CN111344001A - 酸介导的分析配体-药物偶联物的测定法 - Google Patents

Abstract

本文提供了使用酸介导的裂解分析配体‑药物偶联物的方法和用于实施该方法的方法。还提供了包括用于分析和开发配体‑药物偶联物的方法的各种应用。

Description

酸介导的分析配体-药物偶联物的测定法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年11月22日提交的美国专利申请62/590,169的权益，出于所有目的将其公开内容整体合并于此。

背景技术

配体-药物偶联物(LDC)是针对靶向疗法日益增长的关注焦点。LDC由经由接头连接在一起的细胞毒性剂(通常是具有高全身毒性的小分子药物)和对组织或细胞特异性抗原(例如抗体-药物偶联物(ADC)情况下的抗体)的高选择性配体组成，其在循环中相对稳定，但在目标环境中释放细胞毒性剂。抗体-药物偶联物(ADC)作为下一代靶向疗法具有广阔的前景，尤其是在肿瘤学领域。利用抗体的免疫学特异性将强效的细胞毒性剂传递给患病组织，既可以提高抗肿瘤活性，又可以限制靶标毒性。这种方法目前已经在两种FDA批准的ADC中成功使用，即本妥昔单抗(brentuximab vedotin)和曲妥珠单抗-美坦新(ado-trastuzumab emtansine)(Verma等人，2012,Younes等人，2010)，并且是许多临床前研究和临床试验的重点。

大量的研究工作一直致力于改善LDC的药代动力学属性、毒性和化学稳定性。大多数LDC是可变地负荷药物的配体的异质混合物，这意味着可以将数量不定的药物或药物-接头分子连接到一个配体上。一旦将LDC置于生物环境中，就会发生生物转化，例如药物或药物-接头的丢失，从而导致进一步的异质性。尽管大多数ADC使用酰胺和硫醚化学方法通过内源赖氨酸和半胱氨酸残基将有效的细胞毒性剂与抗体连接，并且马来酰亚胺-半胱氨酸偶联已用于许多临床阶段ADC程序，但马来酰亚胺已显示出一定程度的偶联后不稳定性。因此，需要具有改善的药物-抗体连接稳定性的LDC，以确保药物的靶标特异性递送并限制靶标毒性。

改进的LDC的这种发展通常需要多种生物分析测定。可以通过使用各种分析方法测量随时间推移或暴露于生物环境后稳定偶联到配体上的药物的浓度来测定生物转化以及药物或药物-接头的稳定性。此类测定需要释放药物或其部分以进行后续测量的手段。这可以通过酶促裂解来完成。但是，某些药物和药物-接头不能被酶裂解。因此，需要从LDC切割药物和药物-接头的替代方法，其适合与用于检测和定量释放的药物或其部分的适当分析方法一起使用。

发明内容

本公开提供了测量、分析和定量样品中的LDC，从而确定偶联至配体的药物的量的方法。具体地，该方法使用包含分析目标的LDC，该分析目标可通过用酸例如含水三氟乙酸(TFA)处理而从LDC释放。还提供了基于从LDC释放的分析目标的测量值确定LDC的量、浓度和稳定性的方法。本文提供的分析LDC的方法可以是开发具有更好的稳定性和更少的毒性的新型LDC的必要工具。

更具体地说，一方面，本发明提供了一种分析样品中的配体-药物偶联物(LDC)的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含LDC的样品，其中所述LDC包含配体和分析目标，其中分析目标包括药物分子或其一部分；和(b)使样品与浓度为1-30％(v/v)的含水三氟乙酸(TFA)接触，从而诱导分析目标从LDC释放。

在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：(a)测量从LDC释放的分析目标的量；和(b)使用释放的分析目标的量确定样品中药物分子或其部分的浓度。

在一些实施方案中，测量从LDC释放的分析目标的量的步骤包括使分析目标经受液相色谱-质谱法(LC-MS)。在一些实施方案中，测量从LDC释放的分析目标的量的步骤包括使分析目标经受液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。

在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：(a)测量样品中配体的量；和(b)通过使用测得的配体的量确定样品中药物分子或其部分的浓度。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在使样品与含水三氟乙酸(TFA)接触的步骤之前从样品收集LDC的步骤。在一些实施方案中，收集LDC的步骤通过亲和色谱、尺寸排阻色谱、硫酸铵沉淀、离子交换色谱、固定金属螯合物色谱或免疫沉淀来进行。

在一些实施方案中，通过使用LDC的标准曲线执行测量从LDC释放的分析目标的量的步骤。

在一些实施方案中，该方法还包括以下步骤：(a)向样品加入固定量的内标，其中所述内标包含配体和第二分析目标，其中所述第二分析目标是LDC的标记的衍生物；(b)使样品与浓度为1-30％(v/v)的含水三氟乙酸(TFA)接触，从而诱导分析目标从LDC释放以及第二分析目标从内标释放；(c)测量从内标释放的第二分析目标的量；和(d)基于从内标释放的第二分析目标的量测量从LDC释放的分析目标的量。

在一些实施方案中，第二分析目标具有与分析目标不同的分子量。在一些实施方案中，内标包括LDC的同位素标记形式。在一些实施方案中，同位素标记是稳定的或不稳定的。在一些实施方案中，同位素标记是氘或碳13。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在使样品与含水三氟乙酸(TFA)接触的步骤之前从样品收集LDC和内标的步骤。在一些实施方案中，收集LDC或内标的步骤通过亲和色谱、尺寸排阻色谱、硫酸铵沉淀、离子交换色谱、固定金属螯合物色谱或免疫沉淀来进行。在一些实施方案中，配体是抗体或其功能片段，并且通过使样品与选自蛋白A树脂、蛋白G树脂和蛋白L树脂的树脂接触，从样品中提取LDC或内标。

在一些实施方案中，使样品与浓度为10％(v/v)的含水三氟乙酸(TFA)接触。

在一些实施方案中，药物分子是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。在一些实施方案中，药物分子是单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。

在一些实施方案中，分析目标包括四肽，Val-Dil-Dap-Phe。

在另一方面，本发明提供了确定配体-药物偶联物(LDC)的稳定性的方法，其包括以下步骤：(a)在暴露于LDC后的不同时间点后从单一来源获得第一样品和第二样品；(b)通过本文提供的方法分析第一样品和第二样品中的LDC，从而确定从第一样品和第二样品中的LDC释放的分析目标的量；和(c)通过比较在第一样品和第二样品中的释放的分析目标的量确定LDC的稳定性。

在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：(a)测量第一样品和第二样品中配体的量；和(b)确定在第一样品和第二样品中释放的分析目标和配体的量的比率。

在一些实施方案中，样品、第一样品或第二样品是衍生自哺乳动物组织或含水哺乳动物流体的生物样品。在一些实施方案中，生物样品获自以下之一：血浆、血清、血液、组织、组织活检、粪便和尿液。在一些实施方案中，生物样品获自血浆。在一些实施方案中，用LDC处理血浆。在一些实施方案中，血浆来自已经用LDC治疗的人类受试者。

在又一个方面中，本发明提供一种用于定量样品中的LDC的方法，包括以下步骤：(a)提供包含LDC的样品，其中所述LDC包括分析目标，所述分析目标包括药物分子；(b)向样品中添加内标，其中该内标是LDC的标记衍生物，并包含第二分析目标；(c)从样品中提取LDC和内标；(d)使LDC和内标与浓度为1-30％(v/v)的含水TFA接触，其中TFA从LDC释放分析目标和从内标释放第二分析目标；(d)确定从LDC释放的分析目标的量和从内标释放的第二分析目标的量，其中从LDC释放的分析目标的量与样品中LDC的量相关。

在一些实施方案中，通过使用从内标释放的第二分析目标的量确定从LDC释放的分析目标的量，其中从LDC释放的分析目标的量和与样品中LDC中的抗体偶联的药物分子的浓度相关。

在一些实施方案中，通过使用LDC的标准曲线确定从LDC释放的分析目标的量。

在一些实施方案中，药物分子是单甲基澳瑞他汀F(MMAF)或单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，分析目标包括MMAF或四肽Val-Dil-Dap-Phe。在一些实施方案中，分析目标包括mcMMAF。在一些实施方案中，分析目标和第二分析目标包括四肽Val-Dil-Dap-Phe，并且第二分析目标用6个或更多个碳和13或6个或更多个氘进行同位素标记。在一些实施方案中，分析目标和第二分析目标包括聚乙二醇化的接头DPR-PEG-葡萄糖-氨基甲酸酯-MMAE。在一些实施方案中，分析目标和第二分析目标包括MMAE，并且第二分析目标用6个或更多个碳和13或6个或更多个氘进行同位素标记。

在一些实施方案中，使LDC和内标与浓度为10％v/v的含水TFA浓度接触。

一方面，本发明提供了一种用于确定样品中LDC的量的试剂盒，其包括：(a)LDC的内标，其中所述内标是LDC的标记衍生物，并包含药物分子；和(b)含水三氟乙酸TFA，以1-30％(v/v)之间选定的浓度应用。在一些实施方案中，内标被进行同位素标记。

在另一方面，本发明提供了用于确定样品中LDC的量的试剂盒，其包括：(a)标记的接头-药物复合物和配体，其中所述标记的接头-药物复合物可以与所述配体偶联，从而形成内标；和(b)含水三氟乙酸TFA，以1-30％(v/v)之间选定的浓度应用。在一些实施方案中，内标被进行同位素标记。

附图说明

图1提供了两个mAb-mcMMAF ADC的离体稳定性曲线。用ADC掺入柠檬化的大鼠血浆，并在每个时间点分析样品。在蛋白A亲和树脂上捕获ADC，然后使用10％的TFA水溶液释放药物。然后通过LC-MS/MS对释放的药物进行定量。每个时间点反映了在t₀观察到的偶联药物的百分比。

图2示出了来自患者样品的ADC的载药量随时间的变化。对每3周(q3w)或每6周(q6w)用mAb-mcMMAF ADC治疗的患者的临床样品进行分析。在捕获蛋白A亲和力、10％TFA介导的释放以及通过LC-MS/MS进行药物定量后，使用ELISA进一步分析样品的抗体浓度。TFA处理释放了四肽Val-Dil-Dap-Phe，其可通过LC-MS/MS进行定量。将结果绘制为随时间推移每种抗体的药物。

图3提供了mAb-MMAE ADC的体内稳定性曲线。根据所述方法分析酸释放产物MMAE，并绘制为随时间变化的偶联药物的量。

图4A示出了具有选择用于转换成半胱氨酸的抗体C_H2结构域的铰链区附近的位点的预测分子结构。首先在Fc和Fab之间的铰链附近的Fc片段上鉴定位点(左图)。这些位点与CD16结合位点重合，如共晶体结构1E4K(中图)所示。Fc、Fab和CD16的相对方向可以在将CD16停靠在完整抗体晶体结构1HZH上生成的模型中看到(右图)。图4B示出了使用1HZH作为模板计算的转化位点的溶剂可及性。图4C提供了针对表面分子上投影的计算机建模的突变体计算的静电势。这些位点在工程化结合位点附近的高酸性或碱性元件中均未显示出一致的趋势。

图5示出了通过蛋白水解和质谱法确认的药物偶联位点。将野生型(WT Fc)、工程化的半胱氨酸抗体(S239C)和ADC(S239C+药物)用内切蛋白酶GluC(在E233位置和铰链二硫键的C末端裂解)(图5，左)消化，然后随后使用飞行时间质谱分析Fc片段。消化野生型ADC时，得到的Fc片段的质量为24,054Da(上图)，没有任何偶联迹象，与所有偶联位点都在位置233的N端侧一致。消化S239C抗体产生的Fc片段具有质量上额外的16Da，总计24,070Da，对应于丝氨酸和半胱氨酸之间的质量差异(中图)。消化S239C纯2负荷的ADC得到的Fc片段具有质量上额外的942Da，总质量为24,995Da，对应于不同质量的丝氨酸和半胱氨酸以及药物接头的添加(下图)。

图6显示了裸抗体、天然4负荷ADC和工程化半胱氨酸抗体(K326C、E269C、A327C和S239C)的体内活性。在单次10mg/kg剂量的786-0异种移植实验中测试了抗体的活性。2负荷的S239C工程化半胱氨酸优于天然的4负荷和所有其他工程化半胱氨酸突变体ADC。

图7A-B提供了代表血浆中ADC马来酰亚胺稳定性的数据。图7A提供了示意图，其中步骤1显示了用于偶联抗体和药物接头的可逆迈克尔加成。步骤2说明了可能的水解反应，该反应可稳定偶联物并防止药物接头丢失。图7B显示了药物-接头偶联物的时间过程稳定性。数据显示在ADC与大鼠血浆温育过程中，通过逆迈克尔反应的偶联的药物损失。2负荷的S239C工程化半胱氨酸比天然的4负荷和所有其他工程化半胱氨酸突变体ADC更稳定。表2显示了每种构建体的相对于t＝0小时的最终药物载量％。

这些图仅出于说明的目的描绘了本发明的各种实施方案。本领域的技术人员将从以下讨论中容易地认识到在不脱离本文描述的本发明原理的情况下，可以采用本文所示的结构和方法的替代实施方案。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的含义。如本文所使用的，以下术语具有以下赋予它们的含义。

“配体-药物偶联物”或“LDC”是指与药剂例如与细胞毒性或细胞抑制药物偶联的配体(例如抗体)。“配体”包括但不限于聚合物、树状聚合物、寡核苷酸、蛋白质、多肽、包括环肽和糖肽的肽、或任何其他细胞结合分子或物质。更具体地，配体包括适体(寡核苷酸或肽)，以及各种蛋白质，例如干扰素、淋巴因子、结蛋白(knottin)、adnectin、抗运载蛋白(anticalin)、darpins、avimer、Kunitz结构域和centyrins。其他配体包括激素、生长因子、集落刺激因子、维生素和营养物质转运分子。合适的配体包括例如抗体，例如全长抗体及其抗原结合片段。抗体还包括双特异性抗体和多特异性抗体。

“抗体-药物偶联物”或“ADC”是指偶联至药剂的抗体、抗原结合片段或其工程化变体。通常，抗体-药物偶联物结合至细胞表面上的靶抗原(例如，CD70)，然后将抗体-药物偶联物内化至细胞中，随后将药物释放至细胞中。抗体或其抗原结合片段可以与药剂共价或非共价结合。在特定的实施方案中，LDC中的药物，特别是ADC中的药物，通过接头与配体或更具体地与抗体偶联。接头通常包含通过化学间隔物分开的与药物偶联和与配体偶联而产生的残基。化学间隔物可以简单地是烃链、亚烯基(例如-(CH₂)n-，其中n是选择的整数，或n是2-10)，或包含一个或多个氧、羰基(C＝O)、硫或氨基(例如，NH或N烷基)的杂亚烯基链。接头可以是在结构上更加复杂，例如，所述接头可以被PEG(聚乙二醇)基团或其它亲水性基团取代，或可含有可裂解基团，例如，β-葡萄糖醛酸苷，其可通过β-葡糖醛酸糖苷酶裂解，使得切割基团，切割接头。

接头是将配体与药物连接的化学种类。通常，LDC通过两个偶联步骤形成。具有最常被间隔基隔开并且可选地被取代的两个不同反应性基团的为异双官能种类的接头的前体最常与药物分子反应以形成保留反应性基团之一的接头-药物组合。异双官能接头前体在两个具有不同反应性的反应性基团之间包含间隔基。例如，杂双官能接头前体可在一端包含胺反应性基团而在另一端包含硫醇反应性基团。在另一个更具体的实例中，杂双官能接头前体可包含碳酸酯，用于与药物的胺反应形成氨基甲酸酯。在其他更具体的实例中，杂双官能接头前体可包含叠氮化物或N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯或磺基-NHS酯)，以与药物的胺反应，形成酰胺。每个这样的胺反应性基团可以在接头前体中与马来酰亚胺基团配对，该马来酰亚胺基团在选择的已知条件下对与硫醇的反应具有选择性。与药物偶联后，反应性基团之一保留在接头-药物组合中。

然后可以将保留反应性基团的接头-药物组合用作将药物偶联至配体的试剂。例如，配体偶联试剂可包含马来酰亚胺基团以与配体上的硫醇基反应。更一般地，配体偶联试剂可包含任何合适的反应性基团用于偶联至配体上的基团。所述反应性基团可例如与胺基、与羧酸酯基、与硫醇基或与羟基反应。

“分析目标”是指从配体-药物偶联物释放或裂解的药物或其部分，并且通过一种或多种已知的分析技术，例如质谱法，对其进行检测或测量(定量)。分析目标至少包含药物或其一部分，并且可以另外包含接头的一部分。分析目标的量代表从其释放或裂解的配体-药物偶联物的量。更具体地，分析目标是LDC的药物或LDC的药物的一部分。在具体的实施方案中，在药物是澳瑞他汀的情况下，分析目标可以是从药物释放的四肽。

当使用内标时，分析目标可以是从内标释放或裂解的药物或其一部分。在典型的实施方案中，例如，通过具有不同的分子量和/或通过标记，可以使从内标释放的分析目标与从配体-药物偶联物释放的分析目标区分开。

术语“抗体”表示机体响应抗原的存在而产生并与抗原结合的免疫球蛋白，以及其抗原结合片段和工程化变体。因此，术语“抗体”包括例如完整的单克隆抗体(例如，使用杂交瘤技术生产的抗体)和抗原结合抗体片段，例如F(ab')₂、Fv片段、双抗体、单链抗体、scFv片段或scFv-Fc。也包括基因改造的完整抗体和片段，例如嵌合抗体、人源化抗体、单链Fv片段、单链抗体、双抗体、小抗体、线性抗体、多价或多特异性(例如双特异性)杂交抗体等。因此，术语“抗体”被广泛地用于包括任何包含抗体的抗原结合位点并且能够与其抗原特异性结合的蛋白质。

术语“提取物”、“提取的”、“提取”和“正提取”是指从包含几种蛋白质和其他分子的异质样品中分离LDC或ADC。可以从异质样品，特别是生物样品中选择性地提取LDC或ADC的本领域已知的任何合适的方法或材料可以用于本文的方法中。提取例如可以包括：亲和色谱、尺寸排阻色谱、硫酸铵沉淀、离子交换色谱、固定金属螯合物色谱和免疫沉淀。

LDC或ADC与包含配体或抗体结合的种类的树脂的结合可用于提取。抗体结合蛋白可用于ADC的提取。例如，从样品中提取ADC可涉及使样品在蛋白A柱上运行或使样品与蛋白A树脂接触，然后从样品中去除树脂以捕获抗体，从而从样品中提取ADC。关于ADC，表面蛋白质蛋白A、蛋白G或蛋白L可用于提取。给定抗体与蛋白A、蛋白G或蛋白L结合的结构要求是本领域已知的，并且本领域普通技术人员可以从中选择适合与给定抗体一起使用的表面蛋白。在使用这些蛋白质提取中有用的材料包括树脂，例如珠状琼脂糖或磁珠，或将蛋白A、蛋白G或蛋白L共价固定在其上的类似载体材料。

术语“细胞内裂解的”和“细胞内裂解”是指细胞内配体-药物偶联物(例如抗体-药物偶联物)上的代谢过程或反应，其中共价连接例如药物部分和配体单元之间的接头被破坏，产生从细胞内的抗体上解离的游离药物或偶联物的其他代谢物。因此，药物-接头-配体偶联物的被切割部分是细胞内代谢物。

术语“释放”、“释放的”和“正释放”是指通过其中所述的酸介导的裂解方法从LDC对分析目标的细胞外裂解。对于携带(即与之偶联)一定数量的接头-药物组合的给定LDC，释放的分析目标的量通常随释放反应中使用的酸浓度(见下文)、反应温度和压力(见下文)和所用的反应时间而改变。为了使样品之间的结果保持一致，应使用相同的酸浓度和反应条件。如本文所述用酸处理不需要从LDC释放所有分析目标。根据采用的分析方法，所需要的是释放一定量的分析目标，该量足以获得准确而精确的分析目标测量值。

术语“接触”、“接触的”和“正接触”是指向样品中添加酸或试剂，该样品可以是测试样品或对照样品(包括生物样品)，以使样品中的组分对酸或试剂有用，并且可以发生反应。在本文的方法中，与酸添加相关的反应是从LDC或更具体地从ADC释放分析目标。

“细胞毒性作用”是指靶细胞的消耗、消除和/或杀死。“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性作用从而介导靶细胞的消耗、消除和/或杀死的化合物。该术语包括放射性同位素(例如²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P、⁶⁰C、和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂和毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括合成类似物及其衍生物。在某些实施方案中，细胞毒性剂与抗体偶联或与抗体组合施用。合适的细胞毒性剂在本文进一步描述。

“细胞毒性活性”是指配体-药物偶联物化合物或配体-药物偶联物的细胞内代谢物的细胞杀伤、细胞抑制或抗增殖作用。细胞毒性活性可以表示为IC₅₀值，它是一半细胞存活的每单位体积的浓度(摩尔或质量浓度)。

术语“患者”或“受试者”包括接受预防或治疗性处理的人和其他哺乳动物受试者，例如非人灵长类、兔子、大鼠、小鼠等及其转基因物种。

术语“标准曲线”或“校准曲线”是指用作定量研究技术的图。为了生成标准曲线，需要对多个具有已知特性的样品进行测量并绘图，然后通过在图上进行插值来确定未知样品的相同特性。具有已知特性的样品是标准样品，图是标准曲线。当测量可能包含未知量分析物的样品中分析物的量或浓度时，标准曲线特别有用。仅使用标准曲线表示使用外标。如本领域中所理解的，待定量的给定分析物(即，LDC)的标准曲线通常应跨越样品中预期的分析物的浓度范围。再次如本领域中所理解的，用于制备标准曲线的样品通过与测试样品和要在其中测量分析物的任何对照样品相同的步骤进行处理。标准曲线也可以与内标使用结合应用。在这种情况下，将恒定(或固定)量的内标添加到每个所用样品中，以生成已知分析物浓度的标准曲线。将相同恒定量的内标添加到每个测试样品以及任何空白或对照样品中。使用标准曲线(校准曲线)作为外标以及结合使用标准曲线和添加内标来通过分析方法(包括MS、LC-MS和LC-MS/MS方法)定量分析物的细节是本领域众所周知的。本领域普通技术人员理解如何在确定各种样品(包括本文所述的生物样品)中的分析物浓度时使用这种分析方法。

“内标”是一种化学种类，其在选定的分析中的行为类似于要定量的化学种类(即LDC)，但在所使用的分析方法中与该化学种类有区别。通常，对内标进行标记以将其与要定量的化学种类区分开，但是与要定量的化学种类相比，所使用的标记不会显著差异地影响其行为。优选地，影响要定量的化学种类的测量(例如，分析物峰面积)的任何事物也将类似地影响内标的测量。与测试样品中化学种类的测量值相比，待定量化学种类和其内标的测量值之比优选具有更小的可变性。为了用于质谱分析方法，内标的分子量不同于要定量的化学种类。

最常使用稳定同位素进行标记，例如采用氘(²H)和碳13(¹³C)。标记必须允许分别测量分析物和内标。优选地，同位素标记的内标的分子量与要定量的化学种类的分子量相差至少3amu(即，用3个或更多个²H或¹³C标记)。更具体地，标记导致分子量差异为6amu或更大。内标也可以替代要定量的化学种类。替代物内标在结构上与要量化的化学种类不同，在于通过不同基团取代原子或化学基团，例如甲基或其他小烷基取代氢，或卤素例如氟取代氢。当不可能容易地获得同位素标记的内标时，此类替代物可能特别有用。

术语“确定”、“确定的”和“测定”是指基于对分析目标的量的测量和一种或多种相关因子的已知量来确定特定分析物的浓度或量。如本领域中所理解的，可以将分析物浓度与其他测量结果相结合以确定分析物的其他结构和物理性质。

当在本文中使用商品名称时，除非上下文另有说明，否则商品名称包括商品名称的产品配方、通用药和活性药物成分。

其他解释约定

本文所叙述的范围应理解为该范围内所有数值的简写形式，包括所叙述的端点。例如，范围1到50应该理解为包括选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的任何数字、数字的组合或子范围。

除非另外指出，否则提及具有一个或多个立体中心的化合物是指每种立体异构体及其立体异构体的所有组合。

分析配体-药物偶联物(LDC)的测定法

一方面，本发明提供了一种分析样品中的配体-药物偶联物(LDC)的方法，其包括以下步骤：(a)提供包含LDC的样品，其中所述LDC包含配体和分析目标，其中分析目标包括药物分子或其一部分；(b)使样品与浓度为1-30％(v/v)的含水三氟乙酸(TFA)接触，从而诱导分析目标从LDC释放。在一些实施方案中，所述方法可包括以下步骤：(a)提供包含LDC的样品，其中所述LDC包括分析目标，所述分析目标包括药物分子；(b)向样品中添加内标，其中该内标是LDC的标记衍生物，并包含第二分析目标；(c)从样品中提取LDC和内标；(d)使LDC和内标与浓度为1-30％(v/v)的含水TFA接触，其中TFA从LDC释放分析目标和从内标释放第二分析目标；(e)确定从LDC释放的分析目标的量和从内标释放的第二分析目标的量，其中从LDC释放的分析目标的量与样品中LDC的量相关。

包含配体-药物偶联物(LDC)的样品

本发明提供了一种分析样品中的配体-药物偶联物(LDC)的方法。LDC是包含配体和分析目标的复合物。分析目标包括药物分子或其一部分。可以使用本文提供的方法对包含LDC或怀疑包含LDC的各种样品进行分析。特别地，可以分析生物样品。

样品

可以通过本文提供的方法分析生物或非生物样品中的LDC。在优选的实施方案中，样品是源自哺乳动物受试者的生物样品。具体地，在一些实施方案中，生物样品获自以下之一：血浆、血清、血液、组织、组织活检、粪便和尿液。

在一些实施方案中，样品是体内与LDC接触的生物样品。例如，样品可以是源自暴露于LDC的受试者的生物样品。在一些实施方案中，在施用LDC后的特定时间点获得样品。在一些实施方案中，在施用LDC后的多个时间点获得样品。在一些实施方案中，样品是在施用LDC之前获得的。

在一些实施方案中，样品是离体与LDC接触的生物样品。在一些实施方案中，样品与LDC接触特定的时间段。在一些实施方案中，对与LDC接触不同时间的多个样品进行分析。在一些实施方案中，样品在暴露于LDC之前获得。

配体-药物偶联物(LDC)

配体

在一些实施方案中，配体是对靶分子具有特异性亲和力的蛋白质。在一些实施方案中，配体是抗体。有用的多克隆抗体是衍生自免疫动物血清的抗体分子的异质群体。有用的单克隆抗体是针对特定抗原决定簇(例如癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学物质、核酸或其片段)的同质抗体群。可以通过使用本领域已知的任何技术来制备针对目的抗原的单克隆抗体(mAb)，该技术提供了通过培养中的连续细胞系产生抗体分子的方法。

有用的单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体、人源化单克隆抗体或嵌合人小鼠(或其他物种)单克隆抗体。抗体包括全长抗体及其抗原结合片段。人单克隆抗体可以通过本领域已知的多种技术中的任何一种来制备(例如，Teng等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:7308-7312；Kozbor等人,1983,Immunology Today 4:72-79；和Olsson等人,1982,Meth.Enzymol.92：3-16)。

抗体可以是与靶细胞(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)免疫特异性结合的抗体的功能活性片段、衍生物或类似物，或者是与肿瘤细胞或基质结合的其他抗体。在这方面，“功能活性的”是指片段、衍生物或类似物能够引发识别与衍生出片段、衍生物或类似物的抗体相同抗原的抗独特型抗体。具体地，在一个示例性实施方案中，可以通过缺失特异性识别抗原的CDR序列的C末端的框架和CDR序列来增强免疫球蛋白分子独特型的抗原性。为了确定哪些CDR序列结合抗原，可以通过本领域中已知的任何结合测定方法(例如，BIA核心测定)将含有CDR序列的合成肽用于与抗原的结合测定中(参加例如Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,National Institute ofHealth,Bethesda,Md.；Kabat E等人,1980,J.Immunology 125(3):961-969)。

其他有用的抗体包括抗体片段，例如但不限于F(ab')2片段、Fab片段、Fv、单链抗体、双抗体、三抗体、四抗体、scFv、scFv-Fv或具有与抗体相同的特异性的任何其他分子。

另外，可以使用标准重组DNA技术制备的包含人和非人部分的重组抗体，例如嵌合和人源化单克隆抗体，都是有用的抗体。嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有源自鼠单克隆和人免疫球蛋白恒定区的可变区的那些。(参见，例如，美国专利号4,816,567；和美国专利号4,816,397，其每一个均通过引用整体并入本文。)人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，该非人物种具有来自非人类物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区。(参见，例如，美国专利号5,585,089，其通过引用整体并入本文。)此类嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用以下文献描述的方法：国际公开WO 87/02671；欧洲专利公开0 184 187；欧洲专利公开0 171 496；欧洲专利公开0 173 494；国际公开WO 86/01533；美国专利4,816,567；欧洲专利公开012 023；Berter等人，1988，Science 240：1041-1043；Liu等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等人,1987,Cancer.Res.47：999-1005；Wood等人,1985,Nature 314：446-449；和Shaw等人,1988,J.Natl.CancerInst.80：1553-1559；Morrison,1985,Science 229：1202-1207；Oi等人,1986,BioTechniques 4：214；美国专利5,225,539；Jones等人,1986,Nature 321：552-525；Verhoeyan等人,1988,Science 239：1534；和Beidler等人,1988,J.Immunol.141：4053-4060；其均通过引用整体并入本文。

完全人抗体是特别理想的，并且可以使用不能表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因但可以表达人重链和轻链基因的转基因小鼠产生。

抗体包括被修饰的类似物和衍生物，即通过任何类型分子的共价连接修饰的类似物和衍生物，只要这种共价连接允许抗体保持其抗原结合免疫特异性。例如但不限于，抗体的衍生物和类似物包括已经被进一步修饰的那些，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞内抗体单元或其他蛋白质连接，等等。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任何一种，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、在衣霉素存在下的代谢合成等。另外，类似物或衍生物可以包含一种或多种非天然氨基酸。

抗体可在与Fc受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰(例如，取代、缺失或添加)。特别地，抗体可以在氨基酸残基中具有被识别为涉及抗Fc结构域和FcRn受体之间的相互作用的修饰(参见，例如，国际公开号WO 97/34631，其通过引用整体并入本文)。

对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体可商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法产生，例如化学合成或重组表达技术。编码对癌细胞抗原具有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可例如从GenBank数据库或类似数据库、文献出版物或通过常规克隆和测序获得。

在某些实施方案中，有用的抗体可以结合至在活化的淋巴细胞上表达的受体或受体复合物。受体或受体复合物可包含免疫球蛋白基因超家族成员、TNF受体超家族成员、整联蛋白、细胞因子受体、趋化因子受体、主要组织相容性蛋白、凝集素或补体对照蛋白。合适的免疫球蛋白超家族成员的非限制性实例是CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD2O、CD22、CD28、CD30、CD70、CD79、CD90、CD152/CTLA-4、PD-1和ICOS。合适的TNF受体超家族成员的非限制性实例是CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/OX40、CD137/4-1BB、TNF-R1、TNFR-2、RANK、TACI、BCMA、骨保护素、Apo2/TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4和APO-3。合适的整联蛋白的非限制性实例是CD11a、CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD41、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD103和CD104。合适的凝集素的非限制性实例是C型、S型和I型凝集素。

在一些实施方案中，配体是受体配体。受体配体可以具有在特定细胞类型、组织或器官中富集的结合伴侣。配体可以是受体的天然激动剂或拮抗剂，或对受体具有亲和力的合成分子。受体配体可以是蛋白质、核酸或其他受体配体，例如肽、维生素和碳水化合物。在一实施方案中，配体是对叶酸受体具有亲和力的叶酸。

在一些实施方案中，配体是已经被使用和开发用于将药物靶向靶器官或组织的靶向部分。本领域已知的此类位点特异性配体可以在本文提供的方法中使用和采用。

药物

LDC的药物可以是任何细胞毒性、细胞生长抑制或免疫抑制药物，在本文中也称为细胞毒性、细胞生长抑制或免疫抑制剂。该药物具有官能团，例如氨基、烷基氨基或羧酸根，它们可以与含有接头的试剂前体的适当反应性基团形成键，例如胺基、羧酸基、巯基、羟基或醛或酮基。在一个实施方案中，药物与接头偶联以产生酰胺或氨基甲酸酯。在一个实施方案中，药物通过酰胺键偶联至接头。在一个实施方案中，药物包含单个酰胺键。在一个实施方案中，药物通过氨基甲酸酯偶联至接头，并且药物包含酰胺键。在特定的实施方案中，TFA处理通过切割至所述药物中的接头或内部酰胺键的酰胺键来释放所述药物或其一部分。

有用的细胞毒性或免疫抑制剂类别包括例如抗微管蛋白剂，澳瑞他汀，DNA小沟结合剂，DNA复制抑制剂，烷基化剂(例如铂络合物，如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)，蒽环类抗生素，抗生素，抗叶酸药，抗代谢药，化学疗法敏化剂，双羧霉素(duocarmycin)，依托泊苷，氟化嘧啶，离子载体，促排卵素，亚硝基脲，白金醇，预形成化合物，嘌呤类抗代谢药，嘌呤霉素，辐射敏化剂，类固醇，紫杉烷，拓扑异构酶抑制剂，长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性剂类别包括，例如，DNA小沟结合剂、DNA烷基化剂和微管蛋白抑制剂。示例性的细胞毒性剂包括，例如，澳瑞他汀，喜树碱，双羧霉素，依托泊苷，美登素和美登木素生物碱(例如，DM1和DM4)，紫杉烷，苯并二氮杂卓(例如，吡咯并[1,4]苯并二氮杂卓(PBD)、吲哚并苯并二氮杂卓)和长春花生物碱。在WO 2010/091150、WO 2012/112708、WO2007/085930和WO 2011/023883中描述了选择含苯并二氮杂卓的药物。

在一个示例性的实施方案中，药物是含有一个或多个、两个或多个、三个或多个或四个或多个氨基酸基团的肽类药物。在一个示例性的实施方案中，所述药物是含有N端、N-甲基化氨基酸基团的肽类药物。在另一个示例性的实施方案中，所述药物是具有N端、N-甲基化氨基酸和烷基侧基的肽类药物。在另一个示例性的实施方案中，药物是具有N端、N-甲基化的丙氨酸、N-甲基化的异亮氨酸、N-甲基化的亮氨酸或N-甲基化的缬氨酸的肽类药物。在另一个示例性的实施方案中，药物是具有N端、N-甲基化缬氨酸的肽类药物。

在一个优选的实施方案中，药物是澳瑞他汀。澳瑞他汀包括但不限于AE、AFP、AEB、AEVB、MMAF和MMAE。美国专利申请公开号2003-0083263、2005-0238649、2005-0009751、2009-0111756和2011-0020343；国际专利公开号WO 04/010957、国际专利公开号WO 02/088172和美国专利7,659,241和8,343,928中描述了澳瑞他汀的合成和结构；出于所有目的，通过引用将其全部内容并入本文。本发明的示例性澳瑞他汀结合微管蛋白并对期望的细胞系发挥细胞毒性或细胞抑制作用。在一个实施方案中，示例性澳瑞他汀含有N端、N-甲基化氨基酸。更具体地，示例性澳瑞他汀包含具有烷基侧链的N端、N,N-甲基化氨基酸，例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。更具体地，示例性澳瑞他汀包含N端、N-甲基化的缬氨酸。

其他单独的细胞毒性或免疫抑制剂包括例如雄激素，蒽霉素(AMC)，天冬酰胺酶，5-氮杂胞苷，硫唑嘌呤，博来霉素，白消安，丁硫氨酸亚砜，卡奇霉素，喜树碱，卡铂，卡莫司汀(BSNU)，CC-1065，苯丁酸氮芥，顺铂，秋水仙碱，环磷酰胺，阿糖胞苷，胞苷阿拉伯糖苷，细胞松弛素B，达卡巴嗪，放线菌素(以前为放线霉素)，柔红霉素，脱卡巴嗪，多西他赛，阿霉素，依托泊苷，雌激素，5-氟脱氧尿嘧啶，5-氟嘧啶尿苷，吉西他滨，短杆菌肽D，羟基脲，伊达比星，异环磷酰胺，伊立替康，洛莫斯汀(CCNU)，美登素，甲氧乙胺，美法仑，6-巯基嘌呤，甲氨蝶呤，光神霉素，丝裂霉素C，米托蒽醌，硝基咪唑，紫杉醇，海葵毒素(palytoxin)，普卡霉素(plicamycin)，丙卡巴肼(procarbizine)，根瘤菌素(rhizoxin)，链脲佐菌素(Streptozotocin)，依托泊甙，6-硫鸟嘌呤，thioTEPA，托泊替康，长春碱，长春新碱，长春瑞滨，VP-16和VM-26。

合适的细胞毒性剂还包括DNA小沟结合剂(例如，烯二炔和促血线蛋白(lexitropsin)，CBI化合物；还参见美国专利号6,130,237)，双羧霉素(参见美国公开号20060024317)，紫杉烷类(例如，紫杉醇和多西他赛)，嘌呤霉素，长春花生物碱，CC-1065，SN-38，托泊替康，吗啉代多柔比星，根瘤菌素，氰基吗啉代多柔比星，赤霉素，康维他汀，纺锤霉素(netropsin)，埃坡霉素A和B，雌莫司汀，念珠藻素(cryptophysin)，西美多汀，美登醇(maytansinoid)，圆皮海绵内酯(discodermolide)，软珊瑚醇(eleutherobin)，和米托葸醌。

抗微管蛋白剂的实例包括但不限于紫杉烷类(例如，Taxol.RTM.(紫杉醇)，Taxotere.RTM.(多西他赛))，T67(Tularik)和长春花烷类药物(例如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)。其他抗微管蛋白剂包括例如浆果赤霉素衍生物，紫杉烷类似物(例如埃坡霉素A和B)，诺考达唑，秋水仙碱和秋水酰胺(colcimid)，雌莫司汀，念珠藻素，西马多丁(cemadotin)，美登醇，康维他汀，圆皮海绵内酯和软珊瑚醇。美登素和美登醇是另一组抗微管蛋白剂。(ImmunoGen,Inc.；也参见Chari等人,1992,Cancer Res.52：127-131和U.S.Pat.No.8,163,888)。

示例性澳瑞他汀药物具有下式或其药学上可接受的盐，其中波浪线表示与接头的连接点：

(单甲基澳瑞他汀F)和

(单甲基澳瑞他汀E)。

通过接头与配体偶联的替代澳瑞他汀药物具有下式或其药学上可接受的盐，其中波浪线表示与接头的连接点：

可用于制备LDC并且特别可用于制备ADC的其他细胞毒性化合物是美国专利6,884,869中描述的那些，其通过引用整体并入本文，特别是关于细胞毒性化合物的描述。其中的附加描述描述了与所述的细胞毒性化合物的药物偶联物的制备。

接头

用于将药物连接至接头的一般程序是本领域已知的。参见，例如，美国专利号8,163,888、7,659,241、7,498,298，美国公开号US20110256157和国际申请WO2011023883和WO2005112919。

接头在细胞内条件下可裂解，使得接头的裂解在细胞内环境(例如，在溶酶体或内体或小窝内)从配体释放治疗剂。接头可以是例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包括溶酶体或内体蛋白酶)切割的肽基接头。细胞内裂解剂可以包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶(参见，例如，Dubowchik和Walker，Pharm.Therapeutics 83：67-123，1999)。例如，可以使用在癌组织中高表达的可被硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B裂解的肽基接头(例如，包含Phe-Leu或Val-Cit肽的接头)。接头也可以是碳水化合物接头，包括被细胞内糖苷酶切割的糖接头(例如，可被葡糖醛酸糖苷酶切割的葡糖醛酸苷接头)。

接头也可以是不可裂解的接头，例如马来酰亚胺基-亚烷基-或马来酰亚胺-芳基接头，其通过硫(硫醇)连接至配体并通过抗体的蛋白水解降解而释放。

抗体可以通过任何合适的反应性基团，例如通过抗体的胺基团(例如，N端氨基或氨基酸例如赖氨酸侧基的胺基团)、硫醇基团(-SH，例如，半胱氨酸残基的)、羧酸根(例如，C端羧酸根或氨基酸例如谷氨酸侧链的残基)或羟基(例如，丝氨酸残基的)与一个或多个接头偶联。

在示例性的ADC中，单甲基澳瑞他汀E通过蛋白酶可切割的肽接头与抗体偶联，单甲基澳瑞他汀F通过马来酰亚胺基己酸(mc)接头与抗体偶联。另外，接头可以包含调节溶解度或药代动力学的化学基团。例如，示例性的接头被聚乙二醇化。具体的示例性接头-药物组合为：

mc-MMAF，其中接头的马来酰亚胺基团可以与配体特别是抗体的硫醇基团反应；或

DPR-PEG-葡萄糖-氨基甲酸酯-MMAE，其中接头被聚乙二醇化并且包含葡糖醛酸(可被葡糖醛酸糖苷酶切割)，并且其中接头的马来酰亚胺基团可以与配体的硫醇基反应。在含有上述接头-药物组合的LDC中，如本文所述用酸处理可从mc-MMAF中释放四肽Val-Dil-Dap-Phe(其中Dap为多拉脯氨酸)，和从DPR-PEG-葡萄糖-氨基甲酸酯-MMAE释放整个药物。可通过标记此类接头-药物组合制备用于LDC和ADC的内标，其中如本文所述在用酸处理时释放标记。与mc-MMAF结合的LDC和ADC的示例性内标包括氘化或在释放的四肽中用¹³C标记的内标。与mc-MMAF结合的LDC和ADC的示例性内标包括氘化或在释放的MMAE中用¹³C标记的内标。在上述结构中，可能的¹³C标记或氘标记的位置用“*”表示。

本文的定量方法通常采用释放LDC的片段，所述LDC的片段在本文中被指定为分析目标，其代表整个LDC，并且对所述分析目标进行定量。分析目标的定量允许测量释放的分析目标的量、样品中的LDC中的分析目标的量和/或样品中的LDC的量。在某些确定中，有必要通过适当的已知方法知道或确定样品中配体的量，或者需要通过适当的方法知道或确定与给定LDC偶联的药物分子的数量(或平均数量)。更具体地，本文的分析目标是LDC的药物分子或LDC的药物分子的一部分。药物通过接头种类与LDC中的配体偶联，因此分析目标除药物或其一部分外，还可包括接头的部分或整个接头。在具体的实施方案中，本文的分析目标是偶联至LDC的药物。在特定的实施方案中，本文的分析目标是与LDC偶联的药物的一部分。在本文的特定实施方案中，药物是肽或其衍生物，并且分析目标是肽药物或肽药物的肽部分。在具体的实施方案中，当药物是肽或其衍生物时，分析目标是二肽或其衍生物、三肽或其衍生物或四肽或其衍生物。

由三氟乙酸(TFA)介导的裂解

本发明的方法包括使样品与浓度为1-30％(v/v)的三氟乙酸(TFA)水溶液接触的步骤，以诱导分析目标从LDC的释放。也可以使用TFA在乙腈中的溶液。

使用的TFA浓度可以是1-20％、1-10％、2.5-30％、2.5-20％、2.5-10％、5-15％、7-13％、9-11％或9.5至10.5％，v/v，包括所有范围。TFA浓度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％或约30％，全部为％v/v。在一个优选的实施方案中，TFA为10％(v/v)。

TFA浓度可以是在水、样品混合物或任何其他可接受的溶剂中稀释100％TFA的结果。可以在将TFA添加到样品中之前对其进行稀释，或在样品混合物本身中进行稀释。

TFA反应可以在可变的时间和温度条件下进行。例如，反应可以在20至80℃之间进行，例如约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36°、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃、约65℃、约66℃、约67℃、约68℃、约69℃、约70℃、约71℃、约72℃、约73℃、约74℃、约75℃、约76℃、约77℃、约78℃、约79℃或约80℃。

TFA反应通常在环境压力下进行。对于本领域的普通技术人员显而易见的是在这种反应中反应的压力可以变化而没有明显的损害。应当理解，压力的改变可能需要温度的改变。在较高压力下进行的反应可以允许使用较低的反应温度。应当理解，酸的浓度、反应时间和反应温度可以在本文所述的范围内与反应压力一起变化，以实现所需的分析目标释放水平。

反应可以进行约12-24小时、10-20小时或15-17小时的时间。但是，可以使用酸浓度、温度、时间和压力的任意组合，以使所选的分析方法给出期望精度和精密度的测量。如其他地方所述，为确保给定实验或定量结果的一致性，对于给定实验或定量，所有测试样品(未知物)、所有对照和所有校准样品所使用的反应条件应相同。在一个示例性的实施方案中，使用10％的TFA在70℃和环境压力下进行裂解反应约16小时。

在公开的方法中可以使用其他酸，例如但不限于其他氟化酸、有机或无机酸。具体的替代酸包括三氟甲烷磺酸。挥发性酸通常比无机酸(例如HCl)更可取。

分析目标的测量

在一些实施方案中，方法进一步包括测量样品中的分析目标的步骤。可以使用适合在样品中预期遇到的浓度范围内定量分析目标的分析方法。

在一些实施方案中，在分析目标的测量之前，从样品中提取LDC或内标。通过亲和色谱、尺寸排阻色谱、硫酸铵沉淀、离子交换色谱、固定金属螯合物色谱或免疫沉淀收集分析目标。在一些实施方案中，LDC或内标包括抗体或功能片段作为配体。在那些情况下，可通过使样品与选自蛋白A树脂、蛋白G树脂和蛋白L树脂的树脂接触来收集LDC或内标。

在一些实施方案中，使用液相色谱/质谱(LC/MS)方法检测和定量分析目标。更具体地说，采用串联质谱法(MS/MS)。在MS/MS方法中，监控分析目标的选定母体离子的一个或多个碎片离子。如本领域已知的在第一MS步骤中选择分析目标的母离子，并对母离子进行裂解，通常是碰撞诱导的裂解，以产生一个或多个碎片离子，每个碎片离子都可以通过测量来定量，例如，测量与每个碎片相关的离子电流，以产生为质量(m/z)的函数的离子电流峰值。可以测量碎片的积分峰面积以定量衍生其母离子及其一个或多个碎片离子的化学种类。在用于本文的分析目标的测量中，一个或多个碎片衍生自释放的分析目标的母体离子。

任何MS/MS方法都可以用于本文中分析目标的定量，但是更通常应用采用三重四极或四极离子阱的方法。在本文的方法中使用的质谱仪可以被操作以监测样品的整个质谱，或更典型地监测感兴趣的样品的所选部分。特别是在MS/MS方法中，可以监测来自选定母体离子的一个或多个碎片离子的信号(例如离子流)。可以使用选定的反应监视(SRM)操作，其中监视从选定的母体离子生成的单个碎片离子。或者，可以使用多反应监测(MRM)操作，其中监测从选定母体离子产生的一个以上碎片离子。术语碎片离子的使用涉及在MS/MS中通过选定离子的解离或分裂产生的离子。应当理解，方法是本领域已知的，并且用于定量分析物，其包括使选定的母体离子反应以更一般地产生包括碎片离子的产物离子以及不是碎片离子的其他产物离子。可以在本文的方法中类似地使用产生所有此类产物离子的MS/MS方法。

在一些实施方案中，使用适合用于定量各种样品中的分析目标的液相色谱法。

在一些实施方案中，该方法包括使用标准曲线(校准曲线)作为外标以及结合使用标准曲线和添加内标来通过MS、LC-MS和LC-MS/MS方法定量分析物。在一些实施方案中，标准曲线可用于确定多种样品中的分析物浓度，包括本文所述的生物样品。具体地，来自内标的分析物的量可以用于确定来自LDC的分析物的量。在特定的实施方案中，来自内标的分析物的量用于产生标准曲线，用于确定来自LDC的分析物的量。在这些实施方案中，可以通过标记来区分来自内标的分析物和来自LDC的分析物。

浓度测定

在一些实施方案中，方法进一步包括确定样品中LDC的浓度的步骤。本发明还提供一种用于确定样品中与LDC中的配体偶联的药物浓度的方法。

定量分析优选地包括在测定内的校准。例如，可以通过制备一系列至少6个LDC浓度增加的样品来生成标准曲线。将内标添加到标准曲线样品中，然后通过上述蛋白质A和LC-MS/MS方法进行处理。将每种标准物的峰面积除以从内标获得的峰面积，然后将所得峰面积比绘制为标准物浓度的函数。在一些实施方案中，使用例如线性回归分析将至少6个数据点拟合到曲线。

稳定性测定

在一些实施方案中，该方法用于确定LDC的稳定性。

在示例性测定中，将LDC置于无菌血浆中并在37℃下孵育。在孵育开始时以及在从1小时到1周或更长时间的不同时间点，将等分试样取出并在-80℃冷冻。在这些时间点结束后，对样品进行蛋白质纯化方法，该方法将特异性地提取配体和偶联的药物。例如，可以使抗体-药物偶联物通过蛋白A亲和树脂以捕获抗体，然后用缓冲液洗涤该树脂。捕获配体-药物偶联物后，通过用1-30％(v/v)三氟乙酸处理将药物从捕获的配体中释放出来。然后可以通过标准LC-MS方法对释放的药物进行定量，每个时间点测得的药物量除以孵育前等分试样所测得的药物量可以用来确定在每个时间点与配体偶联的药物残留百分比。可以通过包括内标配体-药物偶联物来提高此测定法的准确性，该内标配体-药物偶联物是使用相同药物-接头的同位素标记形式制备的，因此从其释放的药物可以在LC-MS测定中独立于测试药物-接头释放的药物通过其质量差异进行检测。该同位素标记的内标配体-药物偶联物应在配体捕获步骤(例如蛋白A)之前等量添加到每个样品中。然后，使用内标通过常规液相色谱-质谱(LC-MS/MS)技术对从测试LDC释放的药物或部分药物进行定量。用于药代动力学测定的质谱技术是本领域已知的。(参加例如Want等人,Spectroscopy 17：681-691(2003)；Okeley等人,Clin Cancer Res.16：888-897(2010)；Singh等人,DMD(2017)；Alley等人,Bioconjugate Chem.19：759-765(2008).)。

在其他实施方案中，将LDC施用给受试者，并且在施用LDC后的不同时间点从受试者获得样品。使多个样品经受本文提供的用于测量来自LDC的分析目标的方法。在一些实施方案中，将内标与LDC一起施用。可以比较样品中LDC的量，并用于确定LDC随时间的稳定性。

在一些实施方案中，将LDC离体添加至样品。在加入LDC后的多个时间点后收集样品。使多个样品经受本文提供的用于测量来自LDC的分析目标的方法。在一些实施方案中，将内标与LDC一起添加至样品。样品中的LDC的量可以进行比较，并且用于确定随时间的LDC离体的稳定性。

其他测定

本文提供的方法可用于确定每个配体的平均药物数量。例如，可以通过将通过本文所述的方法获得的配体偶联的药物的浓度除以配体的浓度来测量每个配体的平均药物数量。

在其他实施方案中，本文所述的酸介导的裂解方法和相关的分析方法可以用于各种实验中，这些实验依赖于确定样品中LDC的量或确定偶联至LDC的药物的量。在开发用于治疗疾病或病症的临床药剂的情况下，本文的方法可以例如用于确定药物从LDC的释放动力学。本文的方法还可用于研究LDC的药代动力学。本文的方法可用于评估LDC在临床应用中的使用。

试剂盒

在另一方面，提供了一种用于测量样品中的LDC或用于测量偶联至LDC的药物的量的试剂盒。试剂盒包含一种或多种化学成分，通常包括一种以上化学成分，其可用于进行本文所述的测定。在试剂盒中，通常以选定的量在包装在一起的单独容器中提供不同的化学成分，并可选地包括进行测定的说明。给定试剂盒中化学成分的量通常以选定的量提供，以对每个试剂盒进行选定数量的测定。例如，每个试剂盒可以设计成进行一种测定，因此提供有足够量的化学种类以进行给定测定中的所有步骤。试剂盒还可选地提供进行测定所需的试剂或溶剂。试剂盒可提供例如用于从样品中提取给定的LDC或一类LDC的试剂。在一个实施方案中，本文的试剂盒包含用于任何给定的LDC，包括任何ADC的适当标记的内标。试剂盒的内标可以是同位素标记的LDC，其中标记位于药物中。这种试剂盒可能还包含未标记的LDC，用于制备标准曲线。

在另一个实施方案中，试剂盒包含这样的试剂，该试剂包含标记的接头-药物组合，该组合包含反应性基团，用于将接头和药物偶联至任何选定的配体，包括任何选定的抗体。更具体地，该试剂在药物或其一部分中被标记，使得在释放分析目标时，标记物与分析目标一起释放。试剂盒任选地进一步包含用于与选定的配体或抗体偶联的试剂或溶剂。试剂盒也可能包含未标记的接头-药物试剂，用于制备未标记的LDC。试剂盒可进一步包含未标记或标记的分析目标，例如药物或通过酸处理释放的部分药物。在一个具体的实施方案中，试剂盒包含同位素标记的mc-MMAF或同位素标记的DPR-PEG-葡萄糖-氨基甲酸酯-MMAE，以偶联至任何选择的配体或抗体，以用作测量L-mc-MMAF或L-DPR-PEG-葡萄糖-氨基甲酸酯-MMAE的内标。这类试剂盒可用作开发适合临床用途的LDC的研究辅助工具。这样的试剂盒也可以用于需要监测患者中LDC或LDC药物负荷的临床应用中。

在一些实施方案中，试剂盒可包括在分开包装中的用于偶联接头-药物组合和配体的一对试剂，以及单个偶联反应所需的试剂。试剂盒可以任选地包括用于进行反应的溶剂或缓冲液和使用说明。配体和药物-接头的偶联方法是本领域已知的。(参见例如Lyon等人，Methods in Enzymology，第52卷，第123-138页，2012；Sun等人，BioconjugateChem.16：1282-1290,2005.)版，内标和试剂用稳定或不稳定的同位素进行标记。稳定同位素包括但不限于²H、¹³C和¹⁵N。放射性或不稳定同位素包括但不限于³H、¹⁴C和¹²N。

或者，可以通过赋予不同分子量但未进行同位素标记的结构修饰将内标与LDC区别开。例如，内标可以在分析目标的位置上包含甲基或卤素而不是氢。实际上，这将改变分子量，但不会显著改变内标与TFA的反应方式。如本领域中所理解的，必须评估用于给定分析物的任何内标，以确保其在给定分析方法中表现为被分析物。

实施例

通过说明而非限制的方式提供以下实施例。

实施例1：测定方法

准备实验样品、校准品和内标(IS)

1.在样品基质(例如缓冲液、血浆等)中制备ADC校准品的稀释液，抗体-药物偶联(ADC)的浓度如下：

a.8点校准曲线：10μM、4μM、1.6μM、640nM、256nM、102.4nM、41nM、16.4nM ADC当量

b.包含空白(无ADC，仅样品基质)。

2.以500nM ADC当量的单一浓度在样品基质中制备ADC内标(“IS”)的稀释液。

3.将固定体积的ADC IS与固定体积的每个校准品或未知样品混合，最终体积在250μl-1000μl之间。

ADC校准品和IS的标称浓度(在步骤1和2中)以及将IS与ADC校准品和样品混合后的最终体积(在步骤3中)随实验而变化；这些值还取决于所分析的ADC；该方法可适用于广泛的应用。

准备96孔滤板

蛋白A琼脂糖MabSelect(GE Healthcare)在缓冲液(PBS，pH 7.4)中以1份琼脂糖树脂与3份缓冲液的浆料比率进行平衡。

将800μl的浆液(200μl树脂)添加至滤板，并在4℃下以1250x g离心5分钟以去除水相。

从此点开始，对于每个离心步骤，使用96孔聚丙烯2ml稀释块收集流经的缓冲液、样品和校准品，洗涤和洗脱体积。

样品采集和洗脱

1.将200μl ADC校准物(+IS)和实验样品(+IS)添加到200μl蛋白A树脂中并振摇(1h，4℃，约1000rpm)。

2.将板在4℃以2000x g离心5分钟以去除样品基质。

3.加入洗涤缓冲液(1X PBS，pH 7.4；200-400μl)，并在4℃下以2000x g离心5分钟，以完全去除样品基质。

4.在洗脱之前将洗涤步骤进行1-3次。

5.为了从树脂上洗脱ADC，加入200μl IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific)，并将板置于振荡器上(1h，4℃，约1000rpm)。

6.将板在4℃下以2000x g离心5分钟以洗脱ADC/IS。

7.重复步骤4和5，以完成从树脂中洗脱ADC/IS的操作。洗脱的ADC/IS的最终总体积为400μl。

样品处理

1.将ADC/IS校准物和样品(在IgG洗脱缓冲液中)在N₂气中于60℃蒸发4小时或直至板干燥。

2.加入400μl的10％三氟乙酸(TFA)(v/v)(在水中稀释)，并用涂有Teflon^TM的有机硅板垫密封板。

3.将密封的板置于带夹套的Thermomixer中并孵育过夜(在70℃约16h；约600-800rpm)。

4.将该板在4℃以2000x g离心5分钟以使冷凝脱离。

5.将ADC/IS校准物和样品(在10％TFA中，v/v计)在N₂气体下于40℃蒸发4小时或直至板干燥。

6.加入500μl冰冷的100％MeOH，将板用板密封器覆盖，并置于振荡器上(20min，4℃，约1000rpm)。

7.将板在4℃以4000x g离心5分钟以沉淀碎屑。

8.将500μl体积中的400μl转移到自动进样板中。

9.将ADC/IS校准物和样品(在100％MeOH中)在40℃的N₂气体下蒸发，直到板干燥。

10.将样品在0.1％甲酸(FA)中的1000μl 95/5CH₃CN(乙腈，CAN)/H₂O中或0.1％FA中的20％乙腈中复溶。该步骤取决于所用色谱的类型。

样品分析

1.对LC柱和质谱仪进行平衡。

2.将20μL的复溶样品注入LC中。

3.使用LC柱，其为释放的分析目标提供适当的色谱，其直接与质谱仪联接，使用多反应监测(MRM)操作方法监测分析目标和内标碎片离子。

4.将分析目标的峰面积除以内标分析目标获得的峰面积。将得到的分析目标/IS峰面积比绘制为分析目标校准物浓度(ng/ml)的函数，并使用线性回归将点拟合到曲线。使用由标准曲线确定的直线方程式，量化从样品测得的响应率。

以下分析专门针对从与DPR-PEG-葡萄糖-氨基甲酸酯-MMAE偶联的抗体中释放作为分析目标的MMAE。

1.液相色谱仪配备有联接到串联质谱仪(这两者被平衡)的50x3.0mm 5μm硅胶柱(BETASIL^TM，ThermoFisher Scientific)。

2.注入20μl的复溶样品

3.使用流动相A(在H₂O中为0.1％甲酸)和流动相B(在ACN中为0.1％甲酸)的以下梯度(表1)，预期的MMAE(分析目标)保留时间为1.16分钟。

4.使用多反应监测(MRM)。LC-MS/MS测定法测定MMAE浓度，该测定法选择性监测718m/z至686m/z(MMAE的前体和碎片离子)和726m/z至694m/z(d8-MMAE的前体和碎片离子)的跃迁。

5.将每个MMAE标准物的峰面积除以内标d8-MMAE的峰面积。将所得的MMAE/d8-MMAE峰面积比绘制为MMAE标准物浓度(ng/ml)的函数，并使用线性回归将这些点拟合为曲线。使用由标准曲线确定的直线方程式，量化从样品测得的响应率。对于MMAE测量，获得LC-MS/MS数据并使用可从LC-MS/MS仪器制造商获得的操作和数据分析软件(

和Multiquant^TM 2.1版本,AB SCIEX)进行处理。

实施例2：抗体-药物偶联物的离体稳定性

使用酸催化水解方法评估了两个ADC的离体稳定性。ADC1和ADC2是与mcMMAF偶联的抗体，mcMMAF是一种有效的抗有丝分裂和抗微管蛋白澳瑞他汀衍生物(单甲基澳瑞他汀F)，它使用马来酰亚胺基己酰基接头(mc)。

药物的马来酰亚胺接头通常表示为：

mc接头是上述接头，其中n为5。mcMMAF是上述物质，其中n为5，药物是MMAF。

mcMMAF接头-药物组合不能被酶裂解。

原料：

·ADC1-PBS中的7.1mg/mL(4.3药物/mAb；203.5uM mcMMAF当量)

·IS1-PBS中的4.4mg/mL(4.0药物/mAb；117.3uM标记的mcMMAF当量)

·ADC2–PBS中5.5mg/mL(4.1药物/mAb；150.3uM mcMMAF当量)

·IS2-PBS中9.0mg/mL(3.8药物/mAb；228.0uM标记的mcMMAF当量)

将4ml Na⁺柠檬酸化Sprague-Dawley大鼠血浆掺入ADC1或ADC2，浓度为250μg/ml。1ml的掺入的血浆用于生成标准曲线。标准曲线样品包括ADC1或ADC2的系列稀释液。

在0小时、6小时、1天、2天、4天和7天的时间点从剩余的3ml掺入的血浆中取出450μl。准备了ADC1(IS1)和ADC2(IS2)的内标。每个内标包括¹³C标记的药物(特别是MMAF的苯环被6个¹³C标记)，使质量增加了6amu。将内标稀释至柠檬酸化大鼠血浆中的10μM药物-接头当量([5X]浓度)。

制备96孔样品/标准预平板。将200μl每个ADC样品和每个标准曲线样品混合3次，并通过反向移液将其预接种到96孔、350μl/孔板中。将50μl内标添加到ADC样品和标准曲线样品中。将每个板样品混合3-5次。

制备96孔滤板。洗涤蛋白A琼脂糖并在pH 7.4的PBS中以1份树脂与3份缓冲液的浆液比率(在800μl浆液中有200μl树脂床)进行平衡。将800μl蛋白A琼脂糖浆液添加到96孔滤板上的适当位置。将板在4℃下以1250x g离心5分钟以去除水相。

将200μl每个ADC样品和标准曲线样品混合3次，然后通过反向移液将其转移到滤板上的适当位置。

将板固定在4℃下以750-1000rpm设置的滴定板振荡器上1小时。

通过在4℃下以2000x g离心5分钟，将来自96孔滤板的流经级分回收到96孔、2ml收集板中。

各树脂床用200μl洗涤缓冲液(40mM KPO₄,20mM EDTA)洗涤一次。通过在4℃下以2000x g离心5分钟来回收洗涤级分并静置。

ADC洗脱。将200μl IgG洗脱缓冲液添加到每个树脂床中，并将板在室温下以约1000rpm在Thermomixer上放置5分钟。通过在4℃下以2000x g离心5分钟将洗脱液回收到2ml收集板中。将另外的200μl洗脱缓冲液添加到每个树脂床中，并将板在室温下以约1000rpm在Thermomixer上放置5分钟。通过在4℃下以2000x g离心5分钟将洗脱液回收到2ml收集板中。最终洗脱体积为400μl。

洗脱液在60℃的N₂气下蒸发3-4小时。

蒸发后，向每个孔中加入400μl 10％v/v三氟乙酸(TFA)(用水稀释)。使用特氟隆涂层的硅树脂板垫密封96孔板。将该板置于带夹套的Thermomixer中，并在70℃以约850rpm孵育过夜(约16h)。

对96孔板进行硬旋转(4000x g，5分钟)以沉淀蛋白质沉淀物。回收300μl，并转移到新的96孔、2ml收集板上。将板在40℃下在N₂气体下蒸发2-3小时。

将每个样品重悬于300μl的33％CH₃CN(乙腈)/0.1％v/v甲酸中溶解，并以约1000rpm涡旋3分钟。

将板以500x g旋转5分钟，然后将200μl的每种样品转移至带有硅烷化玻璃插入物的HPLC小瓶中。

通过四极飞行时间(Q-TOF)质谱仪分析了25μl每个样品。

处理所有时间点和相应的标准曲线，并确定释放的MMAF的浓度。结果示于图1。

实施例3：临床样品分析

分析了接受ADC3治疗的患者的临床样品。ADC3是mcMMAF偶联抗体。

原料：

·ADC3-PBS中的15mg/mL，4药物/mAb

·IS3-PBS中4.59mg/mL(3.6药物/mAb；110.2μM mcMMAF当量)

将ADC3标准曲线样品稀释到K2EDTA人血浆中。内标(稀释至50μM ADC当量)也被稀释到K2 EDTA人血浆中，每个样品/标准品允许100μl。

制备96孔样品/标准预平板。将每种样品和标准曲线样品100μl混合并预铺到96孔中。然后将200μl内标添加到每个样品/标准曲线样品中。将500μl的PBS-T加入到每个孔中。

制备96孔滤板。洗涤蛋白A琼脂糖并在pH 7.4的PBS中以1份树脂与3份缓冲液的浆液比率(在800μl浆液中有200μl树脂床)进行平衡并在使用前作为储备溶液在4℃下储存。将800μl琼脂糖浆浆液体积(200μl树脂床)添加到96孔滤板上的适当位置。将板在4℃下以1250x g离心5分钟以去除水相。

将每种样品/标准曲线样品/PBS-T 700μl混合3次，然后通过反向移液转移到滤板上的适当位置。

将板固定在4℃下以750-1000rpm设置的滴定板振荡器上1小时。

通过在4℃下以2000x g离心5分钟，将来自96孔滤板的流经级分回收到96孔、2ml收集板中。

每个树脂床用200μl的PBS洗涤一次。通过在4℃下以2000x g离心5分钟来回收洗涤级分并静置。

ADC洗脱。将200μl IgG洗脱缓冲液添加到每个树脂床中，并将板在4℃下以约1000rpm在Thermomixer上放置5分钟。

通过在4℃下以2000x g离心5分钟将洗脱液回收到2ml收集板中。将另外的200μlIgG洗脱缓冲液添加到每个树脂床中，并将板在4℃下以约1000rpm在Thermomixer上放置5分钟。通过在4℃下以2000x g离心5分钟将洗脱液回收到2ml收集板中。最终洗脱体积为400μL。

向每个孔中加入40μl 100％TFA，得到10％v/v TFA，以释放四肽分析目标。使用涂有Teflon^TM的硅树脂板垫密封96孔板。将该板置于带夹套的Thermomixer中，并在70℃在约850rpm的化学通风橱中孵育过夜。

对96孔板进行硬旋转(4000x g，5分钟)以沉淀蛋白质沉淀物。回收300μl，并转移到新的96孔、2ml收集板上。将板在40℃下在N₂气体下蒸发2-3小时。

将每个样品重悬于100μl 2％乙腈+0.1％甲酸中溶解，并以约1000rpm涡旋3分钟。

使用LC-MS/MS分析样品中的分析目标。使用ELISA测定法测量样品中抗体的量。结果示于图2，标绘为每种抗体的药物。

实施例4：抗体-药物偶联物(分析物碎片)的体内稳定性

在以10mg/kg或20mg/kg的ADC4治疗的大鼠中分析了ADC4的稳定性。ADC4是聚乙二醇化的单甲基澳瑞他汀E(DPR-PEG-葡萄糖-氨基甲酸酯-MMAE)偶联的抗体。所述MMAE接头是聚乙二醇化，并包含二氨基丙酸和由β葡萄糖醛酸酶可裂解的β-葡萄糖醛酸苷，参见以下结构。酸释放产物是MMAE(分析目标)。

mal-peg-氨基甲酸酯-MMAE具有以下结构：

据信，接头的碳酸酯与MMAE的偶联以形成氨基甲酸酯有助于TFA处理时整个MMAE药物的裂解。

原料：

·PBS中的5.4mg/mL ADC4(36.0uM ADC)(7.93药物/mAb；285.5MMAE当量)

·PBS中7.03mg/mL的IS4(46.9uM ADC)(7.93药物/mAb；371.9uM d8-MMAE当量)

用ADC4和内标掺入K2EDTA大鼠血浆。内标包括²H标记的MMAE，使质量增加了8Da。还制备了MMAE标准曲线样品。

制备了预平板(参见实施例1)。

制备96孔滤板。洗涤蛋白A琼脂糖并在pH 7.4的PBS中以1份树脂与3份缓冲液的浆液比率(在800μl浆液中有200μl树脂床)进行平衡。将800μl琼脂糖浆浆液体积(200μl树脂床)添加到96孔滤板上的适当位置。将板在4℃下以1250x g离心5分钟以去除水相。

将来自预平板的每种标准物200μl混合3次，然后转移到滤板上的适当位置。

将板固定在4℃下以约900rpm设置的滴定板振荡器上1小时。

通过在4℃下以2000x g离心5分钟，将来自96孔滤板的流经级分回收到96孔、2ml收集板中。

每个树脂床用400μl 1X PBS，pH 7.4洗涤两次。通过在4℃下以2000x g离心5分钟来回收洗涤级分并静置。

ADC洗脱。将200μl IgG洗脱缓冲液添加到每个树脂床中，并将该板在室温下以约900rpm在滴定板混合器上放置5分钟。

通过在4℃下以2000x g离心5分钟将洗脱液回收到2ml收集板中。将另外的200μlIgG洗脱缓冲液添加到每个树脂床中，并将该板在室温下以约900rpm在滴定板混合器上放置5分钟。通过在4℃下以2000x g离心5分钟将洗脱液回收到2ml收集板中。最终洗脱体积为400μL。

将样品在60℃的N₂气体下蒸发3-4小时。

蒸发后，向每个孔中加入400μl 10％TFA(在H₂O中稀释)。使用特氟隆涂层的硅树脂板垫密封96孔板。将该板置于带夹套的Thermomixer中，并在70℃以约650rpm孵育过夜(约16小时)。

将96孔板以2000x g离心5分钟，以从孔的侧面旋转冷凝液。将板在40℃下在N₂气体下蒸发约4小时。

蒸发后，将500μl冰冷的MeOH添加到每个孔中。用板密封器覆盖板，并在4℃下在滴定板振荡器上放置20分钟。

将板进行硬旋转(4000x g，5分钟)。将400μl(总体积为500μl)转移到自动进样器板上。

将自动进样器板在40℃的N₂气体下蒸发至干。将样品在0.1％FA中的1000μl 95/5乙腈/H₂O中复溶。

使用LC-MS/MS分析样品。结果示于图3。

实施例5：开发具有增强的稳定性的抗体-药物偶联物

产生了一组工程化的半胱氨酸抗体(S239C、E269C、K326C和A327C)，其可以与有效的细胞毒性剂进行位点特异性偶联，并通过本文提供的方法测试了它们的稳定性。在实验中，确定了具有接近100％稳定性的均质2负荷ADC。此外，观察到ADC的稳定性与通过HIC测量的表观疏水性相关，这表明化学螯合是在没有催化硫代琥珀酰亚胺水解的情况下提供稳定性的另一种方法。

结构分析和分子建模

分析中使用完整抗体和与Fcγ受体3结合的人Fc区(分别为登录号1HZH和1E4K)的蛋白质数据库文件。Pymol(Schrodinger,2010)用于产生分子结构模型，如在图4A中提供。使用结合到Fcγ受体3(登录号1HZH)人Fc区作为模板，在计算机(in silico)中将选择的残基(K326、S239、E269和A327)转化成半胱氨酸，使用GETAREA计算新残基的溶剂可及性(Fraczkiewicz和Braun,1998)。四个残基的溶剂可及性在图4B中给出，显示位点之间的差异高达5倍。此外，静电计算针对工程化的半胱氨酸抗体(S239C、E269C、K326C和A327C)使用APBS(Baker等人,2001)进行并且在图4C呈现。

偶联物制备

将用附加重链半胱氨酸残基(S239C、E269C、K326C和A327C)工程化的人源化抗CD70(h1F6)(McEarchern等人,2008)偶联到不可裂解的澳瑞他汀，马来酰亚胺己酰基单甲基澳瑞他汀F(mcMMAF)，和蛋白酶可裂解的吡咯并苯并二单杂卓，或山卓霉素(sandramycin)(Biomar)药物接头，这按照先前描述的方案(Jeffrey等人,2013)。简而言之，通过添加10当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)和1mM EDTA并用1M Tris缓冲液(pH 9.0)将pH值调节至7.4，可以完全还原抗体。在37℃下孵育1小时后，将反应冷却至22℃，并加入30当量的脱氢抗坏血酸。用1M Tris-HCl缓冲液(pH 3.7)将pH调节至pH 6.5，并使氧化反应在22℃下进行1小时。这导致天然二硫键的重整，但是使工程化的重链半胱氨酸处于还原状态并且可用于偶联。然后通过添加1M Tris缓冲液(pH 9.0)将溶液的pH再次升高至pH 7.4。然后通过加入2.5当量的药物-接头进行偶联，并使反应在22℃下进行30分钟。使用一次性PD-10柱(GE Healthcare)通过凝胶过滤色谱法纯化得到的偶联物。通过用二硫苏糖醇还原ADC，然后在PLRP色谱柱上进行HPLC分析，以及重链和轻链组分的结合，确定载药量和药物连接位点(Sun等人,2005)。聚集程度通过尺寸排阻色谱法确定。使用HPLC和质谱法以及如本公开中所述方法对完整的ADC进行分析证实了ADC的均匀群体，如预期的，每mAb具有约2种药物(图5)；相反，在这些条件下，野生型mAb不并入任何药物-接头。

EC位点偶联确认

将野生型(WT Fc)、工程化的半胱氨酸抗体(S239C)和偶联的ADC(S239C+药物)用内蛋白酶Glu-C(Sigma-Aldrich)进行蛋白酶处理。用Glu-C消化导致在位置233处铰链半胱氨酸的C末端切割的Fc片段的释放。对该Fc片段的质谱分析表明，当消化野生型ADC时，得到的Fc片段的质量为24,054Da(图5，上图)，没有任何偶联迹象，与所有偶联位点都在位置233的N端侧一致。消化S239C抗体产生的Fc片段具有质量上额外的16Da，总计24,070Da，对应于丝氨酸和半胱氨酸之间的质量差异(图5，中图)。消化S239C纯2负荷的ADC得到的Fc片段具有质量上额外的942Da，总质量为24,995Da，对应于不同质量的丝氨酸和半胱氨酸以及药物接头的添加(图5，下图)。质谱(图5)表明仅突变Fc区掺入了药物接头，并且引入的半胱氨酸(S239C)是新的偶联位点。所有工程化的半胱氨酸抗体(E269C、K326C和A327C)均观察到相似的结果，以及相应Fab的质谱分析表明，所有内源性半胱氨酸均以二硫键形式存在，并且未与药物接头偶联(数据未显示)。

离体马来酰亚胺的稳定性

通过与蛋白A树脂(ProSepA，Millipore)孵育从大鼠血浆(Bioreclamation IVT)中去除IgG，在4℃下旋转过夜，然后过滤以去除树脂(Ultrafree-MC Centrifugal Filter，Millipore)。将ADC加到IgG耗尽的血浆(0.25mg/mL)中。立即移出等分试样(200μL)(t＝0d)，并将其余样品在37℃下孵育7天。在相关的时间点，提取并消化测试物品和内标。使用固相萃取纯化对应于MMAF的N端氨基酸的四肽产物(Val-Dil-Dap-Phe)，并通过四极杆飞行时间(QTOF)质谱参照标准物进行定量。采用本公开的方法从ADC释放四肽并定量释放的量。

我们发现马来酰亚胺经受药物偶联物的逆迈克尔损失的倾向(图7A)取决于偶联的位点，其中野生型4药物负荷的ADC是最易感的，并且七天内损失了约40％的其载药量。相比之下，S239C最为稳定，相同期间损失不到10％。A327C、E269C和K326C显示出中等水平的药物损失，分别为21％、28％和26％(图7B)。

离体马来酰亚胺水解

通过与蛋白A树脂(ProSepA，Millipore)孵育从大鼠血浆(Bioreclamation IVT)中去除IgG，在4℃下旋转过夜，然后过滤以去除树脂(Ultrafree-MC Centrifugal Filter，Millipore)。将ADC加到IgG耗尽的血浆(0.25mg/mL)中。立即移出等分试样(500μL)(t＝0d)，并将其余样品在37℃下孵育7天。每个样品(500μL)与300μL ProSepA树脂一起旋转以捕获ADC(50％PBS浆液，4℃过夜)，然后通过Ultrafree-MC旋转杯过滤(1分钟，11,000x g)。树脂结合的ADC用PBS(3x 500μL)洗涤并用300μL IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific)洗脱到30μL 1M Tris pH 8中。每种洗脱液(100μL)的样品在室温下分别用1μL PNGase F(500U/μL，New England Biolabs)和5μL LysC(0.1μg/μL，Promega)处理30分钟，然后37℃处理25分钟，然后加入100mM二硫苏糖醇(10μL)，并在37℃下进一步孵育15分钟。使用LC-MS通过PLRP-S色谱和电喷雾电离QTOF质谱法检查样品。使用MassLynx 4.0中的MaxEnt1函数对数据进行解卷积。去糖基化的HC Fc加mcMMAF和去糖基化的HC Fc加mcMMAF加水的峰高用于计算水解药物接头的百分比。

孵育前的样品显示，所有突变型ADC的马来酰亚胺水解量均恒定(约15％)，表明质量增加了约20Da。孵育后样品的附加开环水平差异很大：S239C、A327C、E269C和K327C分别为7％、9％、61％和65％(表3)。该结果表示在抗逆迈克尔消除的稳定性与通过药物接头的化学微环境提高水解速率之间的几乎完美的逆相关性。

偶联位点的生物物理表征

为了研究这些不同的水解速率和硫代琥珀酰亚胺键的稳定化的起因，我们研究了工程化偶联位点的几个不同属性：1)偶联位点周围的静电环境(图4C)；2)工程化的半胱氨酸的计算的溶剂可及性(图4B)；和3)每个工程化ADC的表观疏水性(表3)。

局部带电荷的残基可能促进或阻止质子的提取，并导致马来酰亚胺偶联物的稳定或消除。因此，我们通过静电势分析了工程化Fc结构域模型的溶剂可及表面。目视检查偶联位点周围的这些电势，未发现可促进K326C和E269C ADC中的开环的可电离残基的一致放置。实际上，这些引入的半胱氨酸分别在碱性和酸性环境中，并且在稳定性或对水解的敏感性方面没有表现出差异。我们也没有找到可以稳定S239C和A327C的带电荷残基，它们也分别在碱性和酸性环境中。

偶联物水解要求溶剂分子可接近硫代琥珀酰亚胺的羰基原子。在位置239处偶联的马来酰亚胺有可能被简单地与溶剂屏蔽并且不能参与这种反应。为了确定溶剂对偶联位点的可及性是否预测了硫代琥珀酰亚胺水解的倾向，我们计算了计算机生成的模型的Connolly表面。我们发现暴露的表面积和水解速率之间没有相关性(图4B)。但是，当使用疏水相互作用色谱法(HIC)时，发现偶联物的保留时间与药物-接头的稳定性之间存在相关性。该分析表明，稳定性最差且水解最快的工程化ADC(E269C和K326C)也表现出最大的表观疏水性。

竞争结合

在冰上的96孔V型板的每个孔中，等分PBS中的1x 10⁵个抗原表达细胞(786-0)。将细胞与600nM AlexaFluor-647标记的野生型m1F6和浓度增加(从0.19nM到600nM)的未标记突变体或野生型ADC孵育1小时。沉淀细胞并用PBS洗涤3次。然后将细胞沉淀并重悬于125μLPBS/BSA中。通过流式细胞术分析荧光，使用饱和荧光信号的百分比确定结合的标记抗体的百分比，然后通过将数据拟合到具有可变斜率的S形剂量响应曲线来外推EC₅₀。

竞争抗体降低荧光信号50％的浓度在表2中报告为IC₅₀。在测量误差内，野生型和半胱氨酸突变体是相同的，表明半胱氨酸取代和随后的偶联对ADC对目标的结合没有影响。除了测量该ADC集合的相对亲和力外，我们还检查了它们对抗原表达细胞的细胞毒性作用，表2。令人惊讶的是，尽管突变ADC的标称药物剂量仅为野生型ADC的一半的事实，但当用CD70阳性细胞孵育时所有突变ADC都具有与野生型ADC相似的效力。

表2图例：为了定量相对结合亲和力，用增加浓度的未标记突变体或亲代抗体滴定固定浓度的荧光标记的亲本抗体，并将其应用于抗原表达细胞。竞争抗体降低荧光信号50％的浓度报告为IC₅₀。为了评估体外活性，将递增浓度的ADC应用于抗原表达细胞。给出一半最大响应的ADC浓度报告为EC₅₀。

体外细胞毒性活性测定

786-0细胞从美国典型培养物保藏中心获得，并在制造商推荐的培养条件下繁殖。将细胞在每孔150μL生长培养基中铺板到黑色的透明底96孔板(Costar，Corning)中。24小时后，将药物储备液以5倍系列稀释液进行滴定，产生8点剂量曲线，并以每孔50μl添加，一式两份。然后将细胞在37℃、5％CO₂下孵育96小时。通过与100μL Cell Titer Glo(Promega)溶液孵育0.5小时来测量细胞毒性，然后在EnVision Xcite读板仪(PerkinElmer)上测量发光。用Excel(Microsoft)和GraphPad(Prism)处理数据以生成剂量响应曲线，并生成IC₅₀值并收集数据。

体内活性研究

为了建立786-O模型，将5x10⁶个细胞植入无胸腺nu/nu雌性供体小鼠(Harlan)的右胁。当供体肿瘤为约500mm³[(L x W²)/2]时，对小鼠实施安乐死，对肿瘤进行无菌切除，并将约0.5x 0.5mm的碎片装入灭菌的13规格套管针中，以植入麻醉小鼠中。当肿瘤达到～100mm³，将小鼠随机分配至治疗组，并通过腹膜内注射在单个时间点给予10mg/kg ADC剂量。每周两次测量肿瘤，并使用公式V＝(L x W²)/2计算体积。当肿瘤达到～1,000mm³时，对动物实施安乐死。使用公式(A x B²)/2计算肿瘤体积，其中A和B分别是最大和第二大垂直肿瘤尺寸。监测小鼠的平均肿瘤体积和重量，并且当肿瘤体积达到1,000mm³时终止小鼠。

在单剂量786-0体内功效模型中(图6)，与未治疗的小鼠相比，所有ADC对肿瘤的生长都有显著影响。但是，突变体之间的性能存在差异。在突变体中，与野生型4负荷ADC类似，2负荷S239C显示出最佳的肿瘤生长抑制作用，将肿瘤生长延迟了约25天。尽管A327C的疗效略低于S239C(使肿瘤生长延迟了10天)，但它的表现优于具有相同活性并且仅使肿瘤生长延迟了约5天的E269C和K326C。

以引用的方式并入

在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文件，出于所有目的通过引用全文并入本文，其程度就好像每个单独的出版物、专利、专利申请或其他文件被单独指出通过引用并入用于所有目的一样。

等效内容

本公开内容尤其提供了大麻素组合物和随行药物组合物。本公开还提供了通过施用大麻素和随行药物组合物治疗神经退行性疾病的方法。尽管已经图示和描述了各种特定的实施方案，但是以上说明不是限制性的。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以做出各种改变。在审阅本说明书时，许多变化将对所属领域的技术人员变得显而易知。

Claims (41)

1.一种分析样品中的配体-药物偶联物(LDC)的方法，包括以下步骤：

a.提供包含LDC的样品，其中所述LDC包含配体和分析目标，其中所述分析目标包含药物分子或其一部分；和

b.使所述样品与浓度为1-30％(v/v)的含水三氟乙酸(TFA)接触，从而诱导所述分析目标从所述LDC释放。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

a.测量从所述LDC释放的所述分析目标的量；和

b.使用释放的分析目标的量确定所述样品中所述药物分子或其部分的浓度。

3.根据权利要求2所述的方法，其中测量从所述LDC释放的所述分析目标的量的步骤包括使所述分析目标经受液相色谱-质谱法(LC-MS)。

4.根据权利要求2所述的方法，其中测量从所述LDC释放的所述分析目标的量的步骤包括使所述分析目标经受液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：

a.测量所述样品中配体的量；和

b.通过使用测得的配体的量确定所述样品中所述药物分子或其部分的浓度。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，进一步包括在使所述样品与含水三氟乙酸(TFA)接触的步骤之前从所述样品收集所述LDC的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其中收集所述LDC的步骤通过亲和色谱、尺寸排阻色谱、硫酸铵沉淀、离子交换色谱、固定金属螯合物色谱或免疫沉淀进行。

8.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其中通过使用所述LDC的标准曲线执行测量从所述LDC释放的所述分析目标的量的步骤。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：

a.向所述样品加入固定量的内标，其中所述内标包含配体和第二分析目标，其中所述第二分析目标是所述LDC的标记的衍生物；

b.使所述样品与浓度为1-30％(v/v)的含水三氟乙酸(TFA)接触，从而诱导所述分析目标从所述LDC释放和第二分析目标从所述内标释放；

c.测量从所述内标释放的第二分析目标的量；和

d.基于从所述内标释放的第二分析目标的量，测量从所述LDC释放的所述分析目标的量。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第二分析目标具有与所述分析目标不同的分子量。

11.根据权利要求9-10中任一项所述的方法，其中所述内标包括所述LDC的同位素标记形式。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述同位素标记是稳定的或不稳定的。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述同位素标记是氘或碳13。

14.根据权利要求9-13中任一项所述的方法，进一步包括在使所述样品与含水三氟乙酸(TFA)接触的步骤之前从所述样品收集所述LDC和所述内标的步骤。

15.根据权利要求14所述的方法，其中收集所述LDC或所述内标的步骤通过亲和色谱、尺寸排阻色谱、硫酸铵沉淀、离子交换色谱、固定金属螯合物色谱或免疫沉淀进行。

16.根据权利要求7或15所述的方法，其中所述配体是抗体或其功能片段，并且通过使所述样品与选自蛋白A树脂、蛋白G树脂和蛋白L树脂的树脂接触，从所述样品中收集所述LDC或所述内标。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中使所述样品与浓度为10％(v/v)的含水三氟乙酸(TFA)接触。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述药物分子是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述药物分子是单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述分析目标包括四肽Val-Dil-Dap-Phe。

21.一种确定配体-药物偶联物(LDC)的稳定性的方法，包括以下步骤：

a.在暴露于所述LDC之后的不同时间点，从单一来源获得第一样品和第二样品；

b.通过权利要求2-20中任一项所述的方法分析第一样品和第二样品中的所述LDC，由此确定第一样品和第二样品中从所述LDC释放的分析目标的量；和

c.通过比较第一样品和第二样品中释放的分析目标的量确定所述LDC的稳定性。

22.根据权利要求21所述的方法，还包括以下步骤：

a.测量第一样品和第二样品中配体的量；和

b.确定在第一样品和第二样品中释放的分析目标和配体的量的比率。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述样品、第一样品或第二样品是衍生自哺乳动物组织或含水哺乳动物流体的生物样品。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述生物样品获自以下之一：血浆、血清、血液、组织、组织活检、粪便和尿液。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物样品从血浆获得。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述血浆用所述LDC处理。

27.根据权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述血浆来自已经用所述LDC治疗的人类受试者。

28.一种用于定量样品中的LDC的方法，包括以下步骤：

a.提供包含所述LDC的样品，其中所述LDC包含分析目标，所述分析目标包含药物分子；

b.向所述样品中添加内标，其中所述内标是所述LDC的标记衍生物，并且包含第二分析目标；

c.从所述样品中提取所述LDC和所述内标；

d.使所述LDC和所述内标与浓度为1-30％(v/v)的含水TFA接触，其中所述TFA从所述LDC释放所述分析目标和从所述内标释放第二分析目标；

e.确定从所述LDC释放的分析目标和从所述内标释放的第二分析目标的量，其中从所述LDC释放的分析目标的量与所述样品中所述LDC的量相关。

29.根据权利要求28所述的方法，其中通过使用从所述内标释放的第二分析目标的量确定从所述LDC释放的分析目标的量，其中从所述LDC释放的分析目标的量和与所述样品中LDC中的抗体偶联的药物分子的浓度相关。

30.根据权利要求28-29中任一项所述的方法，其中通过使用所述LDC的标准曲线确定从所述LDC释放的所述分析目标的量。

31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述药物分子是单甲基澳瑞他汀F(MMAF)或单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。

32.根据权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述分析目标包括MMAF或四肽Val-Dil-Dap-Phe。

33.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述分析目标包括mcMMAF。

34.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述分析目标和第二分析目标包括四肽Val-Dil-Dap-Phe，并且第二分析目标用6个或更多个碳和13或6个或更多个氘进行同位素标记。

35.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述分析目标和所述第二分析目标包括聚乙二醇化的接头DPR-PEG-葡萄糖-氨基甲酸酯-MMAE。

36.根据权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述分析目标和第二分析目标包括MMAE，并且第二分析目标用6个或更多个碳和13或6个或更多个氘进行同位素标记。

37.根据权利要求28-36中任一项所述的方法，其中使所述LDC和所述内标与浓度为10％v/v的含水TFA浓度接触。

38.一种用于确定样品中的LDC的量的试剂盒，其包括：

a.用于所述LDC的内标，其中所述内标是所述LDC的标记衍生物，并包含药物分子；和

b.含水三氟乙酸TFA，其以1-30％(v/v)的选定浓度应用。

39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述内标是同位素标记的。

40.一种用于确定样品中LDC的量的试剂盒，其包括：

a.标记的接头-药物复合物和配体，其中所述标记的接头-药物复合物可以与所述配体偶联，从而形成内标；和

b.含水三氟乙酸TFA，其以1-30％(v/v)的选定浓度应用。

41.根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述内标是同位素标记的。

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