biacore T200通过SPR评估与HER2蛋白的结合。通过胺偶联方法将FcRn固定到CM5传感器芯片表面上。用1X HBS-EP缓冲液将每个ADC样品稀释至5μg/ml，以5μl/min的流速流过流动池2。用1X HBS-EP缓冲液系列稀释HER2蛋白，并将其进样到配体固定的CM5芯片中，其中进样时间为120秒，解离时间为1500秒。使用1:1结合模型对数据进行全局拟合。使用Biacore T200软件(v2.0)评估KD值。
结果
完整MS分析
抗体药物缀合物是缀合物质的复杂混合物，其在所附接有效负载的数量以及有效负载在mAb上的附接位点方面有所不同。通过完整mAb LC/MS分析确定有效负载的分布。为了降低ADC分子的复杂性，用PNGase F处理ADC样品以除去N-聚糖。在去糖基化步骤后，通过反相(RP)LC/MS分析来自原创药ADC或候选生物仿制药ADC的样品。图2分别示出了原创药ADC和候选生物仿制药ADC的m/z范围在2200和3600Da之间的原始质谱以及MaxEnt 1解卷积质谱。原创药ADC的解卷积质谱显示出8个主峰，在相邻峰之间观察到质量差为957Da。该质量差异与共价连接的DM1药物与一个MCC接头的组合质量(DM1+MCC，MW956.36Da)相匹配。解卷积质谱(原创药和候选生物仿制药ADC)中8个主峰的质量对应于分别具有0至7个DM1有效负载和接头(标记为+0、+1等)的Tmab的质量。对于解卷积峰中的每个主峰，也观察到具有219Da偏移的较低强度峰。这些较小的峰归因于接头与mAb分子缀合但仍与DM1有效负载反应。光谱中相应MS峰(质量)之间的离子强度在两个样品之间略有不同，这可能是由于RP柱上的质量负载略有差异。平均DAR可通过MS曲线中所有峰的加权峰面积来确定。来自原创药ADC的MS获得的DAR值为3.53±0.05，这与报道的Kadcyla值非常一致。4候选生物仿制药ADC表现出略小的DAR值，为3.39±0.01。
高阶结构(DSC)
通过DSC评价原创药ADC和生物仿制药ADC的热稳定性。所有ADC样品都在浓度为1mg/ml的相同缓冲溶液中进行分析。图9显示了所有ADC样品的DSC热谱图。观察到所有样品都有两次主要转变。生物仿制药ADC的第一转变温度比该原创药ADC高约1.5℃。生物仿制药ADC的第一次转变(Tm1)发生在69.84±0.03℃，而两个批次的原创药ADC的相同转变发生在68.55±0.13℃和68.34±0.04℃。两者的第二次转变(Tm2)非常接近(在0.5℃内)。7,8
尺寸变体
通过两种正交方法SEC-HPLC和CE-SDS测定ADC样品的聚集体含量。SEC-HPLC的结果(图10)显示了原创药和生物仿制药候选者的主要单体含量(>95％)。SEC-HPLC结果显示，两批原创药的单体含量(98.30±0.03％和98.20±0.02％)高于生物仿制药候选ADC(96.9±0.03％和96.61±0.02％)。与SEC-HPLC结果类似，在还原条件下进行的CE-SDS分析显示了所有ADC样品的主要单体含量(如图11所示)。两批原创药ADC的单体纯度分别为96.63±0.07％和96.23±0.13％，而两批生物仿制药ADC分别为95.43±0.08％和93.48±0.14％。9
未缀合(游离)药物分析
因为ADC样品中的小分子药物有效负载通常是高效且非常有毒的，所以未缀合(游离)药物的量是与产品毒性和患者安全性直接相关的重要产品质量属性。由于去除不完全，最终产品可能含有残留的游离药物或药物相关的杂质。因此，必须对游离药物含量进行表征和定量。在蛋白质沉淀后，通过反相色谱对ADC样品中的游离药物进行定量。图12示出了ADC样品的游离药物含量。两批原创药ADC的游离药物量的丰度摩尔比为1.15±0.05和0.82±0.05％，而选定的两批生物仿制药ADC为1.88±0.05％和1.33±0.06％(摩尔比)。
生物活性
与mAb相比，ADC在结构上更复杂，除了原创药和生物仿制药之间的ADC的结构比较之外，还使用体外细胞毒活性试验和HER2结合亲和力试验(SPR)评估和比较了ADC的生物活性。
使用人乳腺癌BT-474细胞进行细胞增殖抑制试验。结果表明，T-DM1原创药和生物仿制药表现出相似的剂量-效应关系。相对于参考原创药批次，测得一批原创药的细胞毒活性为100.54％，两批生物仿制药ADC的细胞毒活性为94.04％和98.30％，如图13所示。
使用Biacore T200通过SPR评估与HER2蛋白的结合。KD参考(原创药)和样品(生物仿制药)为(0.8123±0.0482)nM和(0.7684±0.0243)nM，如图14所示。结果表明，生物仿制药的结合活性略低于原创药。
讨论
Tmab的CDR包含一个赖氨酸残基(重链K65)，还发现该残基被部分修饰(表1)。在不考虑缀合肽和未缀合肽之间的电离效率差异的情况下，难以获得CDR赖氨酸位点的精确位点占用(摩尔比)。CDR区中的修饰可能对抗体的结合特性有很大影响[MAbs.2014Mar 1；6(2):327-339]。因此，HER2结合能力可能受到由于缀合的有效负载药物引起的CDR区改变的影响。如果在ADC制备期间CDR中的赖氨酸位点易于被修饰，则CDR肽的监测似乎对于确保产品质量至关重要。
值得注意的是，对于原创药和生物仿制药ADC，都鉴定出同时具有缀合的仅接头和缀合的接头-有效负载部分的相同的lys位点，这表明受控的缀合过程具有一定程度的一致性。然而，缀合肽/位点的相对丰度的比较揭示了原创药和生物仿制药ADC之间的缀合水平的变化，如图8B所示。特别地，CL和CH1区在原创药和生物仿制药之间显示出最显著的差异(约25％)，而VL和VH区、CH2和CH3区没有显著差异。
尽管没有经验证的方法来将DAR值与各个位点处的缀合肽的丰度直接关联起来，但是可使用所有鉴定的缀合肽的总体丰度来比较两个ADC样品中的缀合水平以及进行平均DAR比较。在本文讨论的技术和方法中，生物仿制药候选ADC的DAR(3.39±0.01)略低于原创药ADC(3.53±0.05)，这与观察到生物仿制药候选者的缀合肽的丰度略低于原创药ADC的肽分析结果一致。
DSC通过定量热变性过程来测量蛋白质或抗体的热稳定性。热稳定性可用于确定给定样品的熔解温度、稳定性和纯度[J Biomol Tech.2010年12月；21(4):167-193.]。DSC广泛用于评估药品[Curr Med Chem.2005；12(17):2011-20]。之前已经讨论了DSC在表征单克隆抗体中的具体应用[J Pharm Sci.2007年3月；96(3):532-46]。这些应用包括制剂优化研究14、原创药和生物仿制药的比较[mAbs 6:5,1163-1177]以及确定特定低聚糖PTM对mAb稳定作用15和构象变化的pH依赖16。之前由Ionescu等人发表的一项研究表明，Tmab中的第一次转变(Tm1)表示解折叠CH2域，而第二次转变表示熔解CH3和Fab区。7在Tm1中观察到比较Tmab和Tmab-DM1的降低量为约3.2℃，而在Tm2中的降低量仅为约0.1℃(数据未示出)。该发现与另一项研究一致，该项研究表明Tmab与DM1的缀合对剩余抗体的CH2域的热稳定性有更大影响。8
如之前的研究所证明，T-DM1和Tmab的聚集水平显著不同。8利用大疏水性分子如DM1对表面赖氨酸残基进行修饰会导致正电荷中和以及分子的疏水性显著增加。由于T-DM1易于聚集，因此必须由于工艺变化或在制造过程中严密监测单体含量。SEC-HPLC和CE-SDS证明了生物仿制药中的单体含量略低于原创药。另外，在原创药和生物仿制药ADC之间观察到细胞抑制活性和抗原结合活性方面的生物活性没有显著差异。
表1。在T-DM1中鉴定的赖氨酸缀合位点的汇总表。原创药和候选生物仿制药展现出相同的缀合位点。*DM1的缀合位于N-末端胺基上。
表2.在T-DM1中鉴定的仅接头位点的汇总表。原创药和候选生物仿制药显示出相同的仅接头位点。
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Claims (34)

1.一种用于分析抗体药物缀合物中的位点占用比率的方法，所述方法包括：
(i)电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品，以形成所述抗体药物缀合物化合物和所述肽的自由基离子片段；
(ii)检测与所述自由基离子片段相关联的质荷比；以及
(iii)分析所述自由基离子片段的所述质荷比，以确定所述抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括鉴定所述样品中的所述肽。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括定量所述样品中的所述肽。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述肽包含缀合肽和未缀合肽。
5.根据权利要求4所述的方法，还包括通过确定缀合肽与未缀合肽的比率来定量所述样品的位点占用比率。
6.一种用于分析抗体药物缀合物中的位点占用比率的方法，所述方法包括：
(i)提供包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品；
(ii)将所述样品暴露于脱盐中；
(iii)将所述样品暴露于多酶消化中；
(iv)电离所述样品以形成所述抗体药物缀合物化合物和所述肽的自由基离子片段；
(v)检测与所述自由基离子片段相关联的质荷比；以及
(vi)分析所述自由基离子片段的所述质荷比，以确定所述抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括鉴定所述样品中的所述肽。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述肽包含缀合肽和未缀合肽。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括选择所述自由基离子片段的两组独立的质荷比。
10.根据权利要求9所述的方法，其中第一组质荷比与所述缀合肽的所述自由基离子片段相关联。
11.根据权利要求9所述的方法，其中第二组质荷比与所述未缀合肽的所述自由基离子片段相关联。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中选择所述两组独立的质荷比基于已知离子片段化模式进行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述已知离子片段化模式存储在库中。
14.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，还包括定量所述样品中的所述肽。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括通过确定缀合肽与未缀合肽的比率来定量所述样品中的位点占用比率。
16.根据权利要求6至15中任一项所述的方法，其中所述多酶消化包括第一酶和第二酶。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一酶是胰蛋白酶/Lys C。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述胰蛋白酶/Lys C与样品的比率为约1:25(w/w)。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二酶是Asp N。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述Asp N与样品的比率为约1:100(w/w)。
21.一种用于分析抗体药物缀合物中的位点占用比率的方法，所述方法包括：
(i)电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品，以形成所述抗体药物缀合物化合物和所述肽的自由基离子片段；
(ii)检测与所述自由基离子片段相关联的质荷比；
(iii)选择所述自由基离子片段的两组独立的质荷比，其中第一组质荷比与缀合肽的所述自由基离子片段相关联，并且第二组质荷比与未缀合肽的所述自由基离子片段相关联；以及
(iv)分析所述自由基离子片段的所述质荷比，以确定所述抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率。
22.根据权利要求21所述的方法，还包括鉴定所述样品中的所述肽。
23.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述肽包含缀合肽和未缀合肽。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中选择所述两组独立的质荷比基于已知离子片段化模式进行。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述已知离子片段化模式存储在库中。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，还包括通过确定缀合肽与未缀合肽的比率来定量所述样品中的位点占用比率。
27.一种用于分析抗体药物缀合物中的位点占用比率的方法，所述方法包括：
(i)电离包含抗体药物缀合物化合物和肽的样品，以形成所述抗体药物缀合物化合物和所述肽的自由基离子片段；
(ii)检测与所述自由基离子片段相关联的质荷比；
(iii)监测所述自由基离子片段的两组独立的质荷比，其中第一组质荷比与缀合肽的所述自由基离子片段相关联，并且第二组质荷比与未缀合肽的所述自由基离子片段相关联；以及
(iv)分析所述自由基离子片段的所述质荷比，以确定所述抗体药物缀合物化合物中的占用位点与未占用位点的位点占用比率。
28.根据权利要求27所述的方法，还包括鉴定所述样品中的所述肽。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述肽包含缀合肽和未缀合肽。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中基于已知离子片段化模式选择所述两组独立的质荷比。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述已知离子片段化模式存储在库中。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的方法，还包括通过确定缀合肽与未缀合肽的比率来定量所述样品中的所述肽。
33.根据权利要求32所述的方法，还包括定量不同样品之间的单个位点的位点占用比率。
34.根据权利要求32所述的方法，还包括定量同一样品内的一个或多个位点的位点占用比率。
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