KR20200090195A - 리간드-약물 컨쥬게이트의 분석을 위한 산 매개 검정 - Google Patents

리간드-약물 컨쥬게이트의 분석을 위한 산 매개 검정 Download PDF

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스티븐 씨. 앨리
러셀 샌더슨
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시애틀 지네틱스, 인크.
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Abstract

산-매개 절단을 사용하여 리간드-약물 컨쥬게이트를 분석하는 방법, 및 이러한 방법을 실행하기 위한 키트가 본원에 제공된다. 리간드-약물 컨쥬게이트의 분석 및 개발 방법의 다양한 적용이 추가로 제공된다.

Description

리간드-약물 컨쥬게이트의 분석을 위한 산 매개 검정
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2017년 11월 22일자 출원된 미국 특허 출원 제 62/590,169호를 우선권 주장하며, 상기 문헌의 개시내용은 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
리간드-약물 컨쥬게이트 (ligand-drug conjugate, LDC)는 증가하고 있는 표적 요법에 대한 관심의 초점이다. LDC는 세포독성제, 전형적으로 높은 전신 독성을 갖는 소분자 약물, 및 순환에서 비교적 안정하지만 표적 환경에서 세포독성제를 방출하는 링커를 통해 함께 연결된 조직 또는 세포 특이적 항원 (예를 들어, 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)의 경우 항체)에 대하여 고도로 선택적인 리간드로 구성된다. 항체-약물 컨쥬게이트 (ADC)는, 특히 종양학에서, 차세대 표적 요법으로서 큰 가능성을 가지고 있다. 고도로 강력한 세포독성제를 병든 조직에 전달하기 위해 항체의 면역학적 특이성을 이용하는 것은, 항종양 활성을 개선시키고, 표적외 독성을 제한할 수 있다. 이러한 접근법은 현재 2가지 FDA 승인된 ADC, 즉 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin) 및 아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine)에서 성공적으로 사용되었으며 ([Verma et al., 2012, Younes et al., 2010]), 수많은 전임상 연구 및 임상 시험의 초점이다.
LDC의 약동학적 프로파일, 독성 및 화학적 안정성을 개선시키기 위한 집중적인 연구 노력이 진행되어 왔다. 대부분의 LDC는 가변적으로 약물 로딩된 리간드의 불균질 혼합물이며, 이는 가변수의 약물 또는 약물-링커 분자가 하나의 리간드에 연결될 수 있음을 의미한다. LDC가 생물학적 환경에 위치하게 되면, 약물 또는 약물-링커의 손실과 같은 생물변환이 일어나 추가의 불균질성이 유도될 수 있다. 대부분의 ADC는 아미드 및 티오에테르 화학을 사용하여 강력한 세포독성제를 내인성 리신 및 시스테인 잔기를 통해 항체에 연결하고, 말레이미드-시스테인 컨쥬게이션은 많은 임상 단계 ADC 프로그램에 사용되어 왔지만, 말레이미드는 어느 정도의 컨쥬게이션후 불안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 약물의 표적 특이적 전달을 보장하고, 표적외 독성을 제한하기 위해 약물-항체 연결의 안정성이 개선된 LDC가 필요하다.
이러한 개선된 LDC의 개발은 전형적으로 다수의 생물분석 검정을 필요로 한다. 생물변환, 및 약물 또는 약물-링커 안정성은, 다양한 분석 방법을 사용하여 생물학적 환경에의 노출 후 또는 시간 경과에 따라 리간드에 안정하게 컨쥬게이션된 약물의 농도를 측정함으로써 분석될 수 있다. 이러한 검정은 후속 측정을 위해 약물 또는 이의 일부를 방출하는 수단을 필요로 한다. 이는 효소적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 하지만, 일부 약물 및 약물-링커는 효소에 의해 절단 가능하지 않다. 따라서, 방출된 약물 또는 이의 일부의 검출 및 정량화를 위한 적절한 분석 방법과 함께 사용하기에 적합한, LDC로부터 약물 및 약물-링커를 절단하는 대안적인 수단이 필요하다.
본 개시내용은 샘플에서 LDC를 측정, 분석 및 정량화함으로써, 리간드에 컨쥬게이션된 약물의 양을 결정하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 산, 예를 들어 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)으로의 처리에 의해 LDC로부터 방출될 수 있는 분석 표적을 포함하는 LDC를 사용한다. LDC로부터 방출된 분석 표적의 측정을 기반으로 LDC의 양, 농도 및 안정성을 결정하는 방법을 추가로 제공한다. 본원에 제공된 LDC 분석 방법은 더 우수한 안정성 및 더 적은 독성을 갖는 신규한 LDC의 개발을 위한 필수적인 도구일 수 있다.
보다 구체적으로, 하나의 양태에서, 본 발명은 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법으로서, (a) LDC를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 LDC는 리간드 및 분석 표적을 포함하고, 분석 표적은 약물 분자 또는 이의 일부를 포함하는 단계; 및 (b) 샘플을 1 내지 30% (v/v) 농도의 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시켜, LDC로부터 분석 표적의 방출을 유도하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 방출된 분석 표적의 양을 사용하여 샘플에서 약물 분자 또는 이의 일부의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계는, 분석 표적을 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)에 적용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계는, 분석 표적을 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 적용하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 샘플에서 리간드의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 리간드의 양을 사용하여 샘플에서 약물 분자 또는 이의 일부의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시키는 단계 전에 샘플로부터 LDC를 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LDC를 수집하는 단계는, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피 또는 면역침강법에 의해 수행된다.
일부 구현예에서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계는, LDC의 표준 곡선을 사용하여 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 샘플에 고정된 양의 내부 표준물을 첨가하는 단계로서, 여기서 내부 표준물은 리간드 및 제2 분석 표적을 포함하고, 제2 분석 표적은 LDC의 표지된 유도체인 단계; (b) 샘플을 1 내지 30% (v/v) 농도의 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시켜, LDC로부터 분석 표적의 방출 및 내부 표준물로부터 제2 분석 표적의 방출을 유도하는 단계; (c) 내부 표준물로부터 방출된 제2 분석 표적의 양을 측정하는 단계; 및 (d) 내부 표준물로부터 방출된 제2 분석 표적의 양을 기반으로 LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 분석 표적은 분석 표적과 상이한 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 내부 표준물은 LDC의 동위원소 표지된 버전을 포함한다. 일부 구현예에서, 동위원소 표지는 안정하거나 불안정하다. 일부 구현예에서, 동위원소 표지는 중수소 또는 탄소-13이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시키는 단계 전에 샘플로부터 LDC 및 내부 표준물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LDC 또는 내부 표준물을 수집하는 단계는, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피 또는 면역침강법에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 리간드는 항체 또는 이의 기능성 단편이고, LDC 또는 내부 표준물은 샘플을 단백질 A 수지, 단백질 G 수지 및 단백질 L 수지로부터 선택되는 수지와 접촉시킴으로써 샘플로부터 추출된다.
일부 구현예에서, 샘플은 10% (v/v) 농도의 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉된다.
일부 구현예에서, 약물 분자는 모노메틸 아우리스타틴(monomethyl auristatin) E (MMAE) 또는 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)이다. 일부 구현예에서, 약물 분자는 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)이다.
일부 구현예에서, 분석 표적은 테트라펩티드인 Val-Dil-Dap-Phe를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)의 안정성을 결정하는 방법으로서, (a) LDC에의 노출 후 상이한 시점에서 단일 공급원으로부터 제1 샘플 및 제2 샘플을 수득하는 단계; (b) 본원에 제공된 방법에 의해 제1 샘플 및 제2 샘플에서 LDC를 분석하여, 제1 샘플 및 제2 샘플에서 LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 결정하는 단계; 및 (c) 제1 샘플 및 제2 샘플에서 방출된 분석 표적의 양을 비교하여 LDC의 안정성을 결정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 제1 샘플 및 제2 샘플에서 리간드의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 제1 샘플 및 제2 샘플에서 방출된 분석 표적과 리간드 양의 비를 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 샘플 또는 제2 샘플인 샘플은 포유류 조직 또는 수성 포유류 체액에서 유도된 생물학적 샘플이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈장, 혈청, 혈액, 조직, 조직 생검, 대변 및 소변 중 하나로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈장으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 혈장은 LDC로 처리된 것이다. 일부 구현예에서, 혈장은 LDC로 치료된 인간 대상에서 유래된 것이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법으로서, (a) LDC를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 LDC는 분석 표적을 포함하고, 분석 표적은 약물 분자를 포함하는 단계; (b) 샘플에 내부 표준물을 첨가하는 단계로서, 여기서 내부 표준물은 LDC의 표지된 유도체이며 제2 분석 표적을 포함하는 단계; (c) 샘플로부터 LDC 및 내부 표준물을 추출하는 단계; (d) LDC 및 내부 표준물을 1 내지 30% (v/v) 농도의 수성 TFA와 접촉시키는 단계로서, 여기서 TFA가 LDC로부터 분석 표적을 방출시키고 내부 표준물로부터 제2 분석 표적을 방출시키는 단계; (e) LDC로부터 방출된 분석 표적 및 내부 표준물로부터 방출된 제2 분석 표적의 양을 결정하는 단계로서, 여기서 LDC로부터 방출된 분석 표적의 양이 샘플 내 LDC의 양과 상관관계가 있는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양은 내부 표준물로부터 방출된 제2 분석 표적의 양을 사용하여 결정되고, 여기서 LDC로부터 방출된 분석 표적의 양은 샘플 내 LDC에서 항체에 컨쥬게이션된 약물 분자의 농도와 상관관계가 있다.
일부 구현예에서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양은 LDC의 표준 곡선을 사용하여 결정된다.
일부 구현예에서, 약물 분자는 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) 또는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)이다. 일부 구현예에서, 분석 표적은 MMAF 또는 테트라펩티드인 Val-Dil-Dap-Phe를 포함한다. 일부 구현예에서, 분석 표적은 mcMMAF를 포함한다. 일부 구현예에서, 분석 표적 및 제2 분석 표적은 테트라펩티드인 Val-Dil-Dap-Phe를 포함하고, 제2 분석 표적은 6개 이상의 탄소-13 또는 6개 이상의 중수소로 동위원소 표지된다. 일부 구현예에서, 분석 표적 및 제2 분석 표적은 페길화된 링커인 DPR-PEG-gluc-카르바메이트-MMAE를 포함한다. 일부 구현예에서, 분석 표적 및 제2 분석 표적은 MMAE를 포함하고, 제2 분석 표적은 6개 이상의 탄소-13 또는 6개 이상의 중수소로 동위원소 표지된다.
일부 구현예에서, LDC 및 내부 표준물은 10% v/v 농도의 수성 TFA 농도로 접촉된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 샘플에서 LDC의 양을 결정하기 위한 키트로서, (a) LDC의 표지된 유도체이며 약물 분자를 포함하는, LDC에 대한 내부 표준물; 및 (b) 1 내지 30% (v/v)의 선택된 농도로 적용되는 수성 트리플루오로아세트산 TFA를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 내부 표준물은 동위원소 표지된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 샘플에서 LDC의 양을 결정하기 위한 키트로서, (a) 표지된 링커-약물 복합체가 리간드에 컨쥬게이션되어 내부 표준물을 형성할 수 있는, 표지된 링커-약물 복합체 및 리간드; 및 (b) 1 내지 30% (v/v)의 선택된 농도로 적용되는 수성 트리플루오로아세트산 TFA를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 내부 표준물은 동위원소 표지된다.
도 1은, 2가지 mAb-mcMMAF ADC의 생체외 안정성 프로파일을 제공한다. 시트르산 처리된(citrated) 래트 혈장에 ADC를 접종하고, 샘플을 각 시점에서 분석하였다. ADC를 단백질 A 친화성 수지 상에 포획하고, 10% 수성 TFA를 사용하여 약물을 방출시켰다. 이어서, 방출된 약물을 LC-MS/MS로 정량화하였다. 각 시점은 t0에서 관찰된 컨쥬게이션된 약물의 백분율(%)을 나타낸다.
도 2는, 환자 샘플로부터 ADC에 대한 시간 경과에 따른 약물 로딩의 변화를 예시한다. 3주마다 (q3w) 또는 6주마다 (q6w) mAb-mcMMAF ADC로 치료된 환자의 임상 샘플을 분석하였다. 단백질 A 친화성 포획, 10% TFA 매개 방출 및 LC-MS/MS에 의한 약물 정량화 후, 샘플을 ELISA를 사용하여 항체 농도에 대하여 추가로 분석하였다. TFA 처리는 테트라펩티드인 Val-Dil-Dap-Phe를 방출시켰으며, 이는 LC-MS/MS로 정량화되었다. 결과는 시간 경과에 따른 항체 당 약물로 플롯팅되어 있다.
도 3은, mAb-MMAE ADC의 생체내 안정성 프로파일을 제공한다. 산 방출 생성물 MMAE를 기재된 방법에 따라 분석하고, 시간 경과에 따른 컨쥬게이션된 약물의 양으로 플롯팅하였다.
도 4a는, 항체 CH2 도메인의 힌지(hinge) 영역 근처의 시스테인으로의 전환을 위해 선택된 부위를 갖는 예측된 분자 구조를 나타낸다. Fc와 Fab 사이의 힌지에 근접한 Fc 단편에서 먼저 부위가 확인되었다 (좌측 패널). 이러한 부위는 공결정 구조 1E4K에 도시된 바와 같은 CD16 결합 부위와 일치한다 (중간 패널). Fc, Fab 및 CD16의 상대적 배향은 온전한 항체 결정 구조 1HZH 상에의 CD16의 도킹(docking)으로부터 생성된 모델에서 볼 수 있다 (우측 패널). 도 4b는, 주형으로서 1HZH를 사용하여 계산된 전환 부위의 용매 접근성을 보여준다. 도 4c는, 분자 표면에 투영된 가상 실험으로(in silico) 모델링된 돌연변이체에 대하여 계산된 정전기 전위를 제공한다. 이러한 부위는 조작된 컨쥬게이션 부위 근처의 고도로 산성 또는 염기성인 요소에서 일관된 경향을 나타내지 않았다.
도 5는, 단백질 분해 및 질량 분석법에의 확인된 약물 컨쥬게이션 부위를 예시한다. 야생형 (WT Fc), 조작된 시스테인 항체 (S239C) 및 ADC (S239C + 약물)를 엔도프로테이나아제 GluC로 소화시킨 후 (힌지 디술파이드 결합에 대한C-말단 및 위치 E233에서의 절단 (도 5, 좌측)), 비행 시간(time-of-flight) 질량 분석법을 사용하여 Fc 단편의 후속 분석을 수행하였다. 야생형 ADC가 소화된 경우, 생성된 Fc 단편은 위치 233의 N-말단 측에 있는 모든 컨쥬게이션 부위와 일치하는, 컨쥬게이션의 징후를 나타내지 않는 24,054 Da의 질량을 가졌다 (상단 패널). S239C 항체의 소화는, 세린과 시스테인 사이의 질량 차이에 해당하는 16 Da의 질량이 추가된, 총 24,070 Da을 갖는 Fc 단편을 생성하였다 (중간 패널). S239C 순수 2-로딩된 ADC의 소화는, 세린과 시스테인 사이의 질량 차이 및 약물 링커의 추가에 해당하는 942 Da의 질량이 추가된, 총 24,995 Da을 갖는 Fc 단편을 생성하였다 (하단 패널).
도 6은, 네이키드(naked) 항체인 고유의(native) 4-로딩된 ADC, 및 조작된 시스테인 항체 (K326C, E269C, A327C 및 S239C)의 생체내 활성을 나타낸다. 단일 10 mg/kg 용량 786-0 이종이식편 실험에서 항체의 활성을 시험하였다. 2-로딩된 S239C 조작된 시스테인은 고유의 4-로딩된 ADC와 모든 다른 조작된 시스테인 돌연변이체 ADC를 능가하였다.
도 7a 내지 7b는, 혈장에서 ADC 말레이미드 안정성을 나타내는 데이터를 제공한다. 도 7a는, 단계 1이 항체와 약물 링커를 컨쥬게이션하는데 사용되는 가역적 마이클(Michael) 부가 반응을 나타내는 계략도를 제공한다. 단계 2는 컨쥬게이트를 안정화시키고 약물 링커의 손실을 방지하는 잠재적인 가수분해 반응을 예시한다. 도 7b는, 약물-링커 컨쥬게이트의 시간 경과에 따른 안정성을 나타낸다. 데이터는, 래트 혈장과 함께 ADC를 인큐베이션하는 동안의 역-마이클 반응을 통한 컨쥬게이션된 약물의 손실을 나타낸다. 2-로딩된 S239C 조작된 시스테인이 고유의 4-로딩된 ADC와 모든 다른 조작된 시스테인 돌연변이체 ADC보다 더 안정하다. 각각의 구조에 대한 t = 0시간을 기준으로 한 말단 약물 로딩%가 하기 표 2에 제시되어 있다.
도면은 단지 예시의 목적으로 본 발명의 다양한 구현예를 도시한다. 당업자는, 하기 논의로부터, 본원에 기재된 본 발명의 원리를 벗어나지 않는 한, 본원에 예시된 구조 및 방법의 대안적인 구현예가 이용될 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바, 다음의 용어는 하기의 그 용어에 속하는 것으로 여겨지는 의미를 갖는다.
"리간드-약물 컨쥬게이트" 또는 "LDC"는, 약학적 작용제, 예를 들어 세포독성 또는 세포분열억제(cytostatic) 약물에 컨쥬게이션된 리간드 (예를 들어 항체)를 나타낸다. "리간드"에는, 비제한적으로, 중합체, 덴드리머, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 (시클릭 펩티드 및 글리코펩티드 포함), 또는 임의의 다른 세포 결합 분자 또는 물질이 포함된다. 보다 구체적으로, 리간드에는, 압타머 (올리고뉴클레오티드 또는 펩티드)뿐 아니라, 인터페론, 림포카인(lymphokine), 노틴(knottin), 아드넥틴(adnectin), 안티칼린(anticalin), 다르핀(darpin), 아비머(avimer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 및 센티린(centyrin)과 같은 다양한 단백질이 포함된다. 추가의 리간드에는, 호르몬, 성장 인자, 콜로니 자극 인자, 비타민 및 영양소 수송 분자가 포함된다. 적합한 리간드에는, 예를 들어 항체, 예를 들어 전장 항체 및 이의 항원 결합 단편이 포함된다. 항체는 또한 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체를 포함한다.
"항체-약물 컨쥬게이트" 또는 "ADC"는, 약학적 작용제에 컨쥬게이션된 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 조작된 변이체를 나타낸다. 전형적으로, 항체-약물 컨쥬게이트는 세포 표면 상에서 표적 항원 (예를 들어, CD70)에 결합한 후, 항체-약물 컨쥬게이트를 세포 내로 내재화시키고, 후속으로 약물을 세포 내로 방출시킨다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 약학적 작용제에 공유결합적으로 또는 비(非)공유결합적으로 결합될 수 있다. 특정 구현예에서, LDC, 특히 ADC에서 약물은, 링커를 통해 리간드 또는 보다 특히 항체에 컨쥬게이션된다. 링커는 전형적으로 화학적 스페이서에 의해 분리된 약물에 대한 컨쥬게이션 및 리간드에 대한 컨쥬게이션으로부터 생성된 잔기를 포함한다. 화학적 스페이서는 단순히 탄화수소쇄, 알케닐렌 (예를 들어, -(CH2)n- (여기서 n은 선택된 정수이거나, 2 내지 10임)), 또는 하나 이상의 산소, 카르보닐 (C=O), 황 또는 아미노기 (예를 들어, NH 또는 N알킬)를 함유하는 헤테로알케닐렌쇄일 수 있다. 링커는 구조적으로 보다 복잡할 수 있으며, 예를 들어 링커는 PEG (폴리에틸렌 글리콜)기, 또는 다른 친수성기로 치환될 수 있거나, 또는 해당 기를 절단하면 링커가 절단되는 절단 가능한 기, 예를 들어 β-글루쿠로니다아제에 의해 절단 가능한 β-글루쿠로니드를 함유할 수 있다.
링커는 리간드를 약물에 연결하는 화학 종이다. 전형적으로, LDC는 2개의 컨쥬게이션 단계에 의해 형성된다. 대부분의 경우 스페이서에 의해 분리되어 있고 선택적으로 치환되는 2개의 상이한 반응성기를 갖는 이종이관능성 종인, 링커에 대한 전구체는, 대부분의 경우 약물 분자와 반응하여 반응성기 중 하나를 보유하는 링커-약물 조합을 형성한다. 이종이관능성 링커 전구체는 상이한 반응성을 갖는 2개의 반응성기 사이에 스페이서를 함유한다. 예를 들어, 이종이관능성 링커 전구체는 한쪽 말단에 아민 반응성기 및 다른 쪽 말단에 티올 반응성기를 함유할 수 있다. 또 다른 보다 구체적인 예에서, 이종이관능성 링커 전구체는 약물의 아민과 반응하여 카르바메이트를 형성하는 카르보네이트를 함유할 수 있다. 다른 보다 구체적인 예에서, 이종이관능성 링커 전구체는 약물의 아민과 반응하여 아미드를 형성하기 위한, 아지드 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS 에스테르 또는 술포-NHS 에스테르)를 함유할 수 있다. 이러한 아민 반응성기는 각각 링커 전구체에서 말레이미드기와 짝을 이룰 수 있으며, 선택된 공지된 조건 하에서 티올과의 반응에 선택적이다. 약물에의 컨쥬게이션 후, 반응성기 중 하나는 링커-약물 조합에 남아있다.
이어서, 반응성기를 보유하는 링커-약물 조합은 약물의 리간드에의 컨쥬게이션을 위한 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 리간드 컨쥬게이션 시약은 리간드에서 티올기와의 반응을 위한 말레이미드기를 함유할 수 있다. 보다 일반적으로, 리간드 컨쥬게이션 시약은 리간드에서 해당 기에의 컨쥬게이션을 위한 임의의 적절한 반응성기를 함유할 수 있다. 반응성기는, 예를 들어 아민기, 카르복실레이트기, 티올기 또는 히드록실기와 반응할 수 있다.
"분석 표적"은, 리간드-약물 컨쥬게이트로부터 방출 또는 절단되며, 하나 이상의 공지된 분석 기법, 예를 들어 질량 분석법에 의해 검출 또는 측정 (정량화)되는 약물 또는 이의 일부를 나타낸다. 분석 표적은 적어도 약물 또는 이의 일부를 함유하며, 추가로 링커의 일부를 함유할 수 있다. 분석 표적의 양은 리간드-약물 컨쥬게이트로부터 방출 또는 절단된 양을 나타낸다. 보다 구체적으로, 분석 표적은 LDC 중 약물 또는 LDC 중 약물의 일부이다. 특정 구현예에서, 약물이 아우리스타틴인 경우, 분석 표적은 약물로부터 방출된 테트라펩티드일 수 있다.
내부 표준물이 사용되는 경우, 분석 표적은 내부 표준물로부터 방출되거나 절단된 약물 또는 이의 일부일 수 있다. 전형적인 구현예에서, 내부 표준물로부터 방출된 분석 표적은, 예를 들어 상이한 분자량 및/또는 표지화에 의해 리간드-약물 컨쥬게이트로부터 방출된 분석 표적과 구별될 수 있다.
용어 "항체"는, 항원뿐 아니라, 이의 항원-결합 단편 및 조작된 변이체에 결합하는, 항원의 존재에 반응하여 신체에 의해 생성된 면역글로불린 단백질을 나타낸다. 따라서, 용어 "항체" 에는, 예를 들어 온전한 단일클론 항체 (예를 들어, 하이브리도마 기법을 사용하여 생성된 항체), 및 F(ab')2, Fv 단편, 디아바디, 단쇄 항체, scFv 단편 또는 scFv-Fc와 같은 항원-결합 항체 단편이 포함된다. 키메라 항체, 인간화 항체, 단쇄 Fv 단편, 단쇄 항체, 디아바디, 미니바디, 선형 항체, 다가 또는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적) 하이브리드 항체 등과 같은 유전자 조작된 온전한 항체 및 단편이 또한 포함된다. 따라서, 용어 "항체"는, 항체의 항원-결합 부위를 포함하고 이의 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질을 포함하는 것으로 광범위하게 사용된다.
용어 "추출하다", "추출된", "추출", 및 "추출하는"은, 몇몇 단백질 및 다른 분자를 포함하는 불균질 샘플로부터의 LDC 또는 ADC의 단리를 나타낸다. 불균질 샘플, 특히 생물학적 샘플로부터 LDC 또는 ADC를 선택적으로 추출할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법 또는 물질이, 본원의 방법에 이용될 수 있다. 추출은, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피 및 면역침강법을 포함할 수 있다.
리간드 또는 항체가 결합되는 종을 함유하는 수지에의 LDC 또는 ADC의 결합은 추출에 사용될 수 있다. 항체 결합 단백질은 ADC의 추출에 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플로부터 ADC의 추출은 단백질 A 컬럼 상에 샘플을 이동시키거나, 샘플을 단백질 A 수지와 접촉시킨 후, 항체를 포획하기 위해 샘플로부터 수지를 제거함으로써 샘플로부터 ADC를 추출하는 것을 포함할 수 있다. ADC와 관련하여, 표면 단백질 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L이 추출에 사용될 수 있다. 주어진 항체의 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L에의 결합에 위한 구조적 요건은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자는 그 중에서 주어진 항체를 사용하는데 적절한 표면 단백질을 선택할 수 있다. 이러한 단백질을 사용하는 추출에 유용한 물질에는, 수지, 예를 들어 비드화된 아가로오스, 또는 자성 비드, 또는 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L이 공유결합적으로 고정화된 유사한 지지체 물질이 포함된다.
용어 "세포내 절단된" 및 "세포내 절단"은, 리간드-약물 컨쥬게이트 (예를 들어, 항체-약물 컨쥬게이트) 상에서의 세포 내부의 대사 과정 또는 반응으로, 이에 의해 공유결합적 부착, 예를 들어 약물 모이어티와 리간드 단위 사이의 링커가 파괴되어, 유리된 약물, 또는 세포 내부에서 항체로부터 해리된 컨쥬게이트의 다른 대사 산물이 생성되는 것을 나타낸다. 따라서, 약물-링커-리간드 컨쥬게이트의 절단된 모이어티는 세포내 대사산물이다.
용어 "방출하다", "방출된", 및 "방출하는"은, 본원에 기재된 산 매개 절단 방법에 의한 LDC로부터의 분석 표적의 세포외 절단을 나타낸다. 주어진 수의 링커-약물 조합을 갖는 (즉, 컨쥬게이션된) 주어진 LDC의 경우, 방출된 분석 표적의 양은 전형적으로 방출 반응에 사용되는 산 농도 (하기 참조), 반응의 온도 및 압력 (하기 참조), 및 이용되는 반응 시간에 따라 달라질 것이다. 샘플간 결과의 일관성을 위해, 동일한 산 농도 및 반응 조건이 이용되어야 한다. 본원에 기재된 바와 같은 산으로의 처리는, LDC로부터 모든 분석 표적이 방출되는 것을 필요로 하지 않는다. 이용되는 분석 방법의 관점에서 분석 표적의 정확하고 정밀한 측정을 수득하기에 충분한 분석 표적의 양이 방출되기만 하면 된다.
용어 "접촉하다", "접촉된", 및 "접촉하는"은, 샘플의 성분이 산 또는 시약에 이용 가능하게 되어, 반응이 일어날 수 있도록, 시험 샘플 또는 대조군 샘플 (생물학적 샘플 포함)일 수 있는 샘플에 산 또는 시약을 첨가하는 것을 나타낸다. 본원의 방법에서 산 첨가와 관련된 반응은 LDC 또는 보다 구체적으로 ADC로부터 분석 표적의 방출이다.
"세포독성 효과"는, 표적 세포의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 나타낸다. "세포독성제"는, 세포에 대한 세포독성 효과를 가짐으로써 표적 세포의 고갈, 제거 및/또는 사멸을 매개할 수 있는 화합물을 나타낸다. 상기 용어에는, 방사성 동위원소 (예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소, 및 이의 합성 유사체 및 유도체가 포함된다. 특정 구현예에서, 세포독성제는 항체에 컨쥬게이션되거나, 항체와 조합으로 투여된다. 적합한 세포독성제는 본원에 추가로 기재되어 있다.
"세포독성 활성"은, 리간드-약물 컨쥬게이트 화합물 또는 리간드-약물 컨쥬게이트의 세포내 대사산물의 세포 사멸, 세포분열억제 또는 항증식 효과를 나타낸다. 세포독성 활성은 세포 절반이 생존하는 단위 부피 당 농도 (몰 또는 질량)인, IC50 값으로 표시될 수 있다.
용어 "환자" 또는 "대상"에는, 예방적 또는 치료적 치료를 받는, 인간, 및 비인간 영장류, 토끼, 래트, 마우스 등과 같은 다른 포유류 대상, 및 이의 유전자 이식 종이 포함된다.
용어 "표준 곡선" 또는 "보정 곡선"은, 정량적 연구 기법으로서 사용되는 그래프를 나타낸다. 표준 곡선을 생성하기 위해서는, 공지된 특성을 다수의 샘플을 측정하고 그래프로 작성하여, 그래프 상에서 보간법에 의해 미지의 샘플에 대해 동일한 특성을 결정할 수 있다. 공지된 특성을 갖는 샘플은 표준물이며, 그래프는 표준 곡선이다. 표준 곡선은 미지의 양의 분석물을 함유할 수 있는 샘플에서 분석물의 양 또는 농도를 측정할 때 특히 사용된다. 표준 곡선 단독의 사용은 외부 표준물의 사용을 나타낸다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 정량화하고자 하는 주어진 분석물 (즉, LDC)의 표준 곡선은 일반적으로 샘플에서 예측된 분석물의 농도 범위에 걸쳐 있어야 한다. 또한 당업계에서 이해되는 바와 같이, 표준 곡선을 준비하는데 사용되는 샘플은 시험 샘플 및 분석물이 측정되는 임의의 대조군 샘플과 동일한 단계로 처리된다. 표준 곡선은 또한 내부 표준물의 사용과 조합으로 이용될 수 있다. 이러한 경우, 일정한 (또는 고정된) 양의 내부 표준물이 공지된 분석물 농도의 표준 곡선을 생성하는데 사용되는 각각의 샘플에 첨가된다. 동일한 일정한 양의 내부 표준물이 각각의 시험 샘플, 및 임의의 블랭크 또는 대조군 샘플에 첨가된다. MS, LC-MS 및 LC-MS/MS 방법을 포함하는 분석 방법에 의한 분석물의 정량화를 위한, 외부 표준물로서 표준 곡선 (보정 곡선)의 사용 및 내부 표준물과의 표준 곡선의 조합 사용에 대한 세부사항은, 당업계에 널리 공지되어 있다. 당업자는 본원에 논의된 바와 같은 생물학적 샘플을 포함하는 다양한 샘플에서 분석물의 농도를 결정하는데 이러한 분석 방법을 사용하는 방법을 이해한다.
"내부 표준물"은, 선택된 검정에서 정량화하고자 하는 화학 종 (즉, LDC)과 유사하게 거동하지만, 사용되는 분석 방법에서 해당 화학 종과 구별 가능한 화학 종이다. 전형적으로, 내부 표준물은 정량화하고자 하는 화학 종과 구별되도록 표지화되지만, 이용되는 표지는 정량화하고자 하는 화학 종에 비해 그 거동에 유의하게 구별되는 영향을 미치지 않는다. 바람직하게는, 정량화하고자 하는 화학 종의 측정에 영향을 미치는 임의의 것 (예를 들어, 분석물 피크 면적)은 또한 내부 표준물의 측정에 유사하게 영향을 미칠 것이다. 정량화하고자 하는 화학 종과 내부 표준물의 측정 비는, 바람직하게는 시험 샘플에서 화학 종의 측정보다 적은 변동성을 나타낸다. 질량 분석법에 사용되는 경우, 내부 표준물은 정량화하고자 하는 화학 종과 상이한 분자량을 갖는다.
대부분의 경우 중수소 (2H) 및 탄소-13 (13C)와 같은 안정한 동위원소를 이용한 표지화가 이용된다. 표지화는 분석물 및 내부 표준물의 별도의 측정을 가능하게 해야 한다. 바람직하게는, 동위원소 표지된 내부 표준물은 정량화하고자 하는 화학 종과 적어도 3 amu (즉, 3 개 이상의 2H 또는 13C로의 표지화)의 분자량 차이가 있다. 보다 구체적으로, 표지화는 6 amu 이상의 분자량 차이를 유도한다. 내부 표준물은 또한 정량화하고자 하는 화학 종의 대체물일 수 있다. 대체 내부 표준물은 원자 또는 화학 기의 상이한 기로의 치환, 예를 들어 수소의 메틸기 또는 다른 작은 알킬로의 치환, 또는 수소의 할로겐, 예를 들어 플루오린으로의 치환에 의해, 정량화하고자 하는 화학 종과 구조적으로 상이하다. 이러한 대체물은 동위원소 표지된 내부 표준물을 용이하게 수득할 수 없는 경우에 특히 사용될 수 있다.
용어 "결정하다", "결정된" 및 "결정하는"은, 분석 표적의 양 및 하나 이상의 상관 인자의 공지된 양의 측정을 기반으로, 특정 분석물의 농도 또는 양을 확인하는 것을 나타낸다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 분석물 농도는 분석물의 다른 구조적 및 물리적 특성을 결정하기 위해 다른 측정 결과와 조합될 수 있다.
본원에서 상표명이 사용될 때, 상표명은, 문맥에 의해 달리 지시되지 않는 한, 상표명 제품의 제품 제형, 제네릭 약물, 및 활성 약학적 성분(들)을 포함한다.
다른 해석상의 관례
본원에 인용된 범위는 인용된 종점을 포함하여, 범위 내 모든 값에 대한 속기인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50으로 이루어지는 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합 또는 하위범위를 포함하는 것으로 이해된다.
달리 지시되지 않는 한, 하나 이상의 입체 중심을 갖는 화합물에 대한 언급은, 이의 각각의 입체이성질체 및 입체이성질체들의 모든 조합을 의미한다.
리간드-약물 컨쥬게이트 ( LDC )의 분석을 위한 검정
하나의 양태에서, 본 발명은, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법으로서, (a) LDC를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 LDC는 리간드 및 분석 표적을 포함하고, 분석 표적은 약물 분자 또는 이의 일부를 포함하는 단계; 및 (b) 샘플을 1 내지 30% (v/v) 농도의 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시켜, LDC로부터 분석 표적의 방출을 유도하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, (a) LDC를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 LDC는 분석 표적을 포함하고, 분석 표적은 약물 분자를 포함하는 단계; (b) 샘플에 내부 표준물을 첨가하는 단계로서, 여기서 내부 표준물은 LDC의 표지된 유도체이며 제2 분석 표적을 포함하는 단계; (c) 샘플로부터 LDC 및 내부 표준물을 추출하는 단계; (d) LDC 및 내부 표준물을 1 내지 30% (v/v) 농도의 수성 TFA와 접촉시키는 단계로서, 여기서 TFA가 LDC로부터 분석 표적을 방출시키고 내부 표준물로부터 제2 분석 표적을 방출시키는 단계; (e) LDC로부터 방출된 분석 표적 및 내부 표준물로부터 방출된 제2 분석 표적의 양을 결정하는 단계로서, 여기서 LDC로부터 방출된 분석 표적의 양이 샘플 내 LDC의 양과 상관관계가 있는 단계를 포함할 수 있다.
리간드-약물 컨쥬게이트 ( LDC )를 포함하는 샘플
본 발명은 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법을 제공한다. LDC는 리간드 및 분석 표적을 포함하는 복합체이다. 분석 표적은 약물 분자 또는 이의 일부를 포함한다. LDC를 포함하거나 LDC를 포함하는 것으로 의심되는 다양한 샘플이 본원에 제공된 방법을 사용하는 분석에 적용될 수 있다. 특히 생물학적 샘플이 분석될 수 있다.
샘플
생물학적 또는 비(非)생물학적 샘플에서 LDC는 본원에 제공된 방법으로 분석될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 샘플은 포유류 대상에서 유도된 생물학적 샘플이다. 구체적으로, 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈장, 혈청, 혈액, 조직, 조직 생검, 대변 및 소변 중 하나로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 샘플은 생체 내에서 LDC와 접촉되는 생물학적 샘플이다. 예를 들어, 샘플은 LDC에 노출된 대상에서 유도된 생물학적 샘플일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 LDC의 투여 후 특정 시점에서 수득된다. 일부 구현예에서, 샘플은 LDC의 투여 후 다수의 시점에서 수득된다. 일부 구현예에서, 샘플은 LDC의 투여 전에 수득된다.
일부 구현예에서, 샘플은 생체 외에서 LDC와 접촉되는 생물학적 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 특정 기간 동안 LDC와 접촉된다. 일부 구현예에서, 상이한 기간 동안 LDC와 접촉된 복수의 샘플이 분석 대상이다. 일부 구현예에서, 샘플은 LDC에의 노출 전에 수득된다.
리간드-약물 컨쥬게이트 ( LDC )
리간드
일부 구현예에서, 리간드는 표적 분자에 대한 특정 친화성을 갖는 단백질이다. 일부 구현예에서, 리간드는 항체이다. 유용한 다중클론 항체는 면역화된 동물의 혈청에서 유도된 불균질한 항체 분자 집단이다. 유용한 단일클론 항체는 특정 항원 결정인자 (예를 들어, 암 세포 항원, 바이러스 항원, 미생물 항원, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 화학물질, 핵산 또는 이의 단편)에 대한 균질한 항체 집단이다. 관심 항원에 대한 단일클론 항체 (mAb)는 배양물에서 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는, 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
유용한 단일클론 항체에는, 비제한적으로, 인간 단일클론 항체, 인간화 단일클론 항체 또는 키메라 인간-마우스 (또는 다른 종) 단일클론 항체가 포함된다. 항체는 전장 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 인간 단일클론 항체는 당업계에 공지된 다수의 기법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, [Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:7308-7312]; [Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72-79]; 및 [Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16]).
항체는 표적 세포 (예를 들어, 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원)에 면역특이적으로 결합하는 항체, 또는 종양 세포 또는 매트릭스에 결합되는 다른 항체의, 기능적으로 활성인 단편, 유도체 또는 유사체일 수 있다. 이와 관련하여, "기능적으로 활성인" 은, 단편, 유도체 또는 유사체가 단편, 유도체 또는 유사체가 유도되는 항체와 동일한 항원을 인식하는 항개별특이형(anti-idiotype) 항체를 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 구체적으로, 예시적인 구현예에서, 면역글로불린 분자의 개별특이형의 항원성은 항원을 특이적으로 인식하는 CDR 서열에 대한 C-말단인, CDR 서열 및 프레임워크의 결실에 의해 증강될 수 있다. CDR 서열이 항원에 결합하는지를 결정하기 위해, CDR 서열을 함유하는 합성 펩티드가 당업계에 공지된 임의의 결합 검정 방법 (예를 들어, BIA 코어 검정)에 의한 항원과의 결합 검정에 사용될 수 있다 (예를 들어, [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md.]; [Kabat E et al., 1980, J. Immunology 125(3):961-969] 참조).
다른 유용한 항체에는, 비제한적으로, F(ab')2 단편, Fab 단편, Fvs, 단일 쇄 항체, 디아바디, 트리바디, 테트라바디, scFv, scFv-Fv 와 같은 항체의 단편, 또는 항체와 동일한 특이성을 갖는 임의의 다른 분자가 포함된다.
또한, 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조될 수 있는, 인간 및 비인간 부분 둘 모두를 포함하는 키메라 및 인간화 단일클론 항체와 같은 재조합 항체가 유용한 항체이다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종에서 유도된 분자, 예를 들어 쥣과 단일클론에서 유도된 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것들이다. (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 및 미국 특허 제4,816,397호 참조, 상기 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 인간화 항체는 비인간 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 분자이다. (예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호 참조, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 이러한 키메라 및 인간화 단일클론 항체는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기법에 의해, 예를 들어 하기에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다: 국제 공개 WO 87/02671호; 유럽 특허 공개 0 184 187호; 유럽 특허 공개 0 171 496호; 유럽 특허 공개 0 173 494호; 국제 공개 WO 86/01533호; 미국 특허 제4,816,567호; 유럽 특허 공개 012 023호; [Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043]; [Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443]; [Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526]; [Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218]; [Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005]; [Wood et al., 1985, Nature 314:446-449]; 및 [Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559]; [Morrison, 1985, Science 229:1202-1207]; [Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214]; 미국 특허 5,225,539호; [Jones et al., 1986, Nature 321:552-525]; [Verhoeyan et al., 1988, Science 239:1534]; 및 [Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060] (상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨).
완전 인간 항체가 특히 바람직하며, 이는 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 형질전환 마우스를 사용하여 제조될 수 있다.
항체는, 공유결합 부착이 항체에게 이의 항원 결합 면역특이성을 보유할 수 있게 하는 한, 임의의 유형의 분자의 공유결합 부착에 의해 변형된 유사체 및 유도체를 포함한다. 예를 들어, 비제한적으로, 항체의 유도체 및 유사체에는, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 항체 단위 또는 단백질에의 연결 등에 의해 추가로 변형된 것들이 포함된다. 비제한적으로, 특정 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신(tunicamycin)의 존재 하에서의 대사 합성 등을 포함하는 공지된 기법에 의해, 다수의 화학적 변형 중 임의의 것이 수행될 수 있다. 또한, 유사체 또는 유도체는 하나 이상의 비(非)천연 아미노산을 함유할 수 있다.
항체는 Fc 수용체와 상호작용하는 아미노산 잔기에서 변형 (예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)을 가질 수 있다. 특히, 항체는 항-Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기에서 변형을 가질 수 있다 (예를 들어, 국제 공개 WO 97/34631호 참조, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨).
암 세포 항원에 면역특이적인 항체는 상업적으로 입수되거나, 또는 예를 들어 화학적 합성 또는 재조합 발현 기법과 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 암 세포 항원에 면역특이적인 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어 GenBank 데이터베이스 또는 이와 유사한 데이터베이스, 문헌 공보로부터, 또는 통상의 클로닝 및 서열분석에 의해 수득될 수 있다.
특정 구현예에서, 유용한 항체는 활성화된 림프구에서 발현되는 수용체 또는 수용체 복합체에 결합할 수 있다. 수용체 또는 수용체 복합체는 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리 멤버, TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버, 인테그린, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 주요 조직적합성 단백질, 렉틴 또는 보체 제어 단백질을 포함할 수 있다. 적합한 면역글로불린 수퍼패밀리 멤버의 비제한적인 예는, CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD2O, CD22, CD28, CD30, CD70, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1 및 ICOS이다. 적합한 TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버의 비제한적인 예는, CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4-1BB, TNF-R1, TNFR-2, RANK, TACI, BCMA, 오스테오프로테게린, Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4 및 APO-3이다. 적합한 인테그린의 비제한적인 예는, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 및 CD104이다. 적합한 렉틴의 비제한적인 예는 C-형, S-형 및 I-형 렉틴이다.
일부 구현예에서, 리간드는 수용체 리간드이다. 수용체 리간드는 특정 세포 유형, 조직 또는 기관에 풍부한 결합 파트너를 가질 수 있다. 리간드는 수용체의 천연 발생 아고니스트 또는 안타고니스트, 또는 수용체에 친화성을 갖는 합성 분자일 수 있다. 수용체 리간드는 단백질, 핵산, 또는 다른 수용체 리간드, 예컨대 펩티드, 비타민 및 탄수화물일 수 있다. 하나의 구현예에서, 리간드는 엽산 수용체에 친화성을 갖는 엽산이다.
일부 구현예에서, 리간드는 약물을 표적 기관 또는 조직으로 표적화하기 위해 사용 및 개발된 표적화 모이어티이다. 당업계에 공지된 이러한 부위-특이적 리간드는 본원에 제공된 방법에서 사용 및 채택될 수 있다.
약물
LDC의 약물은, 본원에서 세포독성제, 세포분열억제제 또는 면역억제제로도 언급되는, 임의의 세포독성, 세포분열억제 또는 면역억제 약물일 수 있다. 약물은 아민기, 카르복실산기, 술프히드릴기, 히드록실기, 또는 알데히드 또는 케톤기와 같은 링커를 함유하는 시약 전구체의 적절한 반응성기와 결합을 형성할 수 있는, 아미노, 알킬 아미노기 또는 카르복실레이트와 같은 관능기를 갖는다. 일 구현예에서, 약물은 링커에 컨쥬게이션되어 아미드 또는 카르바메이트를 생성한다. 일 구현예에서, 약물은 아미드 결합에 의해 링커에 컨쥬게이션된다. 일 구현예에서, 약물은 단일 아미드 결합을 함유한다. 일 구현예에서, 약물은 카르바메이트에 의해 링커에 컨쥬게이션되고, 아미드 결합을 함유한다. 특정 구현예에서, TFA 처리는, 약물에서 링커에 대한 아미드 결합 또는 내부 아미드 결합의 절단에 의해 약물 또는 이의 일부를 방출한다.
유용한 부류의 세포독성제 또는 면역억제제에는, 예를 들어, 항튜불린제, 아우리스타틴, DNA 소홈 결합제(minor groove binder), DNA 복제 저해제, 알킬화제 (예를 들어, 시스플라틴, 단일(백금), 이중(백금) 및 삼중핵 백금 착물, 및 카르보플라틴과 같은 백금 착물), 안트라시클린, 항생제, 항엽산, 항대사산물, 화학요법 증감제, 듀오카르마이신(duocarmycin), 에토포시드, 플루오르화 피리미딘, 이오노포어(ionophore), 렉시트롭신(lexitropsin), 니트로소우레아, 플라티놀(platinol), 예비형성 화합물, 퓨린 항대사산물, 퓨로마이신, 방사선 증감제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라아제 저해제, 빈카 알칼로이드 등이 포함된다. 특히 유용한 부류의 세포독성제에는, 예를 들어 DNA 소홈 결합제, DNA 알킬화제 및 튜불린 저해제가 포함된다. 예시적인 세포독성제에는, 예를 들어 아우리스타틴, 캄프토테신, 듀오카르마이신, 에토포시드, 메이탄신 및 메이탄시노이드 (예를 들어, DM1 및 DM4), 탁산, 벤조디아제핀 (예를 들어, 피롤로[1,4]벤조디아제핀 (PBD), 인돌리노벤조디아제핀 및 옥사졸리디노벤조디아제핀) 및 빈카 알칼로이드가 포함된다. 약물을 함유하는 선택된 벤조디아제핀은, WO 2010/091150, WO 2012/112708, WO 2007/085930 및 WO 2011/023883에 기재되어 있다.
예시적인 구현예에서, 약물은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상 또는 4개 이상의 아미노산기를 함유하는 펩티드 약물이다. 예시적인 구현예에서, 약물은 N-말단 N-메틸화 아미노산기를 함유하는 펩티드 약물이다. 추가의 예시적인 구현예에서, 약물은 알킬 측기를 갖는 N-말단 N-메틸화 아미노산을 갖는 펩티드 약물이다. 추가의 예시적인 구현예에서, 약물은 N-말단 N-메틸화 알라닌, N-메틸화 이소류신, N-메틸화 류신 또는 N-메틸화 발린을 갖는 펩티드 약물이다. 추가의 예시적인 구현예에서, 약물은 N-말단 N-메틸화 발린을 갖는 펩티드 약물이다.
바람직한 구현예에서, 약물은 아우리스타틴이다. 아우리스타틴에는, 비제한적으로, AE, AFP, AEB, AEVB, MMAF 및 MMAE가 포함된다. 아우리스타틴의 합성 및 구조는 미국 특허 출원 공개 제2003-0083263호, 제2005-0238649호, 제2005-0009751호, 제2009-0111756호 및 제2011-0020343호; 국제 특허 공개 WO 04/010957호, 국제 특허 공개 WO 02/088172호, 및 미국 특허 제7,659,241호 및 제8,343,928호에 기재되어 있으며; 상기 문헌들은 각각 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 예시적인 본 발명의 아우리스타틴은 튜불린에 결합하고, 목적하는 세포주에서 세포독성 또는 세포분열억제 효과를 발휘한다. 일 구현예에서, 예시적인 아우리스타틴은 N-말단 N-메틸화 아미노산을 함유한다. 보다 구체적으로, 예시적인 아우리스타틴은 알라닌, 이소류신, 류신 또는 발린과 같은, 알킬 측쇄를 갖는 N-말단 N-메틸화 아미노산을 함유한다. 보다 구체적으로, 예시적인 아우리스타틴은 N-말단 N-메틸화 발린을 함유한다.
다른 개별 세포독성제 또는 면역억제제에는, 예를 들어 안드로겐, 안트라마이신 (AMC), 아스파라기나아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 부설판, 부티오닌 술폭시민, 칼리키아미신(calicheamicin), 캄프토테신, 카르보플라틴, 카르무스틴 (BSNU), CC-1065, 클로람부실, 시스플라틴, 콜키신, 시클로포스파미드, 시타라빈, 시티딘 아라비노시드, 시토칼라신 B, 다카르바진, 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신), 다우노루비신, 데카르바진, 도세탁셀, 독소루비신, 에토포시드, 에스트로겐, 5-플루오르데옥시우리딘, 5-플우오로우라실, 젬시타빈, 그라미시딘 D, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로무스틴 (CCNU), 메이탄신, 메클로레타민, 멜팔란, 6-메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미톡산트론, 니트로이미다졸, 파클리탁셀, 팔리톡신, 플리카마이신, 프로카르비진, 리족신, 스트렙토조토신, 테노포시드, 6-티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, VP-16 및 VM-26이 포함된다.
적합한 세포독성제에는 또한, DNA 소홈 결합제 (예를 들어, 에네디인 및 렉시트롭신, CBI 화합물; 또한 미국 특허 제6,130,237호 참조), 듀오카르마이신 (미국 특허출원 공개 제20060024317호 참조), 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 퓨로마이신, 빈카 알칼로이드, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 네트롭신, 에포틸론 A 및 B, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 메이탄시노이드, 디스코데르몰리드, 엘레우테로빈 및 미톡산트론이 포함된다.
항튜불린제의 예에는, 비제한적으로, 탁산 (예를 들어, Taxol.RTM. (파클리탁셀), Taxotere.RTM. (도세탁셀)), T67 (Tularik) 및 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈)이 포함된다. 다른 항튜불린제에는, 예를 들어, 박카틴 유도체, 탁산 유사체 (예를 들어, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜키신 및 콜세미드, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 메이탄시노이드, 콤프레타스타틴, 디스코데르몰리드 및 엘레우테로빈이 포함된다. 메이탄신 및 메이탄시노이드는 항튜불린제의 또 다른 군이다. (ImmunoGen, Inc.; 또한 [Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131] 및 미국 특허 제8,163,888호 참조).
예시적인 아우리스타틴 약물은 하기 화학식 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 가지며, 여기서 물결선은 링커에의 부착 부위를 나타낸다:
Figure pct00001
(모노메틸 아우리스타틴 F) 및
Figure pct00002
(모노메틸 아우리스타틴 E).
링커를 통한 리간드에의 컨쥬게이션을 위한 대안적인 아우리스타틴 약물은 하기 화학식 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 가지며, 여기서 물결선은 링커에의 부착 부위를 나타낸다:
Figure pct00003
또는
Figure pct00004
.
LDC의 제조에 유용하고, ADC의 제조에 특히 유용한 추가의 세포독성 화합물은, 특히 세포독성 화합물의 설명에 대하여, 미국 특허 제6,884,869호 (이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재되어 있다. 본원의 추가의 설명은 기재된 세포독성 화합물과의 약물 컨쥬게이트의 제조를 기술한다.
링커
링커에 약물을 연결하기 위한 일반적인 절차는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,163,888호, 제7,659,241호, 제7,498,298호, 미국 특허출원 공개 US20110256157호, 및 국제 출원 WO2011023883호 및 WO2005112919호를 참조한다.
링커의 절단이 세포내 환경에서 (예를 들어, 리소좀 또는 엔조좀 또는 카베올라(caveolea) 내에서) 리간드로부터 치료제를 방출하도록, 링커는 세포내 조건 하에서 절단 가능할 수 있다. 링커는, 예를 들어 세포내 펩티다아제, 또는 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함하는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 세포내 절단제는 카텝신 B 및 D, 및 플라스민을 포함할 수 있다 (예를 들어, [Dubowchik and Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999] 참조). 예를 들어, 암성 조직에서 고도로 발현되는 티올-의존적 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커 (예를 들어, Phe-Leu 또는 Val-Cit 펩티드를 포함하는 링커)가 사용될 수 있다. 링커는 또한 세포내 글리코시다아제에 의해 절단되는 당 링커 (예를 들어, 글루쿠로니다아제에 의해 절단 가능한 글루쿠로니드 링커)를 포함하는 탄수화물 링커일 수 있다.
링커는 또한 황 (티올)을 통해 리간드에 부착되고 항체의 단백질 분해에 의해 방출되는, 말레이미도-알킬렌- 또는 말레이미드-아릴 링커와 같은 절단 가능하지 않은 링커일 수 있다.
항체는 항체의 임의의 적절한 반응성기, 예를 들어 아민기 (예를 들어, N-말단 아미노기, 또는 리신과 같은 아미노산 측기의 아민기), 티올기 (-SH, 예를 들어 시스테인 잔기의 것), 카르복실레이트 (예를 들어, C-말단 카르복실레이트, 또는 글루탐산과 같은 아미노산 측쇄의 것) 또는 히드록실기 (예를 들어 세린 잔기의 것)를 통해, 하나 이상의 링커에 컨쥬게이션될 수 있다.
예시적인 ADC에서, 모노메틸 아우리스타틴 E는 프로테아제 절단 가능한 펩티드 링커를 통해 항체에 컨쥬게이션되고, 모노메틸 아우리스타틴 F는 링커 말레이미도카프로산 (mc)을 통해 항체에 컨쥬게이션된다. 또한, 링커는 용해도 또는 약동학을 조절하는 화학기를 함유할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 링커는 페길화되어 있다. 특정한 예시적인 링커-약물 조합은 하기와 같다:
Figure pct00005
mc-MMAF (여기서 링커의 말레이미드기는 리간드 및 특히 항체의 티올기와 반응할 수 있음); 또는
Figure pct00006
DPR-PEG-gluc-카르바메이트-MMAE (여기서 링커는 페길화되어 있고 글루쿠론산 (글루쿠로니다아제에 의해 절단 가능함)을 함유하며, 링커의 말레이미드기는 리간드의 티올기와 반응할 수 있음). 상기 링커-약물 조합을 함유하는 LDC에서, 본원에 기재된 바와 같은 산으로의 처리는, mc-MMAF로부터 테트라펩티드인 Val-Dil-Dap-Phe (여기서 Dap는 돌라프롤린(dolaproline)임)를, DPR-PEG-gluc-카르바메이트-MMAE로부터 전체 약물 MMAE를 방출시킨다. LDC 및 ADC에 대한 내부 표준물은 이러한 링커-약물 조합의 표지화에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 표지는 본원에 기재된 바와 같은 산으로의 처리 시 방출된다. mc-MMAF에 컨쥬게이션된 LDC 및 ADC에 대한 예시적인 내부 표준물은, 방출된 테트라펩티드에서 중수소화되거나 13C로 표지된 것을 포함한다. mc-MMAF에 컨쥬게이션된 LDC 및 ADC에 대한 예시적인 내부 표준물은, 방출된 MMAE에서 중수소화되거나 13C로 표지된 것을 포함한다. 상기 구조에서, 가능한 13C 표지화 또는 중수소 표지화 부위는 "*"로 표시된다.
본원의 정량화 방법은 일반적으로 전체 LDC를 나타내는 본원에서 분석 표적으로 지정된 LDC 단편의 방출을 이용하며, 분석 표적이 정량화된다. 분석 표적의 정량화는 방출된 분석 표적의 양, 샘플 내 LDC에서의 분석 표적의 양 및/또는 샘플 내 LDC의 양을 측정하는 것을 가능하게 한다. 일부 결정에서, 샘플에서 리간드의 양을 적절한 공지된 방법으로 공지 또는 결정하거나, 또는 주어진 LDC에 컨쥬게이션된 약물 분자의 수 (또는 평균 수)를 적절한 방법으로 공지 또는 결정할 필요가 있다. 보다 구체적으로, 본원의 분석 표적은 LDC의 약물 분자 또는 LDC의 약물 분자의 일부이다. 약물은 링커 종에 의해 LDC에서 리간드에 컨쥬게이션되어, 분석 표적은 또한 약물 또는 이의 부분에 더하여 전체 링커 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원의 분석 표적은 LDC에 컨쥬게이션된 약물이다. 특정 구현예에서, 본원의 분석 표적은 LDC에 컨쥬게이션된 약물의 일부이다. 본원의 특정 구현예에서, 약물은 펩티드 또는 이의 유도체이고, 분석 표적은 펩티드 약물 또는 펩티드 약물의 펩티드 부분이다. 특정 구현예에서, 약물이 펩티드 또는 이의 유도체인 경우, 분석 표적은 디펩티드 또는 이의 유도체, 트리펩티드 또는 이의 유도체, 또는 테트라펩티드 또는 이의 유도체이다.
트리플루오로아세트산 ( TFA )에 의해 매개된 절단
본 발명의 방법은 샘플을 1 내지 30% (v/v) 농도의 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 반응시켜, LDC로부터 분석 표적의 방출을 유도하는 단계를 포함한다. 아세토니트릴 중의 TFA 용액이 또한 이용될 수 있다.
이용되는 TFA 농도는 1 내지 20%, 1 내지 10%, 2.5 내지 30%, 2.5 내지 20%, 2.5 내지 10%, 5 내지 15%, 7 내지 13%, 9 내지 11%, 또는 9.5 내지 10.5% v/v (기재된 모든 범위 포함)일 수 있다. TFA 농도는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29% 또는 약 30% (모두 %v/v)이다. 바람직한 구현예에서, TFA는 10% (v/v)이다.
TFA 농도는 물, 샘플 혼합물 또는 임의의 다른 허용 가능한 용매에서 100% TFA의 희석의 결과일 수 있다. TFA는 샘플에 첨가되기 전 희석되거나, 샘플 혼합물 그 자체에서 희석될 수 있다.
TFA 반응은 가변적인 시간 및 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 반응은 20 내지 80℃, 예컨대 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 약 45℃, 약 46℃, 약 47℃, 약 48℃, 약 49℃, 약 50℃, 약 51℃, 약 52℃, 약 53℃, 약 54℃, 약 55℃, 약 56℃, 약 57℃, 약 58℃, 약 59℃, 약 60℃, 약 61℃, 약 62℃, 약 63℃, 약 64℃, 약 65℃, 약 66℃, 약 67℃, 약 68℃, 약 69℃, 약 70℃, 약 71℃, 약 72℃, 약 73℃, 약 74℃, 약 75℃, 약 76℃, 약 77℃, 약 78℃, 약 79℃ 또는 약 80℃에서 수행될 수 있다.
TFA 반응은 전형적으로 주위 압력에서 수행된다. 반응의 압력이 유의한 손상 없이 이러한 반응에서 가변적일 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 압력의 변화는 온도의 변화를 필요로 할 수 있다고 이해될 것이다. 더 높은 압력에서 수행되는 반응은 더 낮은 반응 온도의 사용을 허용할 수 있다. 목적하는 수준의 분석 표적의 방출을 달성하기 위해, 반응의 압력과 함께 산의 농도, 반응 시간 및 반응 온도가 본원에 기재된 범위 내에서 가변적일 수 있다고 이해될 것이다.
상기 반응은 약 12 내지 24 시간, 10 내지 20시간 또는 15 내지 17 시간의 기간 동안 수행될 수 있다. 하지만, 선택된 분석 방법이 목적하는 정확성 및 정밀성의 측정을 제공할 수 있도록, 산 농도, 온도, 시간 및 압력의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 다른 곳에 언급된 바와 같이, 주어진 실험 또는 정량화에서 결과의 일관성을 위해, 사용되는 반응 조건은 주어진 실험 또는 정량화를 위한 모든 시험 샘플 (미지의 샘플), 모든 대조군 및 모든 보정 샘플에 대하여 동일해야 한다. 예시적인 구현예에서, 절단 반응은 TFA 10%를 사용하여, 주위 압력에서 70℃에서 약 16시간의 기간 동안 수행된다.
비제한적으로, 다른 플루오르화된 산, 유기 또는 무기 산과 같은 다른 산이 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 특정한 대안적인 산에는 트리플루오로메탄 술폰산이 포함된다. 휘발성인 산이 일반적으로 HCl과 같은 무기산보다 바람직하다.
분석 표적의 측정
일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플에서 분석 표적을 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 샘플에서 발생할 것으로 예측되는 농도 범위에서 분석 표적의 정량화에 적절한 분석 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, LDC 또는 내부 표준물은 분석 표적의 측정 전에 샘플로부터 추출된다. 분석 표적은 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피 또는 면역침강법에 의해 수집될 수 있다. 일부 구현예에서, LDC 또는 내부 표준물은 리간드로서 항체 또는 기능성 단편을 포함한다. 이러한 경우, LDC 또는 내부 표준물은 샘플을 단백질 A 수지, 단백질 G 수지 및 단백질 L 수지로부터 선택되는 수지와 접촉시킴으로써 수집될 수 있다.
일부 구현예에서, 분석 표적은 액체 크로마토그래프/질량 분석법 (LC/MS) 방법을 사용하여 검출 및 정량화된다. 보다 구체적으로, 탠덤 질량 분석법 (MS/MS) 방법이 이용된다. MS/MS 방법에서, 분석 표적의 선택된 모 이온의 하나 이상의 단편 이온이 모니터링된다. 분석 표적의 모 이온은 제1 MS 단계에서 당업계에 공지된 바와 같이 선택되고, 모 이온은 단편화, 전형적으로 충돌-유도 단편화에 적용되어, 하나 이상의 단편 이온을 생성하며, 이들은 각각, 예를 들어 질량 (m/z)의 함수로서 이온 전류 피크를 생성하기 위해 각각의 단편과 관련된 이온 전류의 측정에 의해 정량화될 수 있다. 모 이온 및 이의 하나 이상의 단편 이온이 유도되는 화학 종의 정량화를 위해 단편의 통합 피크 면적이 측정될 수 있다. 본원의 분석 표적의 측정에의 적용에서, 하나 이상의 단편은 방출된 분석 표적의 모 이온으로부터 유도된다.
본원의 분석 표적의 정량화에 임의의 MS/MS 방법이 이용될 수 있지만, 3중 사중극자 또는 사중극자 이온 트랩을 이용하는 방법이 보다 전형적으로 이용된다. 본원의 방법에 사용되는 질량 분석계는 샘플의 전체 질량 스펙트럼, 또는 보다 전형적으로 관심있는 이의 선택된 부분을 모니터링하도록 작동될 수 있다. 특히 MS/MS 방법에서, 선택된 모 이온의 하나 이상의 단편 이온의 신호 (예를 들어, 이온 전류)가 모니터링될 수 있다. 선택된 모 이온으로부터 생성된 단일 단편 이온이 모니터링되는, 선택된 반응 모니터링 (SRM) 작업이 사용될 수 있다. 대안적으로, 선택된 모 이온으로부터 생성된 하나 초과의 단편 이온이 모니터링되는, 다중 반응 모니터링 (MRM) 작업이 사용될 수 있다. 단편 이온이라는 용어의 사용은 선택된 이온의 해리 또는 단편화에 의해 MS/MS에서 생성된 이온에 관한 것이다. 상기 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 보다 일반적으로 단편 이온뿐 아니라 단편 이온이 아닌 다른 생성물 이온을 포함하는 생성물 이온을 생성하기 위해 선택된 모 이온은 반응시키는 것을 포함하는 분석물의 정량화에 사용된다고 이해될 것이다. 이러한 모든 생성물 이온을 생성하는 MS/MS 방법이 본원의 방법에서 유사하게 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다양한 샘플에서 분석 표적의 정량화에 사용하기에 적절한 액체 크로마토그래피 방법이 사용된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 외부 표준물로서 표준 곡선 (보정 곡선)의 사용, 및 MS, LC-MS 및 LC-MS/MS 방법에 의한 분석물의 정량화를 위한 내부 표준물과의 표준 곡선의 조합 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 표준 곡선은 본원에 논의된 바와 같은 생물학적 샘플을 포함하는 다양한 샘플에서 분석물의 농도를 결정하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 내부 표준물로부터의 분석물의 양은 LDC로부터의 분석물의 양을 결정하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 내부 표준물로부터의 분석물의 양은 LDC로부터의 분석물의 양의 결정에 사용하기 위한 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. 이러한 구현예에서, 내부 표준물로부터의 분석물 및 LDC로부터의 분석물은 표지화에 의해 구별될 수 있다.
농도 검정
일부 구현예에서, 상기 방법은 샘플에서 LDC의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 샘플 내 LDC에서 리간드에 컨쥬게이션된 약물의 농도를 결정하는 방법을 제공한다.
정량화 분석은 바람직하게는 검정 내에서의 보정을 포함한다. 표준 곡선은, 예를 들어 증가하는 농도의 LDC를 갖는 적어도 6개의 일련의 샘플을 제조함으로써 생성될 수 있다. 내부 표준물이 표준 곡선 샘플에 추가되고, 이어서 상기 기재된 단백질 A 및 LC-MS/MS 방법에 의해 처리된다. 각각의 표준물에 대한 피크 면적을 내부 표준물에 대하여 수득된 피크 면적으로 나누고, 수득된 피크 면적 비를 표준 농도의 함수로서 플롯팅한다. 일부 구현예에서, 적어도 6개의 데이터 점이, 예를 들어 선형 회귀 분석을 사용하여 곡선으로 피팅된다.
안정성 검정
일부 구현예에서, 상기 방법은 LDC의 안정성을 결정하는데 사용된다.
예시적인 검정에서, LDC를 멸균 혈장에 배치하고, 37℃에서 인큐베이션한다. 인큐베이션의 시작, 및 1시간 내지 1 주 이상의 다양한 시점에서, 분취액을 취하여 -80℃에서 동결시킨다. 시점의 종결 시, 샘플을 리간드 및 컨쥬게이션된 약물을 특이적으로 추출하는 단백질 정제 방법에 적용시킨다. 예를 들어, 항체-약물 컨쥬게이트를 단백질 A 친화성 수지 상에 통과시켜 항체를 포획하고, 이어서 수지를 완충액으로 세척한다. 리간드-약물 컨쥬게이트의 포획 후, 1-30% (v/v) 트리플루오로아세트산으로 처리하여 약물을 포획된 리간드로부터 방출시킨다. 이어서, 방출된 약물을 표준 LC-MS 방법론에 의해 정량화한 후, 각 시점에서 측정된 약물의 양을 인큐베이션전 분취액에 대하여 측정된 약물의 양으로 나눈 값을 사용하여 각 시점에서 리간드에 컨쥬게이션된 남아있는 약물의 %를 결정할 수 있다. 이러한 검정의 정확성은 동일한 약물-링커의 동위원소 표지된 버전을 사용하여 제조된 내부 표준 리간드-약물 컨쥬게이트를 포함시킴으로써 개선될 수 있으며, 이로부터 방출되는 약물은 질량 차이로 인해 시험 약물-링커로부터 방출된 약물의 LC-MS 검정에서 독립적으로 검출될 수 있다. 이러한 동위원소 표지된 내부 표준 리간드-약물 컨쥬게이트는 리간드 포획 단계 직전에 동일한 양으로 각각의 샘플에 첨가된다 (예를 들어 단백질 A). 이어서, 시험 LDC로부터 방출된 약물 또는 약물의 일부의 정량화가 통상의 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS/MS) 기법에 의해 내부 표준물을 사용하여 수행된다. 약동학적 검정에 사용하기 위한 질량 분석 기법은 당업계에 공지되어 있다. (예를 들어, [Want et al., Spectroscopy 17:681-691 (2003)]; [Okeley et al., Clin Cancer Res. 16: 888-897 (2010)]; [Singh et al., DMD (2017)]; [Alley et al., Bioconjugate Chem. 19:759-765 (2008)] 참조).
다른 구현예에서, LDC가 대상에게 투여되고, LDC의 투여 후 상이한 시점에서 대상으로부터 샘플이 수득된다. 복수의 샘플이 LDC로부터 분석 표적의 측정을 위해 본원에 제공된 방법에 적용된다. 일부 구현예에서, 내부 표준물은 LDC와 함께 투여된다. 샘플에서 LDC의 양을 비교하여, 시간 경과에 따른 LDC의 안정성을 결정하는데 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, LDC는 생체 외에서 샘플에 첨가된다. LDC의 첨가 후 다양한 시점 후에 샘플이 수집된다. 복수의 샘플이 LDC로부터 분석 표적의 측정을 위해 본원에 제공된 방법에 적용된다. 일부 구현예에서, 내부 표준물은 LDC와 함께 샘플에 첨가된다. 샘플에서 LDC의 양을 비교하여, 시간 경과에 따른 생체외 LDC의 안정성을 결정하는데 사용할 수 있다.
다른 검정
본원에 제공된 방법은 리간드 당 약물의 평균 수를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 리간드 당 약물의 평균 수는 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 리간드 컨쥬게이션된 약물의 농도를 리간드의 농도로 나눔으로써 측정될 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 산 매개 절단 방법 및 관련 분석 방법은 샘플에서 LDC의 양을 결정하거나 LDC에 컨쥬게이션된 약물의 양을 결정하는데 의존하는 다양한 실험에 사용될 수 있다. 본원의 방법은, 예를 들어 질환 또는 장애의 치료를 위한 임상 작용제를 개발하는 맥락에서, LDC로부터 약물의 방출 동력학을 결정하는데 사용될 수 있다. 본원의 방법은 또한 LDC의 약동학을 연구하는데 사용될 수 있다. 본원의 방법은 임상 적용에서 LDC의 사용을 평가하는데 사용될 수 있다.
키트
또 다른 양태에서, 샘플에서 LDC의 양을 측정하거나, LDC에 컨쥬게이션된 약물의 양을 측정하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 본원에 기재된 바와 같은 검정을 수행하는데 유용한 하나 이상의 화학 성분 및 전형적으로 하나 초과의 화학 성분을 포함한다. 키트에서, 상이한 화학 성분은 전형적으로 선택적으로 검정을 수행하기 위한 지침서를 포함하는 함께 포장된 별도의 컨테이너에 선택된 양으로 제공된다. 주어진 키트에서 화학 성분의 양은 전형적으로 각각의 키트에 대하여 선택된 수의 검정을 수행하기 위해 선택된 양으로 제공된다. 예를 들어, 각각의 키트는 하나의 검정을 수행하도록 설계될 수 있으며, 따라서 주어진 검정에서 모든 단계를 수행하기에 충분한 양의 화학 종이 제공된다. 키트에는 선택적으로 또한 검정을 수행하는데 필요한 시약 또는 용매가 제공된다. 키트에는, 예를 들어 샘플로부터 주어진 LDC 또는 한 부류의 LDC를 추출하기 위한 시약이 제공될 수 있다. 일 구현예에서, 본원의 키트는 임의의 ADC를 포함하는 임의의 주어진 LDC에 대하여 적절하게 표지된 내부 표준물을 포함한다. 키트의 내부 표준물은 동위원소 표지된 LDC일 수 있으며, 여기서 표지는 약물에 위치한다. 이러한 키트는 또한 표준 곡선의 준비를 위해 표지되지 않은 LDC를 함유할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 키트는 임의의 선택된 항체를 포함하는 임의의 선택된 리간드에 링커 및 약물을 컨쥬게이션하기 위한 반응성기를 함유하는, 표지된 링커-약물 조합을 포함하는 시약을 포함한다. 보다 구체적으로, 상기 시약은 분석 표적의 방출 시, 표지가 분석 표적과 함께 방출되도록 약물 또는 이의 일부에 표지된다. 키트는 선택적으로 선택된 리간드 또는 항체와의 컨쥬게이션을 수행하기 위한 시약 또는 용매를 추가로 함유한다. 키트는 또한 표지되지 않은 LDC의 제조를 위한 표지되지 않은 링커-약물 시약을 함유할 수 있다. 키트는 표지되지 않은 또는 표지된 분석 표적, 예를 들어 산 처리에 의해 방출된 약물 또는 약물의 일부를 추가로 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 키트는 L-mc-MMAF 또는 L-DPR-PEG-gluc-카르바메이트-MMAE의 측정을 위한 내부 표준물로서 작용하는, 임의의 선택된 리간드 또는 항체에의 컨쥬게이션을 위한 동위원소 표지된 mc-MMAF 또는 동위원소 표지된 DPR-PEG-gluc-카르바메이트-MMAE를 함유한다. 이러한 키트는 임상 용도에 적합한 LDC의 개발을 위한 연구 보조수단으로 사용될 수 있다. 이러한 키트는 또한 환자에서 LDC 또는 LDC 약물 로딩을 모니터링할 필요가 있는 임상 적용에 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 링커-약물 조합 및 리간드를 컨쥬게이션하기 위한 별도의 포장으로의 한 쌍의 시약뿐 아니라, 단일 컨쥬게이션 반응에 필요한 시약을 포함한다. 키트는 선택적으로 반응을 수행하기 위한 용매 또는 완충액, 및 사용 지침서를 포함할 수 있다. 리간드와 약물-링커의 컨쥬게이션 방법은 당업계에 공지되어 있다. (예를 들어, [Lyon et al., Methods in Enzymology, vol. 52, pgs. 123-138, 2012]; [Sun et al., Bioconjugate Chem. 16:1282-1290, 2005] 참조). 내부 표준물 및 시약은 안정하거나 불안정한 동위원소로 동위원소 표지된다. 안정한 동위원소에는, 비제한적으로, 2H, 13C 및 15N이 포함된다. 방사성 또는 불안정한 동위원소에는, 비제한적으로, 3H, 14C 및 12N이 포함된다.
대안적으로, 내부 표준물은 상이한 분자량을 부여하지만, 동위원소 표지되지 않은 구조적 변형에 의해 LDC와 구별될 수 있다. 예를 들어, 내부 표준물은 분석 표적 내 위치에서 수소 대신 메틸기 또는 할로겐을 포함할 수 있다. 이는, 사실상, 분자량을 변화시키지만, 내부 표준물이 TFA와 반응하는 방식을 실질적으로 변화시키지는 않을 수 있다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 사용되는 주어진 분석물에 대한 임의의 내부 표준물은 주어진 분석 방법에서 분석물로서 거동하는 것을 확인하기 위해 평가되어야 한다.
실시예
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.
실시예 1: 검정 방법
실험 샘플, 보정물질(calibrator) 및 내부 표준물 (IS)의 제조
1. ADC 보정물질의 희석액을 샘플 매트릭스 (예를 들어, 완충액, 혈장, 등)에서 하기 항체-컨쥬게이션된 약물 (ADC)의 농도로 제조하였다:
a. 8점 보정 곡선: 10 μM, 4 μM, 1.6 μM, 640 nM, 256 nM, 102.4 nM, 41 nM, 16.4 nM ADC 당량
b. 블랭크를 포함시킴 (ADC 없음, 샘플 매트릭스만).
2. ADC 내부 표준물 ("IS")의 희석액을 샘플 매트릭스에서 500 nM ADC 당량의 단일 농도로 제조하였다.
3. 고정된 부피의 ADC IS를 250 μl 내지 1000 μl 범위의 최종 부피로 고정된 부피의 각각의 보정물질 또는 미지의 샘플과 조합하였다.
ADC 보정물질 및 IS의 공칭 농도 (단계 1 및 2), 및 IS와 ADC 보정물질 및 샘플의 혼합 후 최종 부피 (단계 3)는 실험마다 다르고; 이러한 값은 또한 분석되는 ADC에 따라 달라지며; 이러한 방법은 광범위한 적용을 가능하게 한다.
96-웰 필터 플레이트의 제조
단백질 A 아가로오스 MabSelect (GE Healthcare)를 1부의 아가로오스 수지 대 3부의 완충액의 슬러리 비로 완충액 (PBS, pH 7.4)에서 평형화시켰다.
800 μl의 슬러리 (200 μl 수지)를 필터 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 5분 동안 1250 x g에서 원심분리하여 수성 상을 제거하였다.
96-웰 폴리프로필렌 2 ml 희석 블록을 사용하여, 이 시점부터 각각의 원심분리 단계에 대한 완충액, 샘플 및 보정물질 통과액, 세척액 및 용리 부피를 수집하였다.
샘플 포획 및 용리
1. 200 μl ADC 보정물질 (+IS) 및 실험 샘플 (+IS)을 200 μl 단백질 A 수지에 첨가하고, 진탕시켰다 (1시간, 4℃, 약 1000 rpm).
2. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 샘플 매트릭스를 제거하였다.
3. 세척 완충액을 첨가하고 (1X PBS, pH 7.4; 200 내지 400 μl), 4℃에서 5분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 샘플 매트릭스의 제거를 완료하였다.
4. 세척 단계를 용리 전 1 내지 3회 수행하였다.
5. 수지로부터 ADC를 용리시키기 위해, 200 μl의 IgG 용리 완충액 (Thermo Scientific)을 첨가하고, 플레이트를 진탕기 상에 위치시켰다 (1시간, 4℃, 약 1000 rpm).
6. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 ADC/IS를 용리시켰다.
7. 단계 4 및 5를 반복하여 수지로부터 ADC/IS의 용리를 완료하였다. 용리된 ADC/IS의 조합 최종 부피는 400 μl였다.
샘플 처리
1. ADC/IS 보정물질 및 샘플 (IgG 용리 완충액 중)을 N2 가스 하60℃에서 4 시간 동안, 또는 플레이트가 건조될 때까지 증발시켰다.
2. 400 μl의 10% 트리플루오로아세트산 (TFA) (v/v)(물에 희석됨)을 첨가하고, 플레이트를 Teflon™-코팅된 실리콘 플레이트 매트로 밀봉하였다.
3. 밀봉된 플레이트를 재킷형 써모믹서(Thermomixer) 내에 위치시키고, 밤새 인큐베이션하였다 (70℃에서 약 16시간; 약 600 내지 800 rpm).
4. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 응축물을 침전시켰다.
5. ADC/IS 보정물질 및 샘플 (10% TFA 중, v/v)을 N2 가스 하 40℃에서 4 시간 동안, 또는 플레이트가 건조될 때까지 증발시켰다.
6. 500 μl의 얼음 냉각된 100% MeOH을 첨가하고, 플레이트를 플레이트 밀봉제로 덮고, 진탕기 상에 위치시켰다 (20분, 4℃, 약 1000 rpm).
7. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 4000 x g에서 원심분리하여 잔해물을 침전시켰다.
8. 500 μl 부피 중 400 μl를 자동 샘플 주입기(auto-sampler) 플레이트로 옮겼다.
9. ADC/IS 보정물질 및 샘플 (100% MeOH 중)을 N2 가스 하 40℃에서, 또는 플레이트가 건조될 때까지 증발시켰다.
10. 샘플을 0.1% 포름산 (FA) 중 95/5 CH3CN(아세토니트릴, ACN)/H2O 또는 0.1% FA 중 20% 아세토니트릴 1000 μl에서 재구성하였다. 단계는 사용된 크로마토그래피의 유형에 따라 달라졌다.
샘플 분석
1. LC 컬럼 및 질량 분석계를 평형화시켰다.
2. 20 μL의 재구성된 샘플을 LC에 주입하였다.
3. 질량 분석계에 직접 결합된, 방출된 분석 표적에 적절한 크로마토그래피를 제공하는 LC 컬럼을 사용하였고, 분석 표적 및 내부 표준물 단편 이온을 다중 반응 모니터링 (MRM) 작동 방법을 사용하여 모니터링하였다.
4. 분석 표적에 대한 피크 면적을 내부 표준물 분석 표적에 대하여 수득된 피크 면적으로 나누었다. 수득된 분석 표적/IS 피크 면적 비를 분석 표적 보정물질 농도 (ng/ml)의 함수로 플롯팅하고, 선형 회귀를 사용하여 점들을 곡선에 피팅하였다. 표준 곡선에 의해 결정된 선의 방정식을 사용하여, 샘플로부터 측정된 반응 비를 정량화하였다.
하기 분석은 구체적으로 DPR-PEG-gluc-카르바메이트-MMAE에 컨쥬게이션된 항체로부터의, 분석 표적으로서 MMAE의 방출에 관한 것이었다.
1. 액체 크로마토그래프에는 탠덤 질량 분석계가 결합된, 50 x 3.0 mm 5 μm 실리카 컬럼 (BETASILTM, ThermoFisher Scientific)이 장착되어 있었으며, 둘 모두 평형화되었다.
2. 20 μl의 재구성된 샘플을 주입하였다.
3. 이동상 A (H2O 중 0.1% 포름산) 및 이동상 B (ACN 중 0.1% 포름산)를 하기 구배 (표 1)로 사용하였으며, 예측된 MMAE (분석 표적) 체류 시간은 1.16분이었다.
Figure pct00007
4. 718 m/z에서 686 m/z로의 전이 (MMAE의 전구체 및 단편 이온), 및 726 m/z에서 694 m/z로의 전이 (d8-MMAE의 전구체 및 단편 이온)를 선택적으로 모니터링하는 다중 반응 모니터링 (MRM) LC-MS/MS 검정을 사용하여, MMAE 농도를 결정하였다.
5. 각각의 MMAE 표준물에 대한 피크 면적을 내부 표준물 d8-MMAE에 대하여 수득된 피크 면적으로 나누었다. 수득된 MMAE/d8-MMAE 피크 면적 비를 MMAE 표준물 농도 (ng/ml)의 함수로 플롯팅하고, 선형 회귀를 사용하여 점들을 곡선에 피팅하였다. 표준 곡선에 의해 결정된 선의 방정식을 사용하여, 샘플로부터 측정된 반응 비를 정량화하였다. MMAE 측정의 경우, LC-MS/MS 기기 제조업체로부터 입수 가능한 조작 및 데이터 분석 소프트웨어 (Analyst®1.6.1 및 MultiquantTM 버전 2.1, AB SCIEX)를 사용하여, LC-MS/MS 데이터를 획득하고 처리하였다.
실시예 2: 항체-약물 컨쥬게이트의 생체외 안정성
2가지 ADC의 생체외 안정성을 산-촉매화 가수분해 방법을 사용하여 평가하였다. ADC1 및 ADC2는 말레이미도카프로일 링커 (mc)를 이용하는 강력한 항유사분열 및 항튜불린 아우리스타틴 유도체 (모노메틸 아우리스타틴 F)인 mcMMAF에 컨쥬게이션된 항체이다.
약물에 대한 말레이미드 링커는 일반적으로 하기와 같이 표시된다:
Figure pct00008
mc 링커는, n인 5인 경우의 상기 링커이다. mcMMAF는, n이 5이고, 약물이 MMAF인 경우의 상기 종이다.
mcMMAF 링커-약물 조합은 효소적으로 절단 가능하지 않다.
스톡:
ㆍ ADC1 - PBS 중 7.1 mg/mL (4.3 약물/mAb; 203.5 uM mcMMAF 당량)
ㆍ IS1 - PBS 중 4.4 mg/mL (4.0 약물/mAb; 117.3 uM 표지된 mcMMAF 당량)
ㆍ ADC2 - PBS 중 5.5 mg/mL (4.1 약물/mAb; 150.3 uM mcMMAF 당량)
ㆍ IS2 - PBS 중 9.0 mg/mL (3.8 약물/mAb; 228.0 uM 표지된 mcMMAF 당량)
4 ml의 Na+ 시트르산 처리된 스프래그-돌리(Sprague-Dawley) 래트 혈장에, 250 μg/ml 농도의 ADC1 또는 ADC2를 접종하였다. 1 ml의 접종된 혈장을 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 표준 곡선 샘플에는 ADC1 또는 ADC2의 연속 희석액이 포함되어 있었다.
남아있는 3 ml의 접종된 혈장으로부터, 0시간, 6시간, 1일, 2일, 4일 및 7일의 시점에서 450 μl를 제거하였다. ADC1 (IS1) 및 ADC2 (IS2)에 대한 내부 표준물을 제조하였다. 내부 표준물은 각각 질량에 6 amu를 추가하는, 13C-표지된 약물 (구체적으로, MMAF의 페닐 고리가 6 13C로 표지됨)을 포함하고 있었다. 내부 표준물을 10 μM 약물-링커 당량 ([5X] 농도)으로 시트르산 처리된 래트 혈장 내로 희석시켰다.
96-웰 샘플/표준물 예비플레이트(pre-plate)의 제조. 각각의 ADC 샘플 200 μl 및 각각의 표준 곡선 샘플을 3회 혼합하고, 역 피펫팅(reverse pipetting)에 의해 96-웰 350 μl/웰 플레이트에 예비플레이팅하였다. 50 μl의 내부 표준물을 ADC 샘플 및 표준 곡선 샘플에 첨가하였다. 각각의 플레이팅된 샘플을 3 내지 5회 혼합하였다.
96-웰 필터 플레이트의 제조. 단백질 A 아가로오스를 세척하고, 1부의 수지 대 3부의 완충액의 슬러리 비 (800 μl 슬러리 중 200 μl 수지 층)로 PBS (pH 7.4)에서 평형화시켰다. 800 μl 슬러리 부피의 단백질 A 아가로오스를 96-웰 필터 플레이트 상의 적절한 위치에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 1250 x g에서 원심분리하여 수성 상을 제거하였다.
각각의 ADC 샘플 200 μl 및 각각의 표준 곡선 샘플을 3회 혼합하고, 역 피펫팅에 의해 필터 플레이트 상의 적절한 위치로 옮겼다.
플레이트를 4℃에서 1시간 동안 750 내지 1000 rpm으로 설정된 역가 플레이트 진탕기에 고정시켰다.
96-웰 필터 플레이트로부터의 통과액 분획을 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 96-웰 2 ml 수집 플레이트로 회수하였다.
각각의 수지 층을 200 μl의 세척 완충액 (40 mM KPO4, 20 mM EDTA)으로 1회 세척하였다. 세척액 분획을 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 회수하고, 따로 두었다.
ADC 용리. 200 μl의 IgG 용리 완충액을 각각의 수지 층에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 5 분 동안 약 1000 rpm으로 써모믹서 상에 위치시켰다. 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 용리액을 2 ml 수집 플레이트로 회수하였다. 추가 200 μl의 용리 완충액을 각각의 수지 층에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 5 분 동안 약 1000 rpm으로 써모믹서 상에 위치시켰다. 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 용리액을 2 ml 수집 플레이트로 회수하였다. 이로써 최종 용리 부피 400 μl를 얻었다.
용리액을 N2 가스 하 60℃에서 3 내지 4시간 동안 증발시켰다.
증발 후, 400 μl의 10%v/v 트리플루오로아세트산 (TFA) (물 중에 희석됨)을 각각의 웰에 첨가하였다. 테플론-코팅된 실리콘 플레이트 매트를 사용하여 96-웰 플레이트를 밀봉하였다. 플레이트를 재킷형 써모믹서 내에 위치시키고, 70℃에서 약 850 rpm으로 밤새 (약 16시간) 인큐베이션하였다.
96-웰 플레이트를 강한 회전 (4000 x g, 5 분)에 적용하여, 단백질 침전물을 펠릿화하였다. 300 μl를 회수하고, 새로운 96-웰 2 ml 수집 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 N2 가스 하 40℃에서 2 내지 3시간 동안 증발시켰다.
각각의 샘플을 33% CH3CN (아세토니트릴)/0.1% v/v 포름산 300 μl에 재현탁시켜 용해시키고, 약 1000 rpm으로 3 분 동안 볼텍싱하였다.
플레이트를 5 분 동안 500 x g에서 회전시키고, 각각의 샘플 200 μl를 실란화 유리 삽입물을 사용하여 HPLC 바이알로 옮겼다.
각각의 샘플 25 μl를 사중극자-비행 시간 (Q-TOF) 질량 분석계를 통해 분석하였다.
모든 시점 및 상응하는 표준 곡선을 처리하고, 방출된 MMAF의 농도를 결정하였다. 결과는 도 1에 제시되어 있다.
실시예 3: 임상 샘플 분석
ADC3로 치료받은 환자로부터의 임상 샘플을 분석하였다. ADC3은 mcMMAF-컨쥬게이션된 항체이다.
스톡:
ㆍ ADC3 - PBS 중 15 mg/mL (4 약물/mAb)
ㆍ IS3 - PBS 중 4.59 mg/mL (3.6 약물/mAb; 110.2 μM mcMMAF 당량)
ADC3 표준 곡선 샘플을 K2EDT인간 혈장 내로 희석시켰다. 내부 표준물 (50 μM ADC 당량으로 희석됨)을 또한 샘플/표준물 당 100 μl가 되도록 K2 EDT인간 혈장 내로 희석시켰다.
96-웰 샘플/표준물 예비플레이트의 제조. 각각의 샘플 100 μl 및 표준 곡선 샘플을 혼합하고, 96-웰에 예비플레이팅하였다. 이어서, 200 μl의 내부 표준물을 각각의 샘플/표준 곡선 샘플에 첨가하였다. 500 μl의 PBS-T를 각각의 웰에 첨가하였다.
96-웰 필터 플레이트의 제조. 단백질 A 아가로오스를 세척하고, 1부의 수지 대 3부의 완충액의 슬러리 비 (800 μl 슬러리 중 200 μl 수지 층)로 PBS (pH 7.4)에서 평형화시키고, 사용 전 4℃에서 스톡 용액으로 보관하였다. 800 μl 슬러리 부피 (200 μl 수지 층)의 단백질 A 아가로오스를 96-웰 필터 플레이트 상의 적절한 위치에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 1250 x g에서 원심분리하여 수성 상을 제거하였다.
각각의 샘플/표준 곡선 샘플/PBS-T 700 μl를 3회 혼합한 후, 역 피펫팅에 의해 필터 플레이트 상의 적절한 위치로 옮겼다.
플레이트를 4℃에서 1시간 동안 750 내지 1000 rpm으로 설정된 역가 플레이트 진탕기에 고정시켰다.
96-웰 필터 플레이트로부터의 통과액 분획을 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 96-웰 2 ml 수집 플레이트로 회수하였다.
각각의 수지 층을 200 μl의 PBS로 1회 세척하였다. 세척액 분획을 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 회수하고, 따로 두었다.
ADC 용리. 200 μl의 IgG 용리 완충액을 각각의 수지 층에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 5 분 동안 약 1000 rpm으로 써모믹서 상에 위치시켰다.
4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 용리액을 2 ml 수집 플레이트로 회수하였다. 추가 200 μl의 IgG 용리 완충액을 각각의 수지 층에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 5 분 동안 약 1000 rpm으로 써모믹서 상에 위치시켰다. 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 용리액을 2 ml 수집 플레이트로 회수하였다. 이로써 최종 용리 부피 400 μl를 얻었다.
10% v/v TFA를 제공하도록 40 μl의 100% TFA를 각각의 웰에 첨가하여 테트라펩티드 분석 표적을 방출시켰다. 테플론TM-코팅된 실리콘 플레이트 매트를 사용하여 96-웰 플레이트를 밀봉하였다. 플레이트를 재킷형 써모믹서 내에 위치시키고, 화학 흄 후드 내에서 70℃에서 약 850 rpm으로 밤새 (약 16시간) 인큐베이션하였다.
96-웰 플레이트를 강한 회전 (4000 x g, 5 분)에 적용하여, 단백질 침전물을 펠릿화하였다. 300 μl를 회수하고, 새로운 96-웰 2 ml 수집 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 N2 가스 하 40℃에서 2 내지 3시간 동안 증발시켰다.
각각의 샘플을 2% 아세토니트릴 + 0.1% 포름산 100 μl에 재현탁시켜 용해시키고, 약 1000 rpm으로 3 분 동안 볼텍싱하였다.
LC-MS/MS를 사용하여 샘플 내 분석 표적을 분석하였다. ELISA 검정을 사용하여 샘플 내 항체의 양을 측정하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있으며, 항체 당 약물로서 플롯팅되어 있다.
실시예 4: 항체-약물 컨쥬게이트 ( 분석물 단편)의 생체내 안정성
10 mg/kg 또는 20 mg/kg의 ADC4로 처리된 래트에서 ADC4의 안정성을 분석하였다. ADC4는 페길화된 모노메틸 아우리스타틴 E (DPR-PEG-gluc-카르바메이트-MMAE)-컨쥬게이션된 항체이다. MMAE 링커는 페길화되어 있고, 디아미노프로피온산, 및 β-글루쿠로니다아제에 의해 절단 가능한 β-글루쿠로니드를 함유하고 있다 (하기 구조 참조). 산 방출 생성물은 MMAE (분석 표적)이다.
mal-peg-카르바메이트-MMAE는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00009
카르바메이트를 형성하기 위한 MMAE에의 링커의 카르보네이트의 컨쥬게이션은, TFA로의 처리 시 전체 MMAE 약물의 절단을 용이하게 하는 것으로 여겨진다.
스톡:
ㆍ PBS 중 5.4 mg/mL의 ADC4 (36.0 uM ADC) (7.93 약물/mAb; 285.5 MMAE 당량)
ㆍ PBS 중 7.03 mg/mL의 IS4 (46.9 uM ADC) (7.93 약물/mAb; 371.9 uM d8-MMAE 당량)
K2EDTA 래트 혈장에 ADC4 및 내부 표준물을 접종하였다. 내부 표준물은 질량에 8 Da을 추가하는, 2H-표지된 MMAE를 포함하고 있었다. MMAE 표준 곡선 샘플을 또한 제조하였다.
예비플레이트를 제조하였다 (실시예 1 참조).
96-웰 필터 플레이트의 제조. 단백질 A 아가로오스를 세척하고, 1부의 수지 대 3부의 완충액의 슬러리 비 (800 μl 슬러리 중 200 μl 수지 층)로 PBS (pH 7.4)에서 평형화시켰다. 800 μl 슬러리 부피 (200 μl 수지 층)의 단백질 A 아가로오스를 96-웰 필터 플레이트 상의 적절한 위치에 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 1250 x g에서 원심분리하여 수성 상을 제거하였다.
예비플레이트로부터의 각각의 표준물 200 μl를 3회 혼합한 후, 필터 플레이트 상의 적절한 위치로 옮겼다.
플레이트를 4℃에서 1시간 동안 약 900 rpm으로 설정된 역가 플레이트 진탕기에 고정시켰다.
96-웰 필터 플레이트로부터의 통과액 분획을 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 96-웰 2 ml 수집 플레이트로 회수하였다.
각각의 수지 층을 400 μl의 1X PBS (pH 7.4)로 2회 세척하였다. 세척액 분획을 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 회수하고, 따로 두었다.
ADC 용리. 200 μl의 IgG 용리 완충액을 각각의 수지 층에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 5 분 동안 약 900 rpm으로 써모믹서 상에 위치시켰다.
4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 용리액을 2 ml 수집 플레이트로 회수하였다. 추가 200 μl의 용리 완충액을 각각의 수지 층에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 5 분 동안 약 900 rpm으로 써모믹서 상에 위치시켰다. 4℃에서 5 분 동안 2000 x g에서 원심분리하여 용리액을 2 ml 수집 플레이트로 회수하였다. 이로써 최종 용리 부피 400 μl를 얻었다.
샘플을 N2 가스 하 60℃에서 3 내지 4시간 동안 증발시켰다.
증발 후, 400 μl의 10% TFA (H2O 중에 희석됨)를 각각의 웰에 첨가하였다. 테플론-코팅된 실리콘 플레이트 매트를 사용하여 96-웰 플레이트를 밀봉하였다. 플레이트를 재킷형 써모믹서 내에 위치시키고, 70℃에서 약 650 rpm으로 밤새 (약 16시간) 인큐베이션하였다.
96-웰 플레이트를 2000 x g에서 5 분 원심분리하여, 웰의 측면으로부터 응축물을 침전시켰다. 플레이트를 N2 가스 하 40℃에서 약 4시간 동안 증발시켰다.
증발 후, 500 μl의 얼음 냉각된 MeOH을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 밀봉제로 덮고, 4℃에서 20분 동안 역가 플레이트 진탕기 상에 위치시켰다.
플레이트를 강한 회전 (4000 x g, 5 분)에 적용하였다. 400 μl (총 부피 500 μl 중)를 자동 샘플 주입기 플레이트로 옮겼다.
자동 샘플 주입기 플레이트를 건조될 때까지 N2 가스 하 40℃에서 증발시켰다. 샘플을 0.1% FA 중 95/5 아세토니트릴/H2O 1000 μl에서 재구성하였다.
LC-MS/MS를 사용하여 샘플을 분석하였다. 결과는 도 3에 제시되어 있다.
실시예 5: 증강된 안정성을 갖는 항체-약물 컨쥬게이트의 개발
강력한 세포독성제에 부위-특이적으로 컨쥬게이션될 수 있는 조작된 시스테인 항체 (S239C, E269C, K326C 및 A327C)의 수집물을 생성하고, 이의 안정성을 본원에 제공된 방법에 의해 시험하였다. 실험에서, 거의 100% 안정성을 갖는 균질한 2-로딩된 ADC를 확인하였다. 나아가, ADC의 안정성이 HIC에 의해 측정 시 명백한 소수성과 상관관계가 있다는 것을 관찰하였으며, 이는 티오숙신이미드 가수분해를 촉매화하지 않고 안정성을 부여하기 위한 추가의 수단으로서의 화학적 격리를 시사한다.
구조 분석 및 분자 모델링
온전한 항체, 및 Fc 감마 수용체 3에 결합된 인간 Fc 영역 (각각, 수탁 번호 1HZH 및 1E4K)의 단백질 데이터베이스 파일을 분석에 사용하였다. Pymol (Schrodinger, 2010)을 사용하여 도 4a에 제공된 바와 같은 분자 구조 모델을 생성하였다. Fc 감마 수용체 3에 결합된 인간 Fc 영역 (수탁 번호 1HZH)을 주형으로서 사용하여, 선택된 잔기 (K326, S239, E269 및 A327)를 가상 실험으로 시스테인으로 전환시키고, 새로운 잔기에 대한 용매 접근성을 GETAREA (Fraczkiewicz and Braun, 1998)를 사용하여 계산하였다. 4개의 잔기에 대한 용매 접근성은 도 4b에 제시되어 있으며, 이는 부위간 최대 5배 차이를 보여준다. 또한, 조작된 시스테인 항체 (S239C, E269C, K326C 및 A327C)에 대하여 APBS (Baker et al., 2001)를 사용하여 정전기적 계산을 수행하고, 도 4c에 나타내었다.
컨쥬게이트 제조
추가의 중쇄 시스테인 잔기로 조작된 인간화 항-CD70 (h1F6) (S239C, E269C, K326C 및 A327C) (McEarchern et al., 2008)을, 절단 가능하지 않은 아우리스타틴, 말레이미도카프로일 모노메틸아우리스타틴 F (mcMMAF), 및 프로테아제-절단 가능한 피롤로벤조디아제핀 또는 산드라마이신 (Biomar) 약물 링커에, 상기 기재된 프로토콜 (Jeffrey et al., 2013)에 따라 컨쥬게이션하였다. 간략하게, 10 당량의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP) 및 1 mM EDTA를 첨가하고, 1M Tris 완충액 (pH 9.0)을 이용하여 pH를 7.4로 조정하여, 항체를 완전히 환원시켰다. 37℃에서 1시간 인큐베이션 후, 반응액을 22℃까지 냉각시키고, 30 당량의 데히드로아스코르브산을 첨가하였다. pH를 1M Tris-HCl 완충액 (pH 3.7)을 이용하여 pH 6.5로 조정하고, 산화 반응을 22℃에서 1시간 동안 진행시켰다. 이는 본래 디술파이드의 재형성을 유도하였지만, 조작된 중쇄 시스테인을 컨쥬게이션에 이용 가능한 환원된 상태로 유지시켰다. 이어서, 용액의 pH를 1M Tris 완충액 (pH 9.0)을 첨가하여 pH 7.4까지 다시 상승시켰다. 이어서, 2.5 당량의 약물-링커를 첨가하여 컨쥬게이션을 수행하고, 반응을 22℃에서 30 분 동안 진행시켰다. 생성된 컨쥬게이트를 일회용 PD-10 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 약물 로딩 정도 및 약물 부착 부위는 ADC를 디티오트레이톨로 환원시킨 후, PLRP 컬럼 상에서의 HPLC 분석, 및 중쇄 및 경쇄 성분의 통합에 의해 결정되었다 (Sun et al., 2005). 응집 정도는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정되었다. HPLC 및 질량 분석법 및 본 개시내용에 기재된 방법을 사용한 온전한 ADC의 분석은, 예측된 바와 같이 mAb 당 약 2개의 약물을 갖는 ADC의 균일한 집단이며 (도 5); 반대로 야생형 mAbs는 이러한 조건 하에서 임의의 약물-링커와 결합하지 않는다는 것을 확인시켜주었다.
EC 부위 컨쥬게이션 확인
야생형 (WT Fc), 조작된 시스테인 항체 (S239C) 및 컨쥬게이션된 ADC (S239C + 약물)를 엔도프로테이나아제 Glu-C (Sigma-Aldrich)로의 프로테아제 처리에 적용하였다. Glu-C로의 소화는, 위치 233에서 힌지 시스테인의 C-말단 절단된 Fc 단편을 유리시켰다. 이러한 Fc 단편의 질량 분석은, 야생형 ADC가 소화될 때, 생성되는 Fc 단편이 위치 233의 N-말단 측에 있는 모든 컨쥬게이션 부위와 일치하는, 컨쥬게이션의 징후를 나타내지 않는 24,054 Da의 질량을 가짐을 나타냈다 (도 5, 상단 패널). S239C 항체의 소화는, 세린과 시스테인의 질량 차이에 해당하는 16 Da의 질량이 추가된, 총 24,070 Da의 Fc 단편을 생성하였다 (도 5, 중간 패널). S239C 순수한 2-로딩된 ADC의 소화는, 세린과 시스테인의 질량 차이 및 약물 링커의 첨가에 해당하는 942 Da의 질량이 추가된, 총 24,995 Da의 Fc 단편을 생성하였다 (도 5, 하단 패널). 질량 스펙트럼 (도 5)은, 돌연변이체 Fc 영역만이 약물 링커와 결합하며, 도입된 시스테인 (S239C)이 컨쥬게이션의 신규한 부위임을 입증한다. 유사한 결과를 모든 조작된 시스테인 항체 (E269C, K326C 및 A327C)에서 볼 수 있으며, 상응하는 Fab의 질량 분석 스펙트럼은, 모든 내인성 시스테인이 디술파이드 결합으로 존재하고, 약물 링커에 컨쥬게이션되지 않았음을 보여주었다 (데이터는 제시되지 않음).
생체외 말레이미드 안정성
단백질 A 수지 (ProSepA, Millipore)와 함께 인큐베이션하고, 4℃에서 밤새 회전시킨 후, 여과하여 (Ultrafree-MC Centrifugal Filter, Millipore) 수지를 제거함으로써, 래트 혈장 (Bioreclamation IVT)으로부터 IgG를 제거하였다. ADC를 IgG-결핍된 혈장 (0.25 mg/mL)에 접종하였다. 분취액 (200 μL)을 즉시 (t = 0일) 제거하고, 남아있는 샘플을 37℃에서 최대 7일 동안 인큐베이션하였다. 관련 시점에서, 시험물 및 내부 표준물을 추출하고, 소화시켰다. MMAF (Val-Dil-Dap-Phe)로부터의 N-말단 아미노산에 해당하는 테트라펩티드 생성물을 고체상 추출을 사용하여 정제하고, 사중극자-비행 시간 (QTOF) 질량 분석법에 의해 표준물을 기준으로 정량화하였다. 본 개시내용의 방법을 이용하여 ADC로부터 테트라펩티드를 방출시키고, 방출된 양을 정량화하였다.
본 발명자들은, 약물 컨쥬게이트의 역-마이클 손실을 거치는 말레이미드의 경향이 (도 7a) 컨쥬게이션의 부위에 따라 달라졌으며, 여기서 야생형 4-약물 로딩된 ADC가 가장 민감하였고, 7 일에 걸쳐 약물 로딩의 대략 40%를 손실했다는 것을 발견하였다. 이에 비해, S239C는 가장 안정하였고, 동일한 기간에 걸쳐 10% 미만을 손실하였다. A327C, E269C 및 K326C는, 각각, 21%, 28% 및 26%의 중간정도의 약물 손실 수준을 나타냈다 (도 7b).
생체외 말레이미드 가수분해
단백질 A 수지 (ProSepA, Millipore)와 함께 인큐베이션하고, 4℃에서 밤새 회전시킨 후, 여과하여 (Ultrafree-MC Centrifugal Filter, Millipore) 수지를 제거함으로써, 래트 혈장 (Bioreclamation IVT)으로부터 IgG를 제거하였다. ADC를 IgG-결핍된 혈장 (0.25 mg/mL)에 접종하였다. 분취액 (500 μL)을 즉시 (t = 0일) 제거하고, 남아있는 샘플을 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 각각의 샘플 (500 μL)을 300 μL ProSepA 수지와 함께 회전시켜 ADC (50% PBS 슬러리, 4℃ 밤새)를 포획한 후, Ultrafree-MC 스핀 컵 (1 분, 11,000 x g)을 통해 여과하였다. 수지-결합된 ADC를 PBS (3 x 500 μL)로 세척하고, 300 μL IgG 용리 완충액 (Thermo Scientific)으로 30 μL 1M Tris (pH 8)로 용리시켰다. 각각의 용리액 (100 μL)의 샘플을 1 μL PNGase F (500 U/μL, New England Biolabs) 및 5 μL LysC (0.1 μg/μL, Promega)로 실온에서 30 분 동안, 이어서 37 ℃에서 25 분 동안 처리한 후, 100 mM 디티오트레이톨 (10 μL)을 첨가하고, 37℃에서 추가 15 분 인큐베이션하였다. PLRP-S 크로마토그래피 및 전기분무 이온화 QTOF 질량 분석법을 통해 LC-MS를 사용하여 샘플을 조사하였다. MassLynx 4.0에서 MaxEnt1 기능을 사용하여 데이터를 분리하였다. 탈글리코실화된 HC Fc + mcMMAF와, 탈글리코실화된 HC Fc + mcMMAF + 물의 피크 높이를 사용하여, 가수분해된 약물 링커의 %를 계산하였다.
인큐베이션전 샘플은, 일정한 양의 말레이미드 가수분해 (약 15%)를 나타냈으며, 이는 모든 돌연변이체 ADC에 대하여 약 20 Da의 질량 증가를 나타냈다. 인큐베이션후 샘플은 극적으로 상이한 추가의 개환 수준을 가졌다: S239C, A327C, E269C 및 K327C에 대하여, 각각 7%, 9%, 61% 및 65% (표 3). 이러한 결과는, 역-마이클 제거에 대한 안정성과, 약물 링커의 화학적 미세환경에 의한 가수분해율 증강 사이에 거의 완벽한 역의 상관관계가 있음을 나타낸다.
Figure pct00010
컨쥬게이션 부위의 생물물리학적 특징분석
티오숙신이미드 결합의 가수분해 및 안정화의 이러한 차등적 비율의 원인을 조사하기 위해, 본 발명자들은 조작된 컨쥬게이션 부위의 몇몇 상이한 속성을 조사하였다: 1) 컨쥬게이션 부위를 둘러싼 정전기적 환경 (도 4c); 2) 조작된 시스테인의 계산된 용매 접근성 (도 4b); 및 3) 조작된 ADC 각각의 명백한 소수성 (표 3).
국소적으로 하전된 잔기는 양성자 제거를 촉진 또는 방지하여, 말레이미드 컨쥬게이트의 안정화 또는 제거를 유도한다. 따라서, 본 발명자들은 정전기 전위에 의해 조작된 Fc 도메인 모델의 용매 접근 가능 표면을 분석하였다. 컨쥬게이션 부위를 둘러싼 이러한 전위의 육안 검사는, K326C 및 E269C ADC에서 개환을 촉진시킬 수 있는 이온화 가능한 잔기의 일정하지 않은 배치를 보여주었다. 사실, 이러한 도입된 시스테인은, 각각, 염기성 및 산성 환경에 있으며, 가수분해에 대한 안정성 또는 민감성에서 차이를 나타내지 않았다. 본 발명자들은, 각각, 염기성 및 산성 환경에 있는, S239C 및 A327C를 안정화시킬 수 있는 하전된 잔기도 발견하지 못했다.
컨쥬게이트 가수분해는 티오숙신이미드의 카르보닐 원소에 대한 용매 분자의 접근성을 필요로 한다. 위치 239에서 컨쥬게이션된 말레이미드는 단순히 용매로부터 차폐되어, 이러한 반응에 참여하지 못할 수 있다. 컨쥬게이션 부위에 대한 용매 접근성이 티오숙신이미드 가수분해의 경향을 예측하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 가상 실험으로 생성된 모델의 코놀리(Connolly) 표면을 계산하였다. 본 발명자들은, 노출된 표면적과 가수분해율 사이에 상관관계가 없다는 것을 발견하였다 (도 4c). 하지만, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 사용할 때, 컨쥬게이트의 체류 시간과 약물-링커 안정성 사이에서 상관관계를 확인하였다. 이러한 검정은, 가장 덜 안정하며 가수분해가 가장 빠른 조작된 ADC (E269C 및 K326C)가 또한 가장 명백한 소수성을 나타낸다는 것을 보여준다.
경쟁 결합
PBS 중의 1 x 105개의 항원 발현 세포 (786-0)를 얼음 상의 96-웰 V-바닥 플레이트의 각각의 웰에 분취하였다. 세포를 600 nM AlexaFluor-647 표지된 야생형 m1F6, 및 증가하는 농도 (0.19 nM에서 600 nM)의 표지되지 않은 돌연변이체 또는 야생형 ADC와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 펠릿화하고, PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 펠릿화하고, 125 μL의 PBS/BSA에 재현탁시켰다. 포화된 형광 신호의 %를 사용하여 유세포 분석법에 의해 형광을 분석하여 결합된 표지 항체의 %를 결정한 후, 데이터를 가변 기울기를 갖는 S자형 용량-반응 곡선으로 피팅하여 EC50를 외삽하였다.
경쟁 항체가 형광 신호를 50% 감소시키는 농도는, 표 2에 IC50 로서 보고되어 있다. 야생형 및 시스테인 돌연변이체는 측정 오차 내에서 동일하였으며, 이는 시스테인 치환 및 후속 컨쥬게이션이 ADC에 의한 표적의 관여에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 이러한 ADC 수집물의 상대적 친화성을 측정하는 것 이외에, 본 발명자들은 항원 발현 세포에 미치는 세포독성 영향을 조사하였다 (표 2). 놀랍게도, 모든 돌연변이체 ADC는, 돌연변이체 ADC에 대한 공칭 약물 용량이 야생형 ADC의 절반에 불과하다는 사실에도 불구하고, CD70 양성 세포와 함께 인큐베이션될 때, 야생형 ADC와 유사한 효능을 가졌다.
Figure pct00011
표 2 범례: 상대적 결합 친화성을 정량화하기 위해, 고정된 농도의 형광 표지된 모 항체를 증가하는 농도의 표지되지 않은 돌연변이체 또는 모 항체로 적정하고, 항원 발현 세포에 적용하였다. 경쟁 항체가 형광 신호를 50% 감소시키는 농도는 IC50로 보고된다. 시험관내 활성을 평가하기 위해, 증가하는 농도의 ADC를 항원 발현 세포에 적용하였다. 최대 반응의 절반을 제공하는 ADC의 농도는 EC50로 보고된다.
시험관내 세포독성 활성 검정
786-0 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에서 입수하고, 제조업자가 권장한 배양 조건에서 번식시켰다. 세포를 흑색 측면 투명 바닥 96-웰 플레이트 (Costar, Corning)에 웰 당 150 μL 성장 배지에 플레이팅하였다. 24시간 후, 약물 스톡을 8-점 용량 곡선을 생성하는 5배 연속 희석액으로 적정하고, 웰 당 50 μl로 이중으로 첨가하였다. 이어서, 세포를 37℃, 5% CO2에서 96시간 동안 인큐베이션하였다. 100 μL Cell Titer Glo (Promega) 용액과 함께 0.5 시간 동안 인큐베이션하여 세포독성을 측정한 후, EnVision Xcite 플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 상에서 발광을 측정하였다. 데이터를 엑셀 (Microsoft) 및 그래프패드(GraphPad) (Prism)로 처리하여 용량 반응 곡선을 생성하고, IC50 값을 생성하고, 데이터를 수집하였다.
생체내 활성 연구
786-O 모델을 확립하기 위해, 5x106개의 세포를 무흉선 nu/nu 암컷 공여자 마우스 (Harlan)의 우측 측면에 이식하였다. 공여자 마우스가 약 500 mm3 [(L x W2)/2]였을 때, 마우스를 안락사시키고, 종양을 무균 절제하고, 약 0.5 x 0.5 mm 단편을 마취된 마우스에 이식하기 위해 멸균된 13-게이지 투관침에 로딩하였다. 종양이 약 100 mm3에 도달하였을 때, 마우스를 처리군으로 무작위 할당하고, 단일 시점에서 10 mg/kg ADC로 복강내 주사를 통해 투약하였다. 종양을 주2회 측정하고, 식 V = (L x W2)/2를 사용하여 부피를 계산하였다. 종양이 약 1,000 mm3에 도달했을 때, 동물을 안락사시켰다. 식 (A x B2)/2 (여기서, A 및 B는, 각각, 최대 및 두 번째 최대의 수직 종양 치수임)을 사용하여 종양 부피를 계산하였다. 마우스의 평균 종양 부피 및 중량을 모니터링하고, 종양 부피가 약 1,000 mm3에 도달했을 때, 마우스를 종결시켰다.
단일 용량 786-0 생체내 효능 모델 (도 6)에서, 모든 ADC는 미처리 마우스와 비교하여 종양 성장에 유의한 영향을 미쳤다. 하지만, 돌연변이체간 성능의 차이가 있었다. 돌연변이체 중에서, 2-로딩된 S239C가 야생형 4-로딩 ADC와 유사하게, 약 25일 동안 종양 성장을 지연시키는 최고 종양 성장 억제를 나타냈다. A327C는 S239C보다 약간 덜 효과적이었지만 (10일 동안 종양 성장을 지연시킴), 이는 동일한 활성을 갖고 단지 약 5일 동안만 종양 성장을 지연시켰던 E269C 및 K326C보다 성능이 우수하였다.
참조에 의한 인용
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허 출원 및 다른 문헌은, 각각의 개별 간행물, 특허 출원 및 다른 문헌이 모든 목적을 위하여 참조로서 인용되는 것으로 제시된 바와 동일한 정도로, 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
등가물
본 개시내용은, 특히, 칸나비노이드 조성물 및 주변 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 칸나비노이드 및 주변 조성물을 투여하여 신경변성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 특정 구현예가 예시 및 기재되었지만, 상기 명세서는 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명(들)의 사상 및 범위에서 벗어나지 않는 한 다양한 변화가 이루어질 수 있다고 이해될 것이다. 본 명세서를 검토하면, 다수의 변형이 당업자에게 명백해질 것이다.

Claims (41)

  1. a. 리간드-약물 컨쥬게이트(LDC)를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 LDC는 리간드 및 분석 표적을 포함하고, 분석 표적은 약물 분자 또는 이의 일부를 포함하는 단계; 및
    b. 샘플을 1 내지 30% (v/v) 농도의 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시켜, LDC로부터 분석 표적의 방출을 유도하는 단계를 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    a. LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계; 및
    b. 방출된 분석 표적의 양을 사용하여 샘플에서 약물 분자 또는 이의 일부의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계가 분석 표적을 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC-MS)에 적용하는 것을 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계가 분석 표적을 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS/MS)에 적용하는 것을 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 샘플에서 리간드의 양을 측정하는 단계; 및
    b. 측정된 리간드의 양을 사용하여 샘플에서 약물 분자 또는 이의 일부의 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시키는 단계 전에 샘플로부터 LDC를 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, LDC를 수집하는 단계가 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피 또는 면역침강법에 의해 수행되는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계가 LDC의 표준 곡선을 사용하여 수행되는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 샘플에 고정된 양의 내부 표준물을 첨가하는 단계로서, 여기서 내부 표준물은 리간드 및 제2 분석 표적을 포함하고, 제2 분석 표적은 LDC의 표지된 유도체인 단계;
    b. 샘플을 1 내지 30% (v/v) 농도의 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시켜, LDC로부터 분석 표적의 방출 및 내부 표준물로부터 제2 분석 표적의 방출을 유도하는 단계;
    c. 내부 표준물로부터 방출된 제2 분석 표적의 양을 측정하는 단계; 및
    d. 내부 표준물로부터 방출된 제2 분석 표적의 양을 기반으로 LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제2 분석 표적이 분석 표적과 상이한 분자량을 갖는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 내부 표준물이 LDC의 동위원소 표지된 버전을 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 동위원소 표지가 안정하거나 불안정한 것인, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 동위원소 표지가 중수소 또는 탄소-13인, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시키는 단계 전에 샘플로부터 LDC 및 내부 표준물을 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, LDC 또는 내부 표준물을 수집하는 단계가 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전법, 이온 교환 크로마토그래피, 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피 또는 면역침강법에 의해 수행되는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  16. 제7항 또는 제15항에 있어서, 리간드가 항체 또는 이의 기능성 단편이고, LDC 또는 내부 표준물이 샘플을 단백질 A 수지, 단백질 G 수지 및 단백질 L 수지로부터 선택되는 수지와 접촉시킴으로써 샘플로부터 수집되는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 10% (v/v) 농도의 수성 트리플루오로아세트산 (TFA)과 접촉시키는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 분자가 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 또는 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)인, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 약물 분자가 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF)인, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 표적이 테트라펩티드인 Val-Dil-Dap-Phe를 포함하는, 샘플에서 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)를 분석하는 방법.
  21. a. 리간드-약물 컨쥬게이트(LDC)에 노출 후 상이한 시점에서 단일 공급원으로부터 제1 샘플 및 제2 샘플을 수득하는 단계;
    b. 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제1 샘플 및 제2 샘플에서 LDC를 분석하여, 제1 샘플 및 제2 샘플에서 LDC로부터 방출된 분석 표적의 양을 결정하는 단계; 및
    c. 제1 샘플 및 제2 샘플에서 방출된 분석 표적의 양을 비교하여 LDC의 안정성을 결정하는 단계를 포함하는, 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)의 안정성을 결정하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    a. 제1 샘플 및 제2 샘플에서 리간드의 양을 측정하는 단계; 및
    b. 제1 샘플 및 제2 샘플에서 방출된 분석 표적과 리간드의 양의 비를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)의 안정성을 결정하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 샘플 또는 제2 샘플인 샘플이 포유류 조직 또는 수성 포유류 체액에서 유도된 생물학적 샘플인, 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)의 안정성을 결정하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈장, 혈청, 혈액, 조직, 조직 생검, 대변 및 소변 중 하나로부터 수득된 것인, 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)의 안정성을 결정하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈장으로부터 수득된 것인, 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)의 안정성을 결정하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 혈장이 LDC로 처리된 것인, 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)의 안정성을 결정하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 혈장이 LDC로 치료된 인간 대상에서 유래된 것인, 리간드-약물 컨쥬게이트 (LDC)의 안정성을 결정하는 방법.
  28. a. LDC를 포함하는 샘플을 제공하는 단계로서, 여기서 LDC는 분석 표적을 포함하고, 분석 표적은 약물 분자를 포함하는 단계;
    b. 샘플에 내부 표준물을 첨가하는 단계로서, 여기서 내부 표준물은 LDC의 표지된 유도체이며 제2 분석 표적을 포함하는 단계;
    c. 샘플로부터 LDC 및 내부 표준물을 추출하는 단계;
    d. LDC 및 내부 표준물을 1 내지 30% (v/v) 농도의 수성 TFA와 접촉시키는 단계로서, 여기서 TFA가 LDC로부터 분석 표적을 방출시키고 내부 표준물로부터 제2 분석 표적을 방출시키는 단계;
    e. LDC로부터 방출된 분석 표적 및 내부 표준물로부터 방출된 제2 분석 표적의 양을 결정하는 단계로서, 여기서 LDC로부터 방출된 분석 표적의 양이 샘플 내 LDC의 양과 상관관계가 있는 단계를 포함하는, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양이 내부 표준물로부터 방출된 제2 분석 표적의 양을 사용하여 결정되고, 여기서 LDC로부터 방출된 분석 표적의 양이 샘플 내 LDC에서 항체에 컨쥬게이션된 약물 분자의 농도와 상관관계가 있는, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, LDC로부터 방출된 분석 표적의 양이 LDC의 표준 곡선을 사용하여 결정되는, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 분자가 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) 또는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)인, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서 분석 표적이 MMAF 또는 테트라펩티드인 Val-Dil-Dap-Phe를 포함하는, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 표적이 mcMMAF를 포함하는, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  34. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 표적 및 제2 분석 표적이 테트라펩티드인 Val-Dil-Dap-Phe를 포함하고, 제2 분석 표적이 6개 이상의 탄소-13 또는 6개 이상의 중수소로 동위원소 표지된 것인, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  35. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 표적 및 제2 분석 표적이 페길화된 링커인 DPR-PEG-gluc-카르바메이트-MMAE를 포함하는, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  36. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 분석 표적 및 제2 분석 표적이 MMAE를 포함하고, 제2 분석 표적이 6개 이상의 탄소-13 또는 6개 이상의 중수소로 동위원소 표지된 것인, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  37. 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, LDC 및 내부 표준물을 10% v/v 농도의 수성 TFA 농도와 접촉시키는, 샘플에서 LDC를 정량화하는 방법.
  38. a. LDC의 표지된 유도체이며 약물 분자를 포함하는, LDC에 대한 내부 표준물; 및
    b. 1 내지 30% (v/v)의 선택된 농도로 적용되는 수성 트리플루오로아세트산 TFA를 포함하는, 샘플에서 LDC의 양을 결정하기 위한 키트.
  39. 제38항에 있어서, 내부 표준물이 동위원소 표지된 것인, 샘플에서 LDC의 양을 결정하기 위한 키트.
  40. a. 표지된 링커-약물 복합체가 리간드에 컨쥬게이션되어 내부 표준물을 형성할 수 있는, 표지된 링커-약물 복합체 및 리간드; 및
    b. 1 내지 30% (v/v)의 선택된 농도로 적용되는 수성 트리플루오로아세트산 TFA를 포함하는, 샘플에서 LDC의 양을 결정하기 위한 키트.
  41. 제40항에 있어서, 내부 표준물이 동위원소 표지된 것인, 샘플에서 LDC의 양을 결정하기 위한 키트.
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