TW202204329A - 螢光淬滅免疫分析 - Google Patents

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凱瑪斯 哈極嘉戴
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Abstract

本發明係關於一種用於測定樣品中之分析物之存在或量的方法及試劑。

Description

螢光淬滅免疫分析
本發明係關於一種用於測定樣品中之分析物之濃度的螢光淬滅免疫分析。本發明亦關於一種新穎類別之螢光素衍生物，其可用作免疫分析中之示蹤劑。
免疫分析係用於量測時常含有物質之複雜混合物的測試樣品，通常溶液中之物質之存在或濃度的技術。通常，測試樣品係生物體液，諸如血清或尿液。免疫分析係基於抗體或其他蛋白質以高特異性結合於一個分子或極有限分子群的獨特能力。結合於抗體之分子稱為抗原。可進行免疫分析以量測抗原或抗體之存在或濃度(亦即，抗原或抗體可為分析物)。在任一情況下，分析之特異性視分析物能夠結合於其特異性結合搭配物以排除可能存在於所分析之樣品中之其他物質的程度而定。除需要特異性之外，亦必須選擇對分析物具有足夠高的親和力以准許精確量測的結合搭配物。
免疫分析要求回應於特異性結合事件產生可量測信號之手段。此可藉由量測在分析物結合於其結合搭配物時出現的一些物理特徵，諸如光散射或折射率之變化而實現。大部分免疫分析視與可偵測標記結合之結合搭配物的用途而定。與可偵測標記結合之結合搭配物通常稱為示蹤劑。已使用許多種可偵測標記，包括放射性元素(用於放射免疫分析)；酶；螢光、磷光及化學發光染料；乳膠及磁性粒子；染料微晶；金、銀及硒膠態粒子；金屬螯合物；輔酶；電活性基團；寡核苷酸、穩定基團及其他。此類可偵測標記准許在分離游離及結合之示蹤劑之後或藉由以使得結合事件實現由示蹤劑產生之信號之變化的方式設計系統來偵測及定量結合事件。
需要分離步驟之免疫分析，通常稱為分離免疫分析或異質免疫分析，通常需要多個步驟，例如謹慎洗滌表面以使與其結合搭配物結合之示蹤劑與未結合示蹤劑分離。其中信號受結合影響的免疫分析通常可在無分離步驟之情況下操作。此類分析可通常藉由簡單地混合試劑及樣品且進行物理量測來進行。此類分析稱為均質免疫分析且比異質免疫分析更易於進行。
不管所使用之方法，免疫分析中產生之信號之解釋需要參考模擬樣品介質之特徵的標準物。對於定性分析，標準物可由無分析物之參考樣品及具有視為可偵測之最低濃度之分析物的陽性樣品組成。定量分析需要具有已知分析物濃度之額外標準物。測試樣品之分析反應與由標準物產生之分析反應之比較使得有可能就樣品中分析物之存在或濃度而言解釋信號強度。
免疫分析可為競爭性或非競爭性的。在競爭性免疫分析中，樣品中之抗體與示蹤劑(亦即連接於可偵測標記之抗體)競爭結合抗原。隨後量測結合於抗體之示蹤劑之量。在競爭性免疫分析中，結合於抗體之示蹤劑之量與樣品中抗體之濃度反向相關。此係因為當樣品中存在較高量之抗體時，更多抗原結合於樣品中之抗體且更少抗原可供結合於示蹤劑。
在非競爭性免疫分析中，樣品中之抗原特異性結合於抗體，或樣品中之抗體特異性結合於抗原。隨後量測抗原或抗體之量。不同於競爭性免疫分析，在非競爭性免疫分析中，反應與樣品中抗原之濃度成正比。此係因為若樣品中不存在抗原，則第二抗體上之可偵測標記將不被結合。
螢光偏振已用作測定樣品中之例如抗體或抗原之濃度的偵測技術。螢光偏振技術係基於含有發螢光之基團之化合物(亦即，螢光示蹤劑)在藉由線性偏振光激發時將發射具有與其旋光率(rate of rotation)反向相關之偏振度之螢光的原理。因此，當結合於抗體之螢光抗原藉由線性偏振光激發時，所發射之光保持高度偏振，此係由於螢光抗原-抗體複合物由於其尺寸而在吸收至發射光之時間期間受約束而無法旋轉。當未結合之螢光抗原(亦即，未結合於抗體)藉由線性偏振光激發時，其旋轉比對應的螢光抗原-抗體複合物之旋轉快得多，且未結合之螢光抗原分子更加隨機地定向，因此，所發射之光消偏振。螢光偏振提供用於量測免疫分析中產生之螢光抗原-抗體複合物之量的定量手段。
螢光淬滅技術亦涉及使用螢光示蹤劑，但其係基於當螢光抗原與抗體結合時，螢光抗原之螢光淬滅的原理。因此，當結合於抗體之螢光抗原用光激發時，所發射光之強度與來自未結合之螢光抗原的所發射光之強度相比降低。因此，螢光淬滅亦提供用於量測免疫分析中產生之螢光抗原-抗體複合物之量的定量手段。在典型分析中，將含有濃度有待測定之抗體的測試樣品與螢光抗原混合，所得混合物用光激發，且量測所發射光之強度。樣品中所存在之抗體結合於螢光抗原。與對照物(無抗體)相比，混合物之所發射光之強度的降低與樣品中之抗原濃度成反比。
在另一螢光淬滅分析中，將含有濃度待測定之抗原的測試樣品與螢光抗原及對螢光抗原之抗原部分具有特異性之抗體的混合物組合。測試樣品中存在之抗原與螢光抗原競爭有限數目之抗體。測試樣品中抗原之濃度愈高，使得愈多抗體結合於來自測試樣品之抗原且愈不結合於螢光抗原(亦即，產生愈多未結合之螢光抗原)。藉由維持螢光抗原及抗體之濃度恆定，樣品抗原-抗體複合物:螢光抗原-抗體複合物之比率與樣品中存在之抗原之量成正比。類似地，未結合之螢光抗原之量與樣品中存在之抗原之量成正比。因此，藉由用光激發混合物且量測所發射光之強度，能夠定量地測定樣品中之抗原之量。測試樣品中抗原之濃度與所發射光之強度成正比。
此等技術不限於抗體-抗原結合搭配物。可使用蛋白質(其不為抗體)進行類似分析以測定特異性結合於蛋白質之受質之存在或濃度。此等分析中之示蹤劑可為例如連接於蛋白質之可偵測標記或連接於與蛋白質結合之分子的可偵測標記。
免疫分析優於用於量測測試樣品中之物質之存在或濃度的其他分析方法，諸如氣相層析(GC)及高效液相層析(HPLC)，此係因為免疫分析避免了提取及其他複雜樣品處理程序及通常與此等其他分析方法相關之冗長的分析時間。
然而，此項技術中仍需要呈現更高靈敏度、實施起來更簡單且執行成本更低的免疫分析。
本申請案中任何參考文獻之引用不應理解為此類參考文獻為本申請案之先前技術。
本發明之此等及其他特徵及優勢將自本發明之其餘部分，尤其較佳實施例之以下詳細描述變得顯而易見，該等實施例皆藉助於實例說明本發明之原理。
本發明係關於用於測定樣品中分析物之存在或量的方法。該等方法涉及： (i)  提供疑似含有分析物之樣品； (ii)  使該樣品與螢光示蹤劑及結合搭配物接觸，以提供分析組合物； 其中該結合搭配物對該分析物及該螢光示蹤劑具有特異性； (iii)  藉由在第一波長下之光照射該分析組合物，其中該第一波長下之光不線性偏振；及 (iv)  量測在第二波長下發射的光之強度， 其中在該第二波長下發射的該光之強度與該樣品中該分析物之濃度成比例。
該方法可在溶液中或作為乾燥載片分析進行。在一個實施例中，該分析物為SDMA。在一個實施例中，該方法不涉及分離步驟。
本發明亦涵蓋可用於本發明之方法中之螢光示蹤劑。在一個實施例中，該螢光示蹤劑係選自由以下組成之群：
Figure 02_image003
其中X=-H、-F、-CH3 、-OCH3 、- Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH或-SO3 H。
本發明亦涵蓋可用於該等方法中之載片。
本發明亦涵蓋衍生化螢光素分子，其可用作合成可用於本發明之方法之經取代之螢光示蹤劑的中間物。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張分別在2020年4月17日及2021年2月23日申請之美國臨時申請案第63/011,403號及第63/152,365號之申請日的權利，該等臨時申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於用於測定樣品中分析物之存在或量的方法。
本發明亦涵蓋可用於該方法中之載片。
本發明亦涵蓋可用於本發明之方法中之經取代之螢光示蹤劑。
本發明亦涵蓋衍生化螢光素分子，其可用作合成可用於本發明之方法之經取代之螢光示蹤劑的中間物。1. 定義
如本文所用之術語，術語「分析物」係指樣品，諸如生物體液中存在之分子(例如抗體或抗原)，意欲測定其在樣品中之存在或濃度，且其結合於結合搭配物(例如抗原或抗體) (亦即與其形成複合物)。分析物可為例如蛋白質、醣蛋白、醣、多醣、胺基酸、經取代胺基酸、甲基化胺基酸、激素、抗生素、核酸、代謝物或任何前述物之衍生物。
如本文所用之術語，「複合物」為藉由不涉及實體之間的共價鍵的兩個或更多個分子實體(其可為離子性或不帶電的)結合所形成的物種。複合物之實例為抗體與抗原(或抗原衍生物)之結合及肽與受體之結合。
如本文所用之術語，術語「半抗原」為當注射至動物中時不誘發抗體形成但可連接於載體蛋白以提供抗原(免疫原)的分子，該抗原在注射至動物中時引起免疫反應，從而引起抗體形成。所得抗體可藉由已知抗體分離技術分離。半抗原結合於所得抗體。
如本文所用，術語「抗原」具有其此項技術中公認的含義，亦即當引入身體中時刺激抗體產生之物質。
如本文所用，術語「抗體」具有其此項技術中公認的含義，亦即由於抗原引入身體中而產生的蛋白質。抗體可活體內、活體外、以重組方式或以合成方式產生。如本文所用，術語「抗體」包括多株抗體、單株抗體、單鏈抗體(scFv)或抗體之抗原結合片段。抗體之抗原結合片段為包含完整抗體之抗原結合位點或可變區之完整抗體的一部分，其中該部分不含完整抗體之Fc區之恆定重鏈域。抗原結合抗體片段之實例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 及Fv 片段。抗體可為任何抗體類別，包括例如IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。
如本文所用，術語「mAb」或「Mab」為單株抗體之縮寫。
如本文所用之片語，片語「結合搭配物」意謂特異性結合第二分子之分子。舉例而言，第二分子可為抗原/抗體且「結合搭配物」可為抗體/抗原。類似地，第二分子可為受體之受質且「結合搭配物」可為受體或第二分子可為受體且「結合搭配物」可為受質。另外，結合搭配物可為適體。結合搭配物可為凝集素且第二分子可為碳水化合物。第二分子可為分析物。
如本文所用，片語「具有特異性」、「特異性結合」、「特異性結合分析物」、「對分析物具有特異性」及類似片語具有其此項技術中公認的含義，亦即結合搭配物以相比於其結合於其他非特異性分子更大之親和力識別及結合於分析物(或一類分析物)。舉例而言，針對抗原產生的抗體比其他非特異性分子更有效地結合抗原可描述為特異性結合於抗原。結合特異性可以使用此項技術中已知之方法測試，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或西方墨點(western blot)分析。非特異性分子為以小於25%、較佳小於10%、更佳小於5%且最佳小於1%之結合搭配物與其對應分析物之間展現的反應性結合結合搭配物的分子。
如本文所用，術語「分析物-結合物」係指由連接於第二分子之結合搭配物(例如抗體或抗原)識別且結合於該結合搭配物的分子(例如抗原或抗體)。分析物-結合物之特徵在於其具有與相關分析物足夠類似之結構以使得其將被分析物之結合搭配物識別且結合於該結合搭配物。
舉例而言，若分析物係抗原，則大部分之分析物-結合物將具有與抗原實質上相同的結構、空間及極性配置，以便界定一或多個決定子或抗原決定基位點(下文中稱為「抗原決定基部分」)，使得分析物-結合物能夠與抗原競爭抗體之一或多個結合位點。主要地，分析物-結合物大部分之分子表面將具有與在樣品中分析之分析物相同或實質上相同的結構及電荷分佈(空間及極性配置)。
分析物-結合物可為連接於可偵測標記(亦即，第二分子部分為可偵測標記)以便提供「示蹤劑」的抗原決定基部分。
分析物-結合物可為連接於可偵測標記以便提供示蹤劑之半抗原。換言之，連接於可偵測標記以便提供示蹤劑之抗原決定基部分為半抗原之部分，亦即用於產生免疫反應之半抗原之部分。半抗原上之官能基可經化學改質以使半抗原連接於可偵測標記。
分析物-結合物可為連接於可偵測標記以便提供示蹤劑之結合蛋白，諸如抗體。
如本文所用之術語「示蹤劑」為包括可偵測標記之分析物-結合物。
螢光素係具有以下結構之分子：
Figure 02_image005
螢光素 應瞭解螢光素可以開放形式及閉合形式存在，其中開放形式作為一對旋轉異構體存在，如下文所說明：
Figure 02_image007
如本文所用，術語螢光素包括開放形式及閉合形式以及開放形式之兩種旋轉異構體。如本文所用，術語螢光素亦包括離子及/或鹽形式。視考慮分子之開放或閉合形式而定，螢光素分子之碳原子之編號在此項技術中變化。因此，關於螢光素及螢光素之衍生物的文獻在碳原子編號上不一致。上文所指示之編號用於本發明之目的。
如本文所用之術語，術語「螢光示蹤劑」意謂分析物-結合物，其中抗原決定基部分連接於直接發螢光或藉由連接基團發螢光之分子。在一實施例中，抗原決定基部分連接於衍生自螢光素之分子。較佳地，抗原決定基部分連接於螢光素或二氟螢光素。
如本文所用，片語「抗原決定基部分」意指分析物之一部分，其具有使得界定分析物之一或多個決定子或抗原決定基位點，使得分析物能夠被其結合搭配物識別且特異性結合於其結合搭配物的結構、空間及極性佈置。如本文所用，片語「抗原決定基部分」意指抗原決定基部分或包括抗原決定基部分之分子實體。
在一個實施例中，該螢光示蹤劑為：
Figure 02_image009
其中T為將抗原決定基部分連接於螢光素分子之鍵或二價基團(亦即連接基團)且波浪線展示T-抗原決定基部分可置換鍵結於螢光素分子之碳的任何氫。
如本文所用，術語「淬滅劑」意謂如下部分：在螢光淬滅免疫分析中，當其連接於結合搭配物時，與當螢光示蹤劑與同一結合搭配物複合但不連接於淬滅劑時該螢光示蹤劑發射之光的強度相比，降低由與結合搭配物複合之螢光示蹤劑發射之光的強度。
如本文所用，術語「約」意謂±10%、較佳±5%、更佳±2%且最佳±1%。
如本文所用，片語「實質上不含」意謂小於10%，較佳小於5%，更佳小於2%，且最佳小於1%。
如本文所用，片語「成比例」意謂在某物之量測值與量之間存在對應性或關係。舉例而言，片語「在第二波長下發射之光的強度與樣品中之分析物的濃度成比例」意謂在第二波長下發射之光的強度對應於樣品中之分析物的濃度。量測值及量可為線性相關的。
如本文所用，術語「大分子」意謂分子量大於約500道爾頓之化合物。在一個實施例中，分子量大於約2,200道爾頓。在一個實施例中，分子量大於約5,500道爾頓。在一個實施例中，分子量大於約11,000道爾頓。大分子之分子量通常小於約200千道爾頓。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約3個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約5個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約10個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約20個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約50個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約100個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約200個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約300個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約400個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約500個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約600個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約700個胺基酸。在一個實施例中，大分子為多肽，其中胺基酸長度大於約800個胺基酸。當大分子為多肽時，胺基酸長度通常小於約1000個胺基酸。多肽可經糖基化。多肽可為抗體。在其他實施例中，大分子可為碳水化合物、多醣、脂質或核酸。
術語「SDMA」意謂對稱二甲基精胺酸，亦稱為游離SDMA，及其衍生物。SDMA之衍生物之實例包括烷基化SDMA及醯基化SDMA。某些對SDMA具有特異性之抗體描述於美國專利第9,970,927號。2. 方法之描述
本發明之方法包含： (i) 提供疑似含有分析物之樣品； (ii) 使該樣品與螢光示蹤劑及結合搭配物接觸，以提供分析組合物； 其中該結合搭配物對該分析物及該螢光示蹤劑具有特異性； (iii) 藉由在第一波長下之光照射該分析組合物，其中該第一波長下之光不線性偏振；及 (iv) 量測在第二波長下發射的光之強度， 其中在該第二波長下發射的該光之強度與該樣品中該分析物之濃度成比例。
在本發明之另一實施例中，該方法包含： (i) 提供疑似含有分析物之樣品； (ii) 使該樣品與螢光示蹤劑及結合搭配物接觸，以提供分析組合物； 其中該結合搭配物對該分析物及該螢光示蹤劑具有特異性； (iii) 藉由在第一波長下之光照射該分析組合物，其中該第一波長下之光線性偏振；及 (iv) 量測在第二波長下發射的光之強度， 其中在該第二波長下發射的該光之強度與該樣品中該分析物之濃度成比例。
因此，在一個實施例中，第一波長下之光不線性偏振，且在另一實施例中，第一波長下之光線性偏振。
在一個實施例中，在第二波長下發射之光之強度與樣品中之分析物之濃度之間存在線性關係。
不希望受理論所束縛，該方法之基礎為當示蹤劑結合於結合搭配物時，螢光示蹤劑之螢光被淬滅。因此，若螢光示蹤劑在其經第一波長之光激發時結合於結合搭配物，則與示蹤劑不結合於結合搭配物之情況下將發射之強度相比，在第二波長下發射之光之強度降低(淬滅)。存在於樣品中之分析物與螢光示蹤劑競爭結合搭配物上之有限數目個結合位點，使得形成分析物-結合搭配物複合物及示蹤劑-結合搭配物複合物。樣品中分析物之濃度愈高，可結合於結合搭配物之螢光示蹤劑分子愈少，且因此，未結合之螢光示蹤劑分子愈多。因此，在第二波長下發射之光的強度與樣品中之分析物之量成正比。此一般原理描繪於圖1中。結合搭配物對分析物之親和力及結合搭配物對螢光示蹤劑之親和力可不同。
在一個實施例中，分析物係抗原，螢光示蹤劑係包含與螢光標記連接之抗原的抗原決定基部分的分析物-結合物，且結合搭配物為抗原之抗體。
在一個實施例中，該螢光示蹤劑選自由以下組成之群：經4'-取代之螢光示蹤劑、經4'-取代之螢光示蹤劑衍生物、經5-取代之螢光示蹤劑及經5-取代之螢光示蹤劑衍生物。
在一個實施例中，螢光示蹤劑為經4'-取代之螢光示蹤劑。
在一個實施例中，螢光示蹤劑為經4'-取代之螢光示蹤劑衍生物。
較佳地，螢光示蹤劑為經4'-取代之螢光示蹤劑或經4'-取代之螢光示蹤劑衍生物，最佳螢光示蹤劑為經4'-取代之螢光示蹤劑。
在一個實施例中，經4'-取代之螢光示蹤劑為結構A1。
在一個實施例中，經4'-取代之螢光示蹤劑為結構A2。
在一個實施例中，經4'-取代之螢光示蹤劑為結構A3。
在一個實施例中，螢光示蹤劑為經5-取代之螢光示蹤劑。
在一個實施例中，螢光示蹤劑為經5-取代之螢光示蹤劑衍生物。
在一個實施例中，經5-取代之螢光示蹤劑為結構A4。
在一個實施例中，經5-取代之螢光示蹤劑為結構A5。
在一個實施例中，經5-取代之螢光示蹤劑為結構A6。
在一個實施例中，示蹤劑為具有以下結構之經4'-取代之螢光素示蹤劑或經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物：
Figure 02_image011
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，示蹤劑為具有以下結構之經4'-取代之螢光素示蹤劑或經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物：
Figure 02_image013
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，示蹤劑為具有以下結構之經4'-取代之螢光素示蹤劑或經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物：
Figure 02_image015
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，示蹤劑為具有以下結構之經5-取代之螢光素示蹤劑或經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物：
Figure 02_image017
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，示蹤劑為具有以下結構之經5-取代之螢光素示蹤劑或經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物：
Figure 02_image019
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，示蹤劑為具有以下結構之經5-取代之螢光素示蹤劑或經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物：
Figure 02_image021
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
分析物之分子量可在廣泛範圍內變化。通常，分析物之分子量大於50道爾頓。對於為小分子之分析物，分析物之分子量通常在約50與約4,000道爾頓之間，較佳為約100至約2,000道爾頓。當分析物係較大分子，諸如蛋白質時，分子量可大於2,000道爾頓。當分析物係較大分子，諸如蛋白質時，分子量可甚至大於4,000道爾頓。
本發明之方法可用於分析廣泛多種分析物。說明性分析物包括但不限於小分子(例如對稱二甲基精胺酸(SDMA)、不對稱二甲基精胺酸(ADMA)、單甲基精胺酸(MMA)、三聚氰胺、抗生素、T4、β-內醯胺抗生素(諸如青黴素)、磺胺藥、頭胞菌素及類固醇(例如孕酮及皮質醇))及大分子，諸如蛋白質(例如胱蛋白-B)及抗體。
在一個實施例中，分析物為SDMA。
在一個實施例中，分析物為三聚氰胺。
在一個實施例中，分析物為T4。
在一個實施例中，分析物為皮質醇。在另一實施例中，分析物為膽汁酸。
在一個實施例中，分析物為孕酮。
在一個實施例中，分析物為胱蛋白-B。在特定實施例中，分析物為犬或貓胱蛋白-B。在一個實施例中，分析物為NT-proBNP。在特定實施例中，分析物為犬或貓NT-proBNP。
在一個實施例中，分析物為抗生素。
說明性抗生素包括但不限於阿莫西林(amoxicillin)、安比西林、頭孢乙腈(cefacetrile)、頭孢喹肟(cefquinome)、頭孢若林(cefazolin)、頭孢匹拉(cefoperazone)、頭孢噻夫(ceftiofur)、頭孢力欣(cephalexin)、頭孢洛寧(cefalonium)、氯噻青黴素(cloxacillin)、脫乙醯吡硫頭孢菌素(desacetyl cephapirin)、二氯噻青黴素(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、扼噻青黴素(oxacillin)、吡硫頭孢菌素(cephapirin)、脫呋喃甲醯頭孢噻呋(desfuroylceftiofur)、頭孢呋辛(cefuroxime)及青黴素。
在一個實施例中，分析物係一或多種選自由如歐盟要求必須在乳中測試的抗生素組成之群的抗生素。
在一個實施例中，分析物係一或多種選自由以下組成之群的抗生素：青黴素G (苄青黴素)、安比西林、阿莫西林、扼噻青黴素、氯噻青黴素、二氯噻青黴素、萘夫西林、吡硫頭孢菌素、脫乙醯吡硫頭孢菌素、頭孢噻夫、脫呋喃甲醯頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢若林、頭孢乙腈、頭孢力欣、頭孢呋辛及頭孢匹拉
在一個實施例中，分析物係一或多種選自由如美國食品藥物管理局(United States Food and Drug Administration)要求必須在乳中測試的抗生素組成之群的抗生素。
在一個實施例中，分析物係一或多種選自由以下組成之群的抗生素：青黴素G (苄青黴素)、安比西林、阿莫西林、氯噻青黴素、吡硫頭孢菌素、頭孢噻夫及脫呋喃甲醯頭孢噻呋。
在一個實施例中，分析物為大分子。在一個實施例中，大分子為多肽。
在一個實施例中，分析組合物為溶液。在一個實施例中，分析組合物為水性溶液。
樣品通常為液體且通常為生物樣品，諸如但不限於尿液、血清、乳、唾液、血漿、全血、汗液、淚液及脊髓液。儘管樣品通常為液體，但固體樣品亦可用於本發明之方法中。固體材料包括但不限於糞便樣品及固體組織樣品、固體材料之提取物及經乾燥液體樣品。在一個實施例中，固體樣品溶解於或懸浮於液體中。
在一個實施例中，樣品為水性溶液。
在一個實施例中，樣品為尿液。
在一個實施例中，樣品為血清。
在一個實施例中，樣品為乳。
在一個實施例中，樣品為唾液。
在一個實施例中，樣品為血漿。
在一個實施例中，樣品為全血。
在一個實施例中，樣品為汗液。
在一個實施例中，樣品為淚液。
在一個實施例中，樣品為脊髓液。
在一個實施例中，樣品為糞便樣品或糞便提取物。
通常，樣品尺寸在約1 μL至約5 mL範圍內。在一個實施例中，樣品尺寸較佳為約2 μL至約20 μL，更佳為約2 μL至約15 μL，且最佳為約2 μL至約10 μL。在一個實施例中，樣品尺寸在約50 μL至約200 μL範圍內。在一個實施例中，樣品尺寸為約75 μL至約150 μL。在一個實施例中，樣品尺寸為約100 μL。
分析溶液中之分析物之濃度可在廣泛範圍內變化。一般而言，分析溶液中之分析物之濃度在約0.1 nM至約1,000 nM範圍內，且通常為約10 nm至約100 nM。將容易理解，更濃之樣品可簡單地用適當的稀釋劑稀釋以提供具有適合於分析之濃度的經稀釋樣品。本發明方法極其靈敏且對於一些分析物可用於偵測濃度低至4 ppb之分析物。
分析溶液中之結合搭配物之濃度通常在約0.1 nM至約2,000 nM範圍內。在一個實施例中，分析溶液中之結合搭配物之濃度在約1 nM至約1,000 nM範圍內。在一個實施例中，分析溶液中之結合搭配物之濃度在約5 nM至約500 nM範圍內。在一個實施例中，分析溶液中之結合搭配物之濃度在約10 nM至約200 nM範圍內。
在各種實施例中，結合搭配物連接於固體支撐物。固體支撐物之實例包括但不限於反應容器、粒子、微粒、微珠、條碼珠粒、磁性粒子或磁性條碼珠粒。
分析溶液中螢光示蹤劑之濃度通常在約0.1至約1,000 nM範圍內。在一個實施例中，分析溶液中螢光示蹤劑之濃度在約1 nM至約500 nM範圍內。在一個實施例中，分析溶液中螢光示蹤劑之濃度在約10 nM至約200 nM範圍內。
通常，分析溶液中結合搭配物:螢光示蹤劑之比率在約0.05至約10範圍內。在一個實施例中，分析溶液中結合搭配物:螢光示蹤劑之比率在約0.1至約8範圍內。在一個實施例中，分析溶液中結合搭配物:螢光示蹤劑之比率在約0.5至約5範圍內。然而，應瞭解，分析之精確性將取決於結合搭配物與示蹤劑及結合搭配物與分析物具有適當比率。適合比率取決於分析物(及示蹤劑)對結合搭配物之親和力。一般熟習此項技術者將能夠容易地確定何為適合之比率。
在一個實施例中，結合搭配物:螢光示蹤劑之比率為約1:1。在一個實施例中，結合搭配物及示蹤劑以複合物形式提供，其中複合物中結合搭配物:螢光示蹤劑之比率為約1:1。在一個實施例中，複合物以固體形式提供。舉例而言，將結合搭配物及螢光示蹤劑組合於水性溶劑中以提供複合物之水性溶液，且藉由凍乾自溶液移除水以便提供呈固體狀之複合物。
通常，分析藉由將樣品與先前已組合在一起之結合搭配物及螢光示蹤劑互混來進行。通常，將約25 μl結合搭配物之溶液與約25 μl螢光示蹤劑之溶液組合，且隨後將所得溶液添加至約50 μl疑似含有分析物之樣品之溶液中以便提供分析組合物。然而，結合搭配物之溶液、螢光示蹤劑之溶液及樣品溶液之體積可在廣泛範圍內變化。分析亦可藉由將螢光示蹤劑與先前已組合在一起之結合搭配物及樣品互混來進行。分析可進一步藉由將結合搭配物與先前已組合在一起之螢光示蹤劑及樣品互混來進行。
在一個實施例中，樣品及螢光示蹤劑及結合搭配物藉由溫和渦流或振盪互混以製得呈溶液形式之分析組合物。當樣品、螢光示蹤劑及結合搭配物互混時，所得分析溶液通常必須在用第一波長之光照射分析溶液之前平衡僅較短時段。一般而言，需要平衡分析溶液少於1分鐘。在大多數情況下，需要平衡分析溶液少於15秒。
第一波長及第二波長視螢光示蹤劑之激發及發射光譜而定。一般熟習此項技術者將能夠容易地判定何為適合的第一波長及適合的第二波長。如本文所用，術語第一波長可涵蓋一系列波長。類似地，如本文所用，術語第二波長可涵蓋一系列波長。通常，第一波長及第二波長各自在約200 nm與約900 nm之間。在一個實施例中，第一波長(λex )為約490 nm，且第二波長(λem )為約520 nm。
在一個實施例中，樣品為乳。在一個實施例中，樣品為乳，其中乳已與核黃素結合蛋白(可購自Sigma Aldrich, St. Louis, MO)接觸。不希望受理論所束縛，咸信用核黃素結合蛋白處理乳減少與乳樣品相關之自體螢光。不希望受理論所束縛，咸信乳樣品觀測到之自體螢光由乳中之核黃素引起，且核黃素結合蛋白藉由與核黃素結合而減少自體螢光。減少自體螢光有利地提供對在第二波長下發射之光的更精確量測。通常，核黃素結合蛋白以足以在分析溶液中提供濃度大於約100 μg/mL、較佳約100 μg/mL至約300 μg/mL之核黃素結合蛋白之量添加至乳中。
在一個實施例中，樣品為乳，且乳在樣品之第一側上藉由第一波長下之光照射，且在第二波長下發射之光之強度自不同於第一側之樣品之第二側量測。
在一個實施例中，樣品為乳，且乳在樣品之一側上藉由第一波長下之光照射，且在第二波長下發射之光之強度自樣品之相對側量測。
在一個實施例中，樣品為乳，且乳在樣品之一側上藉由第一波長下之光照射，且在第二波長下發射之光之強度自樣品之同一側量測。
當樣品為乳時，乳可為全乳(生乳)或脫脂乳(亦即，已移除脂肪之乳)。當樣品為乳時，不需要預處理步驟例如藉由離心自乳移除奶油(cream)。
在一個實施例中，樣品為乳且分析物為三聚氰胺。
在一個實施例中，樣品為乳且分析物為抗生素。說明性抗生素包括但不限於β-內醯胺抗生素(諸如青黴素)、頭孢菌素、磺胺藥、氟喹啉酮(fluorquinolone)、氯黴素及氟黴素(fluoramphenicol)。
在一個實施例中，樣品為乳，且分析物係一或多種選自由如歐盟要求必須在乳中測試的抗生素組成之群的抗生素。
在一個實施例中，抗生素係選自由以下組成之群：青黴素G (苄青黴素)、安比西林、阿莫西林、扼噻青黴素、氯噻青黴素、二氯噻青黴素、萘夫西林、吡硫頭孢菌素、脫乙醯吡硫頭孢菌素、頭孢噻夫、脫呋喃甲醯頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢若林、頭孢乙腈、頭孢力欣、頭孢呋辛及頭孢匹拉。
在一個實施例中，樣品為乳，且分析物係一或多種選自由如美國食品藥物管理局要求必須在乳中測試的抗生素組成之群的抗生素。
在一個實施例中，樣品為乳，且分析物係一或多種選自由以下組成之群的抗生素：青黴素G (苄青黴素)、安比西林、阿莫西林、氯噻青黴素、吡硫頭孢菌素、頭孢噻夫及脫呋喃甲醯頭孢噻呋。
可用於進行分析之適合之儀器包括任何市售螢光光譜儀，諸如Fluoromax+光譜儀(可購自日本Horiba Instruments公司)及Synergy 4微量盤讀取器(可購自Winooski, VT的Biotek Instruments公司)。
該方法僅涉及一個步驟(亦即組合樣品與螢光示蹤劑及結合搭配物)，且有利地不需要任何分離步驟(亦即分離結合於其結合搭配物之示蹤劑與未結合示蹤劑之步驟)，諸如洗滌步驟。3. 乾燥載片分析方法
在一個實施例中，該方法涉及測定在乾燥載片(在本文中亦稱為「載片」)上之樣品中分析物之存在或量。該方法涉及簡單地將樣品塗覆至載片，藉由第一波長之光照射載片，及量測在第二波長下發射之光的強度。本發明亦涵蓋該方法中所用之載片。該載片包含2個或更多個層。
載片之一般結構描繪於圖18A中。該載片包含支撐層，在該支撐層上塗覆有指示層。
支撐層係為載片提供支撐之固體。支撐層對於第一波長及第二波長為光學透明的，亦即，其不實質上吸收在第一波長及第二波長下之光。較佳地，支撐層為水不可溶及水不可滲透的。較佳地，支撐層為機械穩定且熱穩定且耐刮擦的。支撐層可為符合此等標準之任何適合聚合物。
說明性支撐層包括但不限於玻璃、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、纖維素衍生物(諸如乙酸纖維素)、聚對苯二甲酸乙二酯及其混合物。
在一個實施例中，支撐層為聚對苯二甲酸乙二酯層。
在一個實施例中，支撐層為聚酯層。在一個實施例中，支撐層為可以商標名Melinex® (可購自Berlin, WI的EIS公司的分公司Tekra)商購之聚酯。在一個實施例中，支撐層為可以商標名ESTARTM (可購自Rochester, NY的Eastman Kodak公司)商購之聚酯。
支撐層之厚度通常在約15 μm至約200 μm、較佳約50 μm至約150 μm且更佳約70 μm至約130 μm範圍內。在一個實施例中，支撐層之厚度為約125 μm。在一個實施例中，支撐層之厚度為約75 μm。
指示層包含分散於聚合物中之螢光示蹤劑及結合搭配物。螢光示蹤劑及結合搭配物可呈複合物形式存在。
在一個實施例中，將螢光示蹤劑及結合搭配物組合於液體中，移除液體以得到固體，且所得固體分散或溶解於聚合物中，其用以提供指示層。在一個實施例中，將螢光示蹤劑及結合搭配物組合於水中，藉由凍乾移除水，且將所得固體凍乾物溶解或分散於聚合物中以提供指示層。在一個實施例中，螢光示蹤劑及結合搭配物以預形成複合物形式提供。
在一個實施例中，指示層藉由以下獲得：將螢光示蹤劑及結合搭配物(較佳地呈預形成複合物形式)及聚合物溶解或懸浮於溶劑中以提供塗佈液體，塗佈液體塗佈於支撐層上以提供濕指示層，且隨後移除溶劑以提供具有分散於聚合物中之螢光示蹤劑及結合搭配物的乾指示層。較佳地，溶劑為水性溶劑。
濕指示層的厚度通常在約30 μm至約200 μm、較佳約50 μm至約150 μm且更佳約80 μm至約120 μm範圍內。在乾燥時，指示層之厚度通常在約15 μm至約100 μm、較佳約10至約75 μm、更佳約20 μm至約60 μm範圍內。在一個實施例中，乾指示層的厚度為約30 μm至約40 μm。在一個實施例中，乾指示層的厚度為約50 μm。指示層之厚度部分取決於樣品體積。舉例而言，當樣品為分析物之極稀溶液時，分析將需要較大樣品體積且較厚指示層將為較佳的以便適應較大樣品體積。
在一個實施例中，結合搭配物為抗體。濕指示層中螢光示蹤劑及抗體之濃度通常分別在層之約4×10-6 重量%至約4×10-2 重量%及約4×10-4 重量%至約4重量%範圍內。在一個實施例中，濕指示層中螢光示蹤劑及抗體之濃度分別在層之約8×10-6 重量%至約2×10-2 重量%及約8×10-4 重量%至約2重量%範圍內。在一個實施例中，濕指示層中螢光示蹤劑及抗體之濃度分別在層的約1.6×10-5 重量%至約1×10-2 重量%及約1.6×10-3 重量%至約1重量%範圍內。在一個實施例中，濕指示層中螢光示蹤劑及抗體之濃度分別在層的約4×10-5 重量%至約4×10-3 重量%及約4×10-3 重量%至約4×10-1 重量%範圍內。乾指示層中螢光示蹤劑及抗體之濃度通常分別在層之約1×10-5 重量%至約1×10-1 重量%及約1×10-4 重量%至約1重量%範圍內。在一個實施例中，乾指示層中螢光示蹤劑及抗體之濃度分別在層之約2×10-5 重量%至約5×10-2 重量%及約2×10-4 重量%至5×10-1 重量%範圍內。在一個實施例中，乾指示層中螢光示蹤劑及抗體之濃度分別在層的約4×10-5 重量%至約2.5×10-2 重量%及約4×10-4 重量%至2.55×10-1 重量%範圍內。在一個實施例中，乾指示層中螢光示蹤劑及抗體之濃度分別在層的約1×10-4 重量%至約1×10-2 重量%及約1×10-3 重量%至1×10-1 重量%範圍內。
指示層為水可滲透的。適合於指示層之聚合物包括但不限於纖維素及纖維素衍生物(例如，羥丙基纖維素、甲基纖維素及羥丙基甲基纖維素)、多醣(諸如聚葡萄糖、阿拉伯膠、瓊脂糖及普魯蘭(pullulan))、明膠及明膠衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、丙烯醯胺聚合物、聚胺基甲酸酯、海藻酸酯、三仙膠及其混合物。
在一個實施例中，指示層包括多醣。在一個實施例中，指示層包括線性葡聚糖(polyglucan)。在一個實施例中，多醣包含麥芽三醣單元。在一較佳實施例中，指示層包括普魯蘭。不希望受理論所束縛，咸信多醣充當向指示層提供穩定性及整體性之黏合劑。
多醣通常以濕層之約0.5重量%至約40重量%、較佳約1重量%至約30重量%、更佳約5重量%至約20重量%且最佳約6重量%至約15重量%範圍內之量存在於濕指示層中。在乾指示層中，多醣通常以乾層之約1重量%至約60重量%、較佳約5重量%至約50重量%、更佳約10重量%至約40重量%且最佳約20重量%至約35重量%範圍內之量存在。
較佳地，指示層包括普魯蘭。在一個實施例中，指示層包含普魯蘭、纖維素、羥丙基纖維素及其混合物。
在一個實施例中，指示層包含普魯蘭、纖維素、界面活性劑、緩衝劑及螢光示蹤劑及結合搭配物。
普魯蘭為由具有以下結構之麥芽三糖單元組成之多醣聚合物：
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普魯蘭通常以濕層之約0.5重量%至約40重量%、較佳約1重量%至約30重量%、更佳約5重量%至約20重量%且最佳約6重量%至約15重量%範圍內之量存在於濕指示層中。在乾指示層中，普魯蘭通常以乾層之約1重量%至約60重量%、較佳約5重量%至約50重量%、更佳約10重量%至約40重量%且最佳約20重量%至約35重量%範圍內之量存在。
不希望受理論所束縛，咸信普魯蘭充當向指示層提供穩定性且有利地不造成螢光示蹤劑與結合搭配物之複合物、螢光示蹤劑或結合搭配物降解的黏合劑。普魯蘭為用於形成指示層之尤其有利聚合物，因為其為水溶性的且因此允許使用主要為水性之溶液，以及最小量之有機溶劑(例如乙醇)形成指示層，該等有機溶劑可造成螢光示蹤劑及/或結合搭配物降解。普魯蘭使生物試劑，諸如蛋白質穩定化。在一個實施例中，普魯蘭之分子量為約25 kDa。
界面活性劑為視情況選用的。較佳地，指示層包括界面活性劑。界面活性劑較佳為非離子型界面活性劑。說明性界面活性劑包括但不限於Igepal (可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)或Merpol A (可購自Northfield, IL的Stepan公司)。界面活性劑通常以層的約0.05重量%至約2.0重量%、較佳約0.1重量%至約1.0重量%、更佳約0.2重量%至約0.6重量%且最佳約0.3重量%至約0.5重量%範圍內的量存在於濕指示層中。在乾指示層中，界面活性劑通常以層的約0.1重量%至約4.0重量%、較佳約0.2重量%至約3.0重量%、更佳約0.4重量%至約2.5重量%且最佳約0.5重量%至約2.0重量%範圍內之量存在。不希望受理論所束縛，咸信界面活性劑提供指示層之較佳潤濕，以便提供更加均勻之層。
說明性緩衝劑包括但不限於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸(HEPES)。緩衝劑通常以約10 mM至約300 mM、較佳約25 mM至約250 mM、更佳約50 mM至約200 mM且最佳約75 mM至約175 mM範圍內之量存在於濕指示層中。較佳地，緩衝劑為提供在約4.5至約9.5、更佳約5至約9且最佳約6至約8.5之間的水性溶液的pH值的緩衝劑。在一個實施例中，緩衝劑為提供約8之水性溶液之pH值的緩衝劑。
纖維素通常以層之約2重量%至約40重量%、較佳約5重量%至約35重量%、更佳約10重量%至約30重量%且最佳約15重量%至約25重量%範圍內之量存在於濕指示層中。在乾指示層中，纖維素通常以乾層之約30重量%至約90重量%、較佳約40重量%至約85重量%、更佳約45重量%至約85重量%且最佳約50重量%至約75重量%範圍內之量存在。在一個實施例中，纖維素為分子量為約350 kDa之微晶纖維素。較佳地，纖維素之粒度在約5 μm至約30 μm、較佳約10 μm至約25 μm範圍內。在一個實施例中，纖維素之粒度為約20 μm。不希望受理論所束縛，咸信纖維素聚合物之量及粒度對於使方法之靈敏度最大化而言為重要的。
指示層可進一步含有羥丙基纖維素(HPC)。HPC，若存在，通常以濕層之約2重量%至約10重量%、較佳約3重量%至約7.5重量%且更佳約5重量%範圍內之量存在於濕層中。不希望受理論所束縛，咸信HPC增加濕層之黏度，以便改良層之擴展。亦咸信HPC改良指示層之整體性。
在一個實施例中，指示層藉由以下形成：將含有約18重量%纖維素、約9重量%普魯蘭、約0.4重量% Merpol A、約52重量% HEPES水性溶液(250 mM於去離子水中，pH 8)、約20重量%與淬滅劑結合之抗體之溶液(2.31 mg/mL於250 mM HEPES緩衝劑中，pH 8)及約1.5重量%螢光示蹤劑之溶液(0.25 mg/mL於去離子水中)之溶液/懸浮液塗覆至支撐層並自溶液/懸浮液移除溶劑。所得乾指示層含有約57.0重量%之纖維素、約28.5重量%之普魯蘭、約1.2重量%之Merpol A、約0.14重量%之與淬滅劑結合之抗體、約1.1×10-3 重量%之螢光示蹤劑及約13.2重量%之HEPES緩衝劑。在一個實施例中，螢光示蹤劑具有結構A3，抗體為SDMA之抗體，且淬滅劑為BHQ10。SDMA之抗體描述於例如美國專利第8,481,690號中。
用於形成指示層之溶液/懸浮液可進一步含有適合於防止溶液/懸浮液中細菌生長之量的防腐劑。在一個實施例中，防腐劑為在溶液/懸浮液中濃度為0.05重量%之Proclin™ 300 (MilliporeSigma, Burlington, MA)。熟習此項技術者將能夠容易地鑑別其他適合之防腐劑。
指示層通常藉由在溶劑(較佳水性溶劑)中組合組分且使其混合來製備。添加次序並不特別重要。一般而言，在添加各組分之後，混合所得溶液/懸浮液。通常，在塗佈至支撐層上之前混合最終溶液約½小時。隨後將溶液塗覆至支撐層，且移除溶劑以便在支撐層之頂部上提供指示層。螢光示蹤劑及結合搭配物可個別地或以螢光示蹤劑與結合搭配物之預形成複合物形式添加至溶液中。較佳地，將螢光示蹤劑與結合搭配物之預形成複合物添加至溶液中。
在一個實施例中，載片進一步包含擴散層。擴散層塗佈於指示層之頂部上。擴散層為水可滲透的。擴散層為水可滲透的且為各向同性地多孔的，亦即，其在層內之每一方向內為多孔的。
在一個實施例中，載片進一步包含過濾層。過濾層塗佈於指示層之頂部上。
在一個實施例中，載片進一步包含擴散層及過濾層。當載片進一步包含擴散層及過濾層時，過濾層塗佈於指示層之頂部上且擴散層隨後塗佈於過濾層之頂部上。進一步包含擴散層及過濾層的載片之一般結構描繪於圖18B中。
以類似於提供指示層之方式的方式提供擴散層及過濾層，亦即層之組分在混合下組合於溶劑中以提供溶液/懸浮液，將溶液/懸浮液塗覆於載片之適當層，且移除溶劑以便在適當層之頂部上提供擴散層或過濾層。
濕擴散層之厚度通常在約100 μm至約500 μm、較佳約150 μm至約450 μm、更佳約200 μm至約400 μm且最佳約250 μm至約350 μm範圍內。在乾燥時，擴散層之厚度通常在約25 μm至約250 μm，較佳約50 μm至約200 μm，且更佳約75 μm至約150 μm範圍內。擴散層之厚度部分取決於樣品體積。舉例而言，當樣品為分析物之極稀溶液時，分析將需要較大樣品體積且較厚擴散層將為較佳的以便適應較大樣品體積。
擴散層通常為親水性聚合物基質中纖維素之混合物。適合之親水性聚合物包括但不限於聚丙烯酸、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺及聚乙烯亞胺。擴散層有利地使液體樣品在載片上均勻擴散及分散。
濕擴散層中之纖維素的量通常在層之約1重量%至約20重量%、較佳5重量%至約15重量%且更佳約10重量%範圍內。在乾燥時，濕擴散層中之纖維素之量通常在層之約50重量%至約98重量%、較佳約60重量%至約95重量%且更佳約70重量%至約90重量%範圍內。在一個實施例中，擴散層為100%纖維素。在一個實施例中，纖維素具有約300 μm之粒度。
擴散層可包括聚乙烯吡咯啶酮(PVP)。以重量計，濕擴散層中PVP之量通常在層之約0.5重量%至約10重量%，較佳約1重量%至約5重量%，更佳約1.5重量%至約3重量%範圍內。在一個實施例中，濕擴散層中PVP之量為約2重量%。以重量計，乾擴散層中PVP之量通常在層之約1重量%至約30重量%，較佳約5重量%至約25重量%，更佳約10重量%至約20重量%範圍內。在一個實施例中，乾擴散層中PVP之量為約17重量%。
擴散層可包括四甲基銨氫氧化物(TMAH)或其他適合的鹼。TMAH可用以調節擴散層之pH。不希望受理論所束縛，咸信TMAH增加擴散層在整個載片中快速吸收及擴散樣品之能力。以重量計，濕擴散層中TMAH之量通常在約0.01重量%至約0.5重量%，較佳約0.025重量%至約0.25重量%範圍內。在一個實施例中，濕擴散層中之TMAH之量為約0.05重量%。以重量計，乾擴散層中TMAH之量通常在約0.08重量%至約4重量%，較佳約0.2重量%至約2重量%，更佳約10重量%範圍內。在一個實施例中，乾擴散層中之TMAH之量為約0.4重量%。
在一個實施例中，擴散層藉由以下形成：塗覆含有約10重量%纖維素、約2重量%聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、約68重量%水、約20重量%乙醇、約0.06重量%聚丙烯酸(PAA)及約0.05重量%四甲基銨氫氧化物(TMAH)之溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。所得乾擴散層含有約82.6重量%之纖維素、約16.5重量%之PVP、約0.5重量%之PAA及約0.4重量%之TMAH。
過濾層結合於除分析物以外之存在於樣品中之可潛在地干擾分析的化合物，且防止此等其他化合物擴散至指示層中。
濕過濾層之厚度通常在約50 μm至約250 μm、較佳約75 μm至約225 μm且更佳約100 μm至約200 μm範圍內。在乾燥時，過濾層之厚度通常在約5 μm至約50 μm，較佳約7 μm至約40 μm，且更佳約10 μm至約30 μm範圍內。過濾層之厚度部分取決於樣品體積。舉例而言，當樣品為分析物之極稀溶液時，分析將需要較大樣品體積且較厚過濾層將為較佳的以便適應較大樣品體積。
過濾層通常包含聚胺基甲酸酯以及保留水分之另一或多種親水聚合物。在一個實施例中，過濾層包含聚胺基甲酸酯及纖維素。適合的聚胺基甲酸酯為HydroMed D4 (可購自Wilmington, MA的AdvanSource Biomaterials公司)。在一個實施例中，聚胺基甲酸酯為低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物。在一個實施例中，聚胺基甲酸酯為約等量低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物。
濕過濾層中的聚胺基甲酸酯之量通常在層的約2重量%至約40重量%、較佳約5重量%至約30重量%且更佳約10重量%至約20重量%範圍內。在一個實施例中，濕過濾層中之聚胺基甲酸酯之量為層之約15重量%。在乾燥時，過濾層中聚胺基甲酸酯之量通常在層之約40重量%至約95重量%、較佳約50重量%至約80重量%、更佳約55重量%至約75重量%範圍內。在一個實施例中，乾過濾層中聚胺基甲酸酯之量為層之約65重量%。
濕過濾層中的纖維素之量通常在層的約2重量%至約60重量%，較佳約4重量%至約50重量%，且更佳約6重量%至約40重量%範圍內。在一個實施例中，濕過濾層中纖維素之量為約8重量%。在乾燥時，過濾層中纖維素之量通常在層之約10重量%至約60重量%、較佳約20重量%至約50重量%且更佳約25重量%至約45重量%範圍內。在一個實施例中，乾過濾層中纖維素之量為層之約35重量%。
圖24描繪分析(使用具有含有約20重量%之纖維素、約42重量%之二氧化鈦及約38重量%之HydroMed D4的過濾層之載片，如下文所描述)之結果，該分析測定含有固定量之SDMA之樣品中SDMA之濃度(μg/dL)，其中樣品包括各種濃度之可潛在地干擾分析之化合物(亦即，干擾物)。干擾物為(A)溶血(0至500 mg/dL)、(B)膽紅素(0至30 mg/dL)、(C)英脫利匹特(0至1000 mg/dL)及(D)全血(0至10%)。實驗描述於實例39中。
在一個實施例中，過濾層進一步包含氧化鈦(TiO2 )。通常，二氧化鈦以層之約2重量%至約30重量%、較佳約5重量%至約20重量%且更佳約10重量%至約20重量%範圍內之量存在於濕過濾層中。在一個實施例中，氧化鈦以層之約14重量%的量存在於濕過濾層中。通常，二氧化鈦以層之約20重量%至約60重量%、較佳約25重量%至約55重量%且更佳約30重量%至約50重量%範圍內之量存在於乾過濾層中。在一個實施例中，氧化鈦以層之約42重量%的量存在於濕過濾層中。
氧化鈦粒子之平均粒度通常小於約10 μm且較佳小於約5 μm。在一個實施例中，氧化鈦粒子之平均粒度為約0.35 μm。
如下文所描述，當載片包括碳黑層時，包含氧化鈦之過濾層尤其有利，因為碳黑層吸收散射光。氧化鈦層有利地將光反射遠離碳黑層且回去朝向偵測器，以便防止碳黑層吸收散射光，引起靈敏度提高。
在一個實施例中，過濾層藉由以下形成：塗覆含有約7重量%之纖維素、約14重量%之二氧化鈦及約79重量%之D4水凝膠溶液(含有約16重量%的等量低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物、約90重量%之乙醇及約10重量%之水)之溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。所得乾過濾層含有約20重量%之纖維素、約42重量%之二氧化鈦及約38重量%之HydroMed D4。
在一個實施例中，載片進一步包含底塗層。底塗層在支撐層之頂部上成層且位於支撐層與指示層之間。除支撐層及指示層以外，進一步包含擴散層、過濾層及底塗層的載片之一般結構描繪於圖18C中。
底塗層有利地有助於指示層塗佈於支撐層之頂部上。不希望受理論所束縛，咸信支撐層為疏水性的且指示層為親水性的，使得其並不特別相容。底塗層克服此不相容性。底塗層較佳包含聚胺基甲酸酯，諸如HydroMed D4。在一個實施例中，聚胺基甲酸酯為低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物。在一個實施例中，聚胺基甲酸酯為約等量低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物。
濕底塗層之厚度通常在約5 μm至約60 μm、較佳約10 μm至約55 μm且更佳約20 μm至約50 μm範圍內。在一個實施例中，底塗層之濕厚度為約40 μm。在乾燥時，底塗層之厚度通常在約1 μm至約20 μm、較佳約1.5 μm至約15 μm且更佳約2 μm至約10 μm範圍內。在一個實施例中，底塗層之乾燥厚度為約4 μm。
在一個實施例中，底塗層藉由以下形成：塗覆含有約10重量%等量低黏度HydroMed D4及高黏度HydroMed D4之混合物於約90重量%乙醇及約10重量%水的溶劑中之溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。所得乾底塗層含有約100重量%之HydroMed D4。
在一個實施例中，載片進一步包含碳黑層。碳黑層塗佈於過濾層之頂部上且位於過濾層與擴散層之間。碳黑層充當光學障壁以有利地對干擾第二波長的所發射光之量測的來自環境之雜散光進行濾光。碳黑層亦用以結合除分析物以外之存在於樣品中之可潛在地干擾分析的化合物，且防止此等其他化合物擴散至指示層中。因此，碳黑層之功能類似於過濾層之功能。
碳黑可用其他材料替換或與其他材料組合使用以過濾雜散光。說明性其他材料包括但不限於黑色乳膠珠粒、黑色二氧化矽珠粒、活性木炭、C60 、石墨烯或其他有色材料，諸如紅色乳膠珠粒。
碳黑層包含分散於聚合物中之碳黑。適用於碳黑層之聚合物包括但不限於聚胺基甲酸酯(諸如HydroMed D4)、聚氧化乙烯、聚矽氧、聚乙烯醇及聚丙烯醯胺。在一個實施例中，聚合物為HydroMed D4。
濕碳黑層中碳黑之量通常在層的約1重量%至約20重量%、較佳約1.5重量%至約15重量%，更佳約2重量%至約10重量%範圍內。在一個實施例中，濕碳黑層中碳黑之量為層之約5重量%。在乾燥時，碳黑層中碳黑之量通常在層之約10重量%至約40重量%、較佳約15重量%至約35重量%、更佳約20重量%至約30重量%範圍內。在一個實施例中，濕碳黑層中碳黑之量為層之約25重量%。
濕碳黑層之厚度通常在約50 μm至約300 μm，較佳約75 μm至約250 μm，且更佳約100 μm至約200 μm範圍內。在一個實施例中，濕碳黑之厚度為約140 μm。在乾燥時，碳黑層之厚度通常在約5 μm至約30 μm，較佳約7.5 μm至約25 μm，且更佳約10 μm至約20 μm範圍內。在一個實施例中，濕碳黑之厚度為約14 μm。
在一個實施例中，碳黑層藉由以下形成：塗覆含有約4.7重量%碳黑、約95.3重量% D4水凝膠溶液(含有約16重量%的等量低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物、約90重量%之乙醇及約10重量%之水)之溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。所得乾碳黑層含有約24重量%碳黑及約76重量% HydroMed D4。
如上文所提及，當載片包括碳黑層時，載片較佳在過濾層中亦包括氧化鈦。
或者，當載片包括碳黑層時，比起載片在過濾層中包括氧化鈦，載片可包括位於指示層與過濾層之間或過濾層與碳黑層之間的個別氧化鈦層。當載片包括個別氧化鈦層時，濕氧化鈦層之厚度通常在約50 μm至約250 μm，較佳約75 μm至約225 μm，且更佳約100 μm至約200 μm範圍內。在乾燥時，二氧化鈦層之厚度通常在約5 μm至約50 μm、較佳約7 μm至約40 μm且更佳約10 μm至約30 μm範圍內。
氧化鈦層包含分散於聚合物中之氧化鈦。適用於氧化鈦層之聚合物包括但不限於聚胺基甲酸酯聚合物(例如，HydroMed D4)、聚氧化乙烯、聚矽氧、聚乙烯醇及聚丙烯醯胺。在一個實施例中，氧化鈦分散於諸如HydroMed D4之聚胺基甲酸酯聚合物中。在一個實施例中，聚胺基甲酸酯為低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物。在一個實施例中，聚胺基甲酸酯為約等量低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物。
當載片包括個別氧化鈦層時，二氧化鈦通常以層之約2重量%至約30重量%、較佳約5重量%至約25重量%且更佳約10重量%至約20重量%範圍內之量存在於濕二氧化鈦層中。在一個實施例中，氧化鈦以層之約14重量%的量存在於濕層中。通常，二氧化鈦以層之約20重量%至約60重量%、較佳約25重量%至約55重量%且更佳約30重量%至約50重量%範圍內之量存在於乾層中。在一個實施例中，氧化鈦以層之約42重量%的量存在於乾層中。
氧化鈦粒子之平均粒度通常小於約20 μm，較佳地小於約15 μm，更佳地小於約10 μm，且最佳地小於約5 μm。
氧化鈦可用其他反射材料替換或與其他反射材料組合使用。說明性其他反射材料包括但不限於硫酸鋇、氧化鋅、黏土及矽酸鋁。在一個實施例中，反射材料為完全或部分經金屬塗佈之粒子。適合之金屬包括但不限於鋁、金、鎳或銀。銀為較佳塗層。此等粒子可單獨或與諸如TiO2 之其他光反射材料組合使用。粒子(亦即，所塗佈之核心)可為多種材料，包括但不限於實心及空心玻璃、聚(甲基丙烯酸甲酯) (PMMA)及二氧化矽。適合的經金屬塗佈之粒子可商購，例如購自Cospheric公司(Santa Barbara, California, USA)。較佳粒子為例如來自Cospheric公司之塗佈有銀之二氧化矽微球體。
在另一實施例中，載片不包括個別碳黑層。實情為，碳黑包括於擴散層中。包括於擴散層中之碳黑的量類似於包括於個別碳黑層中之碳黑的量。
載片藉由以支撐層開始且在支撐層上依序塗佈各層來製備。將各層之組分溶解或懸浮於適合溶劑中以提供溶液或懸浮液，隨後將所得溶液或懸浮液塗覆至前一層以提供所要濕層，且移除溶劑以便提供所要乾層。較佳地，溶液為水性溶液。任何塗佈方法均可用於以所要厚度提供載片之各層。適合塗佈技術描述於「Liquid Film Coating: Scientific principles and their technological implications ,」編輯：Stephan F. Kistler及Peter M. Schweizer，第一版，©1997 Springer Science+Business Media Dordrecht。
通常，載片之厚度不超過約300 μm，較佳地，載片之厚度不超過約250 μm，且更佳地，載片之厚度不超過約200 μm。在一個實施例中，載片之厚度為約185 μm。
圖19描繪載片之說明性實施例。
圖19A描繪其中Melinex支撐層依序塗佈有底塗層、指示層、亦包括氧化鈦之過濾層、碳黑層及擴散層的實施例。在一個實施例中，如圖19A中所描繪，擴散層藉由以下形成：塗覆含有約10重量%纖維素、約2重量%聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、約0.1重量%四甲基銨氫氧化物(TMAH)、約0.01重量%聚丙烯酸(PAA)及約68重量%水及約20重量%乙醇之水性乙醇溶液/懸浮液，且隨後自溶液/懸浮液移除水及乙醇。濕擴散層具有約310 μm之厚度。所得乾擴散層含有約82.6重量%之纖維素、約16.5重量%之PVP、約0.42重量% TMAH，及約0.46重量% PAA。乾擴散層具有約100 μm之厚度。
碳黑層藉由以下形成：塗覆含有約95重量%之D4水凝膠溶液(含有溶解/懸浮於約90重量%之乙醇及約10重量%之水的溶劑中的約16重量%的等量低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物)及約5重量%之碳黑之水性溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。濕碳黑層具有約140 μm之厚度。所得乾碳黑層含有約76.3重量% HydroMed D4及23.7重量%碳黑。乾碳黑層具有約14 μm之厚度。
過濾層藉由以下形成：塗覆含有約79重量% D4水凝膠溶液(含有溶解/懸浮於約90重量%之乙醇及約10重量%之水的溶劑中的約16重量%的等量低黏度HydroMed D4與高黏度HydroMed D4之混合物)、約7重量%纖維素及約14重量%氧化鈦之溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。濕過濾層具有約130 μm之厚度。所得乾過濾層含有約37.9重量%之HydroMed D4、約20.0重量%之纖維素及約42.1重量%之氧化鈦。乾過濾層具有約20 μm之厚度。
指示層藉由以下形成：塗覆含有約18.7重量%之纖維素、約9.3重量%之普魯蘭、約0.4重量%之Merpol A、約4.3重量% HEPES緩衝劑(以52重量% 250 mM水性溶液形式添加)、約4.0×10-4 重量%之螢光示蹤劑及約0.04重量%之與淬滅劑結合之抗體之水性溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。濕指示層具有約93 μm之厚度。所得乾指示層含有約57.0重量%之纖維素、約28.5重量%之普魯蘭、約1.2重量%之Merpol A、約13.2重量%之HEPES緩衝劑、約0.14重量%之與淬滅劑結合之抗體及約1.1×10-3 重量%之螢光示蹤劑。乾指示層具有約30至40 μm之厚度。在一個實施例中，螢光示蹤劑為A4且抗體為SDMA之抗體，該抗體已與BHQ10結合且藉由組合A4與20當量BHQ10而獲得。
底塗層藉由以下形成：塗覆含有溶解/懸浮於約90重量%乙醇及約10重量%水之溶劑中的約10重量%之D4水凝膠(含有等量低黏度HydroMed D4及高黏度HydroMed D4)之水性溶液/懸浮液。濕底塗層之厚度為約40 μm。乾底塗層為100重量% HydroMed D4。乾底塗層之厚度為約4 μm。
圖19B描繪其中Melinex支撐層依序塗佈有底塗層、指示層、含氧化鈦層、過濾層、碳黑層及擴散層之實施例。在一個實施例中，如圖19B中所描繪，擴散層藉由以下形成：塗覆含有約10重量%之纖維素、約1重量%之PVP、約1重量%之TMAH、約0.01重量%之PAA及約88重量%之水的水性溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除水。濕擴散層具有約350 μm之厚度。所得乾擴散層含有約83.2重量%之纖維素、約8.3重量%之PVP、約8.3重量% TMAH，及約0.1重量% PAA。
碳黑層藉由以下形成：塗覆含有約95重量%之10% HydroMed D4溶液(於90重量%之水及10重量%之乙醇中)及約5重量%之碳黑的溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。濕碳黑層具有約250 μm之厚度。所得乾碳黑層含有約65.5重量% HydroMed D4及34.5重量%碳黑。
過濾層藉由以下形成：塗覆含有約95重量%之10% HydroMed D4溶液(於90重量%之水及10重量%之乙醇中)及約5重量%之纖維素的水性溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。濕過濾層具有約250 μm之厚度。所得乾過濾層含有約65.5重量% HydroMed D4及約34.5重量%的纖維素。
含氧化鈦層藉由以下形成：塗覆含有約95重量%之9.13% HydroMed D4溶液(於90重量%之水及10重量%之乙醇中)及約5重量%之氧化鈦的水性溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。濕含氧化鈦層之厚度為約100 μm。所得乾含氧化鈦層含有約63.5重量%的HydroMed D4及約36.5重量%的氧化鈦。
指示層藉由以下形成：塗覆含有約14重量%之纖維素、約14重量%之普魯蘭、約0.1重量% Igepal CA-630、約58重量%水性PBS溶液(100 mM)及約14.5重量%螢光示蹤劑與其結合搭配物的複合物的水性溶液/懸浮液且自溶液/懸浮液移除溶劑。濕指示層具有約100 μm的厚度。所得乾指示層含有約32.8重量%之纖維素、約32.8重量%之普魯蘭、約0.2重量%之Igepal CA-630、約34.0重量%之複合物及磷酸鹽緩衝液。在一個實施例中，該複合物為A4與SDMA之抗體之複合物，該抗體已與BHQ10結合且藉由將抗體與4當量BHQ10組合而獲得。
濕底塗層之厚度為約35 μm。乾底塗層為100% HydroMed D4。
分析藉由簡單地將含有相關分析物的樣品添加至載片頂部(亦即，載片最遠離支撐層之層)，用第一波長之光自載片底部(亦即，具有支撐層的載片之層)照射載片，且量測在第二波長下自載片底部發射之光的強度來進行。圖20描繪使用圖18C中描繪之載片的分析方法。
通常，將樣品以含有溶解於其中之分析物的液體形式添加至載片頂部。通常，樣品尺寸在約0.5 μL至約30 μL範圍內。在一個實施例中，樣品尺寸在約1 μL至約20 μL範圍內。在一個實施例中，樣品尺寸在約2 μL至約15 μL範圍內。在一個實施例中，樣品尺寸在約3 μL至約12 μL範圍內。
在一個實施例中，載片進一步包括「釋放(pop-off)」層。釋放層包括當分析物與另一分子(諸如結合蛋白)複合時釋放分析物的試劑。分析物(例如皮質醇)通常與結合蛋白(例如皮質醇結合蛋白)複合。釋放層包括自結合蛋白釋放分析物的試劑。在一個實施例中，自結合蛋白釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉。十二烷基肌胺酸鈉之結構為：
Figure 02_image025
當分析物為皮質醇時，十二烷基肌胺酸鈉尤其有用。潛在地可用以自皮質醇結合蛋白釋放皮質醇的其他試劑包括普賴蘇穠(prednisolone)、普賴松(prednisone)、11-去氧皮質固酮、皮質酮及11-去氧皮質醇。在另一實施例中，自結合蛋白釋放分析物之試劑為多庫酯(Docusate) (磺琥珀酸鈉二辛酯)。當分析物為皮質醇時，十二烷基肌胺酸鈉較佳。
在一個實施例中，載片不包括額外釋放層，但載片上已存在的層中之一或多者中，例如擴散層、過濾層及/或指示層中包括自結合蛋白質釋放分析物的試劑。
包括自結合蛋白釋放分析物之試劑的載片組態之說明性實例在下文描述。當分析物係皮質醇時，此等實施例特別有用。
在一個實施例中，圖57中所描繪，支撐層(例如，Melinex)依序塗佈有底塗層、指示層(包括螢光示蹤劑及結合搭配物)、過濾層(視情況包括二氧化鈦或其他反射材料)、釋放層及擴散層。
在一個實施例中，底塗層藉由以下形成：將含有約9至10% HydroMed D4 (可購自Wilmington, MA的AdvanSource Biomaterials公司)的溶液/懸浮液塗覆至支撐層且自溶液/懸浮液移除溶劑；指示層藉由以下形成：將含有約12%聚乙烯吡咯啶酮、約6%纖維素、約1% Tween-20及螢光示蹤劑及結合搭配物之溶液/懸浮液塗覆至底塗層且自溶液/懸浮液移除溶劑；過濾層藉由以下形成：將含有約10% HydroMed D4、約10% TiO2 及約5%纖維素之溶液/懸浮液塗覆至偵測層且自溶液/懸浮液移除溶劑；釋放層藉由以下形成：將含有約12%普魯蘭、約6%纖維素、約1%自結合蛋白釋放分析物之試劑及約1% Merpol A的溶液/懸浮液塗覆至過濾層且自溶液/懸浮液移除溶劑；且擴散層藉由以下形成：將含有擴散層之適合組分的溶液/懸浮液塗覆至釋放層且自溶液/懸浮液移除溶劑。
在一個實施例中，自結合蛋白釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉。在一個實施例中，分析物為皮質醇，結合搭配物為針對皮質醇之抗體，且自結合蛋白釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉。
在一個實施例中，圖58中所描繪，支撐層(例如，Melinex)依序塗佈有底塗層、偵測層、過濾層(視情況包括二氧化鈦或其他反射材料)、指示層及擴散層。在此實施例中，擴散層包括自結合蛋白釋放分析物的試劑。
在一個實施例中，底塗層藉由以下形成：將含有約9至10% HydroMed D4 (可購自Wilmington, MA的AdvanSource Biomaterials公司)的溶液/懸浮液塗覆至支撐層且自溶液/懸浮液移除溶劑；偵測層藉由以下形成：將含有約12%聚乙烯吡咯啶酮、約6%纖維素及約1% Tween-20之溶液/懸浮液塗覆至底塗層且自溶液/懸浮液移除溶劑；過濾層藉由以下形成：將含有約10% HydroMed D4、約10% TiO2 及約5%纖維素之溶液/懸浮液塗覆至偵測層且自溶液/懸浮液移除溶劑；指示層藉由以下形成：將含有約12%普魯蘭、約6%纖維素、約1% Tween-20及螢光示蹤劑及結合搭配物之溶液/懸浮液塗覆至過濾層且自溶液/懸浮液移除溶劑；且擴散層藉由以下形成：將含有約1%自結合蛋白釋放分析物之試劑、約1% Merpol A及擴散層之適合組分的溶液/懸浮液塗覆至指示層且自溶液/懸浮液移除溶劑。
在一個實施例中，自結合蛋白釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉。在一個實施例中，分析物為皮質醇，結合搭配物為針對皮質醇之抗體，且自結合蛋白釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉。
在另一實施例中，圖58中描繪，指示層包括自結合蛋白釋放分析物之試劑。
在一個實施例中，底塗層藉由以下形成：將含有約9至10% HydroMed D4之溶液/懸浮液塗覆至支撐層且自溶液/懸浮液移除溶劑；偵測層藉由以下形成：將含有約12%聚乙烯吡咯啶酮、約6%纖維素及約1% Tween-20之溶液/懸浮液塗覆至底塗層且自溶液/懸浮液移除溶劑；過濾層藉由以下形成：將含有約10% HydroMed D4、約10% TiO2 及約5%纖維素之溶液/懸浮液塗覆至偵測層且自溶液/懸浮液移除溶劑；指示層藉由以下形成：將含有約12%普魯蘭、約6%纖維素、約1%十二烷基肌胺酸鈉、約1% Merpol A及螢光示蹤劑及結合搭配物之溶液/懸浮液塗覆至過濾層且自溶液/懸浮液移除溶劑；且擴散層藉由以下形成：將含有擴散層之適合組分的溶液/懸浮液塗覆至指示層且自溶液/懸浮液移除溶劑。
在一個實施例中，自結合蛋白釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉。在一個實施例中，分析物為皮質醇，結合搭配物為針對皮質醇之抗體，且自結合蛋白釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉。
在另一實施例中，圖58中所描繪，自結合蛋白釋放分析物之試劑包括於擴散層及偵測層中。在一個實施例中，底塗層藉由以下形成：將含有約9至10% HydroMed D4之溶液/懸浮液塗覆至支撐層且自溶液/懸浮液移除溶劑；偵測層藉由以下形成：將含有約12%聚乙烯吡咯啶酮、約6%纖維素及約1% Tween-20之溶液/懸浮液塗覆至底塗層且自溶液/懸浮液移除溶劑；過濾層藉由以下形成：將含有約10% HydroMed D4、約10% TiO2 及約5%纖維素之溶液/懸浮液塗覆至偵測層且自溶液/懸浮液移除溶劑；指示層藉由以下形成：將含有約12%普魯蘭、約6%纖維素、約0.5%十二烷基肌胺酸鈉、約0.5% Merpol A及螢光示蹤劑及結合搭配物之溶液/懸浮液塗覆至過濾層且自溶液/懸浮液移除溶劑；且擴散層藉由以下形成：將含有擴散層之適合組分、約0.5%十二烷基肌胺酸鈉及約0.5% Merpol A的溶液/懸浮液塗覆至指示層且自溶液/懸浮液移除溶劑。
在一個實施例中，自結合蛋白釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉。在一個實施例中，分析物為皮質醇，結合搭配物為針對皮質醇之抗體，且自結合蛋白釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉。
在其他實施例中，底塗層及偵測層組合。組合之底塗/偵測層藉由以下形成：將含有約9至10% HydroMed D4及約10%纖維素之溶液/懸浮液塗覆至支撐層且自溶液/懸浮液移除溶劑。在一個實施例中，將圖58中所示之載片之底塗及偵測層組合。
在一些實施例中，層中之一或多者可包含玻璃珠。為了形成含有玻璃珠之層，用於形成該層之溶液/懸浮液含有約6%玻璃珠。在較佳實施例中，玻璃珠包括於指示層及/或過濾層中。
層中之一或多者可包含Merpol A。當釋放分析物之試劑為十二烷基肌胺酸鈉時，較佳添加Merpol A。當十二烷基肌胺酸鈉用作釋放分析物之試劑時，Merpol A較佳至少包括於含有十二烷基肌胺酸鈉之層中。
樣品可為上文所描述之樣品中之任一者，包括但不限於尿液、血清、乳、唾液、血漿、全血、汗液、淚液、糞便及脊髓液。
分析物可為上文所述之分析物中之任一者，包括但不限於SDMA、三聚氰胺、抗生素、T4、β-內醯胺抗生素(諸如青黴素)、磺胺藥、頭胞菌素、孕酮、皮質醇、膽汁酸、蛋白質、NT-proBNP及胱蛋白-B。
在一個實施例中，乾燥載片為裝置之一部分，其中將含有相關分析物的液體樣品塗覆至裝置上之孔口，且液體隨後經由毛細管轉運區輸送至乾燥載片。此類裝置之說明性實例描述於美國專利第4,323,536號及第5,726,010號中。載片可為裝置之一部分，其中載片安置於由框架、外殼或殼體界定之開口或腔體內。在一個實施例中，載片安置於如美國專利第9,933,428號中所揭示之外殼或殼體內。包含外殼或殼體之乾燥載片裝置之其他實例為Catalyst®載片，例如Catalyst®果糖胺載片或Catalyst®總T4 (TT4)載片(可購自Westbrook, ME的IDEXX Laboratories公司)。
在一個實施例中，分析使用乾式化學分析儀器，例如Catalyst One®或Catalyst Dx®分析儀(可購自Westbrook, ME的IDEXX Laboratories公司)進行。4. 螢光示蹤劑
可使用發螢光且可連接於T-抗原決定基部分的任何分子以提供螢光示蹤劑。適合之發螢光分子之實例包括但不限於螢光素、香豆素及若丹明(rhodamine)染料。
在一個實施例中，螢光示蹤劑具有連接於螢光素分子之T-抗原決定基部分。較佳地，T-抗原決定基部分連接於螢光素分子之4'-位置或5-位置。更佳地，T-抗原決定基部分連接於螢光素分子之4'-位置。
特定言之，本發明考慮經4'-取代之螢光素示蹤劑，亦即其中T-抗原決定基部分連接於螢光素分子之4'-位置的螢光示蹤劑。經4'-取代之螢光素示蹤劑之一般結構為：
Figure 02_image027
其中T為鍵或連接基團。
本發明亦考慮經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物。如本文所用，片語「經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物」意謂經4'-取代之螢光素示蹤劑分子，其中鍵結至螢光素核心結構之碳的氫原子中之一或多者經另一官能基置換。在一個實施例中，鍵結至螢光素核心結構之碳的氫原子中的一或多者經供電子基團，諸如但不限於-CH3 、-OCH3 及-OH置換。在一個實施例中，鍵結至螢光素核心結構之碳的氫原子中的一或多者經拉電子基團，諸如但不限於-F、-NO2 、-CN、-COOH、-SO3 H及-Cl置換。在一個實施例中，官能基在螢光素分子之2'-位置及/或7'-位置置換氫。
說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物為：
Figure 02_image029
本發明亦考慮經5-取代之螢光素示蹤劑，亦即其中T-抗原決定基部分連接於螢光素分子之5-位置的螢光素示蹤劑。經5-取代之螢光素示蹤劑之一般結構為：
Figure 02_image031
其中T為鍵或連接基團。
本發明亦考慮經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物。如本文所用，片語「經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物」意謂經5-取代之螢光素示蹤劑分子，其中鍵結至螢光素核心結構之碳的氫原子中之一或多者經另一官能基置換。在一個實施例中，鍵結至螢光素核心結構之碳的氫原子中的一或多者經供電子基團，諸如但不限於-CH3 、-OCH3 及-OH置換。在一個實施例中，鍵結至螢光素核心結構之碳的氫原子中的一或多者經拉電子基團，諸如但不限於-F、-NO2 、-CN、-COOH、-SO3 H及-Cl置換。在一個實施例中，官能基在螢光素分子之2'-位置及/或7'-位置置換氫。
說明性經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物為：
Figure 02_image033
抗原決定基部分可直接結合於螢光素核心結構或可藉由連接基團T與螢光素核心結構分隔開。通常，抗原決定基部分藉由連接基團與螢光素核心結構分隔開。一般而言，連接基團之長度小於8個原子，較佳長度小於6個原子，更佳長度小於4個原子，且最佳長度小於2個原子。在一個實施例中，連接基團之長度為1個原子。
在一個實施例中，螢光示蹤劑具有連接於香豆素分子之T-抗原決定基部分。
說明性連接基團包括但不限於-CH2 -、-C(O)-、-CH2 -NH-CH2 -CH2 -、-NH-CH2 -CH2 -、-CH2 -NH-C(O)-CH2 CH2 -C(O)-、-NH-、-CH2 -NH-、-CH2 N(CH3 )-及-NH-C(O)-CH2 CH2 -C(O)-。
在一個實施例中，經4'-取代之螢光素示蹤劑係藉由使螢光素之4'位置經醛基官能化而獲得，該醛基可隨後與抗原決定基部分上之官能基(諸如胺)反應以提供其中連接基團為-CH2 -部分的經4'-取代之螢光素示蹤劑，如下文所示：
Figure 02_image035
在另一實施例中，醛基使用熟習此項技術者熟知之化學方法轉化為另一官能基，如圖2中所示，且所得經4'-取代之螢光素分子隨後使用熟習此項技術者已知之化學方法與抗原決定基部分上之官能基(諸如胺或羧酸基)反應，得到經4'-取代之螢光素示蹤劑。
在另一實施例中，醛轉化成羧酸，所得羧酸與N-羥基丁二醯亞胺反應，且所得N-羥基丁二醯亞胺酯隨後與抗原決定基部分上之官能基(諸如胺)反應，得到其中連接基團為-C(O)-部分的經4'-取代之螢光素示蹤劑，如下文所示：
Figure 02_image037
用於將醛轉化為羧酸之適合試劑包括但不限於高錳酸鉀及重鉻酸鈉。
在另一實施例中，抗原決定基部分上之胺基與2,2-二甲氧基乙醛反應以提供縮醛衍生化抗原決定基部分，縮醛衍生化抗原決定基部分之縮醛基團轉化為醛，且所得醛衍生化抗原決定基部分隨後與其中4'-位置經-CH2 -NH2 -基團或-NH2 基團取代的螢光素衍生物稠合，以提供其中連接基團為-CH2 NHCH2 CH2 -或-NHCH2 CH2 -部分的經4'-取代之螢光素示蹤劑，如下文所示：
Figure 02_image039
在4'-位置處經-NH2 基團取代之螢光素分子可如下製備：首先保護在4'-位置經醛基取代之螢光素(如實例1中所述製備)之3-位置處之羧酸基(例如作為酯)，將醛基轉化為羧酸，得到在4'-位置處具有羧酸基且在3-位置具有受保護之羧酸之螢光素。在4-位置處之羧酸隨後轉化為酸氯化物(例如藉由與亞硫醯氯反應)，酸氯化物與氨反應得到醯胺，且醯胺與Br2 /NaOH反應得到胺(亦即霍夫曼溴醯胺降解(Hoffman bromamide degradation))。隨後移除酸保護基。通用反應流程描繪於下文中。
Figure 02_image041
Figure 02_image043
在另一實施例中，抗原決定基分子上之胺基與丁二酸酐(二氫呋喃-2,5-二酮)反應以提供-C(O)-CH2 CH2 C(O)OH衍生化抗原決定基部分，衍生化抗原決定基部分隨後與N-羥基丁二醯亞胺反應以提供酸酐，且隨後使酸酐與其中4'-位置經-CH2 -NH2 -基團或-NH2 基團取代的螢光素衍生物反應，得到其中連接基團為-CH2 NHC(O)CH2 CH2 C(O)-或-NHC(O)CH2 CH2 C(O)-的經4'-取代之螢光素示蹤劑，如下文所示：
Figure 02_image045
在另一實施例中，抗原決定基分子上之酸基與N-羥基丁二醯亞胺反應以提供酸酐，且隨後使酸酐與其中4'-位置經-CH2 -NH2 -基團(可購自Sunyvale, CA的AAT Bioquest)或-NH2 基團取代之螢光素衍生物反應，得到其中連接基團為-CH2 -NH2 -基團或-NH2 基團的經4'-取代之螢光示蹤劑，如下文所示：
Figure 02_image047
應理解，當合成經4'-取代之螢光素示蹤劑時，可能需要習知保護基來防止某些官能基經歷不合需要之反應。適用於特定官能基之保護基以及適用於保護及去保護之條件的選擇為此項技術中已知的。舉例而言，許多保護基及其引入及移除描述於T. W. Greene及P. G. M. Wuts,Protecting Groups in Organic Synthesis ，第2版，Wiley, New York, 1991及其中所引用之參考文獻中。
可使用類似化學方法獲得經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物。
在一個實施例中，具有-NH2 基團的抗原決定基分子為對稱二甲基精胺酸(SDMA)。SDMA之結構為：
Figure 02_image049
在一個實施例中，本發明係關於一種經4'-取代之螢光素示蹤劑或經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物，其具有以下結構：
Figure 02_image051
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含選自以上鑑別之結構的經4'-取代之螢光素示蹤劑或經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種經4'-取代之螢光素示蹤劑或經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物，其具有以下結構：
Figure 02_image053
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含選自以上鑑別之結構的經4'-取代之螢光素示蹤劑或經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種經4'-取代之螢光素示蹤劑或經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物，其具有以下結構：
Figure 02_image055
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含選自以上鑑別之結構的經4'-取代之螢光素示蹤劑或經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種經4'-取代之螢光素示蹤劑，其具有以下結構：
Figure 02_image057
結構A1
在一個實施例中，本發明係關於一種經4'-取代之螢光素示蹤劑，其具有以下結構：
Figure 02_image059
結構A2
在一個實施例中，本發明係關於一種經4'-取代之螢光素示蹤劑，其具有以下結構：
Figure 02_image061
結構A3
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含結構A1之經4'-取代之示蹤劑及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含結構A2之經4'-取代之示蹤劑及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含結構A3之經4'-取代之示蹤劑及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
類似地，經5-取代之螢光素示蹤劑係藉由使螢光素之5-位置經醛基官能化而獲得，該醛基可隨後與抗原決定基部分上之官能基(諸如胺)反應以提供其中連接基團為-CH2 -部分的經5-取代之螢光素示蹤劑，如下文所示：
Figure 02_image063
在5-位置處經醛類官能化之螢光素可藉由以下獲得：將在5-位置處經羧酸基取代之螢光素分子之羧酸基還原成醇(-CH2 OH)，且隨後將所得醇氧化成醛。在5-位置處經羧酸基官能化之螢光素可購自Waltham, MA的Thermo Scientific。
在一個實施例中，本發明係關於一種經5-取代之螢光素示蹤劑或經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物，其具有以下結構：
Figure 02_image065
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含選自以上鑑別之結構的經5-取代之螢光素示蹤劑或經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種經5-取代之螢光素示蹤劑或經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物，其具有以下結構：
Figure 02_image067
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含選自以上鑑別之結構的經5-取代之螢光素示蹤劑或經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種經5-取代之螢光素示蹤劑或經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物，其具有以下結構：
Figure 02_image069
其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含選自以上鑑別之結構的經5-取代之螢光素示蹤劑或經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於結構A4之經5-取代之螢光素示蹤劑。
Figure 02_image071
結構A4
在一個實施例中，本發明係關於結構A5之經5-取代之螢光素示蹤劑。
Figure 02_image073
結構A5
在一個實施例中，本發明係關於結構A6之經5-取代之螢光素示蹤劑。
Figure 02_image075
結構A6
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含結構A4之經5-取代之螢光素示蹤劑及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含結構A5之經5-取代之螢光素示蹤劑及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含結構A6之經5-取代之螢光素示蹤劑及針對SDMA之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於三聚氰胺分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image077
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含Mel-F或Mel-Su-F及針對三聚氰胺之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於生物素分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image079
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含生物素-F及針對生物素之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於甲狀腺素分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image081
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含T2-F、T3-F、T4-F或T3-E-F及針對甲狀腺胺酸之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於阿莫西林分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image083
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含AMO-F及針對阿莫西林之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於安比西林分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image085
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含AMP-F及針對安比西林之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於頭孢噻肟分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image087
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含CEF-F及針對頭孢噻肟之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於達美磺胺分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image089
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含SDM-Su-F或SDM-F及針對達美磺胺之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於皮質醇分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image091
皮質醇-4-Fl
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含皮質酮-4-Fl及針對皮質醇之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於孕酮分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image093
孕酮
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含孕酮-4-Fl及針對孕酮之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
可用於膽汁酸分析中之說明性經4'-取代之螢光素示蹤劑為：
Figure 02_image095
CA-Fl
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含CA-Fl及針對膽汁酸之抗體。在一個實施例中，該抗體與淬滅劑結合。
說明性膽汁酸包括但不限於膽酸及牛膽酸。
Figure 02_image097
膽酸
Figure 02_image099
牛膽酸
在一個實施例中，發螢光之分子係在4'-位置及5'-位置例如經醛基、-COOH基團或-CH2 NH2 基團官能化之螢光素，如下文所描繪：
Figure 02_image101
其中X為-C(O)H、-COOH或-CH2 NH2 。T-抗原決定基部分可在4'-位置、5'-位置或4'-位置及5'-位置連接於螢光素核心結構。T-抗原決定基部分可使用上文所述之化學方法連接於螢光素核心結構。
在一個實施例中，本發明係關於一種複合物，其包含AMO-F、AMP-F或CEF-F及青黴素結合蛋白。在一個實施例中，青黴素結合蛋白與淬滅劑結合。5. 結合搭配物
對分析物及螢光示蹤劑具有特異性之結合搭配物可為例如抗體。抗體可藉由使用此項技術中公認之技術在動物中對分析物產生免疫反應而獲得。通常，半抗原(其具有與相關分析物相同的抗原決定基部分)與載體蛋白質(諸如牛血清白蛋白)結合以提供藉由一系列注射投與動物(諸如兔、小鼠或綿羊)的免疫原(抗原)且隨後使用習知技術分離所得抗體。可用於形成免疫原之其他說明性蛋白質載體包括但不限於匙孔螺血氰蛋白、卵白蛋白、牛γ-球蛋白及甲狀腺素結合球蛋白。或者，可藉由使半抗原結合於含有可與半抗原反應之官能基的合成或天然聚合材料來形成抗原。
結合搭配物亦可為並非抗體之蛋白質。蛋白質可藉由習知技術分離。分析物為對蛋白質具有特異性之受質。舉例而言，分別地，分析物可選自由青黴素、雌二醇及孕酮組成的群，且結合搭配物可選自由青黴素結合蛋白、雌二醇結合蛋白及孕酮結合蛋白組成的群。
在一個實施例中，結合搭配物連接於磁性條碼珠粒。
在一個實施例中，結合搭配物與淬滅劑結合。不希望受理論所束縛，咸信當螢光示蹤劑與結合搭配物結合且結合搭配物與淬滅劑結合且螢光示蹤劑藉由經第一波長之光照射而激發時，能量自螢光示蹤劑轉移至淬滅劑，且淬滅劑隨後以熱方式或藉由以除第二波長外之波長發射光而失去能量。因此，與結合搭配物不與淬滅劑結合時將觀測到的相比，淬滅劑提供螢光強度之更大程度降低。
當螢光示蹤劑與結合於淬滅劑之結合搭配物形成複合物時，其螢光減少隨結合於結合搭配物之淬滅劑分子的當量而變。與結合搭配物結合之淬滅劑分子愈多，螢光減少愈大。此作為與2、4、6及8個BHQ10淬滅劑分子結合之抗體之螢光相對於抗體:螢光示蹤劑比率的圖描繪於圖23中。圖23展示當螢光示蹤劑A3與SDMA之抗體形成複合物時，螢光減少，且最大螢光減少與結合於抗體之淬滅劑分子(BHQ10)之當量成比例。圖23展示當抗體與2當量BHQ10結合時，最大螢光減少為約50%，且當抗體與8當量BHQ10結合時，最大螢光減少為約70%。
可結合於結合搭配物之適合之淬滅劑包括但不限於下文所說明之淬滅劑：
Figure 02_image103
其中相對離子未描繪於上述結構中且其中結合搭配物在
Figure 02_image105
處連接於淬滅劑。
額外適合之淬滅劑包括但不限於：DABCYL及DABCYL-PlusTM (可購自Freemont, CA的AnaSpec公司)；Procion® MX-5B、活性紅(Reactive Red) 4及活性紅120 (可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)；DylightQ543 (可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)；TIDE QUENCHERTM 2WS (可購自Sunyvale, CA的AAT Bioquest)；吡啶-2-偶氮基-對-二甲基苯胺(PADA) (可購自Cambridge, MA的TCI America)；QSY™淬滅劑(包括QSY 7、QSY 9及QSY 21，可購自Waltham, MA的Thermo Fisher Scientific)；QXL™淬滅劑(包括QXL 490、QXL 570、QXL 610及QXL 670，可購自Fremont, CA的AnaSpec公司)；Iowa Black®淬滅劑(包括Iowa Black FQ及Iowa Black RQ，可購自Coralville, IA的Integrated DNA Technologies公司)；及𠮻咯啶(julolidine)衍生物(包括BlackBerry®淬滅劑650，可購自Dexter, MI的Berry & Associates公司)。
使用市售試劑製造結合搭配物-淬滅劑結合物。舉例而言，結合於Cy3及Cy5之結合搭配物藉由使結合搭配物分別與以下反應來製備：
Figure 02_image107
(未描繪相對離子)，上述物質可購自Chicago, IL的GE Healthcare；結合於IRDyeQC1之結合搭配物藉由使結合搭配物與以下反應來製備：
Figure 02_image109
(未描繪相對離子)，上述物質可購自Lincoln, NB的Li-Cor Biosciences；結合於BHQ1之結合搭配物藉由使結合搭配物與以下反應來製備：
Figure 02_image111
(未描繪相對離子)，上述物質可購自Petaluma, CA的LGC Biossearch Technologies；且BHQ10之結合搭配物藉由使結合搭配物與以下反應來製備：
Figure 02_image113
(未描繪相對離子)，上述物質可購自Petaluma, CA的LGC Biosearch Technologies。
結合搭配物藉由根據供應商說明使結合搭配物與N-羥基丁二醯亞胺酯反應而結合於淬滅劑。或者，N-羥基丁二醯亞胺酯可由相應羧酸製備。
N-羥基丁二醯亞胺酯:結合搭配物之比率通常在約1至約30、較佳約1至約20且更佳約1至約12範圍內。比率將視用於製造螢光示蹤劑、淬滅劑、分析物及結合搭配物之螢光分子的選擇而變化。較佳比率係藉由量測不同濃度之此等分子中之每一者之螢光淬滅來確定。
不希望受理論所束縛，咸信N-羥基丁二醯亞胺酯醯化結合搭配物上之一或多個基團，諸如胺基，以提供諸如以下關於淬滅劑CY3所描繪之結構：
Figure 02_image115
較佳地，淬滅劑為CY3、CY5、BHQ1或BHQ10。更佳地，淬滅劑為BHQ10。
選擇淬滅劑使得自螢光示蹤劑發射之光能夠激發淬滅劑或由淬滅劑吸收。選擇淬滅劑使得由淬滅劑發射之光的波長實質上不與照射光之波長重疊。
在一個實施例中，分析物係抗原，螢光示蹤劑係包含與螢光標記連接之抗原的抗原決定基部分的分析物-結合物，且結合搭配物為抗原之抗體。
在一個實施例中，分析物為SDMA，螢光示蹤劑為包含SDMA之抗原決定基部分的分析物-結合物，且結合搭配物為與BHQ10結合之SDMA之抗體。較佳地，BHQ10:抗體之比率為20:1。在一個實施例中，BHQ10:抗體之比率為12:1。
在一個實施例中，分析物為SDMA；螢光示蹤劑選自由A1、A2、A3、A4、A5及A6組成之群；且結合搭配物為與BHQ10結合之SDMA之抗體。在一個實施例中，分析物為SDMA；螢光示蹤劑選自由A1、A2及A3組成之群；且結合搭配物為與BHQ10結合之SDMA之抗體。在一個實施例中，分析物為SDMA，螢光示蹤劑為A3；且結合搭配物為與BHQ10結合之SDMA之抗體。6. 其中分析物係大分子之螢光淬滅分析之說明性實施例
在一個實施例中，分析物為大分子，諸如蛋白質。說明性蛋白質為胱蛋白。
在一個實施例中，分析物為胱蛋白-B (亦即，Cys-B或CysB)；螢光示蹤劑為連接於CysB之螢光部分；且結合搭配物為與一或多種淬滅劑結合之抗胱蛋白-B抗體(亦即，抗Cys-B或抗CysB抗體)。
在一個實施例中，螢光示蹤劑為經由一或多個離胺酸殘基與螢光素結合之CysB。為提供經由一或多個離胺酸殘基與螢光素結合的螢光示蹤劑，使CysB與各種當量的螢光素-NHS (螢光素之N-羥基丁二醯亞胺酯(亦即5- (及6-)羧基螢光素丁二醯亞胺酯)，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)反應，以提供經由離胺酸殘基與FL結合的CysB-Fl。不希望受理論所束縛，咸信螢光素-NHS與CysB上之離胺酸殘基反應以提供經由離胺酸殘基與FL結合之CysB-FL。通常，藉由使CysB與1至4當量的螢光素-NHS反應獲得經由離胺酸殘基與FL結合之CysB-FL。在一個實施例中，藉由使CysB與2當量的螢光素-NHS反應獲得經由離胺酸殘基與FL結合之CysB-Fl。在一個實施例中，藉由使CysB與4當量的螢光素-NHS反應獲得經由離胺酸殘基與FL結合的CysB。
在一個實施例中，螢光示蹤劑為經由一或多個半胱胺酸殘基與螢光素結合的CysB。為提供經由一或多個半胱胺酸殘基與螢光素結合的螢光示蹤劑，使CysB與各種當量之螢光素-5-順丁烯二醯亞胺(可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)反應。不希望受理論所束縛，咸信螢光素-5-順丁烯二醯亞胺與CysB上之半胱胺酸殘基反應，以提供經由半胱胺酸殘基與螢光素結合之CysB-FL。通常，藉由使CysB與1至4當量的螢光素-5-順丁烯二醯亞胺反應獲得經由半胱胺酸殘基與FL結合之CysB。在一個實施例中，藉由使CysB與2當量的螢光素-5-順丁烯二醯亞胺反應獲得經由半胱胺酸殘基結合之CysB-FL。
在一個實施例中，螢光示蹤劑為與螢光素結合之CysB-肽9，亦即CysB-肽9-FL。CysB-肽9-FL藉由使CysB-肽9與螢光素-NHS反應獲得。不希望受理論所束縛，咸信螢光素-NHS與CysB-肽9上之離胺酸殘基反應以提供CysB-肽9-FL。通常，CysB-肽9-FL藉由使CysB-肽9與1至4當量的螢光素-NHS反應獲得。在一個實施例中，CysB-肽9-FL藉由使CysB-肽9與4當量螢光素-NHS反應獲得。
在一個實施例中，結合搭配物為與一或多種BHQ10分子結合的抗胱蛋白-B抗體(亦即，抗CysB抗體)，亦即抗CysB-BHQ。抗CysB-BHQ可藉由使抗CysB抗體與BHQ10-NHS (BHQ10之N-羥基丁二醯亞胺酯，可購自Petaluma, CA的LGC Biosearch Technologies)反應獲得。不希望受理論所束縛，咸信BHQ10-NHS與抗CysB抗體上之離胺酸殘基反應，得到抗CysB-BHQ。通常，抗CysB-BHQ藉由使CysB與1至16當量的BHQ10-NHS反應獲得。CysB抗體之說明性實例包括但不限於3H4-抗胱蛋白-B抗體、Ra355多株-抗CysB抗體及7C2-抗CysB抗體(此等抗體中之每一者均為定製；Ra355為兔多株抗CysB抗體，其由SDIX, Newark, Delaware 19702產生，且3H4-抗胱蛋白-B抗體及7C2-抗CysB抗體為小鼠單株抗CysB抗體，其由Immunoprecise Antibodies公司, Vancouver BC, Canada產生)。在一個實施例中，抗CysB-BHQ藉由使3H4-抗胱蛋白-B抗體與2當量BHQ10-NHS反應而獲得。在一個實施例中，抗CysB-BHQ藉由使3H4-抗胱蛋白-B抗體與4當量BHQ10-NHS反應獲得。在一個實施例中，抗CysB-BHQ藉由使Ra355多株-抗CysB抗體與4當量BHQ10-NHS反應獲得。在一個實施例中，抗CysB-BHQ藉由使7C2-抗CysB抗體與4當量BHQ10-NHS反應獲得。
在一個實施例中，結合搭配物為與一或多種硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)分子結合的抗CysB抗體，亦即抗CysB-BODIPY。抗CysB-BODIPY可藉由使抗CysB抗體與BODIPY-NHS (BODIPY之N-羥基丁二醯亞胺酯，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)反應獲得。通常，抗CysB-BODIPY藉由使CysB與1至4當量的BODIPY-NHS反應獲得。在一個實施例中，抗CysB-BODIPY藉由使3H4-抗胱蛋白-B抗體與2當量BODIPY-NHS反應獲得。在一個實施例中，抗CysB-BODIPY藉由使3H4-抗胱蛋白-B抗體與4當量BODIPY-NHS反應獲得。較佳地，抗CysB-BODIPY藉由使3H4-抗CysB抗體與4當量BODIPY-NHS反應獲得。
在一個實施例中，分析物為CysB；螢光示蹤劑為與抗CysB抗體連接之螢光部分；且結合搭配物為與一或多種淬滅劑結合之CysB。
在一個實施例中，螢光示蹤劑為已與各種當量之螢光素-NHS反應的抗CysB抗體，以提供抗CysB-FL。不希望受理論所束縛，咸信螢光素-NHS與抗CysB抗體上之離胺酸殘基反應，得到抗CysB-FL。通常，抗CysB-FL藉由使抗CysB抗體與1至4當量的螢光素-NHS反應獲得。在一個實施例中，抗CysB-FL藉由使3H4-抗CysB抗體與螢光素-NHS反應獲得。CysB抗體之說明性實例包括但不限於3H4-抗胱蛋白-B抗體、Ra355多株-抗CysB抗體及7C2-抗CysB抗體。在一個實施例中，抗CysB-FL藉由使3H4-抗CysB抗體與2當量螢光素-NHS反應獲得。較佳地，抗CysB-FL藉由使3H4-抗CysB抗體與2當量螢光素-NHS反應而獲得。在一個實施例中，抗CysB-FL藉由使3H4-抗CysB抗體與4當量螢光素-NHS反應獲得。在一個實施例中，抗CysB-FL藉由使Ra355多株-抗CysB抗體與2當量螢光素-NHS反應獲得。在一個實施例中，抗CysB-FL藉由使7C2-抗CysB抗體與2當量螢光素-NHS反應獲得。
在一個實施例中，螢光示蹤劑為已與各種當量之螢光素醛，亦即在4'位置經醛基官能化的螢光素反應的抗CysB抗體，以提供與螢光素醛結合的抗CysB-FL，亦即抗CysB-FL-Ald。不希望受理論所束縛，咸信螢光素醛與抗CysB抗體上之離胺酸殘基反應以提供抗CysB-FL-Ald。在一個實施例中，抗CysB-FL-Ald藉由使3H4-抗CysB抗體與2當量螢光素醛反應獲得。較佳地，抗CysB-FL-Ald藉由使3H4-抗CysB抗體與2當量螢光素醛反應獲得。
在一個實施例中，結合搭配物為與一或多種BHQ10分子結合之CysB，亦即CysB-BHQ。CysB-BHQ可藉由使CysB與BHQ10-NHS反應獲得。不希望受理論所束縛，咸信BHQ10-NHS與CysB上之離胺酸殘基反應，得到CysB-BHQ。通常，CysB-BHQ藉由使CysB與1至16當量的BHQ10-NHS反應獲得。在一個實施例中，CysB-BHQ藉由使CysB與4當量之BHQ10-NHS反應獲得。在一個實施例中，CysB-BHQ藉由使CysB與8當量之BHQ10-NHS反應獲得。較佳地，CysB-BHQ藉由使CysB與8當量之BHQ10-NHS反應獲得。在一個實施例中，CysB-BHQ藉由使CysB與12當量BHQ10-NHS反應獲得。
在一個實施例中，分析物係多肽且螢光示蹤劑係連接於胺基酸長度比該多肽之胺基酸長度短的肽鏈的發螢光分子。在一個實施例中，肽鏈具有小於20個胺基酸之胺基酸長度。在一個實施例中，肽鏈具有小於15個胺基酸之胺基酸長度。在一個實施例中，肽鏈具有小於10個胺基酸之胺基酸長度。在一個實施例中，肽鏈具有小於7個胺基酸之胺基酸長度。在一個實施例中，多肽為大分子(例如蛋白質)。在一個實施例中，肽鏈之胺基酸序列對應於多肽上之抗原決定基部分的胺基酸序列。
在一個實施例中，分析物為大分子，諸如蛋白質；螢光示蹤劑為連接於胺基酸長度比該蛋白質之胺基酸長度短的胺基酸鏈之螢光部分。胺基酸鏈之胺基酸序列對應於負責與結合搭配物複合之蛋白質上的抗原決定基之胺基酸序列。在一個實施例中，結合搭配物與淬滅劑結合
使螢光部分連接於胺基酸長度比蛋白質之胺基酸長度短的胺基酸鏈，而非使螢光示蹤劑連接於完整蛋白質之優勢在於，確保發螢光分子與淬滅劑之間的距離足夠接近，以便有效淬滅。當螢光示蹤劑連接於完整蛋白質時，僅完整蛋白質上之抗原決定基位點與結合搭配物相互作用。因此，若蛋白質上之螢光部分不靠近抗原決定基位點，則當蛋白質與結合搭配物形成複合物時，蛋白上之螢光部分與結合搭配物上之淬滅劑之間的間隔可太大而無法有效淬滅。使螢光部分連接於胺基酸長度比蛋白質之胺基酸長度短的胺基酸鏈將此問題最小化。
在一個實施例中，胺基酸序列(亦即具有胺基酸序列之多肽)連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。
在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
舉例而言，分析物為犬CysB；螢光示蹤劑為連接於5至15個胺基酸、較佳5至10個胺基酸的胺基酸序列的螢光部分；且結合搭配物為視情況與一或多種淬滅劑結合的抗胱蛋白-B抗體(亦即，抗Cys-B或抗CysB抗體)。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列(亦即連接於具有以下胺基酸序列之多肽) QTNKAKHDELAYF (P9) [SEQ ID NO:2]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：YQTNKAKHDELAYF (P14) [SEQ ID NO:3]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：GHDELAYF (P7) [SEQ ID NO:4]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：GDELAYF (P6) [SEQ ID NO:5]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：GELAYF (P5) [SEQ ID NO:6]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：GLAYF (P4) [SEQ ID NO:7]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：MMCGAPSASQPATADTQAIADQVKAQLEERENKKYTTFKAVTFRSQVVAGTPYFIKVQVDDDEFVHLRVFQSLPHENKPLALSSYQTNKAKHDELAYF [SEQ ID NO:1]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
作為另一實例，分析物為犬NT-Pro-B-型利尿鈉蛋白質(NT-proBNP)；螢光示蹤劑為連接於5至15個胺基酸、較佳5至10個胺基酸的胺基酸序列的螢光部分；且結合搭配物為視情況與一或多種淬滅劑結合之抗NT-proBNP Mab。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：AEQLALEPLHRS (P1) [SEQ ID NO:8]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：AEQLAL (P2) [SEQ ID NO:9]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：EPLHRS (P3) [SEQ ID NO:10]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：LALEPL (P4) [SEQ ID NO:11]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：AEQLALE (P5) [SEQ ID NO:12]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：LEPLHRS (P6) [SEQ ID NO:13]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：GRSPASEASEASEASGLWAVQ [SEQ ID NO:15]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：SHSPAEAPEAGGTPRGVLAPHDSVLQ [SEQ ID NO:16]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
在一個實施例中，螢光部分連接於胺基酸序列：HPLGGRSPASEASEASEASGLWAVQELLGRLKDAVSELQAEQLALEPLHRSHSPAEAPEAGGTPRGVLAPHDSVLQALR [SEQ ID NO:14]。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之5-位置。在一個實施例中，連接基團為-NH-C(O)-。在一個實施例中，胺基酸序列連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，胺基酸序列藉由連接基團連接於螢光素之4'-位置。在一個實施例中，連接基團為-CH2 -。
螢光部分可連接於美國專利第8,628,973號；第8,778,699號；第9,605,068號；第9,005,984號；及第10,725,052號中所揭示之多肽中之任一者，該等專利以全文引用之方式併入本文中。各所得多肽示蹤劑可與選自美國專利第8,628,973號；第8,778,699號；第9,605,068號；第9,005,984號；及第10,725,052號中所揭示之相應抗體中之任一者的結合搭配物結合用於本發明之方法中。 實例
本發明之範疇不受實例中所揭示之特定實施例限制，該等實施例意欲說明本發明之一些態樣，且在功能上等效之任何實施例均在本發明之範疇內。實際上，除了本文所示及所述之修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見且意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。本發明之此類變化形式，包括目前已知或稍後產生之所有等效物之替換(其將在熟習此項技術者之領域內)及配方之變化或實驗設計之微小變化將視為屬於併入本文中之本發明範疇內。實例 1 ：螢光素醛之製備
螢光素醛如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image117
將螢光素(4g，12 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)溶解於40 mL氫氧化鈉溶液(1M)中，且隨後加熱至70℃。以逐滴方式向升溫溶液中添加氯仿(8 mL，45 mmol)且將所得混合物維持在相同溫度下3小時。冷卻至室溫後，將反應混合物傾入250 mL 1M HCl溶液中，得到沈澱物。藉由過濾收集沈澱物，用水洗滌若干次，乾燥且避光。
所得粗產物隨後藉由管柱層析使用矽膠管柱(2.5 cm×30 cm)用二氯甲烷/乙腈(15:1)溶離來純化。含有螢光素醛之溶離份使用配備有C18逆相管柱之LC/MS鑑別，該管柱用40%至80%乙腈/水+1%乙酸的梯度溶離。合併含有螢光素醛之溶離份，在減壓下移除溶劑且所得殘餘物在高真空下乾燥，得到0.28 g淺黃色晶體。質譜m/z = 361.1(M+H)+ 。實例 2 ： 三聚氰胺 - 螢光素 (Mel-F) 之製備
Mel-F如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image119
將2-氯-4,6-二胺基-1,3,5-三𠯤(4.5 mg，0.03 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)及4'-胺基甲基螢光素(7.9 mg，0.02 mmol，可購自Sunyvale, CA的AAT Bioquest)溶解於無水二甲亞碸(DMSO) (1 mL)中。向所得溶液中添加無水碳酸鉀(5.5 mg，0.04 mmol)，將溶液加熱至95℃，且在此溫度下攪拌溶液隔夜。隨後在減壓下移除溶劑，且將所得殘餘物溶解於含有0.1%三氟乙酸(TFA)之30%乙腈水溶液中。所得溶液藉由管柱層析使用C18逆相管柱(10 g)用含有0.1% TFA之水性乙腈溶液溶離來純化。30%乙腈至60%乙腈之梯度用於梯度。合併含有純Mel-F之溶離份且凍乾，得到呈黃色粉末狀之Mel-F。質譜m/z = 471.7 (M+H)+ 。實例 3 ： 三聚氰胺 - 丁二酸 - 螢光素 (Mel-Su-F) 之製備
Mel-Su-F如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image121
將三聚氰胺(416 mg，3.3 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)及丁二酸酐(0.5 g，5.0 mmol)溶解於無水二甲基甲醯胺(DMF) (8 mL)中。將所得溶液加熱至100℃且在此溫度下攪拌隔夜。隨後在減壓下移除溶劑，得到三聚氰胺-丁二酸衍生物(Mel-Su)。
將Mel-Su (270 mg，1.2 mmol)、N',N'-二環己基碳化二亞胺(268 mg，1.3 mmol)及N-羥基丁二醯亞胺(0.15 g，1.30 mmol)溶解於無水二甲亞碸(DMSO) (5 mL)中且在室溫下攪拌所得溶液隔夜。隨後在減壓下移除溶劑，得到(Mel-Su-NHS)，其不經進一步純化即使用。
將Mel-Su-NHS (8 mg，0.025 mmol)及4'-胺基甲基-螢光素(10 mg，0.025 mmol，可購自Sunyvale, CA的AAT Bioquest)溶解於無水DMF (0.5 mL)中。向所得DMF溶液中添加N'N'-二異丙基乙胺(DIPEA) (10 μL)，在室溫下攪拌溶液2小時，且在高真空下移除溶劑，得到殘餘物。所得殘餘物藉由管柱層析使用C18逆相管柱(10 g)用40%至60%乙腈之梯度溶離來純化，得到Mel-Su-F。質譜m/z = 570.2 (M+H)+ 。實例 4 ： 生物素 - 螢光素 ( 生物素 -F) 之製備
生物素-F如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image123
將4'-胺基甲基螢光素(3 mg，7.54 μmol，可購自Sunyvale, CA的AAT Bioquest)及N-羥基丁二醯亞胺基生物素(2.5 mg，7.54 μmol，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)溶解於無水DMF (0.5 mL)中。向DMF溶液中添加N,N,-二異丙基乙胺(4 μL)且使所得溶液在室溫下攪拌兩小時。溶液隨後用含0.1%甲酸之40%乙腈/水稀釋且藉由管柱層析使用C18逆相管柱(1 g)用含0.1%甲酸之40%乙腈/水的移動相溶離來純化，得到3 mg呈黃色固體狀之生物素-F (產率：68%)。質譜m/z = 588.4 (M+H)+ 。實例 5 ： 達美磺胺 - 丁二酸 - 螢光素 (SDM-Su-F) 之製備
SDM-Su-F如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image125
將達美磺胺(SDM，1.0 g，3.2 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)及丁二酸酐(0.49 g，4.9 mmol)溶解於無水DMF (6 mL)中。將所得溶液加熱至100℃且在此溫度下維持2小時，之後在減壓下移除溶劑，得到殘餘物。所得殘餘物由乙醇:水(1:1)再結晶，得到1 g SDM-丁二酸(SDM-Su)。
在氬氣氛圍下將SDM-Su (0.51 g，1.24 mmol)、N'N'-二環己基碳化二亞胺(0.28 mL，1.36 mmol)及N-羥基丁二醯亞胺(0.15 g，1.30 mmol)合併且溶解於無水DMF (5 mL)中。在室溫下攪拌所得溶液隔夜。隨後在減壓下移除溶劑，且所得產物(SDM-Su-NHS)未經進一步純化即使用。
將SDM-Su-NHS (15.2 mg，0.03 mmol)及4'-胺基甲基-螢光素(8 mg，0.02 mmol，可購自Sunyvale, CA的AAT Bioquest)溶解於無水DMF (0.5 mL)中。向DMF溶液中添加N'N'-二異丙基乙胺(7 μL，0.04 mmol)且在室溫下攪拌溶液2小時。隨後在高真空下移除溶劑，得到殘餘物。所得殘餘物藉由管柱層析使用C18逆相管柱(10 g)用40%乙腈溶離來純化，得到呈黃色粉末狀之SDM-Su-F。質譜m/z = 754.8 (M+H)+ 。實例 6 ： T3- 乙基 - 螢光素 (T3-E-F) 之製備
T3-E-F如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image127
T3-乙基縮醛
將三碘甲狀腺胺酸(100 mg，0.154 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)溶解於甲醇(5 mL)中。隨後向甲醇溶液中添加氫氧化鈉(45 μL，10 M)及二甲氧基縮醛(230 mL，60%水性溶液，1.5 mmol)，且將溶液保持在室溫下30分鐘。隨後添加氰基硼氫化鈉(50 mg，0.77 mmol)且將所得反應混合物攪拌2小時。隨後添加氫氧化鈉(0.1 mL，1 M)且使所得反應混合物再攪拌2小時。隨後將1 M HCl添加至反應混合物中以使T3-乙基縮醛(100 mg)，質譜m/z = 740.3 (M+H)+ 沈澱，其不經進一步純化即使用。 T3-乙基醛
將T3-乙基縮醛在四氫呋喃及硫酸(THF/H2 SO4 )中水解隔夜。隨後在減壓下移除溶劑，得到殘餘物。將所得殘餘物溶解於含有1%乙酸之20%乙腈水溶液中且藉由管柱層析使用C18逆相管柱(5 g)來純化，該管柱用20%至50%乙腈/水之梯度溶離。將含有T3-乙基-醛之溶離份合併且凍乾，得到白色粉末。 T3-E-F
將T3-乙基醛(3 mg，0.0042 mmol)及4'-胺基甲基螢光素(0.9 mg，0.002 mmol，可購自Sunyvale, CA的AAT Bioquest)溶解於THF (1 mL)及乙酸(12 μL)中且添加三乙醯氧基硼氫化鈉(NaBH(OAc)3 ) (2mg)。在室溫下攪拌所得溶液隔夜。第二天，在減壓下移除溶劑且所得殘餘物藉由管柱層析使用C18逆相管柱用20%至60%乙腈/水的梯度溶離來純化，得到T3-E-F。質譜m/z = 1039.4 (M+H)+ 。實例 7 ： 達美磺胺 - 螢光素 (SDM-F) 之製備
SDM-F如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image129
將達美磺胺(8.6 mg，0.028 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)及螢光素醛(8 mg，0.022 mmol)溶解於甲醇(2 mL)中。添加三乙醯氧基硼氫化鈉(15 mg，0.15 mmol)及乙酸(4 μL)且在室溫下攪拌所得溶液隔夜。反應溶液隨後用40%乙腈/水+0.1%三氟乙酸(TFA)稀釋且藉由管柱層析使用C18逆相管柱(5 g)用40%至60%乙腈/水+0.1% TFA的梯度溶離來純化。合併含有SDM-F產物之溶離份且凍乾，得到1 mg呈黃色粉末狀之SDM-F。質譜m/z = 623.7 (M+H)+ 。實例 8 ： T3-F 之製備
T3-F如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image131
在含有40 ml碳酸氫鈉緩衝液(100 mM pH 8.0)及20 mL二㗁烷之混合物的100 mL燒瓶中添加螢光素醛(180 mg，0.5 mmol)及三碘甲狀腺素(390 mg，0.6 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)，且使所得溶液在室溫下攪拌1小時。隨後將氰基硼氫化鈉(400 mg，5 mmol)添加至溶液中且在室溫下在暗處攪拌所得混合物隔夜。所得混合物之pH隨後使用1 M HCl調節至pH 5.0且藉由凍乾移除溶劑。
使用100 g C18逆相二氧化矽製備直徑為38 mm且長度為200 mm之急驟管柱。使用至少三個管柱體積之30%乙腈/水+0.1%乙酸來平衡管柱。隨後將粗T3-F產物溶解於30%乙腈/水+0.1%乙酸中，施加於管柱，且用30%乙腈/水+0.1%乙酸溶離管柱。使用配備有在220 nm下操作之UV偵測器之HPLC (4.6 mm×100 mm XTerrao C18逆相管柱)監測溶離級分是否存在T3-F。合併含有T3-F之溶離份。基於使用220 nm下之UV偵測之HPLC分析，合併之溶離份展現超過95%之純度。將合併之溶離份凍乾，得到350 mg產物。質譜m/z = 996.6(M+H)+ 。總產率為約50%。
使用類似方法製備T2-F及T4-F。產物藉由其質譜表征。T2-F m/z = 869.8 (M+H)+ 且T4-F m/z = 1122.1 (M+H)+ 。實例 9 ： 阿莫西林 - 螢光素 (AMO-F) 之製備
AMO-F如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image133
在含有40 ml碳酸氫鈉緩衝液(100 mM pH 8.0)及20 ml二㗁烷之混合物的100 mL燒瓶中添加螢光素醛(360 mg，1 mmol)及阿莫西林(547 mg，1.5 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)，且使用冰浴將所得溶液冷卻至4℃且攪拌40分鐘。隨後添加氰基硼氫化鈉(314 mg，5 mmol)且在暗處在4℃下攪拌反應混合物。約2小時後，再添加一份氰基硼氫化鈉(125 mg，2 mmol)且在4℃下在暗處攪拌反應混合物。使用HPLC監測反應混合物。當反應完成(如藉由至少90%產物形成所指示)時，用1 M HCl將反應混合物之pH調節至pH 5.5，且隨後藉由凍乾移除溶劑以得到粗產物。將三分之一粗產物溶解於50 mL 30%乙腈/水+0.1%乙酸中，得到pH為5.4之透明黃色溶液，且所得溶液藉由管柱層析使用C18逆相管柱用30%乙腈/水+0.1%乙酸的移動相溶離來純化。合併含有AMO-F之溶離份。合併之溶離份藉由配備有在220 nm下操作的UV偵測器之HPLC分析，且基於220 nm下之吸收展示超過95%之純度。隨後凍乾合併之溶離份，得到61 mg產物。產物之總產率為約42%。質譜m/z = 710.1795 (M+H)+ 。
使用類似方法製備安比西林-螢光素(AMP-F)。質譜m/ z = 694.2 (M+H)+ 。實例 10 ： AMO-FITC 之製備
AMO-FITC如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image135
將阿莫西林(9.4 mg，0.026 mmol，可購自Sigma)、異硫氰酸螢光素(FITC) (10 mg，0.026 mmol，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)及三乙胺(5.6 μL，0.75 mmol)溶解於DMF (1 mL)中，且使所得溶液在室溫下攪拌隔夜。溶液隨後用30%乙腈/水+0.1%乙酸稀釋且施加至C18逆相管柱。管柱用30%至50%乙腈/水+0.1%乙酸之梯度溶離。合併含有AMO-FITC之溶離份且凍乾合併之溶離份，得到黃色粉末。質譜m/z = 755.2 (M+H)+ 。實例 11 ：頭孢噻肟 - 螢光素 ( CEF-F ) 之製備
CEF-F如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image137
將頭孢噻肟酸(63 mg，0.138 mmol，可購自St. Paul, MN的LKT Laboratories公司)、4'-胺基甲基螢光素(50 mg，0.126 mmol，可購自Sunyvale, CA的AAT Bioquest)及無水碳酸鉀(52 mg，0.378 mmol)溶解於無水DMF (10 mL)中，且在室溫下攪拌所得溶液10分鐘。向溶液中添加六氟磷酸2-(1H-7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基銨(HATU) (53 mg，0.15 mmol)且在室溫下攪拌所得混合物6小時。隨後在減壓下移除溶劑，得到殘餘物。隨後將殘餘物溶解於30%乙腈/水+0.1%乙酸中且將所得溶液施加至C18逆相管柱(100 g)，該管柱用40%至50%乙腈/水+0.1%乙酸的梯度溶離。合併含有CEF-F產物之溶離份且凍乾，得到105 mg產物。質譜m/z = 799.1477 (M+H)+ 。實例 12 ： CY3 標記、 CY5 標記、 IRDyeQC1 標記及 BHQ1 標記之抗 T4-Mab 之製備
於PBS (1 mL)中之單株抗T4抗體(抗T4-Mab) (4 mg，可購自Memphis, TN的Meridian Life Sciences公司(Biodesign))與於DMSO (0.25 mL)中之0.5 mg Cy3-NHS (亦即，Cy3的N-羥基丁二醯亞胺酯，可購自Chicago, IL的GE Healthcare)、Cy5-NHS (Cy5的N-羥基丁二醯亞胺酯，可購自Chicago, IL的GE Healthcare)、IRDyeQC1-NHS (IRDyeQC1的N-羥基丁二醯亞胺酯，可購自Lincoln, NB的Li-Cor Biosciences)或BHQ1-NHS (BHQ1的N-羥基丁二醯亞胺酯，可購自Petaluma, CA的LGC Biossearch Technologies)混合，得到溶液。所得溶液在4℃下攪拌隔夜。淬滅劑標記之抗體隨後藉由管柱層析使用Sephadex G-25管柱用PBS移動相溶離來純化。使用BCA套組(可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)測定蛋白質濃度。實例 13 ： T3-FITC 之製備 ：
T3-FITC如下文所提供之反應流程中所描繪來製備：
Figure 02_image139
將三碘甲狀腺素(16.7 mg，0.025 mmol)、異硫氰酸螢光素(FITC，10 mg，0.026 mmol，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)及三乙胺(5.6 μL，0.75 mmol)溶解於DMF (1 mL)中且在室溫下攪拌所得溶液隔夜。溶液隨後用30%乙腈/水+0.1%乙酸稀釋且所得溶液藉由管柱層析使用C18逆相管柱用30%至70%乙腈/水+0.1%乙酸的梯度溶離來純化。將含有T3-FITC之溶離份合併且凍乾，得到黃色粉末。質譜m/z = 1040.8295 (M+H)+ 。實例 14 ： 三聚氰胺 -ED-F 及三聚氰胺 -OG 之製備 ：
Figure 02_image141
將2-氯-4,6-二胺基-1,3,5-三𠯤(36 mg，0.24 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)及乙二胺(30 mg，0.5 mmol)溶解於無水DMSO (2 mL)中，添加無水碳酸鉀(82 mg，0.6 mmol)，且將所得懸浮液加熱至95℃且在該溫度下保持在氬氣氛圍下隔夜。隨後在減壓下移除溶劑，得到殘餘物。所得殘餘物藉由管柱層析使用C18逆相管柱(10 g)用50%乙腈/水溶離來純化，得到三聚氰胺-乙胺。
將三聚氰胺-乙胺(0.5 mg，0.003 mmol)及俄勒岡綠(Oregon Green)-NHS酯(1 mg，0.002 mmol，可購自Carlsbad, CA的Invitrogen Life Technologies)或5-羧基螢光素丁二醯亞胺酯(1 mg，0.002 mmol，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)溶解於含有三乙胺(8 μL)之DMF (0.5 mL)中且在室溫下培育6小時。所得溶液用30%乙腈/水+1%乙酸稀釋且藉由管柱層析使用C18逆相管柱來純化，得到三聚氰胺-ED-F或三聚氰胺-OG。三聚氰胺-ED-F，m/z = 528.2 (M+H)+ ；三聚氰胺-OG，m/z = 564.1 (M+H)+ 。實例 15 ： 各種螢光示蹤劑及抗三聚氰胺抗體之混合物的螢光
將其中三聚氰胺與螢光素結合之各種經取代螢光示蹤劑溶解於DMSO (1 mM)中且稀釋於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS) (pH=7.3)中，得到三聚氰胺示蹤劑溶液(1.2 μM)。使用以下三聚氰胺示蹤劑：
Figure 02_image143
將多株抗三聚氰胺抗體(抗Mel-Ab，4.65 mg/ml，可購自Memphis, TN的Meridian Life Sciences公司(Biodesign))稀釋於PBS中且連續稀釋，得到抗Mel-Ab濃度在0至300 nM範圍內之抗Mel-Ab溶液。在具有非結合表面之96孔黑色分析盤(可購自Corning，NY的Corning公司)中，將三聚氰胺示蹤劑溶液(5 μL)與各抗Mel-Ab溶液(195 μl)混合，得到具有不同的抗Mel-Ab:三聚氰胺示蹤劑莫耳比的溶液。三聚氰胺示蹤劑之濃度為30 nM。在室溫下溫和地振盪盤30分鐘。隨後使用螢光盤讀取器(Synergy 4微量盤讀取器，可購自Winooski, VT的BioTek Instruments公司)使用490 nm之激發波長且讀取520 nm下之發射，量測各溶液之螢光強度。結果展示於圖3中。
圖3展示不同的三聚氰胺-螢光素結合物在不同程度上淬滅螢光且淬滅之量隨抗Mel-Ab:三聚氰胺示蹤劑莫耳比而變。抗Mel-Ab:三聚氰胺示蹤劑比率愈高，淬滅之量愈大。結果亦表明，相較於其他三聚氰胺示蹤劑，當抗Mel-Ab:三聚氰胺示蹤劑莫耳比為6:1時，經4'-取代之示蹤劑(亦即Mel-F)呈現最高淬滅程度且達到飽和點。此等結果展示淬滅效率(亦即，與在抗體不存在下之螢光相比，1:1之螢光抗體:抗原比率下之螢光減少百分比)視配位體連接於螢光素分子之位置而定，其中經4'-取代之示蹤劑展現較經5-取代之示蹤劑更佳的淬滅效率。結果亦表明當連接基團較短時淬滅效率較高。
除非另外指示，否則在整個實例中使用490 nm之激發波長且讀取520 nm下之發射。除非另外指示，否則所有結果均為一式三份量測結果之平均值。實例 16 ： 隨三聚氰胺濃度而變之 Mel-F 及抗 Mel-Ab 之溶液的螢光
將含Mel-F之PBS (1.2 μM，5 μL)及抗Mel-Ab溶液(6 μM，5 μL)之等分試樣添加至96孔黑色分析盤中且在室溫下在溫和振盪下培育30分鐘。在PBS中以0至20 ng/ml範圍內之濃度製備三聚氰胺標準溶液。隨後將各三聚氰胺標準溶液添加至96孔分析盤中Mel-F及抗Mel-Ab之溶液中。隨後在室溫下培育盤1小時且量測螢光強度。結果展示於圖4中，其描繪了隨三聚氰胺濃度而變的螢光恢復。在圖4中，Mel-F之濃度為30 nM，且抗Mel-Ab之濃度為150 nM。結果指示在PBS溶液中三聚氰胺之動態範圍係約0至8 ng/mL。實例 17 ： 在存在及不存在三聚氰胺之情況下 Mel-F 及抗 Mel-Ab 之血清溶液的螢光
未處理之犬血清使用磷酸鹽緩衝液調節至pH 7.3且用PBS稀釋10倍。向Mel-F於PBS中之溶液(1 μM，6 μL)及不存在及存在三聚氰胺(2 μM，6 μL)的含Mel-F之PBS (1 μM，6 μL)及抗Mel-Ab (1 μM，6 μL)之混合物中添加PBS、血清或經稀釋血清(亦即，用PBS 1/10稀釋之血清)，得到200 μL之最終體積。所得溶液在室溫下培育1小時且隨後量測螢光強度。結果展示於圖5中。
此等結果展現對於各溶液，Mel-F之螢光由抗Mel-Ab淬滅至原始值的約一半且螢光藉由添加三聚氰胺恢復。實例 18 ： 在三聚氰胺存在下之抗 Mel-Ab 及 Mel-F 之乳溶液之螢光
生乳樣品用PBS稀釋10倍。藉由連續稀釋製備具有0至250 nM範圍內三聚氰胺濃度之已用PBS稀釋10倍的生乳中之三聚氰胺標準溶液。向96孔黑色分析盤之孔中添加含Mel-F之PBS (2 μM，5 μL)及抗Mel-Ab (10 μM，5 μL)。隨後向各孔中添加三聚氰胺標準溶液(190 μL)，在室溫下培育盤1小時，且記錄螢光強度。結果展示於圖6中。
圖6描繪在各種濃度之三聚氰胺下，在抗Mel-Ab (250 nM)存在下，Mel-F (50 nM)溶液(10%生乳於PBS中)之螢光強度。結果展示，用於偵測三聚氰胺之動態範圍係約0至30 μg/L。實例 19 ： 在生物素 -F 或生物素 -ED 及抗生蛋白鏈菌素存在下溶液之螢光
將生物素-F或生物素-ED (可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)溶解於DMSO中，得到DMSO溶液(8.5 μM)。生物素ED之結構為：
Figure 02_image145
隨後用PBS稀釋DMSO溶液以提供具有100 nM之生物素-F或生物素-ED濃度之溶液。隨後將20 μL所得生物素-F或生物素-ED PBS溶液之等分試樣添加至96孔黑色分析盤之孔中。製備抗生蛋白鏈菌素於PBS中之溶液，其抗生蛋白鏈菌素濃度在0至100 nM範圍內，且添加(180 μL)至盤中之生物素-F或生物素-ED溶液中。在室溫下培育盤30分鐘且隨後記錄螢光強度。結果展示於圖7中，其展示隨抗生蛋白鏈菌素:示蹤劑之莫耳比而變的螢光強度之變化百分比。
圖7中之結果展示生物素F之螢光比生物素ED之螢光更有效地淬滅。在飽和點(1:1莫耳比)下，生物素-F之淬滅效率比生物素-ED之淬滅效率高70%。結果展示，經4'-取代之螢光示蹤劑之螢光變化大於經5-取代之螢光示蹤劑之螢光變化。實例 20 ： 在 T4 存在下 T3-F 及抗 T4-Mab 的溶液之螢光
向不存在及存在L-甲狀腺素(T4，2 μM，6 μL，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)的含T3-F之PBS (1 μM，6 μL)及抗單株抗甲狀腺素抗體(抗T4-Mab (可購自Denver, CO的Biodesign公司) (1 μM，6 μL)之混合物中添加PBS，得到200 μL的最終體積。所得溶液在室溫下培育1小時且隨後量測螢光強度。
製備類似溶液且量測螢光，不同之處在於T3-F被T3-5-F、T3-E-F及T3-FITC替換。
以下程序用於合成T3-5-F： T3-5-螢光素(T3-5-F)之製備
Figure 02_image147
將三碘甲狀腺素(8.2mg，0.013 mmol)、5-羧基螢光素N-羥基丁二醯亞胺(「NHS」) (5.9 mg，0.013 mmol，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)及N'N-二異丙基乙胺(6.5 μL，0.04 mmol)溶解於DMF (1 mL)中，且使所得溶液在室溫下攪拌隔夜。溶液藉由管柱層析使用C18逆相管柱(5 g)用40%乙腈/水+0.1%乙酸溶離來純化，得到T3-5-F。
各示蹤劑之結構描繪如下：
Figure 02_image149
結果展示於圖8中。圖8展示T3-FITC及T3-5-F螢光均未被抗T4-Mab淬滅。對於T3-E-F及T3-F，螢光由抗T4-Mab淬滅。此展示與經5-取代之螢光示蹤劑相比，淬滅對經4'-取代之螢光示蹤劑更有效。
圖9描繪當將T3-F添加至抗T4-Mab時淬滅之量及添加T4之後隨時間推移的淬滅之恢復。結果展示，在10分鐘內獲得穩定螢光信號。實例 21 ： PBS 中之 T4 劑量反應
將含T3-F之PBS (1.0 μM，8 μL)及含抗T4-Mab之PBS (1 μM，8 μL)之混合物在室溫下在96孔黑色分析盤之孔中培育30分鐘。隨後將T4濃度在0至32 μg/dL (184 μL)範圍內的一系列T4標準溶液添加至含T3-F之PBS及含抗T4 Mab之PBS之混合物中。隨後在室溫下培育盤30分鐘且記錄螢光強度。結果展示於圖10中。
圖10展示當T4添加至T3-F (50 nM)及抗T4-Mab (50 nM)之溶液中時螢光恢復。結果展示PBS中T4偵測之動態範圍在約0至15 μg/dL範圍內。實例 22 ： 在凍乾之後 T4 存在下 T3-F 及抗 T4-Mab 之溶液之螢光
將T3-F (1.7 mg)溶解於0.85 ml DMSO中，得到儲備溶液(2 mM)。隨後在PBS中稀釋T3-F儲備溶液，得到1 μM工作溶液，將其分至兩個小瓶中(各1 mL)。向第一小瓶中添加PBS (9 mL)且向第二小瓶中添加PBS (8.9 mL)加抗T4 Mab (15 μM，0.1 mL)。小瓶充分混合且在室溫下培育30分鐘。測定各溶液(200 μL)之螢光強度。隨後將各溶液(200 μL)之等分試樣置於96孔黑色分析盤之孔中且凍乾至乾燥。向乾燥殘餘物中添加200 μL PBS、已用木炭處理之馬血清(亦即，血清為藉由在含有木炭之PBS緩衝液中透析血清至少三個緩衝變化以自血清移除小分子而「木炭剝離」的)或含有T4 (10 μg/dL)之已用木炭處理之馬血清，且在室溫下培育盤30分鐘。隨後再次記錄螢光強度。結果展示於圖11中。
圖11展示即使當T3-F及/或抗T4-Mab凍乾，分析仍有效。實例 23 ： 在 T4 存在下 T4-F 及 Ab-Cy5 之混合物的螢光
將T4-F溶解於DMSO (1 mM)中且用PBS稀釋以提供儲備溶液(4 μM)。藉由連續稀釋製備具有0至400 nM範圍內之Ab-Cy5濃度的Cy5結合抗體(Ab-Cy5，如實例12中所製備)之一系列PBS溶液。在96孔黑色分析盤之孔中合併含T4-F之PBS (5 μL)及連續稀釋之Ab-Cy5溶液(95 μL)，且盤在室溫下振盪30分鐘。使用490 nm之激發波長及520 nm之發射波長量測螢光強度。圖12A及B展示在Ab-Cy5存在下T4-F之螢光淬滅(在約1:1之T4-F:Ab-Cy5之比率下淬滅效率約70%)。單獨Cy5 (亦即不與抗T4-Mab結合)不淬滅螢光。
對於表明螢光可在T4存在下恢復之實驗，向96孔黑色分析盤之孔中添加含T4-F之PBS (5 μL、4 μM)及Ab-Cy5溶液(5 μl、8 μM)之混合物的等分試樣。隨後向各孔中添加90 μL T4之PBS溶液(0、1、2、4、6、8、10、12 μg/dL)。將所得100 μL溶液培育30分鐘且量測螢光。結果描繪於圖13中。
圖13A展示當T4添加至T4-F及Ab-Cy5 (Ab-Cy5:T4-F約2:1)之溶液中時螢光增加且螢光增加與添加的T4之量成比例。動態範圍為約0至12 μg/dL。圖13B描繪隨T4-F濃度而變的螢光恢復百分比。實例 24 ： 在 T4 存在下 T3-F 或 T4-F 及 Ab-Cy3 之混合物的螢光
向已用木炭處理之馬血清(50 mL)中添加8-胺基-萘磺酸(ANS)，得到0.5 mM的ANS濃度且用氫氧化鈉將pH調節至7.3。藉由連續稀釋製備濃度在0至64 μg/dL範圍內的一系列T4標準PBS或血清溶液。在96孔黑色分析盤中，將各T4標準品(在PBS或血清中，80 μL)添加至含T3-F (或T4-F)之PBS (4 μM，5 μL)及含與Cy3結合的抗T4-Mab (Ab-Cy3，如實例12中所描述製備)之PBS (4 μM，5 μL)之混合物中。所得溶液在室溫下培育30分鐘且隨後量測螢光強度。結果展示於圖14中。
圖14A展示當T4添加至T3-F (200 nM)及Ab-Cy3 (200 nM)於PBS及血清中之溶液中時，隨T4濃度而變的螢光強度。結果展示PBS及血清中T4偵測之動態範圍係約0至64 μg/L。
圖14B展示當T4添加至T4-F (200 nM)及Ab-Cy3 (200 nM)於PBS及血清中之溶液中時，隨T4濃度而變的螢光強度。結果展示PBS及血清中T4偵測之動態範圍係約0至64 μg/L。
圖14C展示當樣品在490 nm下激發且發射在615 nm下量測時，當T4添加至T4-F (200 nM)及Ab-Cy3 (200 nM)於PBS中之溶液中時，隨T4濃度而變之螢光強度。發射之此降低歸因於螢光共振能量轉移(FRET)之損失。FRET涉及處於激發態之供體染料經由非輻射方式能量轉移至接受體染料。在此情況下，490 nm下供體(T4-F)之激發引起至接受體染料(Ab-Cy3)之有效能量轉移，引起615 nm下之發射。FRET過程具有高距離依賴性且僅在Ab-Cy3結合於T4-F時發生。添加T4後，結合於T4-F之Ab-Cy3的解離歸因於供體(T4-F)與接受體(Ab-Cy3)之間的距離增加而使得FRET效率降低。實例 25 ： 在游離抗生素存在下與螢光素結合之 β 內醯胺抗生素及抗體之混合物的螢光
在96孔黑色分析盤中，在不存在及存在游離β-內醯胺抗生素(安比西林(400 nM)添加至AMP-F且頭孢噻肟(400 nM)添加至CEF-F)下，將含與螢光素結合之β內醯胺抗生素(亦即，AMO-FITC、AMO-F、AMP-F及CEF-F)之PBS (400 nM，100 μL)與抗青黴素或抗頭孢噻肟多株抗體(400 nM，100 μL，可購自Centennial, CO的Novus Biologicals公司)混合。溶液之示蹤劑及抗體濃度為200 nM。在室溫下培育溶液5分鐘且量測螢光強度。結果展示於圖15中。
此等結果展示，AMO-FITC之螢光不藉由添加抗青黴素抗體淬滅，而AMO-F及AMP-F之螢光藉由同一抗體淬滅。結果亦展示將安比西林添加至抗青黴素抗體及AMP-F之溶液引起螢光強度增加(亦即恢復)。類似地，CEF-F之螢光藉由抗頭孢噻肟抗體淬滅且添加頭孢噻肟至抗頭孢噻肟抗體及CEF-F之溶液引起螢光強度增加(亦即恢復)。實例 26 ： 在達美磺胺存在下 SDM-F 或 SDM-Su-F 及抗達美磺胺單株抗體之混合物的螢光
將含SDM-F或SDM-Su-F之PBS (400 nM，100 μL)與抗達美磺胺單株抗體(400 nM，100 μL，可購自San Diego, CA的Genway Biotech)在不存在及存在達美磺胺(SDM) (400 nM)下混合。在室溫下培育所得溶液5分鐘且隨後量測螢光強度。結果展示於圖16中。
此等結果展示，SDM-F及SDM-Su-F當與抗達美磺胺單株抗體組合時螢光淬滅。與SDM-Su-F相比，SDM-F之淬滅量更大，指示連接基團之長度影響淬滅。結果亦展示將SDM添加至抗達美磺胺抗體及SDM-F或SDM-Su-F之溶液使得螢光強度增加。實例 27 ： 藉由抗 T4-Mab 之 T3-F 螢光淬滅
將T3-F溶解於DMSO (1 mM)中且用PBS稀釋以提供儲備溶液(4 μM)。單株抗T4抗體(抗T4-Mab，可購自Memphis, TN的Meridian Life Sciences公司(Biodesign)) (4.65 mg/mL)在PBS緩衝液中連續稀釋，得到具有0至1000 nM範圍內之抗T4-Mab濃度的溶液。在含有連續稀釋之抗T4-Mab溶液(195 μL)的96孔黑色分析盤中，添加T3-F溶液(5 μL)，充分混合，培育30分鐘且記錄螢光強度。結果提供於圖17中。
圖17展示在抗T4-Mab存在下T3-F之螢光淬滅。最大淬滅在約1:1之抗體:示蹤劑莫耳比下達到。將抗T4-Mab:示蹤劑之比率提高至20:1不展示進一步淬滅量增加。
在另一實驗中，將示蹤劑T2-F、T3-F或T4-F溶解於DMSO中以提供示蹤劑濃度為1 mM之DMSO溶液。DMSO溶液隨後用磷酸鹽緩衝鹽水(「PBS」)稀釋，得到濃度為10 μM之各示蹤劑之儲備溶液。在PBS中連續稀釋單株抗T4-Mab或與淬滅劑結合之抗T4-Mab (Cy3-Ab，IRdyeQC1-Ab，Cy5-Ab，BHQ1-Ab)，以提供濃度在0至2 μ M範圍內之抗T4-Mab或與淬滅劑結合的抗T4-Mab之溶液。在含有連續稀釋之抗T4-Mab或與淬滅劑結合之抗T4-Mab (95 μL)的96孔黑色分析盤中，添加示蹤劑T2-F、T3-F或T4-F溶液(5 μL)，充分混合，且培育30分鐘且隨後以485 nm之激發波長及520 nm之發射波長記錄螢光強度。不同示蹤劑及淬滅劑修飾之抗體之最大螢光淬滅百分比之結果提供於下表中： 在具有及不具有淬滅劑標記之情況下抗T4抗體之螢光素-結合物之螢光淬滅百分比
螢光素- 結合物 Cy3-Ab IRdyeQC1-Ab Cy5-Ab BHQ1-Ab Ab
T2-F 58% 8% 16% 11% 22%
T3-F 80% 53% 40% 30% 30%
T4-F 82% 78% 31% 無 無
結果展示，Cy3-Ab淬滅超過50%之全部三種螢光素-結合物(T2-F、T3-F及T4-F)之螢光，而IRdyeQC1-Ab淬滅超過50%之T3-F及T4-F的螢光。經標記之抗體與螢光素-結合物之此等組合使其可用作T4分析之試劑。資料亦展示與T2-F及T4-F相比T3-F為用於T4分析之最佳結合物。實例 28 ： 皮質醇 -4-Fl 及皮質醇 -5-Fl 藉由皮質醇抗體之螢光淬滅
皮質醇-4-Fl，亦即：
Figure 02_image151
藉由將氫皮質酮-3-(羧基甲基)肟(30 mg，0.069 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)、4'-胺基甲基螢光素(25mg，0.063 mmol，可購自Sunnyvale, CA的AAT Bioquest)、3-氧化六氟磷酸1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠(HATU (2 9mg，0.075 mmol)，可購自Burlington, MA的EMD Millipore)及N'N-二異丙基乙胺(24 mg，0.189 mmol)溶解於無水二甲基甲醯胺(DMF，1.5 mL)中製備。所得混合物在室溫下攪拌超過18小時且隨後稀釋於25 mL 50%乙腈水溶液(含0.1%乙酸)中且藉由管柱層析使用C18逆相管柱(5 g)純化，該管柱用60%至70%乙腈/水之梯度溶離。合併含有皮質醇-4-Fl之溶離份且凍乾，得到黃色固體產物，藉由LCMS (M+1：779.4)確認。
皮質醇-5-Fl，亦即：
Figure 02_image153
藉由將氫皮質酮-3-(羧基甲基)肟(12  mg，0.028 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)、5-胺基甲基螢光素(10 mg，0.025 mmol，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)、HATU (11 mg，0.030mmol，可購自Burlington, MA的EMD Millipore)及N'N-二異丙基乙胺(10 mg，0.075 mmol)溶解於無水DMF (1.0 mL)中製備。所得混合物在室溫下攪拌超過18小時且隨後稀釋於15 mL 50%乙腈/水(含0.1%乙酸)中且藉由管柱層析使用C18逆相管柱(5 g)純化，該管柱用60%至70%乙腈/水之梯度溶離。合併含有皮質醇-5-Fl之溶離份且凍乾，得到黃色固體產物，藉由LCMS (M+1：779.4)確認。
皮質醇-4-FL與各種當量之可購自HyTest (Turku, Finland)、Abcam (Cambridge, United Kingdom)及Bio-Connect BV (Fitzgerald Industries) (the Netherlands)之各種α-皮質醇抗體組合。螢光量測為隨抗體(Ab):皮質醇-4-FL之比率而變。結果描繪於圖21中。
結果展示，皮質醇-4-Fl與抗體形成複合物時其螢光淬滅。在約1:1之抗體/皮質醇-4-Fl之比率下觀測到最大淬滅。
圖22描繪當皮質醇-4-Fl及皮質醇-5-Fl與各種當量的可購自HyTest (Turku, Finland)之α-皮質醇抗體組合時螢光的淬滅。結果展示，經4'-取代之螢光素示蹤劑之螢光變化大於經5-取代之螢光素示蹤劑之螢光變化。實例 29 ： 4 '- 胺基甲基二氟 - 螢光素 (4-AMDFF) 之合成
4-AMDFF，亦即：
Figure 02_image155
根據以下合成流程製備：
Figure 02_image157
將含0.1 g氯乙醯胺甲醇(CLAM，0.82 mmol)之濃硫酸(1.5 mL)添加至2',7'-二氟螢光素(可購自Switzerland的Chemodex公司，0.3 g，0.82 mmol)於硫酸(4 mL)中之溶液中。在避光攪拌18小時之後，將反應混合物傾於冰(25 mL)上以形成橙色沈澱物。經由過濾自融冰收集橙色沈澱物，用水洗滌且乾燥，得到0.3 g產物。產物由LCMS ([M+1] = 474.5)表徵。
在約160℃下，用濃HCl (3 mL)在二乙二醇二甲醚(11 mL)中使0.25 g上述產物回流20小時。在減壓下移除溶劑之後，將殘餘物溶解於DMF (2 mL)中且使用逆相層析系統用水/乙腈梯度溶離來純化。收集適當溶離份，在真空下蒸發至乾燥，且由LCMS ([M+1] = 398.4)表徵。實例 30 ： 4 '- 胺基甲基二氯 - 螢光素 (4-AMDCF) 之合成
4-AMDCF，亦即：
Figure 02_image159
根據以下合成流程製備：
Figure 02_image161
將含0.31 g氯乙醯胺甲醇(CLAM，2.5 mmol )之濃硫酸(4 mL)添加至2',7'-二氯螢光素(可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich，1g，2.5 mmol)於硫酸(12 mL)中之溶液中。在避光攪拌18小時之後，將反應混合物傾於冰(100 mL)上以形成橙色沈澱物。經由過濾自融冰收集橙色沈澱物，用水洗滌且乾燥，得到1 g產物。產物藉由LCMS (＞90%純度，[M+1] = 505.8)表徵。
在約160℃下，用濃HCl (3 mL)在二乙二醇二甲醚(11 mL)中使1.0 g上述產物回流20小時。在減壓下移除溶劑之後，將殘餘物溶解於DMF (2 mL)中且使用逆相層析系統用水/乙腈梯度溶離來純化。收集適當溶離份，在真空下蒸發至乾燥，且由LCMS ([M+1]= 430.4)表徵。實例 31 ： SDMA-DFF 的合成
SDMA-DFF，亦即：
Figure 02_image163
根據以下合成流程製備：
Figure 02_image165
Figure 02_image167
Fmoc-SDMA(Boc)2 -DFF的合成 向2 mL玻璃小瓶中添加Fmoc-SDMA(Boc)2 -OH (9.6 mg，0.0148 mmol)、4'-胺基甲基2',7'-二氟螢光素(5.6 mg，0.0141 mmol)、HATU (6.2 mg，0.0162 mmol)、DIPEA (8.56 μL，0.045 mmol)及無水DMF (1.0 mL)。將所得反應混合物充分混合且在室溫下攪拌18小時。將反應混合物裝載至配備有逆相管柱之自動純化系統上且用水/乙腈梯度(含有0.1%甲酸)溶離。收集適當溶離份且藉由蒸發移除溶劑，得到約10 mg呈紅色粉末狀之產物。產物使用LCMS ([M+1] = 1004.6)表徵。 SDMA-DFF的合成 向Fmoc-SDMA(Boc)2 -DFF (10 mg，0.01 mmol中添加5 mL含20%哌啶之DMF且在室溫下攪拌所得混合物2小時。隨後將反應混合物裝載至配備有逆相管柱之自動純化系統上且用水/乙腈梯度(含有0.1%甲酸)溶離。收集適當溶離份且藉由蒸發移除溶劑，得到紅色固體。將紅色固體與1 mL二㗁烷及0.28 mL含4 M HCl之二㗁烷合併，在室溫下攪拌隔夜，且藉由蒸發移除溶劑，得到粗產物。將粗產物溶解於水中且使用配備有逆相管柱之自動純化系統且用水/乙腈梯度(含有0.1%甲酸)溶離來純化。收集適當溶離份且藉由蒸發移除溶劑，得到黃色晶體，其由LCMS ([M+1] =582.2)表徵。實例 32 ： SDMA-DCF 之合成 SDMA-DCF，亦即：
Figure 02_image169
根據以下合成流程製備：
Figure 02_image171
Fmoc-SDMA(Boc)2 -DCF的合成
向2 mL玻璃小瓶中添加Fmoc-SDMA(Boc)2-OH (20 mg，0.0308 mmol)、4'-胺基甲基2',7'-二氯螢光素(12.6 mg，0.0294 mmol)、HATU (13 mg，0.034 mmol)、DIPEA (17.8 μL，0.088 mmol)及無水DMF (1.0 mL)。將所得反應混合物充分混合且在室溫下攪拌18小時。將反應混合物裝載至配備有逆相管柱之自動純化系統上且用水/乙腈梯度(含有0.1%甲酸)溶離。收集適當溶離份且藉由蒸發移除溶劑，得到約25 mg呈紅色粉末狀之產物。產物使用LCMS ([M+1]=1036.5)表徵。 SDMA-DCF的合成
向Fmoc-SDMA(Boc)2 -DCF (15 mg，0.0145 mmol)中添加5 mL含20%哌啶之DMF且在室溫下攪拌所得混合物2小時。將反應混合物裝載至配備有逆相管柱之自動純化系統上且用水/乙腈梯度(含有0.1%甲酸)溶離。收集適當溶離份且藉由蒸發移除溶劑，得到紅色固體。將紅色固體與1 mL二㗁烷及0.28 mL含4 M HCl之二㗁烷合併，在室溫下攪拌隔夜，且藉由蒸發移除溶劑，得到粗產物。將粗產物溶解於水中且使用配備有逆相管柱之自動純化系統且用水/乙腈梯度(含有0.1%甲酸)溶離來純化。收集適當溶離份且藉由蒸發移除溶劑，得到橙色固體，其由LCMS ([M+1]= 615.6)表徵。實例 33 ： DFF 、 SDMA-DFF 、 DCF 、 SDMA-DCF 、 Fl 及 SDMA-FL 之吸收及發射光譜
PBS緩衝液中螢光素(Fl)之最大吸收為在489 nm下且最大螢光發射為在515 nm下。當螢光素分子經由-CH2 NH-連接基團與SDMA分子結合(亦即，得到SDMA-Fl)時，其最大吸收及發射分別偏移至495 nm及525 nm。當螢光素分子在2'位置及7'位置處經氟取代(亦即，得到DFF)時，相比於未經取代之螢光素，最大吸收及發射無任何變化。當螢光素分子在2'位置及7'位置處經氯取代(亦即，得到DCF)時，最大吸收及發射分別紅移至500 nm及525 nm。另外，經由-CH2 NH-連接基團使DFF或DCF與SDMA結合(亦即，分別得到SDMA-DFF及SDMA DCF)使得最大吸收及發射紅移。螢光素(FL)、2',7'-二氟螢光素(DFF)、2',7'-二氯螢光素(DCF)及其經由-CH2 NH-連接基團與SDMA之結合物(亦即，SDMA-Fl (亦即，結構A3)、SDMA-DFF及SDMA-DCF)的最大吸收及發射波長列於以下提供之表中。DFF、SDMA-DFF、DCF、SDMA-DCF、Fl及SDMA-FL之吸收光譜描繪於圖25A中且SDMA-DFF、SDMA-DCF、Fl及SDMA-FL之發射光譜描繪於圖25B中。
   最大吸收(nm) 最大發射(nm)
DFF 489 515
SDMA-DFF 497 525
DCF 500 525
SDMA-DCF 510 535
FI 489 515
SDMA-FI 495 525
實例 34 ： 各種 SDMA 螢光示蹤劑及抗 SDMA 抗體之混合物之螢光
在0、0.25、0.5、1、2、4、8及16 μM之濃度下製備抗SDMA抗體或與BHQ10 (4當量)結合之抗SDMA抗體於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之溶液(抗體溶液)。在100 nM之濃度下製備SDMA螢光示蹤劑(亦即SDMA-Fl、SDMA-DFF或SDMA-DCF)於PBS中之溶液(示蹤劑溶液)。在96孔UV盤上合併50 μL抗體溶液及50 μL示蹤劑溶液且在室溫下培育30分鐘。使用490 nm之激發波長及對於SDMA-DFF及SDMA-Fl結合物525 nm之發射波長及對於SDMA-DCF 535 nm之發射波長讀取各混合物之螢光強度。結果描繪於圖26及27中。
圖26描繪隨增加之抗體濃度而變的不同SDMA示蹤劑之螢光淬滅百分比。圖26展示藉由添加抗SDMA抗體淬滅約50%之SDMA-DFF示蹤劑之螢光且藉由添加抗SDMA抗體淬滅約30%之SDMA-Fl示蹤劑之螢光。圖26展示，當抗體:SDMA-DFF之莫耳比大於2:1時，SDMA-DFF的淬滅效率為幾乎飽和的。抗SDMA抗體(不與淬滅劑結合)及SDMA-DFF示蹤劑之50%淬滅效率展示在均質SDMA分析中，SDMA-DFF示蹤劑可作為分析試劑與不與淬滅劑結合之抗SDMA抗體一起使用。
圖27描繪隨與BHQ10 (4當量)結合之抗SDMA抗體之濃度增加而變的不同SDMA示蹤劑之螢光淬滅百分比。圖27展示與SDMA-Fl相比，SDMA-DFF之淬滅效率稍高。
在400 nM濃度下製備各種SDMA示蹤劑(SDMA-Fl、SDMA-DFF及SDMA-DCF)於PBS (含0.1% Tween)中之溶液。分別以400及800 nM之濃度製備抗SDMA抗體或與BHQ10 (4當量)結合之抗SDMA抗體於PBS中之溶液。將SDMA示蹤劑之溶液與抗SDMA抗體或與BHQ10結合之抗SDMA抗體之溶液以1:1 (v/v)之比率混合，且在室溫下培育60分鐘。得到SDMA示蹤劑/SDMA抗體溶液。
藉由連續稀釋SDMA於PBS (含0.1% Tween)中製備SDMA標準溶液，得到100、50、25、12、5、6.26、0 μg/dL之最終SDMA濃度。
將50 μl各SDMA標準溶液添加至96孔UV透明盤之孔中。隨後將50 μl SDMA示蹤劑/SDMA抗體溶液添加至各孔中，藉由振盪充分混合所得溶液，且在室溫下培育30分鐘。隨後使用盤讀取器使用490 nm之激發波長及對於SDMA-DFF及SDMA-Fl 525 nm之發射波長及對於SDMA-DCF 535 nm之發射波長讀取各溶液之螢光。
結果描繪於圖28至30中。圖28-30展示螢光強度隨SDMA濃度而增加，亦即，觀測到劑量反應。
圖28展示當SDMA示蹤劑為SDMA-DFF時螢光強度增加。圖28展示當SDMA示蹤劑/SDMA抗體溶液為SDMA-DFF及抗體(亦即抗體不與BHQ10結合)時，當抗體/SDMA-DFF之比率為2:1時，與當比率為1:1時相比，螢光強度增加更大。圖28進一步展示當SDMA示蹤劑/SDMA抗體溶液為SDMA-DFF及與BHQ10結合之抗體時，觀測到螢光強度增加。
圖29展示當SDMA示蹤劑為SDMA-DCF時螢光強度之增加，且圖30展示當SDMA示蹤劑為SDMA-DFl時螢光強度之增加。圖29及圖30展示與未與BHQ10結合之SDMA抗體相比，當SDMA抗體與BHQ10結合時，存在更大螢光強度增加。實例 35 ： SDMA-Fl 的合成
SDMA-Fl，亦即：
Figure 02_image173
根據以下合成流程製備：
Figure 02_image175
Fmoc-SDMA(Boc)2 -Fl
將Fmoc-SDMA(Boc)2 -OH (47mg，0.075 mmol，可購自Novabiochem，一個St. Louis, MO的Sigma Aldrich分部)、4-胺基甲基螢光素(25 mg，0.063，可購自Sunnyvale, CA的ATT Bioquest)、HATU (28.7 mg，0.075mmol)、N'N-二異丙基乙胺(23.6 mg，0.189 mmol)溶解於無水DMF (1.5 mL)中。在室溫下攪拌所得混合物18小時，且隨後稀釋於15 mL 40%乙腈/水(含0.1%乙酸)中且藉由管柱層析使用C18逆相管柱(5 g)純化，該管柱用20%至50%乙腈/水之梯度溶離。將含有Fmoc-SDMA(Boc)2 -Fl之溶離份合併且凍乾，得到黃色固體產物，藉由LCMS (M+1：968.3)確認。 SDMA(Boc)2 -Fl
Fmoc-SDMA(Boc)2 -Fl (45 mg，0.0465 mmol)於含20%哌啶之DMF (8 mL)中脫除保護基1小時。隨後在減壓下移除溶劑，得到殘餘物。將所得殘餘物溶解於40%乙腈/水+0.1%乙酸中且藉由管柱層析使用C18逆相管柱(5g)來純化，該管柱用40%乙腈/水+0.1%乙酸溶離。合併含有SDMA(Boc)2 -Fl之溶離份且凍乾，得到橙色粉末。 SDMA-Fl
將SDMA(Boc)2 -Fl (21 mg，0.028 mmol)溶解於二㗁烷(2 mL)中且向溶液中添加含4 M HCl之二㗁烷(0.28 mL)。將所得混合物攪拌隔夜。移除溶劑且將殘餘物溶解於20%乙腈/水中且藉由管柱層析使用20%乙腈/水溶離之C18逆相管柱(5g)來純化。合併含有SDMA-Fl之溶離份且凍乾，得到呈黃色粉末狀之SDMA-Fl，結構藉由LCMS (M+1：546.9)確認。實例 36 ： 藉由核黃素結合蛋白淬滅乳中之核黃素螢光
以下實例使用自雞蛋白純化之「自產」核黃素結合蛋白(亦即，「IDEXX自產」核黃素結合蛋白)及市售核黃素結合蛋白(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)。
乳外加有核黃素(1 mM)之儲備溶液，得到4 μM之最終核黃素濃度。在PBS中連續稀釋IDEXX自產或市售(Sigma)的核黃素結合蛋白(「RBP」，49.2 mg/mL於磷酸鹽緩衝鹽水(「PBS」)中)之儲備溶液，得到RBP濃度在0至1600 μM範圍內之溶液。向20 μL連續稀釋之RPB溶液添加2 mL外加核黃素之乳以提供0至20 μM之RBP濃度。所得溶液在室溫下培育1小時且在350 nm之激發波長及538 nm之發射波長下量測90 μL體積的所得溶液之螢光強度。圖31描繪隨核黃素結合蛋白之濃度而變的乳中之核黃素螢光。
結果展示，以5 μM之濃度將核黃素結合蛋白添加至乳中淬滅超過95%之核黃素之螢光，其顯著降低了乳之螢光背景。結果描繪於圖31中。實例 37 ： 用於分析 SDMA 之乾燥載片之製備
以以下方式製備用於分析SDMA之乾燥載片：
向Melinex (10''×125 μm厚×24'長)薄片(可購自Stevenage, United Kingdom的HiFi Film，部件編號506)上塗佈含有按重量計約等量的D4水凝膠(高黏度聚合物)及D4水凝膠(低黏度聚合物) (均可購自Wilmington, MA的AdvanSource Biomaterials公司)之溶液，以便提供厚度為約40 μm的濕底塗層。蒸發溶劑，得到含有按重量計約等量的D4水凝膠(高黏度聚合物)及D4水凝膠(低黏度聚合物)的乾底塗層。
向乾底塗層上塗佈含有SDMA-螢光素(如上文實例35中所描述製備)及抗SDMA抗體-BHQ10結合物(如下文實例38中所描述製備)於HEPES緩衝劑(pH 8)中之溶液、HEPES緩衝劑(pH 8)、Merpol A、普魯蘭及纖維素之溶液，以便提供厚度為約93 μm之濕指示層。蒸發溶劑，得到含有約1.4×10-1 重量%之抗SDMA抗體-BHQ10結合物、約1.1×10-3 重量%之SDMA-螢光素、約13重量%之HEPES緩衝劑、約1.2重量%之Merpol A、約28.5重量%之普魯蘭及約57重量%之纖維素之乾指示層。
向乾指示層上塗佈含有按重量計約等量的D4水凝膠(高黏度聚合物)及D4水凝膠(低黏度聚合物) (均可購自Wilmington, MA的AdvanSource Biomaterials公司)、纖維素(可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)及二氧化鈦微粒(可購自Fayetteville, NC的Chemours，部件編號R-706)之溶液，以便提供具有約130 μm之厚度的濕氧化鈦層。蒸發溶劑，得到含有約37重量%之D4水凝膠(作為按重量計約等量的低黏度及高黏度D4水凝膠)、約20重量%之纖維素及約43重量%之二氧化鈦之乾氧化鈦層。
向乾氧化鈦層上塗佈含有約等量的D4水凝膠(高黏度聚合物)及D4水凝膠(低黏度聚合物) (均可購自Wilmington, MA的AdvanSource Biomaterials公司)及碳黑燈碳黑(Lamp Black) 101粉末(可購自Belpre, OH的Orion Specialty Carbon Blacks)之溶液，以便提供具有約140 μm之厚度的濕碳黑層。蒸發溶劑，得到含有約95重量%之D4水凝膠(作為按重量計約等量的低黏度及高黏度D4水凝膠)及約5重量%之碳黑之乾碳黑層。
向乾碳黑層上塗佈含有纖維素；氫氧化四甲基銨(TMAH)；聚丙烯酸(PAA)，分子量約1百萬；及聚乙烯吡咯啶酮(PVP)之溶液，以便提供厚度約310 μm之濕擴散層。蒸發溶劑，得到含有約83重量%之纖維素、約0.5重量%之PAA、約0.4重量%之TMAH及約16重量%之PVP之乾擴散層。
各濕層使用具有乾燥隧道及加熱墊之槽模環塗佈機塗佈。
塗佈有底塗層、指示層、氧化鈦層、碳黑層及擴散層之所得Melinex薄片使用衝頭形成為6.5 mm盤片，且將所得盤片置放於載片外殼之黏合墊中且黏附於該墊以用於IDEXX Catalyst儀器(可購自Westbrook, ME的IDEXX Laboratories公司)中以便提供載片，且所得載片包裹於包裝中。使用載片分析外加各種含量的 SDMA 之一組血清
木炭剝離犬血清(0 μg/dL SDMA)、外加SDMA(5 μg/dL)之木炭剝離犬血清及外加SDMA(15、30、60、100 μg/dL)之犬血清使用經組態具有IDEXX Catalyst移液管尖(可購自Westbrook, ME的IDEXX Laboratories公司)、IDEXX Catalyst樣品杯(可購自Westbrook, ME的IDEXX Laboratories公司)之IDEXX Catalyst儀器(可購自Westbrook, ME的IDEXX Laboratories公司)及上述載片分析。遵循以下程序： 自包裝移出SDMA載片且置於IDEXX Catalyst儀器中； 移液300 μl之組進入樣品杯中； 使IDEXX Catalyst儀器將載片升溫至37℃； 升溫後，儀器以15秒時間間隔量測且記錄乾燥載片之螢光強度(λex = 470nm ，λem = 525 nm)持續1.5分鐘； IDEXX Catalyst儀器隨後將8 μl樣品移液至載片上且隨後如上文所描述以15秒時間間隔量測並記錄螢光強度持續400秒； 將所記錄量測結果與校準曲線進行比較以產生SDMA劑量。
圖32描繪分析結果。圖32描繪當施配不同含量之SDMA (圖例)時隨著時間推移在Catalyst儀器中觀測到之載片中的螢光強度。Y軸為相對螢光單位之強度(無單位)，且x軸為以秒為單位之時間。最初，取得乾燥載片之螢光強度讀數，且隨後在t=0 (亦即，當施配樣品時)下量測濕載片之螢光強度讀數。螢光強度每15秒讀取。各跡線為n=10次重複之平均值。實例 38 抗 SDMA 抗體 -BHQ10 結合物之製備
藉由將抗mAb SDMA用250 mM HEPES pH 8及40%蔗糖稀釋至2.5 mg/ml，得到250 mM HEPES及20%蔗糖中之抗體溶液，以5 mg/mL之濃度產生抗mAb SDMA (由Leinco Technologies, Fenton, MO定製)於250 mM HEPES (pH 8)中之儲備溶液。凍乾BHQ10-NHS酯(可購自LGC Biosearch Technologies, Middlesex, UK，編號BHQ10S)用無水DMSO溶合至5 mg/ml之最終濃度。隨後在溫和混合下將含20莫耳當量BHQ10之無水DMSO添加至抗體溶液中(例如，將52 μL BHQ-10溶液添加至1 mL抗mAb SDMA溶液中)。將所得溶液在室溫下培育1小時且不混合，且藉由添加10 μL 1 M Tris緩衝液(可購自Tewksbury, MA之Alfa Aesar)淬滅反應。將所得溶液在室溫下培育10分鐘，離心以移除任何沈澱物，且不經進一步製備即使用。實例 39 ： 在各種干擾物存在下 SDMA 的測定
為評價干擾物(脂血、膽紅素、溶血及全血)對乾燥載片效能之影響，在一系列干擾物含量下製造混合木炭剝離雜種(mongrel)血清(可購自BioIVT, Westbury, NY，編號DOG42577)中之SDMA的新鮮樣品溶液。經由稀釋產生各SDMA濃度下之各干擾物含量。藉由在木炭剝離血清中形成儲備溶液來產生具有脂血作為干擾物的樣品，該血清具有所要SDMA濃度(例如，100 μg/dL)及最高干擾物含量1000 mg/dL脂血(英脫利匹特20%乳液，可購自Sigma Aldrich, St. Louis, MO，編號100267553)。隨後用100 μg/dL SDMA於木炭剝離血清中之對照溶液連續稀釋所得儲備溶液，產生具有0、250、500、750及1000 mg/dL之脂血濃度的溶液。以此方式，不同干擾物含量下之溶液以0、15、30及100 μg/dL之SDMA濃度製備以評價跨越一系列SDMA濃度之干擾物作用。對於各溶液而言，藉由LCMS測定SDMA濃度，且在Beckman AU5812臨床化學分析儀(可購自Beckman Coulter, Brea CA)上檢驗脂血濃度。
使用類似稀釋方案，製造0、15、30及100 μg/dL之SDMA濃度及0、7.5、15、22.5及30 mg/dL膽紅素之膽紅素濃度下的膽紅素(膽紅素結合物，可購自Scripps, La Jolla, CA，編號B011490604)溶液。在Beckman AU5812臨床化學分析儀(可購自Beckman Coulter, Brea CA)上檢驗膽紅素濃度。藉由LCMS測定SDMA濃度。
溶血干擾物溶液由如上文所描述稀釋以提供0、125、250、375及500 mg/dL之溶血產物濃度的新近抽取且溶血的血液樣品(可購自Pet Food Solutions, Ward, SC)製成。在Beckman AU5812臨床化學分析儀(可購自Beckman Coulter, Brea CA)上檢驗溶血產物濃度。藉由LCMS測定SDMA濃度。
為產生全血污染之樣品，用剝離血清稀釋鋰肝素化抗凝全血(可購自Pet Food Solutions, Ward, SC)以提供0、15、60及100 μg/dL之SDMA濃度及1、5及10%之全血百分比。對於各溶液，藉由量測血容比來確定全血百分比且藉由LCMS測定SDMA濃度。
圖24描繪測定含有固定量之SDMA之樣品中SDMA之濃度的分析(使用具有過濾層之載片)結果。結果展示干擾物不干擾SDMA之分析。實例 40 ： 膽酸 - 螢光素結合物 (CA-Fl) 的合成
Figure 02_image177
將膽酸(28 mg，0.069 mmol，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)、4'-胺基甲基螢光素(25 mg，0.063 mmol，可購自Sunn yvale, CA的AAT Bioquest)、HATU (29 mg，0.075 mmol)及N'N-二異丙基乙胺(29 mg，0.189 mmol)溶解於無水DMF (1.5 ml)中。在室溫下攪拌所得混合物超過20小時，且粗產物使用Biotage Selekt系統(可購自Biotage, Sweden)使用Teledyne Isco RediSep RF Gold C18AQ 5.5 gm管柱用50%至100%乙腈/水+0.1%甲酸的梯度的移動相溶離來純化。收集含有CA-Fl之溶離份且凍乾，得到黃色固體，其使用LCMS (M+1：752.4)表徵。實例 41 ： 使用含抗膽酸抗體之 PBS 的 CA-Fl 的 螢光淬滅
製備CA-Fl於PBS (100 nM)中之工作溶液。隨後將工作溶液與各種當量α-膽酸抗體(1:1，v/v) (可購自Fitzgerald Industries, the Netherlands)組合。螢光量測為隨抗體(Ab):CA-Fl之比率而變。結果描繪於圖33中。結果展示CA-Fl之螢光在其與抗體形成複合物時淬滅，且淬滅之量隨抗體:CA-Fl示蹤劑之莫耳比而變。抗體:CA-Fl示蹤劑之比率愈高，淬滅之量愈大。結果亦表明，當抗體:CA-Fl示蹤劑之莫耳比為約8:1時，淬滅飽和。
含CA-Fl之PBS (具有0.1% tween 20) (200 nM)之等分試樣與濃度為200、400或800 nM之抗體溶液以1:1 (v/v)混合，且所得混合物在4℃下培育30分鐘以提供三種分析試劑：試劑1 (Ab 100 nM/CA-Fl 100 nM)、試劑2 (Ab 200 nM/CA-Fl 100 nM)及試劑3 (Ab 400 nM/CA-Fl 100 nM)。
在PBS (具有0.1% tween 20)中製備濃度介於0至80 μM範圍內之膽汁酸(膽酸或牛膽酸)標準溶液。隨後將各膽汁酸標準溶液(5 μl)添加至96孔分析盤中之試劑1、2或3 (95 μl)中，且在室溫下在溫和振盪下培育所得溶液30分鐘。隨後使用490 nm之激發波長及520 nm之發射波長量測螢光強度。結果展示於圖34A (膽酸)及圖34B (牛膽酸)中。圖34A及34B描繪螢光隨膽汁酸濃度而變之恢復。結果展示具有4:1之抗體:CA-Fl比率之試劑3在0至80 μM範圍內之濃度下對於PBS中之膽汁酸展現最寬動態範圍。實例 42 ： 隨血清中之膽汁酸濃度而變之使用抗膽酸抗體之 CA-Fl 的螢光淬滅
用磷酸鹽緩衝液將木炭剝離犬血清調節至pH 7.3。隨後向血清外加膽汁酸(膽酸或牛膽酸)以提供在0至40 μM範圍內之膽汁酸濃度。
將CA-Fl於PBS (200 nM)中之溶液與α-膽酸抗體(400 nM)之溶液以1:1 (v/v)之比率混合且在4℃下培育30分鐘以提供分析試劑。
隨後將含有膽汁酸之犬血清溶液(5 μl)添加至96孔分析盤中之分析試劑(95 μl)中，且在室溫下在溫和振盪下培育所得混合物30分鐘。
使用490 nm之激發波長及520 nm之發射波長量測螢光強度。膽酸(圖35A)及牛膽酸(圖35B)之結果展示於圖35中。圖35A及35B描繪螢光隨血清膽汁酸濃度而變之恢復。結果展示，血清中膽酸及牛膽酸之分析具有0至40 μM之動態範圍。實例 43 ： BHQ10 標記之胱蛋白 -B (CysB) ： CysB-BHQ 之合成
將含重組胱蛋白-B蛋白質(4.0 mg)之PBS (1 mL)與溶解於DMSO (0.25 mL)中之2.0 mg (8當量，204 μL 10 mg/mL儲備液)的BHQ10-NHS (BHQ10的N-羥基丁二醯亞胺酯，可購自Petaluma, CA的LGC Biosearch Technologies)混合。所得溶液翻滾(end over end)旋轉2小時。淬滅劑標記之蛋白質隨後藉由相對於3×4 L PBS透析純化，各交換最少持續2小時。在透析期間使用10 kDa MWCO過濾器(G2卡匣，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)。使用BCA套組(可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)測定所得產物之蛋白質濃度。實例 44 ： 螢光素標記之抗 CysB (3H4)-mAb NHS 酯的合成 途徑 ： 抗 CysB-FL
將含單株抗CysB抗體(抗CysB (3H4)-mAb) (5 mg)之PBS (1 mL)與溶解於DMSO中之0.025 mg (2當量，12.5 μL 2 mg/mL儲備液)的螢光素-NHS (螢光素之N-羥基丁二醯亞胺酯，可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)混合。所得溶液翻滾旋轉2小時。螢光素標記之抗體隨後藉由相對於3×4 L PBS透析純化，各交換最少持續2小時。在透析期間使用10 kDa MWCO過濾器(G2卡匣，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)。使用BCA套組(可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)測定所得產物之蛋白質濃度。實例 45 ： 螢光素標記之抗 CysB (3H4)-mAb 螢光素醛的合成 途徑 ： 抗 CysB-FL-Ald
將含單株抗CysB抗體(抗CysB (3H4)-mAb) (5 mg)之PBS (1 mL)與溶解於DMSO中之0.024 mg (2當量)螢光素醛混合。向所得溶液中添加溶解於1 N NaOH中之0.02 mg (10當量)氰基硼氫化鈉。使混合物翻滾旋轉2小時。螢光素標記之抗體隨後藉由相對於3×4 L PBS透析純化，各交換最少持續2小時。在透析期間使用10 kDa MWCO過濾器(G2卡匣，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)。使用BCA套組(可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)測定所得產物之蛋白質濃度。實例 46 ： BODIPY 標記之 抗 CysB (3H4)-mAb ：抗 CysB-BODIPY 的合成
將含單株抗CysB抗體(抗CysB (3H4)-mAb) (5 mg)之PBS (1 mL)與溶解於DMSO中之0.026 mg (2當量)的BODIPY-NHS (可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)混合。所得溶液翻滾旋轉2小時。螢光素標記之抗體隨後藉由相對於3×4 L PBS透析純化，各交換最少持續2小時。在透析期間使用10 kDa MWCO過濾器(G2卡匣，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)。使用BCA套組(可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)測定所得產物之蛋白質濃度。實例 47 ： CysB 之 96 孔盤 淬滅及劑量反應分析
以下實例使用如實例41中所描述製備之CysB-BHQ及如實例42中所描述製備之抗CysB-FL。 1. 由儲備溶液將BHQ-結合物及螢光素-結合物10×稀釋於PBS (pH=7.4，含有1% BSA及0.005% Tween 20)中以製造中間儲備溶液。 2. 將中間儲備溶液稀釋至PBS (pH=7.4，含有1% BSA及0.005% Tween 20)中之4倍工作濃度。[抗CysB-FL] = 400 nM且[CysB-BHQ] = 800 nM。 3. 將50 μL CysB-BHQ溶液及50 μL抗CysB-FL溶液添加至96孔黑底盤之孔中。將96孔盤溫和振盪30秒，在室溫下培育5分鐘，且在37℃下在盤讀取器上讀取。最終[抗CysB-FL] =200 nM，最終[CysB-BHQ] =200 nM；激發波長：470 nm及發射波長：520 nm。 4. 將不同濃度之CysB重組標準物之100 μL 2×工作溶液(PBS，pH=7.4)添加至孔中。隨後將96孔盤溫和振盪30秒，在37℃下培育30分鐘，且量測螢光。最終[抗CysB-FL] =100 nM，[CysB-BHQ] =200 nM，[CysB] =0、0.25、0.5、1、2、5 μg/mL。激發波長：470 nm，發射波長：520 nm。
圖36為螢光強度(λex = 470nm ，λem = 520 nm)相對於CysB濃度(μg/mL)之圖。圖36展示隨CysB濃度而變的螢光之恢復，且說明該分析可用於量測樣品中之CysB濃度。該分析具有低至125 ng/mL之靈敏度且涵蓋臨床上相關範圍。螢光信號之最大恢復率為未結合抗CysB-FL螢光之75%。實例 48 ： Catalyst 載片劑量反應研究
載片藉由以下程序製備： 1.  如實例41中所描述製備之CysB-BHQ (1600 nM)及如實例42中所描述製備之抗CysB-FL (800 nM)或如實例44中所描述製備之抗CysB-BODIPY (800 nM)於PBS (pH=7.4，含有1% BSA及0.005% Tween 20)中之混合物在安放於塑膠載片外殼上之7 mm直徑Fusion 5膜上點樣(12 μL)。 2.  點樣載片在40℃下避光乾燥30分鐘。 3.  隨後將載片冷卻至室溫且裝載至Catalyst Dx儀器(可購自IDEXX Laboratories, Portland, ME)中。 4.  血清樣品外加0、250、500、1000及2000 ng/mL重組CysB蛋白且裝載至Catalyst Dx儀器中。 5.  隨後將樣品施配於載片(10 μL)上，且量測隨時間推移的螢光強度。
圖37為經乾燥載片形式中螢光強度之增加速率(如在時間間隔30至100秒所量測)相對於CysB之濃度的圖。此等結果展示抗CysB-FL/CysB-BHQ免疫複合物在固體支撐物上乾燥之後保持完整且能夠在將樣品添加至經乾燥載片時產生在臨床上相關範圍內的劑量反應。實例 49 ： 經由離胺酸殘基與 FL 結合之螢光素標記之胱蛋白 -B 的合成
將含重組胱蛋白-B蛋白質(4.0 mg)之PBS (1 mL)與溶解於DMSO中之0.34 mg (2當量，17 μL 20 mg/mL儲備液)的螢光素-NHS (可購自Sigma Aldrich)混合。所得溶液翻滾旋轉2小時。螢光素標記之CysB (經離胺酸修飾)隨後藉由相對於3×4 L PBS透析純化，各交換最少持續2小時。在透析期間使用10 kDa MWCO過濾器(G2卡匣，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)。使用BCA套組(可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)測定所得產物之蛋白質濃度。實例 50 ： 經由半胱胺酸殘基與 FLT 結合之螢光素標記之胱蛋白 -B 的合成
向含重組胱蛋白-B蛋白質(4.0 mg)之PBS (1 mL)中添加10 μL 0.5 M EDTA (可購自Alfa Aesar, Haverhill, MA)，得到5 mM EDTA之最終濃度。將所得溶液添加至含有0.2 μm過濾器之離心管中之0.5 mL TCEP結合樹脂(可購自Thermofisher Scientific, Waltham, MA)中，且使其在室溫下翻滾旋轉2小時。隨後將反應混合物以8,000 rpm短暫離心1分鐘。收集流過物，得到4 mg/mL濃度之經還原CysB (含有1個經活化半胱胺酸殘基)。將此經活化之CysB與溶解於DMSO中之0.31 mg (2當量，15 μL 20 mg/mL儲備液)的螢光素-順丁烯二醯亞胺(可購自St. Louis, MO的Sigma Aldrich)混合。所得溶液翻滾旋轉2小時。螢光素標記之CysB (經半胱胺酸修飾)隨後藉由相對於3×4 L PBS透析純化，各交換最少持續2小時。在透析期間使用10 kDa MWCO過濾器(G2卡匣，可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)。使用BCA套組(可購自Waltham, MA的Thermo Scientific)測定所得產物之蛋白質濃度。實例 51 ： CysB 肽 - 螢光團結合物
Figure 02_image179
犬 CysB 序列
犬胱蛋白-B，全長：MMCGAPSASQPATADTQAIADQVKAQLEERENKKYTTFKAVTFRSQVVAGTPYFIKVQVDDDEFVHLRVFQSLPHENKPLALSSYQTNKAKHDELAYF [SEQ ID NO:1]
Figure 02_image181
Figure 02_image183
在 5- 位置 處結合之犬 CysB 肽 -Fl 結合物之製備
如下使CysB肽P7、P6、P5及P4各自結合於螢光素之5-位置：將具有GDELAYF [SEQ ID NO:6]之胺基酸序列的CysB肽P6 (15 mg，0.0184 mmol，由GenScript, Piscataway, NJ定製合成)、5-羧基螢光素丁二醯亞胺酯(9.2 mg，0.0194 mmol，可購自Thermo Fisher, Waltham, MA)及N'N-二異丙基乙胺(9.67 μl，0.055mmol)溶解於無水DMF (0.5 ml)中。將所得混合物在室溫下攪拌隔夜，且隨後在1 ml之30% ACN/水(含有0.1%甲酸)中稀釋，且藉由管柱層析使用30%至100%乙腈/水的梯度溶離的C18逆相管柱(5 g)在Biotage Isolera™純化系統上純化。藉由監測257 nm及470 nm下之吸收自動收集溶離份。藉由LCMS分析具有在470 nm下吸收之溶離份，以鑑別含有目標肽P6-Fl結合物之溶離份，且將所要溶離份合併且凍乾，得到藉由LCMS (M+1=1172)確認之最終黃色固體產物。
CysB肽P7、P5及P4與螢光素在5-位置處之結合物使用與上文針對CysB肽P6所描述實質上相同的合成及純化程序合成。最終結合物藉由LCMS表徵為：GHDELAYF，P7-Fl，LCMS (M+1= 1309)；GELAYF，P5-Fl，LCMS (M+1=1057)；GLAYF，P4-Fl，LCMS (M+1=928)。在 5- 位置 處結合之犬 CysB 肽 -DFF 結合物之製備
如下使CysB肽P7、P6、P5及P4各自結合於DFF之5-位置：將具有GDELAYF [SEQ ID NO:6]之胺基酸序列的CysB肽P6 (4.2 mg，0.0052 mmol，由GenScript, Piscataway, NJ定製合成)、5-二氟羧基螢光素丁二醯亞胺酯(2.5mg，0.0049 mmol，可購自ATT Bioquest, Sunnyvale, CA)及N'N-二異丙基乙胺(4.29 μl，0.0245mmol)溶解於無水DMF (0.5 ml中。將所得混合物在室溫下攪拌隔夜，且隨後在1 ml之30% ACN/水(含有0.1%甲酸)中稀釋，且藉由管柱層析使用30%至100%乙腈/水的梯度溶離的C18逆相管柱(5 g)在Biotage Isolera™純化系統上純化。藉由監測257 nm及470 nm下之吸收自動收集溶離份。藉由LCMS分析具有在470 nm下吸收之溶離份，以鑑別含有目標肽P6-DFF結合物之溶離份，且將所要溶離份合併且凍乾，得到藉由LCMS (M+1= 1208)確認之最終黃色固體產物。CysB肽P7、P5及P4與DFF在5-位置之結合物使用與上文針對CysB肽P6所描述實質上相同的合成及純化程序及適當起始材料合成。最終結合物藉由LCMS表徵為：GHDELAYF，P7-DFF，LCMS (M+1=1345)；GELAYF，P5-DFF，LCMS (M+1=1093)；GLAYF，P4-DFF，LCMS (M+1=964)。在 4 '- 位置 處結合之犬 CysB 肽 -4-Fl 結合物之製備
如下使CysB肽P6、P5及P4各自結合於螢光素之4'-位置：在含有1 mL甲醇之2 mL玻璃小瓶中，添加螢光素醛(2.21 mg，0.0061mmol)、CysB肽P6 (5 mg，0.0061 mmol) (由GenScript, Piscataway, NJ定製合成)及碳酸鉀(4.25 mg，0.0307 mmol)，且使所得溶液在室溫下攪拌1小時。隨後將氰基硼氫化鈉(0.77 mg，0.0123 mmol)添加至溶液且在室溫下在暗處攪拌所得混合物隔夜。將所得粗產物稀釋於1 ml之30% ACN/水(含有0.1%甲酸)中，且藉由管柱層析使用30%至100%乙腈/水的梯度溶離的C18逆相管柱(5 g)在Biotage Isolera™純化系統上純化。藉由監測257 nm及470 nm下之吸收自動收集溶離份。藉由LCMS分析具有在470 nm下吸收之溶離份，且將含有目標肽P6-4-Fl結合物之溶離份合併且凍乾，得到藉由LCMS (M+1=1158)確認之最終黃色固體產物。CysB肽P5及P4與螢光素在4'-位置之結合物使用與上文針對CysB肽P6所描述實質上相同的合成及純化程序合成。最終結合物藉由LCMS表徵為：LCMS GELAYF，P5-4-Fl，LCMS (M+1= 1043)；GLAYF，P4-4-Fl，LCMS (M+1=914)。在 4 '- 位置處結合之犬 CysB 肽 -4-DFF 結合物之製備
如下使CysB肽P6、P5及P4各自結合於DFF之4'-位置：在含有1 mL甲醇之2 mL玻璃小瓶中，添加二氟螢光素醛(2.43 mg，0.0061mmol)、CysB肽P6 (5 mg，0.0061 mmol) (由GenScript, Piscataway, NJ定製合成)及碳酸鉀(4.25 mg，0.0307 mmol)，且使所得溶液在室溫下攪拌1小時。隨後將氰基硼氫化鈉(0.77 mg，0.0123 mmol)添加至溶液且在室溫下在暗處攪拌所得混合物隔夜。將所得粗產物稀釋於1 ml之30% ACN/水(含有0.1%甲酸)中，且藉由管柱層析使用30%至100%乙腈/水的梯度溶離的C18逆相管柱(5 g)在Biotage Isolera™純化系統上純化。藉由監測257 nm及470 nm下之吸收自動收集溶離份。藉由LCMS分析具有在470 nm下吸收之溶離份，且將含有目標肽P6-4-DFF結合物之溶離份合併且凍乾，得到藉由LCMS (M+1=1194)確認之最終黃色固體產物。CysB肽P5及P4與DFF在4'-位置之結合物使用與上文針對CysB肽P6所描述實質上相同的合成及純化程序及適當起始材料合成。最終結合物藉由LCMS表徵為：GELAYF，P5-4-DFF，LCMS (M+1=1079)；GLAYF，P4-4-DFF，LCMS (M+1=950)。藉由抗 CysB Mab 或抗 CysB Mab-BHQ10 的犬 CysB P6-Fl 及 P6-DFF 之螢光淬滅
將CysB肽-螢光素(Fl)或CysB肽-二氟螢光素(DFF)結合物溶解於DMSO (0.5 mM)中且用Tris緩衝液(50 nM pH8.0)稀釋，得到儲備溶液(100 nM)。在PBS緩衝液中連續稀釋單株抗CysB抗體(7C2，相對於具有SEQ ID NO: 14之胺基酸序列的肽產生) (8 mg/ml)，得到在Tris緩衝液(50 mM，pH 8.0，具有0.5%十二烷基肌胺酸鈉(月桂醯基肌胺酸鈉))中具有0至800 nM範圍內之抗CysB-Mab濃度的溶液。在含有連續稀釋的抗CysB-Mab溶液(50 μL)之96孔黑色分析盤中，添加肽-Fl或肽-DFF溶液(50 μL)，充分混合，培育30分鐘且記錄螢光強度。結果提供於圖38、39、40及表1中。
圖38展示在抗CysB-Mab存在下P6-Fl之螢光淬滅，而P7-Fl觀測到較弱淬滅。在約8:1之抗體:P6-Fl之莫耳比下觀測到高淬滅(約30%)。圖39展示在抗CysB-Mab存在下P6-DFF之螢光淬滅。在約4:1之抗體:P7-Fl之莫耳比下觀測到最大淬滅(約45%)。圖40展示在抗CysB Mab-BHQ10存在下P6-Fl之螢光淬滅。在抗CysB Mab-BHQ10存在下之淬滅略微高於未修飾之mAb所觀測到的淬滅。P6-DFF在Ab-BHQ10存在下之類似結果展示於圖41及圖42中。
CysB肽P6、P5及P4之示蹤劑結合於螢光素(Fl)或二氟螢光素(DFF)之4'-位置。其他CysB肽-螢光團結合物藉由抗CysB Mab之螢光淬滅概述於表1中。
如表1中所示，當添加抗CysB Mab時，觀測到螢光團之4'-位置處結合之肽-Fl或肽-DFF的螢光淬滅。一般而言，螢光團之4'-位置處結合的肽之淬滅低於螢光團之5-位置處結合的肽之淬滅，除了P5-Fl，其情況下4'結合之螢光素展示較高淬滅。表 1 ： 在Ab/結合物比率=2/1下藉由抗CysB Mab (7C2)之CysB肽螢光素-結合物之螢光淬滅百分比
肽                 Fl結合物                DFF結合物
5-位置 4'-位置 5-位置 4'-位置
P7 5% - 5% -
P6 34% 9.0% 45% 34%
P5 6.0% 26.3% 6.3% 3.0%
P4 30% 17.3% 9.5% 2%
在 Tris 緩衝液及血清中之肽 / 全長犬 CysB 蛋白劑量反應
含CysB P6-Fl或P6-DFF的具有0.1% Tween 20之Tris緩衝液(200 nM，25 μL)及含抗Cys-Mab的具有0.1% Tween 20之Tris緩衝液(400 nM，25 μL)之混合物在室溫下在96孔黑色分析盤之孔中培育30分鐘。隨後將具有0至3200 nM範圍內之肽濃度的一系列CysB肽P6、P7及P14標準溶液(50 μL)添加至Tris緩衝液中P6-Fl或P6-DFF及抗CysB Mab之混合物中。盤隨後在室溫下培育30分鐘，且在485 nm激發及520 nm發射下記錄螢光強度。結果展示於圖43、圖44、圖45及圖46中。
圖43展示，螢光強度隨CysB肽P6、P7或P14之濃度增加而增加，亦即當此等肽中之每一者添加至抗體及P6-Fl或P6-DFF之混合物時觀測到劑量反應。圖44展示在不同濃度十二烷基肌胺酸鈉存在下，螢光強度隨CysB全長蛋白之濃度增加而增加，亦即當將此蛋白質添加至抗體與P6-Fl (圖44A)或P1-DFF (圖44B)之混合物中時觀測到劑量反應。劑量反應幅度隨十二烷基肌胺酸鈉之濃度增加而增加。在清潔劑十二烷基肌胺酸鈉(1%)存在下，當將血清中之CysB全長蛋白添加至抗體或抗體-BHQ10與P6-Fl (圖45)或P6-DFF (圖46)之混合物時，亦觀測到劑量反應。實例 52 ： 犬 NT-proBNP 肽結合物 ： 犬 NT-proBNP 序列 ：
Figure 02_image185
犬NT-proPNP，全長：HPLGGRSPASEASEASEASGLWAVQELLGRLKDAVSELQAEQLALEPLHRSHSPAEAPEAGGTPRGVLAPHDSVLQALR [SEQ ID NO:14] 犬NT-proPNP穩定抗原決定基：GRSPASEASEASEASGLWAVQ [SEQ ID NO:15] 犬NT-proPNP穩定抗原決定基2：SHSPAEAPEAGGTPRGVLAPHDSVLQ [SEQ ID NO:16]在 5- 位置 處結合之犬 NT-proBNP 肽 -Fl 結合物之製備
將具有AEQLALEPLHRS [SEQ ID NO:8]之胺基酸序列的NT-proBNP肽P1 (3.02 mg，0.0022 mmol，由GenScript, Piscataway, NJ定製合成)、5-羧基螢光素丁二醯亞胺酯(1 mg，0.0021 mmol，可購自Waltham, MA的Thermo Fisher)及N'N-二異丙基乙胺(1.6 μl，0.0089 mmol)溶解於無水DMSO (0.5 ml)中。將所得混合物在室溫下攪拌隔夜，且隨後在1 ml之30% ACN/水(含有0.1%甲酸)中稀釋，且藉由管柱層析使用30%至100%乙腈/水的梯度溶離的C18逆相管柱(5 g)在Biotage Isolera™純化系統上純化。藉由監測257 nm及470 nm下之吸收自動收集溶離份。藉由LCMS分析具有在470 nm下吸收之溶離份，且將含有目標肽P1-Fl結合物之溶離份合併且凍乾，得到藉由LCMS (M2+ =861.7)確認之最終黃色固體產物。NT-proBNP肽P2：AEQLAL [SEQ ID NO:9]；P3：EPLHRS [SEQ ID NO:10]；P4：LALEPL [SEQ ID NO:11]；P5：AEQLALE [SEQ ID NO:12]；及P6：LEPLHRS [SEQ ID NO:13]與螢光素在5位置之結合物使用與上文對NT-proBNP肽P1所描述實質上相同的合成及純化程序及起始材料合成。最終結合物藉由LCMS表徵為：P2-Fl，(M+1= 1002.5)；P3-Fl，(M+1=1096.7)；P4-Fl (M+1=1013.4)：P5-Fl，(M+1=1131.8)；P6-Fl (M+1=1209.9)在 5- 位置 處結合之犬 NT-proBNP 肽 - DFF 結合物之製備
將具有AEQLALEPLHRS之胺基酸序列的NT-proBNP肽P1 (2.81 mg，0.0021 mmol，由GenScript, Piscataway, NJ定製合成)、5-二氟羧基螢光素丁二醯亞胺酯(1.0 mg，0.0021 mmol，可購自ATT Bioquest, Sunnyvale, CA)及N'N-二異丙基乙胺(1.5 μl，0.0089 mmol)溶解於無水DMSO (0.5 ml)中。將所得混合物在室溫下攪拌隔夜，且隨後在1 ml之30% ACN/水(含有0.1%甲酸)中稀釋，且藉由管柱層析使用30%至100%乙腈/水的梯度溶離的C18逆相管柱(5 g)在Biotage Isolera™純化系統上純化。藉由監測257 nm及470 nm下之吸收自動收集溶離份。藉由LCMS分析具有在470 nm下吸收之溶離份，且將含有目標肽P1-DFF結合物之溶離份合併且凍乾，得到藉由LCMS (M2+ =879.8)確認之最終黃色固體產物。NT-proBNP肽P2：AEQLAL [SEQ ID NO:9]；P3：EPLHRS [SEQ ID NO:10]；P4：LALEPL [SEQ ID NO:11]；P5：AEQLALE [SEQ ID NO:12]及P6：LEPLHRS [SEQ ID NO:13]與DFF在5-位置之結合物使用與上文對NT-proBNP肽P1所描述實質上相同的合成及純化程序及起始材料合成。最終結合物藉由LCMS表徵為：P2-DFF，(M+1= 1039.1)；P3-DFF，(M+1=1132.2 )；P4-DFF (M+1=1049.5)：P5-DFF，(M+1=1167.9)；P6-DFF(M+1=1245.9)藉由抗 NT-proBNP Mab 及 Ab-BHQ10 的犬 NT-proBNP P1-Fl 及 P1-DFF 之螢光淬滅
將NT-proBNP肽-螢光素(Fl)或NT-proBNP肽-二氟螢光素(DFF)結合物溶解於DMSO (0.4 mM)中且用PBS稀釋，得到儲備溶液(100 nM)。在PBS緩衝液中連續稀釋單株抗NT-proBNP抗體(ADX-15 Mab，Westbrook, ME的IDEXX Laboratories公司) (6.84 mg/ml)，得到在PBS中抗體濃度在0至800 nM範圍內的溶液。在含有連續稀釋之抗體溶液(50 μL)的96孔黑色分析盤中，添加P1-Fl或P1-DFF或其他肽-Fl或肽-DFF溶液(50 μL)，充分混合，培育30分鐘且記錄螢光強度(激發485 nm及發射520 nm)。結果提供於圖47、圖48及表2中。
圖47展示藉由添加抗NT-proBNP抗體P1-Fl的螢光淬滅達到至多70%，且在抗NT-proBNP Ab:P1-Fl之莫耳比為2:1時，淬滅達到飽和點。藉由添加抗NT-proBNP抗體-BHQ10 P1-Fl的螢光淬滅達到至多40%，且在抗NT-proBNP Ab-BHQ10:P1-Fl之莫耳比為2:1時，淬滅達到飽和點。圖48展示P1-DFF之螢光在抗NT-proBNP-Mab存在下淬滅至多大約70%，且淬滅在1:1之抗體:P1-DFF之莫耳比下達到飽和。P1-DFF之螢光在抗NT-proBNP Ab-BHQ10存在下淬滅至多大約65%。所有其他NT-proBNP肽-Fl或NT-proBNP肽-DFF結合物(P2、P3、P4、P5)在以1:1至8:1之任何莫耳比添加抗體或抗體-BHQ10時未展現淬滅。NT-proBNP P6-Fl及P6-DFF在1:1比率下展現輕微螢光淬滅(1.0至3.7%)，其在8:1比率下增加至大約10%。在1:1莫耳比下之結果概述於表2中。表 2 ： 在1:1之Ab/結合物莫耳比下藉由抗NT-proBNP Mab (Ab)或抗NT-proBNP Mab-BHQ10結合物(Ab-BHQ10)之NP proBNP肽螢光團-結合物之螢光淬滅百分比(無=無淬滅)
NP-proBNP 肽 Fl結合物 DFF結合物
Ab Ab-BHQ10 Ab Ab-BHQ10
P1 39.4% 40.2% 63.3% 64.7%
P2 無 無 無 無
P3 無 無 無 無
P4 無 無 無 無
P5 無 無 無 無
P6 2.0% 3.7% 1.0% 1.2%
PBS 及血清中之犬 NT-proBNP 肽 P1 劑量反應
在室溫下在96孔黑色分析盤之孔中培育含NT-proBNP P1-Fl或P1-DFF之PBS (100 nM，25 μL)及含抗NT-proBNP-Mab之PBS (100 nM，25μL)之混合物30分鐘。隨後將具有0至320 nM範圍內之肽或蛋白質濃度的一系列NT-proBNP肽P1之PBS或木炭剝離血清標準溶液(50 μL)添加至P1-Fl或P1-DFF及抗NT-proBNP Mab於PBS中之混合物中。盤隨後在室溫下培育30分鐘，且在485 nm激發及520 nm發射下記錄螢光強度。結果展示於圖49、圖50、圖51及圖52中。
圖49展示螢光強度隨NT-proBNP肽P1濃度增加而增加，亦即當將肽添加至P1-Fl與抗NT-proBNP抗體(Ab)或抗體-BHQ10 (Ab-BHQ10)之混合物中時觀測到劑量反應。圖50亦展示螢光強度隨NT-proBNP肽P1濃度增加而增加，亦即當將肽添加至P1-DFF與抗NT-proBNP抗體(Ab)或抗體-BHQ10 (Ab-BHQ10)之混合物中時觀測到劑量反應。P1肽亦在血清中與抗體或抗體-BHQ10與P1-Fl (圖51)或P1-DFF (圖52)之混合物產生劑量反應。犬 NT-proBNP 全長蛋白質劑量反應
在室溫下在96孔黑色分析盤之孔中培育含NT-proBNP P1-Fl或P1-DFF之PBS (200 nM，10 μL)及含抗NT-proBNP Mab之PBS (200 nM，10 μL)之混合物30分鐘。隨後向P1-Fl或P1-DFF及抗NT-proBNP Mab於PBS中之混合物中添加NT-proBNP全長蛋白質(由New England Biolabs, Ipswich, MA合成之凍乾粉末)濃度在0至320 nM範圍內的一系列NT-proBNP肽P1之PBS標準溶液(80 μL)。盤隨後在室溫下培育30分鐘，且在485 nm激發及520 nm發射下記錄螢光強度。結果展示於圖53及圖54中。
圖53展示螢光強度隨全長NT-proBNP蛋白之濃度增加而增加，亦即當將蛋白質以1:1之P1-Fl/Ab之比率添加至P1-Fl及抗NT-proBNP抗體之混合物中時觀測到劑量反應。類似地，當蛋白質以1:1之比率添加至P1-DFF與抗體之混合物中時，觀測到劑量反應，如圖54中所示。當全長NT-proBNP外加至木炭剝離血清中且添加至P1-Fl/Ab (圖55)或P1-DFF/Ab (圖56)之混合物中時，亦觀測到劑量反應。如P1-Fl/Ab=2:1之圖55及P1-DFF/Ab為2:1之圖56中所示，分析靈敏度藉由減少混合物中抗體之相對量提高。
所引用之所有參考文獻之全部揭示內容以引用的方式併入本文中。
圖1為描繪方法之一般原理的示意圖。
圖2為描繪用於使螢光素分子之4'-位置官能化之合成流程的示意圖。
圖3為如實例15中所描述之各種Mel-示蹤劑之螢光隨[抗Mel-Ab]/[Mel-示蹤劑]之比率變化的變化百分比圖。
圖4為如實例16中所描述當將三聚氰胺添加至Mel-F及抗Mel-Ab之溶液中時螢光強度相對於三聚氰胺濃度之圖。
圖5為如實例17中所描述各種液體中之Mel-F、Mel-F+抗Mel-AB及Mel-F+抗Mel-AB+Mel溶液之螢光強度的圖。
圖6為如實例18中所描述隨三聚氰胺濃度而變的其中已添加含有三聚氰胺之乳的Mel與抗Mel-Ab之混合物的螢光圖。
圖7為如實例19中所述當將抗生蛋白鏈菌素添加至生物素-F溶液及生物素-ED溶液中時，螢光變化百分比相對於抗生蛋白鏈菌素:示蹤劑莫耳比的圖。
圖8為如實例20中所描述T3-F (僅結合物)；T3-F及抗T4-Mab (結合物及單株抗體)；及T3-F、抗T4-Mab (結合物及單株抗體)及T4之溶液之相對螢光圖。
圖9為如實例20中所描述當將T3-F添加至PBS及PBS+抗T4-Mab (亦即AB)中及在添加T4 (PBS+Ab+T4)之後隨時間推移淬滅之恢復的螢光變化百分比圖。
圖10為如實例21中所描述當將各種濃度之T4添加至T3-F及抗T4-Mab之溶液中時螢光強度相對於T4濃度之圖。
圖11為如實例22中所描述在凍乾至乾燥之前及之後T3-F或T3-F與抗T4-Mab之各種溶液之螢光強度圖。
圖12A為如實例22中所描述隨T4-5:Ab-Cy5之比率而變的含有T4-5及Ab-Cy5之溶液螢光強度之圖。圖12B為如實例23中所描述隨T4-5:Ab-Cy5之比率而變的含有T4-5及Ab-Cy5之溶液螢光變化百分比之圖。
圖13A為如實例23中所描述已添加T4之T4-F及Ab-Cy5之溶液的螢光強度相對於T4濃度的圖。圖13B為如實例23中所描述已添加T4之T4-F及Ab-Cy5的螢光恢復百分比相對於T4濃度的圖。
圖14A為如實例24中所述已添加T4之含有T3-F及Ab-Cy3之各種溶液的螢光強度相對於T4濃度的圖。圖14B為如實例24中所述已添加T4之含有T4-F及Ab-Cy3之各種溶液的螢光強度相對於T4濃度的圖。圖14C為如實例24中所述，當溶液在490 nm下激發且在615 nm下量測發射時，已添加T4之含有T4-F及Ab-Cy3之各種溶液的螢光強度相對於T4濃度的圖。
實例15為如實例25中所描述連接於螢光示蹤劑之各種β-內醯胺抗生素的溶液；示蹤劑及抗體(亦即Ab)之溶液；以及示蹤劑、抗體及安比西林(ampicillin)或頭孢噻肟(cefotaxime)之溶液之螢光變化百分比圖。
圖16為如實例26中所述SDM-F或SDM-Su-F溶液；SDM-F或SDM-Su-F及抗達美磺胺(sulfadimethoxine)單株抗體(Ab)溶液；及SDM-F或SDM-Su-F、Ab及SDM溶液之相對螢光百分比的圖。
圖17為如實例27中所描述T3-F及單株抗T4-Mab之各種溶液之螢光強度相對於單株抗T4-Mab:T3-F之莫耳比之圖。
圖18A至18C描繪在本文所述之乾燥載片分析方法中所用之載片的各種實施例之結構。
圖19A及19B描繪本文所述之乾燥載片分析方法中所用之載片的說明性實施例。
圖20係描繪本文所述之乾燥載片分析方法如何使用圖18C中描繪之乾燥載片進行的圖示。
圖21為如實例28中所描述螢光淬滅百分比相對於抗體:皮質醇-4-Fl之比率的圖。
圖22為螢光淬滅百分比相對於抗體:皮質醇-4-Fl之比率且相對於抗體:皮質醇-5-Fl之比率且如實例28中所描述的圖。
圖23描繪當螢光示蹤劑A3與SDMA之抗體形成複合物，隨結合於抗體之BHQ10淬滅劑的當量而變之螢光的減少。
圖24描繪分析(使用具有過濾層之載片)之結果，該分析測定含有固定量之SDMA之樣品中SDMA之濃度(μg/dL)，其中樣品包括各種濃度之可潛在地干擾分析之化合物(亦即，干擾物)。干擾物為(A)溶血(0至500 mg/dL)、(B)膽紅素(0至30 mg/dL)、(C)英脫利匹特(intralipid) (0至1000 mg/dL)及(D)全血(0至10%)。
圖25A描繪DFF、SDMA-DFF、DCF、SDMA-DCF、Fl及SDMA-FL之吸收光譜，且圖25B描繪SDMA-DFF、SDMA-DCF、Fl及SDMA-FL之發射光譜，如實例33中所描述。
圖26描繪如實例34中所描述隨抗體濃度增加而變的不同SDMA示蹤劑之螢光淬滅百分比。
圖27描繪如實例34中所述隨與BHQ10 (4當量)結合之抗SDMA抗體之濃度增加而變的不同SDMA示蹤劑之螢光淬滅百分比。
圖28描繪如實例34中所述當SDMA與SDMA-DFF示蹤劑/SDMA抗體溶液組合時，隨SDMA濃度而變之螢光強度增加。
圖29描繪如實例34中所述當SDMA與SDMA-DCF示蹤劑/SDMA抗體溶液組合時，隨SDMA濃度而變之螢光強度增加。
圖30描繪如實例34中所述當SDMA與SDMA-DCF示蹤劑/SDMA抗體溶液組合時，隨SDMA濃度而變之螢光強度增加。
圖31描繪如實例36中所描述隨核黃素結合蛋白而變的乳中之核黃素螢光。
圖32描繪如實例37中所述來自使用乾燥載片的SMDA分析之輸出。
圖33為如實例40中所述螢光淬滅百分比相對於抗體:CA-Fl之比率的圖。
圖34為如實例40中所述，當將膽酸(圖34A)或牛膽酸(圖34B)添加至CA-Fl及α-膽酸抗體於PBS中之溶液中時螢光強度相對於膽酸濃度之圖。
圖35為如實例42中所述含有不同濃度之膽酸(圖35A)或牛膽酸(圖35B)的CA-Fl及α-膽酸抗體之溶液之螢光相對於膽汁酸濃度的圖。
圖36為如實例47中所描述螢光強度(λex = 470nm ，λem = 520 nm)相對於CysB濃度(μg/mL)之圖。
圖37為如實例48中所描述經乾燥載片形式中螢光強度之增加速率(如在時間間隔30至100秒所量測)相對於CysB之濃度的圖。
圖38為螢光淬滅百分比相對於抗CysB抗體:CysB肽P6-Fl之比率且相對於抗體:P7-Fl之比率且如實例51中所描述的圖。
圖39為螢光淬滅百分比相對於抗CysB抗體:CysB肽P6-DFF之比率且相對於抗體:P7-DFF之比率且如實例51中所描述的圖。
圖40為螢光淬滅百分比相對於抗CysB抗體:CysB肽P6-Fl或P6-DFF之比率且相對於抗體:P6-4-Fl或P-4-DFF之比率且如實例52中所描述的圖。
圖41為螢光淬滅百分比相對於抗CysB抗體(Ab):CysB肽P6-Fl之比率且相對於抗體-BHQ10 (Ab-BHQ10):P6-Fl之比率的圖。
圖42為螢光淬滅百分比相對於抗CysB抗體:CysB肽P6-DFF之比率且相對於抗體-BHQ10 (Ab-BHQ10):P6-DFF之比率的圖。
圖43為如實例51中所述當將CysB肽P6、P7或P14添加至P6-Fl與抗CysB抗體之溶液或P6-DFF與抗CysB抗體之溶液中時，隨P6、P7或P14濃度而變的螢光恢復百分比之圖。
圖44展示如實例51中所述在清潔劑十二烷基肌胺酸鈉存在下，當CysB全長蛋白添加至P6-Fl及抗CysB抗體之溶液(圖44A)或P6-DFF及抗CysB抗體之溶液(圖44B)時隨CysB蛋白質濃度而變的螢光恢復百分比的圖。
圖45為如實例51中所述在清潔劑十二烷基肌胺酸鈉存在下，當外加於血清中之CysB全長蛋白添加至P6-Fl及抗CysB抗體(Ab)之溶液或P6-Fl及與BHQ10結合之抗CysB抗體(Ab-BHQ10)之溶液時隨CysB蛋白質濃度而變的螢光恢復百分比的圖。
圖46為如實例51中所述在清潔劑十二烷基肌胺酸鈉存在下，當外加於血清中之CysB全長蛋白添加至P6-DFF及抗CysB抗體(Ab)之溶液或P6-DFF及與BHQ10結合之抗CysB抗體(Ab-BHQ10)之溶液時隨CysB蛋白質濃度而變的螢光恢復百分比的圖。
圖47為如實例52中所描述螢光淬滅百分比相對於抗NT-proBNP抗體:NT-proBNP肽P1-Fl (Ab)之比率且相對於抗NT-proBNP抗體-BHQ10:肽P1-Fl之比率的圖。
圖48為如實例52中所描述螢光淬滅百分比相對於抗NT-proBNP抗體:NT-proBNP肽P1-DFF (Ab)之比率且相對於抗NT-proBNP抗體-BHQ10:P1-DFF (Ab-BHQ10)之比率的圖。
圖49為如實例52中所述隨P1濃度而變的當將NT-proBNP肽P1添加至P1-Fl及抗NT-proBNP抗體(Ab)之溶液或P1-Fl及抗體-BHQ10 (Ab-BHQ10)之溶液中時螢光恢復百分比之圖。
圖50為如實例52中所述隨P1濃度而變的當將NT-proBNP肽P1添加至P1-DFF及抗NT-proBNP抗體(Ab)之溶液或P1-DFF及抗NT-proBNP抗體-BHQ10之溶液中時螢光恢復百分比之圖。
圖51為如實例52中所述隨P1濃度而變的當將外加至木炭剝離血清中的NT-proBNP肽P1添加至P1-Fl及抗NT-proBNP抗體之溶液中時螢光恢復百分比之圖。
圖52為如實例52中所述隨P1濃度而變的當將外加至木炭剝離血清中的NT-proBNP肽P1添加至P1-DFF及抗NT-proBNP抗體之溶液中時螢光恢復百分比之圖。
圖53為如實例52中所述隨NT-proBNP蛋白質濃度而變的當將含NT-proBNP全長蛋白質之PBS添加至P1-Fl及抗NT-proBNP抗體(P1-Fl/Ab = 1:1)之溶液中時螢光恢復百分比之圖。
圖54為如實例52中所述隨NT-proBNP蛋白質濃度而變的當將含NT-proBNP全長蛋白質之PBS添加至P1-DFF及抗NT-proBNP抗體(P1-DFF/Ab = 1:1)之溶液中時螢光恢復百分比之圖。
圖55為如實例52中所述隨NT-proBNP蛋白質濃度而變的當將含NT-proBNP全長蛋白質之血清添加至P1-Fl及抗NT-proBNP抗體(P1-Fl/Ab = 2:1)之溶液中時螢光恢復百分比之圖。
圖56為如實例52中所述隨NT-proBNP蛋白質濃度而變的當將含NT-proBNP全長蛋白質之血清添加至P1-DFF及抗NT-proBNP抗體(P1-DFF/Ab = 2:1)之溶液中時螢光恢復百分比之圖。
圖57描繪本文所描述之乾燥載片分析方法中所用之載片的說明性實施例。
圖58描繪本文所描述之乾燥載片分析方法中所用之載片的說明性實施例。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 110113844-A0304-11-0002-1

Claims (209)

  1. 一種化合物，其選自由以下組成之群：
    Figure 03_image001
    其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
  2. 一種複合物，其包含如請求項1之化合物及對稱二甲基精胺酸(SDMA)之抗體。
  3. 如請求項2之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  4. 如請求項3之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  5. 如請求項4之複合物，其中該淬滅劑為BHQ10。
  6. 如請求項1之化合物，其選自由以下組成之群：
    Figure 03_image188
    其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-Cl、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
  7. 一種複合物，其包含如請求項6之化合物及對稱二甲基精胺酸(SDMA)之抗體。
  8. 如請求項7之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  9. 如請求項8之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  10. 如請求項9之複合物，其中該淬滅劑為BHQ10。
  11. 如請求項6之化合物，其具有以下結構：
    Figure 03_image190
    。
  12. 一種複合物，其包含如請求項11之化合物及SDMA之抗體。
  13. 如請求項12之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  14. 如請求項13之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  15. 如請求項14之複合物，其中該淬滅劑為BHQ10。
  16. 一種用於測定樣品中對稱二甲基精胺酸(SDMA)之存在或量的方法，其包含： (i) 提供疑似含有SDMA之樣品； (ii) 將該樣品與以下互混： (a) 選自由以下組成之群的螢光示蹤劑：
    Figure 03_image192
    Figure 03_image194
    其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H，及 (b)  SDMA之抗體， 以提供分析溶液； (iii)  使用在第一波長下不偏振之光照射該分析溶液；及 (iv)  量測在第二波長下發射的光之強度， 其中在該第二波長下發射的該光之強度與該樣品中SDMA之濃度成比例。
  17. 如請求項16之方法，其中該方法不涉及分離步驟。
  18. 如請求項16之方法，其中該SDMA之抗體與淬滅劑結合。
  19. 如請求項18之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  20. 如請求項19之方法，其中該淬滅劑為BHQ10。
  21. 如請求項16之方法，其中該螢光示蹤劑選自由以下組成之群：
    Figure 03_image196
    其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
  22. 如請求項21之方法，其中該方法不涉及分離步驟。
  23. 如請求項21之方法，其中該SDMA之抗體與淬滅劑結合。
  24. 如請求項21之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  25. 如請求項24之方法，其中該淬滅劑為BHQ10。
  26. 如請求項21之方法，其中該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image198
    。
  27. 如請求項26之方法，其中該方法不涉及分離步驟。
  28. 如請求項26之方法，其中該SDMA之抗體與淬滅劑結合。
  29. 如請求項28之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  30. 如請求項29之方法，其中該淬滅劑為BHQ10。
  31. 一種用於測定樣品中之分析物之存在或量的方法，其包含： (i) 提供疑似含有分析物之樣品； (ii) 將該樣品與以下互混： (a) 螢光示蹤劑及 (b) 結合搭配物， 其中該結合搭配物對該分析物及該螢光示蹤劑具有特異性以提供分析溶液； (iii) 使用在第一波長下不偏振之光照射該分析溶液；及 (iv) 量測在第二波長下發射的光之強度， 其中在第二波長下發射的該光之強度與該樣品中該分析物之濃度成比例。
  32. 一種用於測定樣品中之分析物之存在或量的方法，其包含： (i) 提供疑似含有分析物之樣品； (ii)  將該樣品與以下互混： (a) 螢光示蹤劑及 (b) 結合搭配物， 其中該結合搭配物對該分析物及該螢光示蹤劑具有特異性以提供分析溶液； (iii) 藉由用在第一波長下尚未偏振之光照射該分析溶液且量測在第二波長下發射之光之強度來測定與該結合搭配物結合之螢光示蹤劑之量。
  33. 如請求項31或32之方法，其中該分析物係選自由以下組成之群：三聚氰胺、抗生素、T3、T4、青黴素、磺胺藥、頭胞菌素、孕酮、皮質醇及胱蛋白-B。
  34. 如請求項31或32之方法，其中該結合搭配物為針對該分析物之抗體。
  35. 如請求項31或32之方法，其中該方法不涉及分離步驟。
  36. 如請求項31或32之方法，其中該方法使用乾燥載片分析。
  37. 如請求項31或32之方法，其中該螢光示蹤劑係選自由以下組成之群：經4'-取代之螢光素示蹤劑、經4'-取代之螢光素示蹤劑衍生物、經5-取代之螢光素示蹤劑及經5-取代之螢光素示蹤劑衍生物。
  38. 如請求項31或32之方法，其中該分析物為三聚氰胺，該螢光示蹤劑係選自由以下組成之群：
    Figure 03_image200
    ， 且該結合搭配物為針對三聚氰胺之抗體。
  39. 如請求項31或32之方法，其中該分析物為生物素，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image202
    且該結合搭配物為針對生物素之抗體。
  40. 如請求項31或32之方法，其中該分析物為甲狀腺素，該螢光示蹤劑選自由以下組成之群：
    Figure 03_image204
    且該結合搭配物為針對甲狀腺素之抗體。
  41. 如請求項31或32之方法，其中該分析物為阿莫西林(amoxicillin)，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image206
    ， 且該結合搭配物為針對阿莫西林之抗體。
  42. 如請求項31或32之方法，其中該分析物為安比西林(ampicillin)，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image208
    ， 且該結合搭配物為針對安比西林之抗體。
  43. 如請求項31或32之方法，其中該分析物為頭孢噻肟(cefotaxime)，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image210
    ， 且該結合搭配物為針對頭孢噻肟之抗體。
  44. 如請求項31或32之方法，其中該分析物為達美磺胺(sulfadimethoxine)，且該螢光示蹤劑係選自由以下組成之群：
    Figure 03_image212
    ， 且該結合搭配物為針對達美磺胺之抗體。
  45. 如請求項31或32之方法，其中該分析物為皮質醇，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image214
    ， 且該結合搭配物為針對皮質醇之抗體。
  46. 一種化合物，其選自由以下組成之群：
    Figure 03_image216
    。
  47. 一種複合物，其包含如請求項46之化合物及針對三聚氰胺之抗體。
  48. 如請求項47之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  49. 如請求項48之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  50. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image218
    。
  51. 一種複合物，其包含如請求項50之化合物及針對生物素之抗體。
  52. 如請求項51之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  53. 如請求項52之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  54. 一種化合物，其選自由以下組成之群：
    Figure 03_image220
    。
  55. 一種複合物，其包含如請求項54之化合物及針對甲狀腺素之抗體。
  56. 如請求項55之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  57. 如請求項56之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  58. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image222
    。
  59. 一種複合物，其包含如請求項58之化合物及針對阿莫西林之抗體。
  60. 如請求項59之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  61. 如請求項60之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  62. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image224
    。
  63. 一種複合物，其包含如請求項62之化合物及針對安比西林之抗體。
  64. 如請求項63之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  65. 如請求項64之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  66. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image226
    。
  67. 一種複合物，其包含如請求項66之化合物及針對頭孢噻肟之抗體。
  68. 如請求項67之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  69. 如請求項68之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  70. 一種化合物，其選自由以下組成之群：
    Figure 03_image228
    。
  71. 一種複合物，其包含如請求項70之化合物及針對達美磺胺之抗體。
  72. 如請求項71之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  73. 如請求項72之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  74. 一種下式之化合物，
    Figure 03_image230
    。
  75. 一種複合物，其包含如請求項74之化合物及針對皮質醇之抗體。
  76. 如請求項75之複合物，其中該抗體與淬滅劑結合。
  77. 如請求項76之複合物，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  78. 如請求項31或32之方法，其中該結合搭配物與淬滅劑結合。
  79. 如請求項78之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  80. 一種包含第一層及第二層之載片，其中： 該第一層包含選自由以下組成之群的第一聚合物：聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、纖維素衍生物、聚對苯二甲酸乙二酯及其混合物，及 該第二層包含其中分散有螢光示蹤劑及結合搭配物之第二聚合物， 其中該結合搭配物對該螢光示蹤劑具有特異性。
  81. 如請求項80之載片，其中該第二層包含普魯蘭(pullulan)。
  82. 如請求項80之載片，其中該第二層包含量在該第二層的約2重量%至約40重量%範圍內的纖維素及量在該第二層的約0.5重量%至約40重量%範圍內的普魯蘭。
  83. 如請求項80之載片，其中該第一層之厚度在約15 μm至約200 μm範圍內，且該第二層之厚度在約30 μm至約200 μm範圍內。
  84. 如請求項80之載片，其中結合搭配物為抗體，且該第二層中之該螢光示蹤劑之濃度在該第二層之約1×10-5 重量%至約1×10-1 重量%範圍內，且抗體濃度在該第二層之約1×10-4 重量%至約1重量%範圍內。
  85. 如請求項80之載片，其中該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image232
    且該結合搭配物為針對SDMA之抗體。
  86. 如請求項80之載片，其進一步包含第三層，其包含選自由聚胺基甲酸酯、纖維素及其混合物組成之群的第三聚合物，其中該第三層塗佈於該第二層之頂部上。
  87. 如請求項86之載片，其中該聚胺基甲酸酯以該第三層之約40重量%至約95重量%範圍內之量存在，且該纖維素以該第三層之約5重量%至約60重量%範圍內之量存在。
  88. 如請求項86之載片，其中該第三層之厚度在約5 μm至約50 μm範圍內。
  89. 如請求項86之載片，其進一步包含第四層，其包含纖維素及親水性聚合物，其中該第四層塗佈於該第三層之頂部上。
  90. 如請求項89之載片，其中該親水性聚合物係選自由以下組成之群：聚丙烯酸、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺、聚乙烯亞胺及其混合物。
  91. 如請求項90之載片，其中該第四層進一步包含聚乙烯吡咯啶酮。
  92. 如請求項89之載片，其中該纖維素以約50重量%至約98重量%範圍內的量存在。
  93. 如請求項91之載片，其中該纖維素以該第四層之約50重量%至約98重量%範圍內之量存在，且該聚乙烯吡咯啶酮以該第四層之約1重量%至約30重量%範圍內之量存在。
  94. 如請求項86之載片，其中該第四層之厚度在約25 μm至約250 μm之範圍內。
  95. 如請求項80、86及89之載片，其進一步包含第五層，其包含聚胺基甲酸酯，其中該第五層定位於該第一層與該第二層之間。
  96. 如請求項95之載片，其中該第五層的厚度在約1 μm至約20 μm範圍內。
  97. 如請求項95之載片，其進一步包含第六層，其包含分散於選自由以下組成之群的第六聚合物中的碳黑：聚胺基甲酸酯、聚氧化乙烯、聚矽氧、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺及其混合物，其中該第六層定位於該第三層與該第四層之間。
  98. 如請求項97之載片，其中碳黑的量在該第六層的約10重量%至約40重量%範圍內。
  99. 如請求項97之載片，其中該第六層具有在約5 μm至約30 μm範圍內的厚度。
  100. 如請求項95之載片，其進一步包含第七層，其包含分散於選自由以下組成之群的第七聚合物中的氧化鈦：聚胺基甲酸酯、聚氧化乙烯、聚矽氧、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺及其混合物，其中該第七層定位於該第二層與該第三層之間。
  101. 如請求項100之載片，其中該氧化鈦以該第七層之約20重量%至約60重量%範圍內之量存在。
  102. 如請求項100之載片，其中該第七層之厚度在約50 μm至約250 μm範圍內。
  103. 如請求項100之載片，其中該氧化鈦以平均粒度小於約20 μm之粒子形式提供。
  104. 如請求項86之載片，其中該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image234
    且該結合搭配物為針對SDMA之抗體。
  105. 如請求項89之載片，其中該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image236
    且該結合搭配物為針對SDMA之抗體。
  106. 如請求項95之載片，其中該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image238
    且該結合搭配物為針對SDMA之抗體。
  107. 如請求項97之載片，其中該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image240
    且該結合搭配物為針對SDMA之抗體。
  108. 如請求項100之載片，其中該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image242
    且該結合搭配物為針對SDMA之抗體。
  109. 一種用於測定樣品中之分析物之存在或量的方法，其包含： 將樣品安置於如請求項80至108中任一項之載片的頂部層上，其中該載片之該頂部層為距該第一層最遠的層； 藉由在第一波長下不偏振之光照射該載片之該第一層；及 量測自該載片之該第一層在該第二波長下發射之該光的強度， 其中在第二波長下發射的該光之強度與該樣品中該分析物之濃度成比例， 其中該載片之該第一層對於該第一波長及該第二波長為光學透明的，及 其中該結合搭配物對該分析物具有特異性。
  110. 如請求項109之方法，其中該方法不涉及分離步驟。
  111. 如請求項109之方法，其中該分析物為SDMA，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image244
    ， 且該結合搭配物為針對SDMA之抗體。
  112. 如請求項111之方法，其中該針對SDMA之抗體與淬滅劑結合。
  113. 如請求項112之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  114. 如請求項113之方法，其中該淬滅劑為BHQ10。
  115. 如請求項111之方法，其中該第一波長為約490 nm，且該第二波長為約520 nm。
  116. 如請求項109之方法，其中該分析物為三聚氰胺，該螢光示蹤劑係選自由以下組成之群：
    Figure 03_image246
    ， 且該結合搭配物為針對三聚氰胺之抗體。
  117. 如請求項116之方法，其中該針對三聚氰胺之抗體與淬滅劑結合。
  118. 如請求項117之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  119. 如請求項109之方法，其中該分析物為生物素，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image248
    且該結合搭配物為針對生物素之抗體。
  120. 如請求項119之方法，其中該針對生物素之抗體與淬滅劑結合。
  121. 如請求項120之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  122. 如請求項109之方法，其中該分析物為甲狀腺素，該螢光示蹤劑選自由以下組成之群：
    Figure 03_image250
    ， 且該結合搭配物為針對甲狀腺素之抗體。
  123. 如請求項122之方法，其中該針對甲狀腺素之抗體與淬滅劑結合。
  124. 如請求項123之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  125. 如請求項109之方法，其中該分析物為阿莫西林，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image252
    ， 且該結合搭配物為針對阿莫西林之抗體。
  126. 如請求項125之方法，其中該針對阿莫西林之抗體與淬滅劑結合。
  127. 如請求項126之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  128. 如請求項109之方法，其中該分析物為安比西林，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image254
    ， 且該結合搭配物為針對安比西林之抗體。
  129. 如請求項128之方法，其中該針對安比西林之抗體與淬滅劑結合。
  130. 如請求項129之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  131. 如請求項109之方法，其中該分析物為頭孢噻肟，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image256
    ， 且該結合搭配物為針對頭孢噻肟之抗體。
  132. 如請求項131之方法，其中該針對頭孢噻肟之抗體與淬滅劑結合。
  133. 如請求項132之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  134. 如請求項109之方法，其中該分析物為達美磺胺，該螢光示蹤劑係選自由以下組成之群：
    Figure 03_image258
    Figure 03_image260
    ， 且該結合搭配物為針對達美磺胺之抗體。
  135. 如請求項134之方法，其中該針對達美磺胺之抗體與淬滅劑結合。
  136. 如請求項135之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  137. 如請求項109之方法，其中該分析物為皮質醇，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image262
    ， 且該結合搭配物為針對皮質醇之抗體。
  138. 如請求項137之方法，其中該針對皮質醇之抗體與淬滅劑結合。
  139. 如請求項138之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  140. 如請求項109之方法，其中該分析物為孕酮，該螢光示蹤劑為：
    Figure 03_image264
    且該結合搭配物為針對孕酮之抗體。
  141. 如請求項140之方法，其中該針對孕酮之抗體與淬滅劑結合。
  142. 如請求項141之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  143. 一種載片，其按順序包含： (i)第一層，其包含聚酯， (ii)第二層，其包含聚胺基甲酸酯， (ii)第三層，其包含： (a)纖維素，其量為該第二層之約57重量%， (b)普魯蘭，其量為該第二層的約28重量%， (c) HEPES緩衝劑，其量為該第二層的約13重量%，其中該HEPES緩衝劑之水性溶液之pH為約8， (d)非離子型界面活性劑，其量為該第二層的約1.17重量%， (e)螢光示蹤劑，其具有以下結構：
    Figure 03_image266
    其量為該第二層之約1.0×10-3 重量%，及 (f)針對SDMA之抗體，其量為該第二層的約1.4×10-2 %重量%， (iv)第四層，其包含量為該第四層之約20重量%的纖維素、量為該第四層之約38重量%的聚胺基甲酸酯以及量為該第四層之約42重量%的二氧化鈦， (v)第五層，其包含分散於量為該第五層之約76重量%的聚胺基甲酸酯中的量為該第五層之約24重量%的碳黑，及 (vi)第六層，其包含量為該第六層之約83重量%的纖維素、量為該第六層之約0.4重量%的氫氧化四甲基銨、量為該第六層之約0.5重量%的聚丙烯酸及量為該第六層之約16重量%的聚乙烯吡咯啶酮。
  144. 如請求項143之載片，其中該第一層的厚度為約75 μm，該第二層的厚度為約4 μm，該第三層的厚度為約35 μm，該第四層的厚度為約20 μm，該第五層的厚度為約14 μm，且該第六層的厚度為約100 μm。
  145. 一種用於測定樣品中對稱二甲基精胺酸(SDMA)之存在或量的方法，其包含： (i) 提供疑似含有SDMA之樣品， (ii) 使該樣品與如請求項143或144之載片的該第六層接觸， (iii) 藉由在第一波長下不偏振之光照射該載片之該第一層；及 (iv) 量測在第二波長下發射的光之強度。
  146. 如請求項145之方法，其中該第一波長為約490 nm，且該第二波長為約520 nm。
  147. 如請求項80之載片，其中該螢光示蹤劑及結合搭配物以包含該螢光示蹤劑及結合搭配物之複合物形式存在。
  148. 如請求項80、86及89、95或100中任一項之載片，其中該螢光示蹤劑為經4'-取代之螢光素示蹤劑。
  149. 如請求項109之方法，其中該螢光示蹤劑為經4'-取代之螢光素示蹤劑。
  150. 如請求項31或32之方法，其中該螢光示蹤劑為經4'-取代之螢光素示蹤劑。
  151. 一種基質，其包含(i)包含螢光示蹤劑及結合搭配物之複合物及(ii)包含普魯蘭之聚合物，其中該複合物分散於該聚合物中。
  152. 如請求項151之基質，其中該聚合物進一步包含纖維素。
  153. 如請求項151之基質，其中該基質包含量為該基質之約1重量%至約60重量%的普魯蘭。
  154. 如請求項152或153之基質，其中該纖維素以約30重量%至約90重量%之量存在。
  155. 如請求項151至154中任一項之基質，其中該基質實質上不含水。
  156. 如請求項109之方法，其中該分析物為蛋白質，該螢光示蹤劑為與該蛋白質連接之螢光部分；且該結合搭配物為針對該蛋白質之抗體。
  157. 如請求項156之方法，其中針對該蛋白質之該抗體與淬滅劑結合。
  158. 如請求項157之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1、BHQ10及BODIPY組成之群。
  159. 如請求項158之方法，其中該淬滅劑係選自由BHQ10及BODIPY組成之群。
  160. 如請求項109之方法，其中該分析物為胱蛋白-B，該螢光示蹤劑為與該胱蛋白-B連接之螢光部分；且該結合搭配物為抗胱蛋白-B抗體。
  161. 如請求項160之方法，其中該抗胱蛋白-B抗體與淬滅劑結合。
  162. 如請求項161之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1、BHQ10及BODIPY組成之群。
  163. 如請求項162之方法，其中該淬滅劑係選自由BHQ10及BODIPY組成之群。
  164. 如請求項160之方法，其中該螢光部分為螢光素。
  165. 如請求項164之方法，其中該螢光素經由一或多個離胺酸殘基與該胱蛋白-B結合。
  166. 如請求項164之方法，其中該螢光素經由一或多個半胱胺酸殘基與該胱蛋白-B結合。
  167. 如請求項160之方法，其中該螢光部分為與螢光素結合之CysB-肽9。
  168. 如請求項167之方法，其中該螢光素經由一或多個離胺酸殘基與該CysB-肽9結合。
  169. 如請求項164之方法，其中該結合搭配物為與一或多種BHQ10分子或與一或多種硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)分子結合的抗胱蛋白-B抗體。
  170. 如請求項165之方法，其中該結合搭配物為與一或多種BHQ10分子或與一或多種硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)分子結合的抗胱蛋白-B抗體。
  171. 如請求項166之方法，其中該結合搭配物為與一或多種BHQ10分子或與一或多種硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)分子結合的抗胱蛋白-B抗體。
  172. 如請求項167之方法，其中該結合搭配物為與一或多種BHQ10分子或與一或多種硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)分子結合的抗胱蛋白-B抗體。
  173. 如請求項168之方法，其中該結合搭配物為與一或多種BHQ10分子或與一或多種硼-二吡咯亞甲基(BODIPY)分子結合的抗胱蛋白-B抗體。
  174. 如請求項109之方法，其中該分析物為蛋白質，該螢光示蹤劑為與抗蛋白質抗體連接之螢光部分；且該結合搭配物為與一或多種淬滅劑結合之該蛋白質。
  175. 如請求項174之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1、BHQ10及BODIPY組成之群。
  176. 如請求項175之方法，其中該淬滅劑係選自由BHQ10及BODIPY組成之群。
  177. 如請求項109之方法，其中該分析物為胱蛋白-B，該螢光示蹤劑為與抗C胱蛋白-B抗體連接之螢光部分；且該結合搭配物為與一或多種淬滅劑結合之胱蛋白-B。
  178. 如請求項177之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1、BHQ10及BODIPY組成之群。
  179. 如請求項178之方法，其中該淬滅劑係選自由BHQ10及BODIPY組成之群。
  180. 如請求項177之方法，其中該螢光示蹤劑係藉由使抗CysB抗體與螢光素-NHS或螢光素醛反應而獲得。
  181. 如請求項178之方法，其中該螢光示蹤劑係藉由使抗CysB抗體與螢光素-NHS或螢光素醛反應而獲得。
  182. 如請求項181之方法，其中該螢光示蹤劑係藉由使抗CysB抗體與螢光素-NHS或螢光素醛反應而獲得。
  183. 一種用於測定樣品中之分析物之存在或量的方法，其包含： (i) 提供疑似含有分析物之樣品； (ii) 使該樣品與螢光示蹤劑及結合搭配物接觸，以提供分析組合物； 其中該結合搭配物對該分析物及該螢光示蹤劑具有特異性； (iii) 藉由在第一波長下之光照射該分析組合物；及 (iv) 量測在第二波長下發射的光之強度， 其中在該第二波長下發射的該光之強度與該樣品中該分析物之濃度成比例。
  184. 如請求項183之方法，其中該分析物為大分子。
  185. 如請求項184之方法，其中該分析物為蛋白質。
  186. 如請求項185之方法，其中(i)該螢光示蹤劑為與胺基酸鏈連接之螢光部分，其中該胺基酸鏈之長度短於該蛋白質之胺基酸長度，且其中該胺基酸鏈之胺基酸序列包含負責與該結合搭配物複合之該蛋白質上的抗原決定基之胺基酸序列，及(ii)該結合搭配物視情況與淬滅劑結合。
  187. 如請求項186之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  188. 如請求項186之方法，其中該結合搭配物為抗體。
  189. 如請求項186之方法，其中該蛋白質係選自由犬CysB蛋白質及犬NT-proBNP組成之群。
  190. 如請求項189之方法，其中該蛋白質為犬CysB蛋白質。
  191. 如請求項190之方法，其中該結合搭配物為抗胱蛋白-B抗體，且該螢光示蹤劑為與選自由以下組成之群的胺基酸序列連接之螢光素：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7。
  192. 如請求項191之方法，其中該胺基酸序列連接於該螢光素之5-位置。
  193. 如請求項192之方法，其中該胺基酸序列藉由-NH-C(O)-連接基團連接於該螢光素之5-位置。
  194. 如請求項192之方法，其中該抗胱蛋白-B抗體與淬滅劑結合。
  195. 如請求項191之方法，其中該胺基酸序列連接於該螢光素之4'-位置。
  196. 如請求項195之方法，其中該胺基酸序列藉由-CH2 -連接基團連接於該螢光素之4'-位置。
  197. 如請求項195之方法，其中該抗胱蛋白-B抗體與淬滅劑結合。
  198. 如請求項186之方法，其中該胺基酸序列連接於該螢光素之5-位置。
  199. 如請求項198之方法，其中該胺基酸序列藉由-NH-C(O)-連接基團連接於該螢光素之5-位置。
  200. 如請求項198之方法，其中該抗胱蛋白-B抗體與淬滅劑結合。
  201. 如請求項183之方法，其中該第一波長下之該光不線性偏振。
  202. 如請求項201之方法，其中該分析物為抗原且該結合搭配物為抗體。
  203. 如請求項202之方法，其中該抗原為SDMA且該抗體為SDMA之抗體。
  204. 如請求項203之方法，其中該螢光示蹤劑係選自由以下組成之群：
    Figure 03_image268
    其中X係選自由以下組成之群：-H、-F、-CH3 、-OCH3 、-OH、-NO2 、-CN、-COOH及-SO3 H。
  205. 如請求項204之方法，其中該SDMA之抗體與淬滅劑結合。
  206. 如請求項205之方法，其中該淬滅劑係選自由CY3、CY5、IRDyeQC1、BHQ1及BHQ10組成之群。
  207. 一種化合物，其選自由以下組成之群：
    Figure 03_image270
    。
  208. 如請求項201之方法，其包含： (A)提供載片，其中該載片依序包含： (i)支撐層，其選自由以下組成之群：玻璃、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、纖維素衍生物、聚對苯二甲酸乙二酯及其混合物， 其中該支撐層對於該第一波長及該第二波長為光學透明的； (ii)底塗層，其包含聚胺基甲酸酯； (iii)指示層，其包含分散於第二聚合物中之該螢光示蹤劑及該結合搭配物，其中該第二聚合物選自由以下組成之群：纖維素、纖維素衍生物、多醣、明膠、明膠衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、丙烯醯胺聚合物、聚胺基甲酸酯、海藻酸酯、三仙膠及其混合物， (iv)過濾層，其包含聚胺基甲酸酯及纖維素；及 (v)擴散層，其包含纖維素與親水性聚合物之混合物，其中該親水性聚合物選自由以下組成之群：聚丙烯酸、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯醯胺及聚乙烯亞胺， (B)將該樣品安置於該載片之該擴散層上； (C)藉由在第一波長下不偏振之該光照射該載片之該支撐層；及 (D)量測自該載片之該支撐層在該第二波長下發射之該光的強度。
  209. 如請求項28之方法，其中該抗原為SDMA且該抗體為SDMA之抗體。
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WO2023215974A1 (en) * 2022-05-10 2023-11-16 Moleculight Inc. Fluorescence reporter and/or therapeutic systems, devices, and methods of use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5371241A (en) * 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
WO2005123105A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-29 The Trustees Of Boston College Phototoxic compounds
LT2313364T (lt) * 2008-08-07 2021-01-25 Idexx Laboratories, Inc. Simetrinio dimetilarginino nustatymo būdai
US7985526B2 (en) * 2009-08-25 2011-07-26 Xerox Corporation Supercritical fluid microencapsulation of dye into latex for improved emulsion aggregation toner
US10031085B2 (en) * 2014-07-24 2018-07-24 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Point of care analytical processing system
US11422136B2 (en) * 2017-10-19 2022-08-23 Idexx Laboratories, Inc. Detection of symmetrical dimethylarginine

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