BR112020007150B1 - Métodos e kit para determinação de dimetilarginina simétrica (sdma) em uma amostra, dispositivo, reagente de captura, fase sólida e composição de um derivado de arginina - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se, em geral, à detecção de dimetilarginina simétrica (SDMA). Mais particularmente, a invenção se refere à detecção da SDMA usando uma fase sólida. A invenção fornece dispositivos, reagentes, kits e métodos para detecção da dimetilarginina simétrica (SDMA) em amostras, tal como uma amostra biológica de um animal. O método inclui detectar a presença ou a quantidade de SDMA na amostra usando um formato de imunoensaio, tal como um imunoensaio competitivo. O ensaio inclui o uso de anticorpos para SDMA que são específicos para SDMA e que têm menos afinidade a outros derivados da arginina.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente US provisório N° 62/574,592, depositado em 19 de outubro de 2017, e ao Pedido de Patente US provisório N° 62/599,117, depositado em 15 de dezembro de 2017, cada um deles é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se, em geral, à detecção da di- metilarginina simétrica (SDMA). Mais particularmente, a invenção se refere à detecção da SDMA usando uma fase sólida.

TÉCNICA RELACIONADA

[0003] A detecção da SDMA livre em uma amostra biológica de um animal pode fornecer uma indicação da função renal nos animais. As doenças e distúrbios renais (por exemplo, falha dos rins, insuficiência renal, doença renal crônica, glomerulonefrite, nefropatia diabética, nefrite intersticial, doença renal policística e doença renal hipertensiva) tendem a diminuir a função renal geral, incluindo a GFR (Taxa de Filtragem Glomerular), e podem ser diagnosticadas de várias maneiras, incluindo o uso dos indicadores renais comuns creatinina e BUN. Comparando os níveis de SDMA, BUN e creatinina em animais saudáveis e doentes, o nível da SDMA em uma amostra pode ser relacionado ao estado de doença do animal. Por conseguinte, animais "saudá-veis" mostrando níveis normais (faixa de referência) de creatinina e BUN, terão níveis de SDMA mais baixos do que os animais doentes. Em geral, os animais que sofrem de um distúrbio/doença renal terão níveis séricos de SDMA mais elevados do que os animais com função renal normal. Em seres humanos saudáveis, os níveis da SDMA no plasma geralmente variam de 0,3 - 0,7 μmol/l (J Am Soc Nephrol (2006) 17:1128-1134; Eur J Clin Invest. Junho de 2007 37(5): 364-371. Nephrol Dial Transplant (2003) 18: 2542-2550; Nephrol Dial Transplant (2006) 21:2446-2451; Kidney International, (2001) 59 (78): S14-S18).

[0004] Da mesma forma, o nível de SDMA livre em uma amostra biológica pode ser usado como um indicador de doença cardíaca nos animais. O nível de SDMA na amostra pode ser comparado a níveis de indicadores conhecidos para doenças cardíacas para determinar um intervalo de corte para diagnóstico de doenças cardíacas (J Am Soc Nephrol (2006) 17:1128-1134).

[0005] Por conseguinte, os inventores identificaram na técnica uma necessidade de determinar com precisão e eficiência a SDMA em amostras provenientes de seres humanos e outros animais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Em um aspecto, a invenção se refere a um dispositivo incluindo uma matriz sólida, tal como uma matriz porosa, tendo uma partícula a ela ligada de forma não difusiva, em que a partícula inclui um reagente de captura incluindo um análogo de um analito ou um derivado do analito acoplado de forma covalente a uma proteína que é acoplada à partícula. Em várias modalidades, a proteína pode ser acoplada de forma covalente ou não covalente à partícula. A proteína pode ser uma ou mais dentre Albumina de Soro Bovino (BSA), ovalbumina, Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) e Glicose-6-Fosfato Desidro- genase (G6PDH). A fixação não covalente da proteína à partícula pode ser mais tolerante a tensoativos ou altas concentrações de sal do que a fixação não covalente da BSA, ovalbumina ou KLH. O derivado pode ser um derivado de arginina, como um derivado metilado de ar- ginina, por exemplo, dimetilarginina assimétrica (ADMA), L-arginina, N- metilarginina (MMA), ADMA acilada, L-arginina acilada e MMA acilada. A matriz pode ser disposta em um cartucho ou alojamento.

[0007] Em outro aspecto, a invenção se refere a um reagente de captura, incluindo um análogo da N-metilarginina (MMA) ou MMA aci- lada acoplada a uma partícula. Em várias modalidades, o análogo pode ser ligado à partícula através de um ligante. O análogo pode ser acoplado de forma covalente a uma proteína que é pressa a uma partícula, e a proteína pode ser acoplada de forma covalente ou não covalente à partícula. A proteína pode ser pelo menos uma dentre Albumina de Soro Bovino (BSA), ovalbumina, Hemocianina de Lapa Cali- forniana (KLH) e Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH). O ligante pode incluir a seguinte estrutura:e o reagente de captura pode ser:

[0008] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método de determinação da dimetil arginina simétrica (SDMA) em uma amostra. O método inclui (a) formar uma mistura incluindo a amostra e um conjugado marcado incluindo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador; b) colocar a mistura em contato com o dispositivo incluindo um análogo de um derivado metilado de arginina e um suporte sólido ou matriz sólida, (c) lavar o suporte ou matriz sólida para remover o conjugado que não está ligado à matriz sólida; medir a quantidade do marcador associado ao suporte ou matriz sólida para determinar a presença ou a quantidade de SDMA na amostra.

[0009] Em várias modalidades, a mistura pode ser colocada em contato com o dispositivo que tem a SDMA como parte do reagente de captura e o anticorpo anti-SDMA que tem menos afinidade ao derivado da arginina do que afinidade à SDMA. Por exemplo, a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao derivado da arginina pode ser inferior a cerca de 25%, inferior a cerca de 10%, inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 1%, inferior a cerca de 0,1%, inferior a cerca de 0,01% ou inferior a cerca de 0,001% da afinidade do anticorpo à SDMA.

[00010] Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a um método de determinação da dimetil arginina simétrica (SDMA) em uma amostra. O método inclui (a) formar uma mistura incluindo a amostra e um conjugado marcado incluindo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador; (b) colocar a mistura em contato com uma matriz sólida incluindo o reagente de captura incluindo um derivado metilado de argi- nina como descrito aqui, (c) lavar a matriz sólida para remover o conjugado que não está ligado à matriz sólida; e medir a quantidade do marcador associado à matriz sólida para determinar a presença ou a quantidade da SDMA na amostra.

[00011] Mais ainda, a invenção se refere a um kit para determinação da SDMA em uma amostra incluindo o dispositivo da invenção e um conjugado incluindo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador, em que a afinidade do anticorpo anti-SDMA a um reagente de captura é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA.

[00012] Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a um kit para determinação da SDMA em uma amostra incluindo uma matriz sólida incluindo o reagente de captura incluindo um derivado metilado de ar- ginina e um conjugado incluindo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador, em que a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao reagente de captura é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA.

[00013] Mais ainda, a invenção se refere a um método de redução ou eliminação da inclinação soro-plasma em um imunoensaio para di- metilarginina simétrica (SDMA) em uma amostra de soro ou amostra de plasma. O método inclui (a) formar uma mistura incluindo a amostra e um conjugado marcado incluindo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador; b) colocar a mistura em contato com uma matriz sólida incluindo a fase sólida incluindo um derivado da arginina como aqui descrito, em que a proteína é acoplada de forma não covalente à partícula, em que a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao derivado da ar- ginina é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA; (c) lavar a matriz sólida para remover o conjugado que não é ligado à matriz sólida; e (d) medir a quantidade do marcador associado à matriz sólida para determinar a presença ou a quantidade da SDMA na amostra.

[00014] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma fase sólida incluindo um análogo de um derivado metilado de arginina, tal como N-metilarginina (MMA) ou MMA acilada, acoplado de forma covalente à G6PDH que é acoplada de forma não covalente a uma partícula. A fase sólida pode incluir uma matriz porosa, que pode ser montada em um alojamento. Um anticorpo anti-SDMA pode ser ligado ao análogo, em que o anticorpo tem menos afinidade para ao análogo do que tem à SDMA. Por exemplo, a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao análogo é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA. O anticorpo anti-SDMA pode ser marcado.

[00015] Em outro aspecto, a invenção se refere a uma composição, incluindo um análogo de um derivado metilado de arginina, tal como N- metilarginina (MMA) ou MMA acilada, imobilizado em uma matriz sólida, em que o análogo é complexado com um anticorpo anti-SDMA. O anticorpo pode ter afinidade ao análogo imobilizado maior do que tem à SDMA em solução. Por exemplo, a afinidade do anticorpo anti- SDMA ao análogo imobilizado pode ser inferior a 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA em so-lução. O anticorpo anti-SDMA pode ser marcado. O análogo pode ser acoplado de forma covalente a uma proteína. A proteína pode ser uma ou mais dentre Albumina de Soro Bovino (BSA), ovalbumina, Hemoci- anina de Lapa Californiana (KLH) e Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH). A proteína pode ser acoplada de forma não covalente à matriz sólida, em que a proteína pode ser acoplada de forma não covalente a uma partícula, a qual é ligada de forma não difusa à matriz sólida.

[00016] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método de reduzir ou eliminar a tendência soro-plasma em um imunoensaio para um analito em amostra de soro ou de plasma. O método inclui (a) formar uma mistura incluindo a amostra e um conjugado marcado incluindo um anticorpo antianalito conjugado a um marcador; b) colocar a mistura em contato com um dispositivo incluindo matriz sólida incluindo uma partícula a ela ligada de forma não difusa, em que a partícula inclui um reagente de captura incluindo um análogo do analito acoplado de forma covalente a uma proteína que é acoplada a uma partícula, em que a afinidade do anticorpo antianalito ao reagente de captura do analito é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo ao analito; (c) lavar a matriz sólida para remover o conjugado não ligado; e (d) medir a quantidade do marcador associado à fase sólida para determinar a presença ou a quantidade do analito na amostra.

[00017] Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a uma composição incluindo um anticorpo anti-T4 e um anticorpo anti-SDMA. Pelo menos um dentre o anticorpo anti-T4 e o anticorpo anti-SDMA pode ser acoplado à biotina, estreptavidina, avidina ou um marcador detectável. Os anticorpos podem ser liofilizados. A composição pode ser parte de um kit incluindo um recipiente contendo a composição. O kit pode ainda incluir uma solução de lavagem e pode ainda incluir um substrato enzimá- tico.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00018] Os desenhos anexos, que são incluídos para proporcionar uma compreensão mais abrangente da invenção, são incorporados e fazem parte deste relatório descritivo, ilustram as modalidades da invenção e, em conjunto com a descrição detalhada, servem para explicar os princípios da invenção. Não há tentativa de mostrar detalhes estruturais da invenção em mais detalhes do que pode ser necessário para uma compreensão fundamental da invenção e das várias maneiras em que ela pode ser praticada.

[00019] As Figuras 1A e 1B mostram curvas de calibração da SDMA preparada de acordo com os métodos da invenção, usando partículas de látex passivamente revestidas com a proteína G6PDH- MMA como fase sólida e o conjugado Anti-SDMA HRP SPDP.

[00020] A Figura 2 mostra as curvas de calibração da SDMA preparada de acordo com os métodos da invenção, usando partículas revestidas com KLH-MMA como fase sólida e o conjugado Anti-SDMA HRP SPDP.

[00021] A Figura 3 mostra as curvas de calibração da SDMA prepa rada de acordo com os métodos da invenção, usando partículas quimicamente modificadas com MMA como fase sólida e o conjugado an- ti-SDMA HRP SPDP.

[00022] A Figura 4 mostra uma análise da amostra preparada de acordo com os métodos da invenção, usando o conjugado de partículas de G6PDH-MMA em fase sólida e SPDP líquido.

[00023] A Figura 5A mostra a correlação de ensaios de SDMA Catalyst DX®, de acordo com os métodos da invenção, com ensaios de LC-MS para 207 amostras de soro canino.

[00024] A Figura 5B mostra a correlação de ensaios de SDMA Catalyst DX®, de acordo com os métodos da invenção, com ensaios de LC-MS para 86 amostras de soro felino.

[00025] A Figura 6A mostra a correlação de ensaios de SDMA Catalyst DX®, de acordo com os métodos da invenção, com ensaios de EMIT® para 207 amostras de soro canino.

[00026] A Figura 6A mostra a correlação de ensaios de SDMA Catalyst DX®, de acordo com os métodos da invenção, com ensaios de EMIT para 86 amostras de soro felino.

[00027] A Figura 7A mostra os resultados de ensaios de SDMA Catalyst DX®, de acordo com os métodos da invenção, para amostras combinadas de soro e plasma caninos, com partículas amina-MMA ligadas de forma covalente ou partículas G6PDH-MMA revestidas de forma passiva.

[00028] A Figura 7B mostra os resultados de ensaios de SDMA Catalyst DX®, de acordo com os métodos da invenção, para amostras combinadas de soro e plasma felinos, com partículas amina-MMA ligadas de forma covalente ou partículas G6PDH-MMA revestidas de forma passiva.

[00029] A Figura 8 mostra os resultados de ensaios de SDMA Catalyst DX®, de acordo com os métodos da invenção, realizados em 20 amostras de soro e plasma pareadas com partículas G6PDH-MMA ou partículas Ovalbumina-MMA.

[00030] A Figura 9 mostra os resultados de ensaios de SDMA Catalyst DX®, de acordo com os métodos da invenção, realizados em 20 amostras de soro e plasma pareadas com partículas Ovalbumina- MMA.

[00031] A Figura 10 mostra os resultados de ensaios de acordo com a invenção, para avaliar a estabilidade de partículas revestidas de forma passiva (revestidas com G6PDH-MMA, G6PDH-MMA ou oval- bumina-MMA).

[00032] A Figura 11 mostra curvas de calibração de SDMA Catalyst DX® usando partículas passivamente revestidas com G6PDH-MMA, com e sem incubação prévia com NaCl a 1 M.

[00033] A Figura 12 mostra curvas de calibração de SDMA usando partículas revestidas de forma passiva com G6PDH-MMA após pré- incubação com ou sem o tensoativo Tween® 20.

[00034] A Figura 13 mostra um gráfico de calibração de SDMA usando o conjugado de proteína KLH-MMA (Exemplo 2) diretamente revestido sobre a membrana da lâmina.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[00035] Em vários aspectos, a invenção fornece dispositivos, reagentes, kits e métodos para detecção da dimetilarginina simétrica (SDMA) em amostras, como uma amostra biológica de um animal. O método inclui detectar a presença ou a quantidade de SDMA na amostra usando um formato de imunoensaio, tal como um imunoensaio competitivo. O ensaio inclui o uso de anticorpos para SDMA que são específicos para SDMA e que têm menos afinidade a outros derivados da arginina, incluindo dimetilarginina assimétrica (ADMA), L-arginina e N-metilarginina.

[00036] Antes de descrever a invenção em maiores detalhes, vários termos são definidos:

[00037] Ab é anticorpo.

[00038] A estrutura da arginina é:

[00039] L-arginina é o isômero L da arginina.

[00040] Os derivados da arginina incluem, mas não se limitam a, derivados metilados de arginina, arginina acilada e derivados, e com-postos com a estrutura a seguir:em que n é um número inteiro 0, 2 ou 3. Em algumas mo-dalidades, os derivados de arginina não incluem SDMA, ADMA e/ou N- MMA para fins de definição, a fim de fornecer uma classe de derivados de arginina que não inclui um ou mais dentre SDMA, ADMA e N-MMA.

[00041] ADMA é dimetil arginina assimétrica. A estrutura da ADMA é:

[00042] N-MMA é N-monometilarginina, ou simplesmente N-metil arginina, que também é aqui referido como simplesmente "MMA". A estrutura da N-monometilarginina é:

[00043] SDMA é dimetilarginina simétrica. A estrutura da SDMA é:

[00044] SDMA livre se refere a SDMA e sais de SDMA que não fazem parte de uma cadeia polipeptídica. Um ou mais resíduos de ami- noácidos da SDMA podem estar presentes em um polipeptídeo.

[00045] O termo "derivado metilado de arginina", conforme usado neste documento, se refere a compostos com a seguinte estrutura:em que n é um número inteiro 0, 1, 2 ou 3; e R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são, cada um independentemente, hidrogênio ou metila, desde que pelo menos um dentre R1, R2, R3, R4, R5 e R6 seja metila.

[00046] Exemplos de derivados metilados de arginina incluem MMA, SDMA e ADMA, embora alguns subconjuntos dos derivados metilados, para fins de definição, não incluam um ou mais desses compostos.

[00047] O termo "sal", conforme usado neste documento, significa um sal formado entre um grupo funcional ácido e um básico de um composto. Sais ilustrativos incluem, mas não se limitam, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, fosfato, lactato, tartarato, ascorbato, succinato, maleato, fumarato, gluconato, glucaro- nato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato e sais. O termo "sal" também se refere a um sal formado entre um composto com um grupo funcional ácido, como um grupo funcional ácido carboxílico e uma base orgânica ou inorgânica. Bases adequadas incluem, mas não se limitam a, hidróxidos de metais alcalinos, como sódio, potássio e lítio; hidróxidos de metais alcalino-terrosos, como cálcio e magnésio; hidróxidos de outros metais, como alumínio e zinco; amônia, e aminas orgânicas.

[00048] O termo "análogo", como aqui usado, se refere em geral a um composto em que um ou mais átomos individuais foram substituídos por um átomo(s) diferente(s) ou por um grupo(s) funcional(ais) di- ferente(s), que fornecem um meio para unir o analito a outra porção, tal como um marcador ou matriz sólida. Por exemplo, um meio de unir o analito a outro radical pode ser um ligante. Um análogo pode competir com o analito por um receptor. Em particular, o análogo do analito pode se ligar a um anticorpo de uma maneira similar ao analito. Como a ligação covalente do analito a uma matriz ou outra molécula é, muitas vezes, realizada através do uso de um análogo de analito, a descrição aqui de "o analito" simplesmente acoplado a ou conjugado a uma matriz ou outra molécula inclui o uso de um análogo de analito para realizar essa fixação ou conjugação covalente, como seria facilmente entendido por aquele com conhecimento na técnica de imuno- ensaios. Por exemplo, vários análogos da MMA são descritos nos Exemplos abaixo.

[00049] Um "derivado" do analito se refere a uma forma modificada do analito que pode competir com o analito por um receptor, a modificação sendo a adição ou a modificação de um grupo(s) funcional(ais) que não fornece um meio de unir um analito a outro radical, como um marcador ou matriz sólida. Duas moléculas podem ser derivadas uma da outra, de tal forma que cada molécula pode ser um analito ou um derivado do analito, conforme o caso. Por exemplo, arginina, SDMA, MMA e L-arginina são, todas, derivadas uma da outra, a diferença en- tre as moléculas sendo o isomerismo, ou a presença ou a posição de um ou dois grupos metila.

[00050] O termo "anticorpo", como aqui usado, em geral se refere a uma glicoproteína produzida por células de linfócitos B em resposta à exposição a um antígeno e se liga especificamente a esse antígeno. O termo "anticorpo" é usado em seu sentido mais amplo e abrange es-pecificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclo- nais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multies- pecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anti-corpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada.

[00051] O termo "fragmento de anticorpo", conforme usado neste documento, se refere a uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente o seu domínio de ligação ao antígeno ou variável. Especificamente, por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem incluir os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos li-neares; moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multi- específicos de fragmentos de anticorpos.

[00052] O termo "anticorpo monoclonal", como aqui usado, se refere em geral a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais incluídos na população são idênticos. Os anticorpos monoclo- nais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Em contraste a preparações de anticorpos policlonais, que geralmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra epítopos diferentes, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um epítopo único no antígeno. O modificador "monoclonal" se refere meramente ao caráter do anticorpo, e não deve ser interpretado como exigência da produção do anticorpo por qualquer método particular. Especificamente, por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por metodologias de hibridoma, ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante, ou podem ser isolados de bibliotecas de anti-corpos por Phage Display, usando técnicas conhecidas.

[00053] Como usado neste documento, um "anticorpo anti-SDMA", "parte de anticorpo anti-SDMA" ou "fragmento de anticorpo anti- SDMA" e/ou "variante de anticorpo anti-SDMA" e similares incluem qualquer proteína ou peptídeo contendo molécula que inclua pelo menos uma parte de uma molécula de imunoglobulina, tal como, mas não limitada a, uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região framework ou qualquer parte dela. Os anticorpos anti-SDMA, como usados neste documento, podem ser preparados de acordo com a Patente US N° 8.481.690, que é aqui incorporada em sua totalidade.

[00054] O termo "antígeno", como aqui usado, se refere em geral a uma substância que é capaz de, em condições adequadas, reagir com um anticorpo específico para o antígeno.

[00055] O termo "analito", como aqui usado, se refere em geral à substância ou conjunto de substâncias em uma amostra que são de-tectadas e/ou medidas. De acordo com aspectos exemplificativos da invenção, a SDMA ou um sal da SDMA são considerados exemplos de um analito.

[00056] O termo "amostra biológica", como aqui usado, se refere em geral a uma amostra de tecido ou fluido de um ser humano ou animal, incluindo, mas não limitado ao sangue total, plasma, soro, líquido espinhal, líquido linfático, líquido abdominal (ascite), seções externas da pele, tratos respiratório, intestinal e geniturinário, lágrimas, saliva, urina, células sanguíneas, tumores, órgãos, tecidos e amostras de constituintes da cultura de células in vitro Muitas dessas amostras requerem processamento antes da análise. Amostra inclui tanto amostras brutas quanto amostras processadas.

[00057] O termo "imunoensaio", como aqui usado, se refere em ge- ral a um teste que utiliza anticorpos e complexos de antígenos para gerar uma resposta mensurável. Um "complexo anticorpo:antígeno" pode ser usado de forma alternada com o termo "imunocomplexo". Imunoensaios, em geral, incluem imunoensaios não competitivos, imunoensaios competitivos, imunoensaios homogêneos e imunoensai- os heterogêneos. Em "imunoensaios competitivos", o analito não marcado (ou antígeno) na amostra de teste é medido por sua capacidade de competir com o antígeno marcado no imunoensaio. O antígeno não marcado bloqueia a capacidade de ligação do antígeno porque o sítio de ligação no anticorpo já está ocupado. Em "imunoensaios competitivos", a quantidade de antígeno presente na amostra de teste é inversamente relacionada à quantidade de sinal gerado a partir do marcador. Por outro lado, em "imunoensaios não competitivos", também conhecidos como imunoensaios "sanduíche", o analito é ligado entre dois reagentes de anticorpos altamente específicos para formar um complexo, e a quantidade de antígeno é diretamente proporcional à quantidade de sinal associado ao complexo. Os imunoensaios que requerem a separação de complexos anticorpo:antígeno ligados são geralmente referidos como "imunoensaios heterogêneos", e os imunoensai- os que não requerem a separação de complexos anticorpo:antígeno são geralmente referidos como "imunoensaios homogêneos". O versado na técnica entenderia facilmente os diferentes formatos de imuno- ensaio.

[00058] O termo "complexos imunes", como aqui usado, se refere em geral aos complexos formados pela ligação de moléculas de antí- geno e anticorpo, com ou sem ligação de complemento. Quando ou o antígeno ou o anticorpo é marcado, o marcador é associado ao complexo imune como resultado da ligação entre o antígeno e o anticorpo. Portanto, quando o anticorpo é marcado, o marcador se torna associado ao antígeno, como resultado da ligação. Da mesma forma, quando o antígeno é marcado (por exemplo, um análogo de analito com um marcador), o marcador se torna associado ao anticorpo, como resultado da ligação entre o antígeno e o anticorpo.

[00059] O termo "marcador", conforme usado neste documento, se refere a um composto detectável, que pode ser conjugado direta ou indiretamente (por exemplo, por meio covalente ou não covalente, so-zinho ou encapsulado) a um anticorpo ou análogos da invenção. O marcador pode ser detectável por si próprio (por exemplo, marcadores radioisótopos, corante quimioluminescentes, marcadores eletroquími- cos, quelatos de metal, partículas de látex ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que seja detectável (por exemplo, enzimas como peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, e similares). O marcador empregado na presente invenção pode ser, mas não se limita a: fosfatase alcalina; glicose- 6-fosfato desidrogenase ("G6PDH"); peroxidase de rábano silvestre (HRP); quimioluminescentes como o isoluminol, fluorescentes como a fluoresceína e compostos rodamina; ribozimas; e corantes. O marcador também pode ser uma molécula de ligação específica que pode ser detectável por si só (por exemplo, biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina, maltose, oligo-histidina, 2,4-dinitrobenzeno, fenilarsena- to, ssDNA, dsDNA e similares). O uso de um marcador produz um sinal que pode ser detectado por meios como a detecção de radiação eletromagnética ou visualização direta, e que pode ser opcionalmente medido.

[00060] O termo "polipeptídeo", como aqui usado, se refere em geral a uma molécula com uma sequência de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. Esse termo inclui proteínas, proteínas de fusão, oligopeptídeos, peptídeos cíclicos e derivados de polipeptídeos. Anti-corpos e derivados de anticorpos são discutidos acima em uma seção separada, mas os anticorpos e derivados anticorpos de são, para efeitos da invenção, tratados como uma subclasse dos polipeptídeos e derivados de polipeptídeos.

[00061] Os termos "suporte sólido", "fase sólida" e "matriz sólida", como aqui usados, se referem a uma matriz não aquosa à qual o parceiro de ligação da presente invenção pode aderir. Exemplos de suportes sólidos, fases sólidas e matrizes sólidas incluem suportes formados parcialmente ou inteiramente de vidro (por exemplo, vidro de poros controlados), polímeros naturais e sintéticos, polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcoois poliviníli- cos e silicones, tiras cromatográficas, placas de poliestireno de microti- tulação ou quaisquer outras substâncias que permitam aos parceiros de ligação ligados serem lavados ou separados de materiais não ligados. Em algumas modalidades, os suportes, fases e matrizes sólidos podem ser porosos. Em algumas modalidades, dependendo da aplicação, o suporte sólido, a fase sólida e a matriz sólida podem ser o poço de uma placa de ensaio. O suporte sólido, a fase sólida e a matriz sólida podem incluir uma lâmina de teste analítico, como descrito na Publicação de Patente US N° 2014/0315216, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[00062] O termo "partícula" ou "partículas" em ligação com a invenção incluem, por exemplo, partículas de látex, poliestireno ou de outros materiais de suporte, como sílica, agarose, cerâmica, vidro, poliacrila- midas, polimetacrilatos de metila, látex modificado com carboxilato, melamina e Sepharose. As partículas variam em tamanho de cerca de 0,1 mícron a cerca de 100 mícrons, por exemplo, cerca de 0,1; 0,5; 1,0; 5; 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90 ou 100 mícrons. Em particular, materiais úteis comercialmente disponíveis incluem látex modificado com carboxilato, esferas de Sepharose ativadas com brometo de cia- nogênio, partículas de sílica fundidas, vidro de isotiocianato, poliestire- no e microesferas monodispersas de carboxilato. As partículas podem ser magnéticas ou paramagnéticas.

[00063] Partículas adequadas para uso na presente invenção são capazes de fixação a outras substâncias, como derivados, moléculas ou proteínas ligantes. A capacidade das partículas de serem acopladas a outras substâncias pode resultar do material da partícula, bem como de quaisquer modificações ou grupos funcionais de superfície adicionados à partícula. As partículas podem ser funcionalizadas ou com a capacidade de serem funcionalizadas a fim de fixarem proteínas, moléculas de ligação ou derivados de forma covalente ou não covalente, como descrito neste documento. Grupos funcionais adequados incluem, por exemplo, amina, biotina, estreptavidina, avidina, proteína A, sulfidrila, hidroxila e carboxila.

[00064] "Receptor" se refere a qualquer composto ou composição capaz de reconhecer uma determinada organização espacial e polar de uma molécula, por exemplo, sítio epitópico ou determinante.

[00065] Receptores ilustrativos incluem anticorpos, fragmentos Fab e similares.

[00066] O termo "reatividade cruzada", como aqui usado, se refere em geral à capacidade de um sítio de ligação ao antígeno individual de um anticorpo de reagir com mais de um determinante antigênico ou à capacidade de uma população de moléculas de anticorpo de reagir com mais de um antígeno. Em geral, as reações cruzadas surgem porque (i) o antígeno de reação cruzada compartilha um epítopo em comum com o antígeno imunizante ou (ii) tem um epítopo que é estruturalmente semelhante àquele no antígeno imunizante (multiespecifici- dade).

[00067] "Especificidade de ligação" ou "ligação específica" se refere ao reconhecimento substancial de uma primeira molécula para uma segunda molécula, por exemplo, um polipeptídeo e um anticorpo mo noclonal ou policlonal, ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, um fragmento Fv, Fv de cadeia única, Fab' ou F(ab')2) específico para o polipeptídeo. Por exemplo, "especificidade", como aqui usado neste documento, se refere em geral à capacidade do sítio de combinação de um anticorpo individual de reagir com apenas um determinante an- tigênico ou à capacidade de uma população de moléculas de anticorpo de reagir com apenas um antígeno. Em geral, há um alto grau de es-pecificidade em reações antígeno-anticorpo. Os anticorpos podem dis-tinguir diferenças em (i) a estrutura primária de um antígeno, (ii) formas isoméricas de um antígeno, e (iii) a estrutura secundária e terciária de um antígeno. As reações anticorpo-antígeno que apresentam alta especificidade exibem baixa reatividade cruzada.

[00068] "Ligação substancial" ou "ligar substancialmente" se refere a uma quantidade de ligação específica ou reconhecimento entre as moléculas em uma mistura de ensaio sob determinadas condições de ensaio. Em seu aspecto mais amplo, a ligação substancial se refere à diferença entre a incapacidade de uma primeira molécula de se ligar ou reconhecer uma segunda molécula, e a capacidade das primeiras moléculas de se ligarem ou reconhecerem uma terceira molécula, de tal forma que a diferença seja suficiente para permitir que um ensaio significativo seja conduzido, distinguindo a ligação específica em um determinado conjunto de condições de ensaio, o que inclui as concentrações relativas das moléculas, e o tempo e a temperatura de incubação.

[00069] Em outro aspecto, uma molécula é substancialmente incapaz de se ligar ou reconhecer outra molécula no sentido de uma reati- vidade cruzada, em que a primeira molécula apresenta uma reativida- de a uma segunda molécula que é inferior a 25%, inferior a 10%, inferior a 5% ou inferior a 1% da reatividade apresentada em relação a uma terceira molécula sob um determinado conjunto de condições de ensaio. A ligação específica pode ser testada usando vários métodos amplamente conhecidos, por exemplo, um ensaio imuno-histoquímico, um ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), um radioimuno- ensaio (RIA) ou um ensaio de Western Blot.

[00070] A afinidade de um anticorpo a seu alvo pode ser influenciada pelo ambiente do anticorpo e/ou alvo. Por exemplo, quando um ou outro é ligado a uma fase sólida ou conjugado a outra molécula, a afinidade entre as moléculas pode ser diferente entre as duas moléculas em solução. Em algumas modalidades, os métodos da invenção aqui exploram as diferenças de afinidade de um anticorpo antianalito ao analito, quando o analito na solução versus a afinidade quando o anali- to é ligado a uma fase sólida. Além disso, em várias modalidades, os métodos da invenção exploram as diferenças de afinidade de um anticorpo para o analito, versus a afinidade de anticorpos para derivados do analito. Por exemplo, embora um anticorpo antianalito não possa ligar substancialmente um derivado do analito, o anticorpo pode ligar o derivado com reatividade suficiente, de forma que mesmo a baixa afinidade do anticorpo e derivado pode ser útil nos métodos da invenção. Por exemplo, a baixa afinidade de ligação (por exemplo, o anticorpo antianalito liga o derivado do analito com menos de 25% de reativida- de da ligação do anticorpo ao analito) pode ser útil quando o anticorpo e o analito estão em solução e o derivado é ligado a uma fase sólida.

[00071] Em relação aos vários aspectos da invenção, a invenção se refere a um método imunológico, dispositivos, reagentes e kits para detectar a presença de uma quantidade de SDMA livre em uma amostra biológica. O método pode incluir controles, calibradores ou padrões, incluindo um ou mais dentre SDMA ou análogos da SDMA. Em particular, o método pode ser realizado usando técnicas de imunoen- saio bem conhecidas para aqueles com conhecimento na técnica, incluindo, mas não limitadas ao uso de microplacas, matrizes porosas,fluxo através de matrizes de fase sólida e dispositivos de fluxo lateral. Animais dos quais amostras são obtidas para detecção de SDMA in-cluem seres humanos e animais não humanos (por exemplo, animais de companhia, animais de pecuária, etc.). A determinação dos estados de doença associados à presença ou à quantidade de SDMA pode ser realizada tanto para seres humanos quanto para não humanos.

[00072] Em um aspecto particular, um dispositivo exemplificativo da invenção inclui uma matriz sólida que tem uma partícula ligada a ela de forma não difusa, em que a partícula inclui um reagente de captura ligado a ela de forma covalente ou passiva (não covalente). O reagente de captura inclui o analito ou um derivado do analito acoplado de forma covalente a uma proteína que é acoplada a uma partícula. A matriz pode ser matriz porosa, que pode ser organizada em um cartucho ou alojamento para facilidade de manuseio e para uso em analisadores automatizados. Consulte a Publicação de Patente US N° 2014/0315216.

[00073] Quando o analito é a SDMA, o derivado inclui derivados de arginina, como dimetilarginina assimétrica (ADMA), L-arginina, N- metilarginina (MMA), ADMA acilada, L-arginina acilada, MMA acilada e compostos com a fórmula a seguir:em que n é um número inteiro 0, 1, 2 ou 3. A dimetilarginina assimétrica (ADMA), L-arginina, N-metilarginina (MMA), ADMA acilada, L-arginina acilada e MMA acilada podem ser ainda mais derivatizadas. Em um aspecto, os derivados de arginina têm uma afinidade a um an-ticorpo anti-SDMA ou um anticorpo anti-acil-SDMA quando os derivados são imobilizados em um suporte sólido. O derivado de arginina pode, ele mesmo, ser SDMA ou acil-SDMA. Ou, em algumas modali-dades, um ou mais dentre SDMA, ADMA, N-MMA e suas formas acila- das são especificamente excluídas do grupo de derivados de arginina.

[00074] Várias proteínas podem ser usadas para fixação do analito ou derivado do analito à fase sólida. Exemplos particulares incluem Albumina de Soro Bovino (BSA), ovalbumina, Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) e Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH).

[00075] Embora a G6PDH seja bem conhecida como um marcador enzimático, neste contexto, ela funciona para fixar o analito ou derivado à fase sólida. Ela não funciona como um marcador, a menos que o substrato adequado seja usado, o que pode ser evitado no método da invenção pelo uso de uma molécula diferente da G6PDH (tal como HRP) como um marcador no ensaio, como descrito em detalhes neste documento. A G6PDH pode ser derivada de um eucarioto, um procari- oto, uma levedura ou expressão recombinante.

[00076] Todas as enumerações de uma proteína à qual um derivado de analito ou análogo é ligado, como BSA, KLH, ovalbumina ou G6PDH, incluem também variantes, isoformas, fragmentos e mutantes da proteína. As variantes, isoformas, fragmentos e mutantes mantêm a capacidade de ligar ou de serem conjugadas ao analito, análogo ou derivado e/ou de se ligarem a um suporte sólido. Se a proteína for uma enzima, as variantes, isoformas, fragmentos ou mutantes da proteína podem ou não manter a atividade enzimática. Por exemplo, formas mutantes da G6PDH tendo várias substituições de aminoácidos são descritas na Patente US N° 6.455.288, que é incorporada por referência aqui em sua totalidade.

[00077] Quando a proteína não é acoplada de forma covalente à partícula, a fixação não covalente da proteína pode ser mais tolerante a tensoativos ou altas concentrações de sais do que a fixação não covalente da BSA, ovalbumina ou KLH à partícula. Por exemplo, a fixa- ção não covalente da G6PDH é mais tolerante a tensoativos e alta concentração de sal a partículas de poliestireno do que a fixação da BSA, ovalbumina ou KLH. A tolerância da fixação das proteínas às partículas sob várias condições de reação pode ser testada de acordo com métodos bem conhecidos para os especialistas na técnica. O formato do ensaio de fase sólida é uma técnica de ensaio de ligação comumente usada. Há um número de dispositivos e procedimentos de ensaio em que a presença de um analito é indicada pela ligação do analito a um conjugado e/ou um elemento de ligação complementar imobilizado. Em um aspecto particular, um elemento de ligação imobilizado (por exemplo, um derivado de arginina ou seu análogo) é ligado, ou fica ligado durante o ensaio, a uma fase sólida como um poço de reação, vareta medidora de nível, tira de teste, almofada de contenção de fluxo, papel, matriz de fibra ou outro material adequado de fase sólida. A reação de ligação entre a SDMA livre na amostra e um anticorpo anti-SDMA é determinada por combinação da amostra com uma quantidade do anticorpo que é conjugado a um marcador. Após colocar a mistura da amostra e do conjugado em contato com a fase sólida, a mistura e a fase sólida são incubadas para permitir a ligação entre o derivado de arginina imobilizado ou seu análogo e o anticorpo anti-SDMA. Após a incubação, reagentes não ligados são removidos da fase sólida. A quantidade do marcador que se torna associada à fase sólida através da ligação do anticorpo ao derivativo ou análogo é medida. A quantidade do marcador associado a fase sólida é inversamente proporcional à quantidade da SDMA livre na amostra.

[00078] A imobilização de um derivado de arginina ou seu análogo em um dispositivo ou suporte sólido é realizada de forma que o derivado ou análogo não seja lavado pela amostra, diluente e/ou procedimentos de lavagem.

[00079] Em outro aspecto, a invenção inclui um ou mais anticorpos marcados que podem ser misturados a uma amostra de teste antes da aplicação da mistura a um suporte sólido. Nesse caso, um derivado de arginina ou seu análogo pode ser acoplado ao suporte sólido, de modo que o análogo não seja lavado pela amostra, diluente e/ou procedimentos de lavagem. Os anticorpos marcados na amostra se ligam à SDMA na amostra e, portanto, não estão disponíveis para ligação aos análogos no suporte sólido. Após aplicação da mistura ao suporte sólido, e uma incubação apropriada, a mistura é lavada do suporte sólido. Os anticorpos que não se ligaram à SDMA da amostra se tornarão ligados ao derivado de arginina ou seu análogo no suporte sólido. A presença ou a quantidade da SDMA na amostra é inversamente proporcional à quantidade de anticorpos que se ligou ao análogo da SDMA. O sinal associado ao marcador no anticorpo pode ser medido pelo método apropriado. Um analisador exemplificativo para uso na medição do marcador é o sistema CATALYST DX® (IDEXX Laboratories, Inc.), que pode ser combinado com uma fase sólida de camada única em um cartucho ou alojamento que é montado no analisador, conforme descrito na Publicação de Patente US N° 2014/0315216.

[00080] Mais particularmente, um exemplo do método da invenção inclui a formação de uma mistura incluindo a amostra e um conjugado marcado incluindo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador. Os anticorpos anti-SDMA e a conjugação de marcadores aos anticorpos são descritos, por exemplo, a Patente US N° 8.481.690. A mistura é colocada em contato com um dispositivo da invenção que inclui uma matriz sólida que tem uma partícula ligada a ela de forma não difusa, em que a partícula inclui um reagente de captura ligado a ela de forma covalente ou passiva (não covalente). Como descrito no presente documento, o reagente de captura inclui SDMA ou seu derivado (por exemplo, derivados de arginina) acoplado de forma covalente a uma proteína que é acoplada a uma partícula. O suporte sólido é lavado para remover o conjugado que não está ligado ao suporte sólido. A quantidade do marcador associado ao suporte sólido é medida para determinar a presença ou a quantidade de SDMA na amostra.

[00081] Como descrito no presente documento, a própria SDMA pode ser ligada à fase sólida através da conjugação a uma proteína e da fixação da proteína à partícula. Exemplos de conjugados de SDMA a proteínas são mostrados na Publicação de Patente US N° 2016/0245801 US, que é incorporada aqui em sua totalidade. Em outras modalidades, os derivados de SDMA (por exemplo, derivados de arginina, derivados metilados de arginina) podem ser usados em vez da SDMA, em que o anticorpo anti-SDMA tem menos afinidade ao derivado do que a afinidade à SDMA. Em exemplos particulares, a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao derivado é inferior a cerca de 25%, inferior a cerca de 10%, inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 1%, inferior a cerca de 0,1%, inferior a cerca de 0,01% ou inferior a cerca de 0,001% da afinidade do anticorpo à SDMA.

[00082] O material de matriz inclui tapetes fibrosos compostos de fibras sintéticas ou naturais (por exemplo, materiais à base de vidro ou celulose ou polímeros termoplásticos, como polietileno, polipropileno ou poliéster); estruturas sinterizadas compostas de materiais particula- dos (por exemplo, vidro ou vários polímeros termoplásticos); ou filmes de membrana fundidos compostos de nitrocelulose, náilon, polissulfo- na ou similares (geralmente de natureza sintética). A matriz também pode ser composta de partículas finas sinterizadas de polietileno, co- mumente conhecido como polietileno poroso, como esferas de polieti- leno sinterizado. Esse material pode ter uma densidade entre 0,35 e 0,55 gramas por centímetro cúbico, um tamanho de poros entre 5 e 40 mícrons e um volume morto entre 40 e 60 por cento. Também pode ser usado polietileno particulado composto de polietileno reticulado ou de peso molecular ultra-alto. Uma matriz exemplificativa inclui polieti- leno com poros de 10 a 15 mícrons da Chromex Corporation FN#38- 244-1 (Brooklyn, N.Y.) e a matriz FUSION 5™ disponível por Whatman, Inc., EUA.

[00083] O uso de tiras de teste impregnadas de reagente em ensaios de ligação específicos também é bem conhecido. Nesses procedimentos, uma amostra de teste é aplicada a uma parte da tira de teste e é deixada migrar ou atravessar o material da tira. Assim, o analito a ser detectado ou medido passa através ou ao longo do material, possivelmente com a ajuda de um solvente de eluição, que pode ser a própria amostra de teste ou uma solução adicionada separadamente. O analito migra para dentro de uma zona de detecção ou de captura na tira de teste, em que é imobilizado o análogo do analito ou outro composto capaz de ligar um anticorpo antianalito. A medida na qual o anticorpo se liga na zona de detecção pode ser determinada com o auxílio de um marcador conjugado ao anticorpo, em que o conjugado é misturado com a amostra. Em uma modalidade, um análogo que é capaz de ligar o anticorpo é imobilizado sobre um suporte sólido em uma posição distinta. Após adição da mistura amostra-conjugado, a detecção de complexos SDMA-anticorpo no suporte sólido pode ser por qualquer meio conhecido na arte. Por exemplo, a Patente US N° 5.726.010, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, descreve um exemplo de um dispositivo de fluxo lateral, o dispositivo de imunoensaio SNAP® (IDEXX Laboratories) útil na presente invenção.

[00084] Outras tecnologias de detecção empregam partículas ou mi- croesferas magnéticas independentes das partículas usadas para o re-agente de captura, tal como descrito neste documento. Por exemplo, as esferas de polímero impregnadas com óxido de ferro superparamagné- tico podem ser associadas, por exemplo, ao analito ou ao derivado para o analito pelo uso da partícula como parte do reagente de captura. As esferas usadas para a fase sólida podem ser isoladas ou separadas da solução magneticamente. Uma vez que o isolamento tenha ocorrido, outros testes podem ser realizados, inclusive a observação dos marca-dores, seja diretamente opticamente ou por meio de uma câmera.

[00085] Em outro aspecto, a invenção se refere a reagentes de captura que usam derivados de arginina e seus análogos para uso nos métodos para determinação da SDMA, de acordo a presente invenção. Em particular, a invenção se refere a análogos de derivados da argini- na contendo tiol, contendo hidroxila, contendo amino e contendo car- boxilato, em que o grupo tiol, o grupo hidroxila, o grupo amino ou o grupo carboxilato permite que o derivado seja ligado a outra molécula (alvo da conjugação), como uma proteína, para formar um conjugado. Os análogos da invenção permitem que os derivados sejam ligados a um alvo de conjugação, como uma proteína, polipeptídeo, marcador detectável, suporte sólido e similares.

[00086] Um aspecto da invenção se refere a um reagente de captura incluindo um análogo de um derivado da arginina, incluindo um derivado metilado da arginina, por exemplo, N-metilarginina (MMA) ou MMA acilada, acoplado a uma partícula. Em uma modalidade, o análogo é ligado à partícula através de um ligante, de forma que o análogo é acoplado de forma covalente a uma proteína que é acoplada a uma partícula. A proteína pode ser acoplada à partícula de forma covalente ou não covalente (passiva). A proteína pode ser pelo menos uma dentre Albumina de Soro Bovino (BSA), ovalbumina, Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) e Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH). A fixação do análogo à partícula, seja de forma passiva ou covalente, e o uso da partícula para ancorar o análogo à fase sólida resultam em maior intervalo linear do ensaio, em comparação ao uso de uma fase sólida com o análogo diretamente acoplado a ela. Essa modalidade também resulta na redução ou eliminação da tendência de amostragem, como descrito e exemplificado neste documento.

[00087] Em um exemplo do reagente de captura da invenção, o li- gante inclui a seguinte estrutura:

[00088] Quando a MMA é acoplada a uma partícula com esse ligan- te, o reagente de captura tem a seguinte estrutura:

[00089] Além disso, os seguintes análogos da MMA podem ter as estruturas a seguir, para fornecer ligação e fixação a proteínas para uso, por exemplo, em reagentes de captura: em que x e y são números inteiros no intervalo de 1 a 5.

[00090] De acordo com uma modalidade, os análogos da MMA da invenção têm a seguinte fórmula geral:em que R1 pode ser um tiol (ou tiol protegido), hidroxila (ou hidroxila protegida), um amino (ou amino protegido) ou um grupo car- boxilato (incluindo ácido carboxílico) ou grupo carboxilato protegido.

[00091] Grupos de proteção tiol, hidroxila, amino e carboxilato adequados são conhecidos para os versados na técnica, assim como aqueles descritos, por exemplo, em T.W. Greene, et al. Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed. (1999).

[00092] Em uma determinada modalidade, a invenção se refere a um análogo da MMA da fórmula (1):ou um seu sal. O composto da fórmula (1) fornece um tiol disponível que pode reagir com um alvo da conjugação que inclui um "sítio reativo a tiol", ou seja, um sítio que vai reagir com um grupo tiol. Por exemplo, maleimidas, halogenetos de alquila e arila, e alfa- haloacilas são sítios reativos a tiol ilustrativos, que podem reagir com tióis para formar tio-éteres. Da mesma forma, dissulfetos de piridila podem reagir com tióis para formar dissulfetos mistos.

[00093] Em outras modalidades, R1 é X-R2, em que X é -S-, -0-, -Nou -COO-, e R2 é um marcador com um grupo reativo tiol, hidroxila, amino ou carboxilato.

[00094] Em uma modalidade, R1 é X-R2, em que X é -S-, -0-, -N-, ou -COO- e R2 é uma proteína que foi funcionalizada para incluir um grupo tiol, hidroxila, amino ou carboxilato.

[00095] Em uma modalidade, o análogo da MMA é conjugado a uma proteína ativada com maleimida, tal como, por exemplo, proteína de lapa californiana ativada com maleimida (KLH) ou albumina de soro bovino (BSA) ativada com maleimida.

[00096] Em uma modalidade, o composto da fórmula (1) é conjugado a uma proteína ativada com maleimida, tal como, por exemplo, proteína de lapa californiana (KLH) ativada com maleimida ou albumina de soro bovino (BSA) ativada com maleimida.

[00097] Assim, em uma determinada modalidade, a invenção se refere a um conjugado de um composto da fórmula (1) e a proteína ativada com maleimida tendo a fórmula:

[00098] Normalmente, m é maior que 5. No entanto, o valor de m é variável. Por exemplo, m é de cerca de 15 grupos maleimida por proteína na BSA ativada com maleimida comercialmente disponível por Sigma-Aldrich de St Louis, MO; m é de cerca de 80 grupos maleimida por proteína na KLH ativada com maleimida comercialmente disponível da Sigma-Aldrich; m está em um intervalo de cerca de 15 a cerca de 25 grupos maleimida por proteína na BSA ativada com maleimida comercialmente disponível por Thermo Scientific Pierce Protein Rese-arch Products de Rockford, IL; m é maior que cerca de 400 grupos ma- leimida por proteína na KLH ativada com maleimida comercialmente disponível por Thermo Scientific Pierce Protein Research Products; e m está em um intervalo de cerca de 150 a cerca de 300 grupos malei- mida por proteína na KLH ativada com maleimida comercialmente disponível por A. G. Scientific de San Diego, CA. Em geral, m é limitado pelo número de grupos amina presentes em uma proteína imunogêni- ca. O número de aminas disponíveis pode ser aumentado por conjugação das proteínas imunogênicas a poliaminas.

[00099] Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m é maior que cerca de 5. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m é maior que cerca de 10. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m é maior que cerca de 25. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m é maior que cerca de 50. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m é maior que cerca de 75. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m está em um intervalo de cerca de 5 a cerca de 80. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m é maior que cerca de 75. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m está em um intervalo de cerca de 10 a cerca de 80. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m é maior que cerca de 75. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m está em um intervalo de cerca de 20 a cerca de 80. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m é maior que cerca de 75. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é BSA e m está em um intervalo de cerca de 30 a cerca de 80.

[000100] Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 5. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 50. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 100. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 200. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 300. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 400. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 500. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 600. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 700. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m é maior que cerca de 800. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m está em um intervalo de cerca de 5 a cerca de 800. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m está em um intervalo de cerca de 5 a cerca de 600. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m está em um intervalo de cerca de 5 a cerca de 400. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m está em um intervalo de cerca de 5 a cerca de 200. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m está em um intervalo de cerca de 5 a cerca de 100. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m está em um intervalo de cerca de 100 a cerca de 200. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m varia em um intervalo de cerca de 100 a cerca de 300. Em uma modalidade, a PROTEÍNA é KLH e m está em um intervalo de cerca de 100 a cerca de 400. Em vários aspectos, a proteína é KLH e m está em um intervalo de cerca de 100 a cerca de 500, de cerca de 100 a cerca de 600, de cerca de 100 a cerca de 700, de cerca de 100 a cerca de 800 ou de cerca de 100 a cerca de 1.000.

[000101] O conjugado de um composto da fórmula (1) e proteína ativada com maleimida pode ser caracterizado usando métodos bem conhecidos para aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Sigma- Aldrich Technical Bulletin for Maleimide Activated BSA, KLH Conjugation Kit (catálogo N° MBK1)).

[000102] Em uma modalidade alternativa, o análogo da MMA é ligado diretamente a um suporte sólido através do grupo tiol, hidroxila, amino ou carboxilato.

[000103] O marcador pode ser detectável por si próprio (por exemplo, marcadores radioisótopos, corante quimioluminescentes, marcadores eletroquímicos, quelatos de metal, partículas de látex ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que seja detectável (por exemplo, enzimas como peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina e similares). O marcador pode ser uma molécula de ligação específica que pode ser detectável por si só (por exemplo, biotina, avidina, estreptavidina, digoxigenina, maltose, oligo-histidina, 2, 4-dinitrobenzeno, fenilarsenato, ssDNA, dsDNA, etc.). A MMA pode ser ligada a um marcador detectável usando métodos bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Como um exemplo ilustrativo, o análogo da MMA pode ser ligado à peroxidase ativada com maleimida, a partir de pó liofilizado com rábano silvestre (disponível comercialmente por Sigma-Aldrich St. Louis, MO (catálogo n° PI 709), seguindo as instruções no manual do produto).

[000104] O análogo da fórmula (1) pode ser preparado a partir da MMA (disponível comercialmente por EMD Chemicals Inc. de Gibbstown, NJ), de acordo com o procedimento a seguir. Os grupos amino primário e secundário da MMA são protegidos por reação da MMA com di-fe/7-butildicarbonato (Boc20). A MMA protegida com terc- butoxicarbonila (BOC) resultante ((Boc3)-MMA) é, então, ligada a uma resina. Por exemplo, a (Boc3)-MMA pode ser ligada a uma resina cis- teamina-4-metóxi tritila (disponível comercialmente por EMD Chemicals, Inc. de Greenville, NJ), colocando a (Boc3)-MMA em contato com a resina na presença de metanaminínio hexafluorofosfato de 2-(1H-7- azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil urânio (HATU) e N,N-di- isopropiletilamina (DIPEA) em dimetil formamida (DMF) para fornecer (Boc3)-MMA cisteamida ligada à resina. Os grupos de proteção BOC na (Boc3)-MMA cisteamida ligada à resina são removidos e a MMA cistamida ligada à resina resultante é clivada a partir da resina, usando, por exemplo, ácido trifluoroacético em diclorometano, para fornecer MMA cisteamida, que foi convertida no sal de cloridrato por reação com ácido clorídrico.

[000105] Os análogos da fórmula A-D, descritos acima, podem ser produzidos usando metodologias similares.

[000106] Com o uso de conjugados da MMA ou conjugados de outros derivados metilados de arginina, como descrito no presente documento, componentes de fase sólida podem ser construídos. Por exemplo, as fases sólidas podem incluir um análogo da MMA ou MMA acilada acoplado de forma covalente à G6PDH que é acoplada de forma não covalente a uma partícula que é ligada de forma não difusa a uma fase sólida, como, por exemplo, uma matriz porosa. Como descrito no presente documento, a fase sólida pode ser montada em um alojamento ou suporte para facilitar seu uso em analisadores automatizados ou em dispositivos de fluxo lateral.

[000107] Em um aspecto, a fase sólida, incluindo as partículas ligadas de forma não difusiva, pode ser preparada por marcação com um diluente de marcação de partículas contendo as partículas na fase sólida. Por exemplo, o diluente de marcação de partículas pode incluir vários tampões, tensoativos e/ou outros compostos (por exemplo, açúcares) que facilitam a aderência das partículas à fase sólida. O volume do diluente aplicado à fase sólida e a concentração das partículas no diluente terá impacto sobre o número de partículas que serão ligadas à fase sólida depois que o diluente tiver sido aplicado. Em várias moda-lidades, o diluente tem uma concentração de partículas de cerca de 0,001% e 1,0%, por exemplo, 0,001%; 0,005%; 0,01%; 0,05%; 0,1%;0,5% e 1,0%, incluindo todo o valor entre 0,001% e 1,0%, como se fossem exaustivamente aqui enumerados.

[000108] Em uso, fase sólida também inclui um anticorpo anti-SDMA ligado ao análogo, em que o anticorpo tem menos afinidade ao analógico do que tem ao SDMA. Por exemplo, a afinidade do anticorpo anti- SDMA ao análogo pode ser inferior a cerca de 25%, inferior a cerca de 10%, inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 1%, inferior a cerca de 0,1%, inferior a cerca de 0,01% ou inferior a cerca de 0,001% da afinidade do anticorpo à SDMA. Em modalidades, o anticorpo SDMA é marcado.

[000109] Da mesma forma, a invenção é dirigida a uma composição, incluindo um análogo da N-metilarginina (MMA), MMA acilada, ADMA, ADMA acilada ou outro derivado metilado de arginina, onde o análogo é complexado com um anticorpo anti-SDMA. Em várias modalidades, o anticorpo tem menos afinidade ao análogo imobilizado do que tem à SDMA em solução. Por exemplo, a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao análogo imobilizado é inferior a cerca de 25% da afinidade do anticorpo à SDMA em solução. Em modalidades, o anticorpo SDMA é marcado. O análogo pode ser acoplado de forma covalente a uma proteína, como a Albumina de Soro Bovino (BSA), ovalbumina, Hemocia- nina Lapa Californiana (KLH) e Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH), e a proteína pode ser acoplada de forma não covalente a um suporte sólido. Em uma modalidade, a proteína é acoplada de forma não covalente a uma partícula, que é ligada de forma não difusa ao suporte sólido. Em outra modalidade, a proteína é acoplada de forma covalente à partícula através do uso, por exemplo, de técnicas bem conhecidas para os versados na arte.

[000110] Os anticorpos anti-SDMA podem ser ligados a um rótulo para fornecer anticorpos anti-SDMA detectáveis para uso em ensaios de ligação ao receptor, como imunoensaios para SDMA. Os anticorpos anti-SDMA podem ser ligados a um marcador usando métodos bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Por exemplo, Immuno-chemical Protocols; Methods in Molecular Biology, Vol. 295, editado por R. Burns (2005)). Os anticorpos anti-SDMA detectáveis podem ser usados em diversos formatos de ensaio, como homogêneo, em sandu-íche, competitivo ou não competitivo, para gerar um sinal que é relaci-onado à presença ou à quantidade de uma SDMA em uma amostra de teste. Em uma modalidade, os métodos da invenção usam a capacidade dos anticorpos anti-SDMA de se ligarem especificamente à SDMA livre (ou seja, SDMA que não é parte de uma cadeia de poli- peptídeos), ao mesmo tempo também reagindo de forma cruzada com derivados da SDMA, como ADMA, L-arginina e/ou N-metilarginina. Nas diversas modalidades dos métodos da invenção, a afinidade do anticorpo anti-SDMA aos derivados é inferior a cerca de 25%, inferior a cerca de 10%, inferior a cerca de 5%, inferior a cerca de 1%, inferior a cerca de 0,1%, inferior a cerca de 0,01% ou inferior a cerca de 0,001% da afinidade do anticorpo à SDMA.

[000111] A invenção fornece ainda kits de diagnóstico contendo o dispositivo e reagentes para uso na detecção da SDMA, conforme descrito neste documento. Normalmente, esse kit contém pelo menos um derivado de arginina diferente da SDMA, como um derivado da SDMA, associado a uma fase sólida e um reagente que se liga substancialmente à SDMA, tal como um anticorpo anti-SDMA. Os kits normalmente também incluem orientações ou instruções descrevendo como realizar os ensaios de diagnóstico acima descritos, e/ou como interpretar os resultados assim obtidos. Nesse sentido, em várias modalidades, a invenção se refere a um kit para determinação da SDMA em uma amostra. O kit inclui o dispositivo como descrito no presente documento, que inclui uma fase sólida tendo nela imobilizado um reagente de captura e inclui também um conjugado incluindo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador, em que a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao reagente de captura é inferior a 25% da afinidade do anticorpo à SDMA. Em uma modalidade, o kit inclui um suporte sólido com o reagente de captura incluindo um análogo da MMA ou MMA acilada, e um conjugado de um anticorpo anti- SDMA conjugado a um marcador, em que a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao reagente de captura é inferior a 25% da afinidade do anticorpo à SDMA.

[000112] Em um exemplo específico, esse kit incluiria um dispositivo completo com reagentes de ligação específicos (por exemplo, um rea-gente de ligação específico marcado e não imobilizado e um reagente de captura de analito imobilizado) e um reagente de lavagem, bem como um reagente detector e reagentes de controle positivo e negativo, se desejado ou apropriado. Além disso, outros aditivos podem ser incluídos, como estabilizantes, tampões e similares. As quantidades relativas dos diferentes reagentes podem ser variadas, para fornecer concentrações na solução dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos como pós secos, geralmente liofilizados, que, em dissolução, irão fornecer uma solução de reagente tendo as concentrações adequadas para combinação com uma amostra.

[000113] O dispositivo também pode incluir um reagente líquido que transporta material não ligado (por exemplo, amostra de fluido não re-agido e reagentes de ligação específicos não ligados) para longe da zona de reação (fase sólida). Um reagente líquido pode ser um reagente de lavagem e serve apenas para remover material não ligado da zona de reação, ou ele pode incluir um reagente detector e serve tanto para remover material não ligado quanto para facilitar a detecção de analito. Por exemplo, no caso de um reagente de ligação específico conjugado a uma enzima, o reagente detector inclui um substrato que produz um sinal detectável mediante a reação com o conjugado enzima-anticorpo na zona reativa. No caso de um reagente de ligação específico marcado conjugado a uma molécula radioativa, fluorescente ou de absorção de luz, o reagente detector atua apenas como uma solução de lavagem que facilita a detecção da formação de complexo na zona reativa, removendo por lavagem o reagente marcado não ligado.

[000114] Dois ou mais reagentes líquidos podem estar presentes em um dispositivo, por exemplo, um dispositivo pode incluir um reagente líquido que age como um reagente de lavagem e um reagente líquido que age como um reagente detector e facilita a detecção do analito.

[000115] Os kits e dispositivos da invenção podem ser usados no método para reduzir a tendência de ensaio entre amostras de soro e de plasma. Como descrito nos exemplos abaixo, o uso de uma proteína para prender análogos do analito ou derivados do analito a uma partícula que é, então, imobilizada em uma fase sólida reduz a tendência entre as amostras quando comparadas a análogos que são ligados diretamente a uma fase sólida (por exemplo, através de um li- gante). Assim, em uma modalidade, a invenção se refere a um método de reduzir ou eliminar a tendência soro-plasma em um imunoensaio para um analito em amostra de soro ou de plasma. O método inclui formar uma mistura da amostra e um conjugado marcado de um anticorpo antianalito conjugado a um marcador. A mistura é colocada em contato com um dispositivo incluindo um suporte sólido, tendo uma partícula a ele ligada de forma não difusiva, em que a partícula inclui um reagente de captura incluindo um análogo de um analito ou um derivado do analito acoplado de forma covalente a uma proteína que é acoplada à partícula. A afinidade do anticorpo anti-analito ao reagente de captura de analito é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo ao analito. O método inclui ainda lavar a fase sólida para remover o conjugado não ligado e medir a quantidade do marcador associado à fase sólida para determinar a presença ou a quantidade do analito na amostra.

[000116] Em um exemplo particular, a invenção inclui um método de reduzir ou eliminar a tendência soro-plasma em um imunoensaio para dimetilarginina simétrica (SDMA) em uma amostra de soro ou amostra plasma. O método inclui formar uma mistura incluindo a amostra e um conjugado marcado incluindo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador. A mistura é colocada em contato com um suporte sólido, incluindo a fase sólida que tem um análogo acoplado a uma proteína, em que a proteína é acoplada de forma não covalente à partícula que é ligada de forma não difusiva à fase sólida. Como descrito aqui em mais detalhes, a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao derivado de ar- ginina é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA. O método inclui lavar o suporte sólido para remover o conjugado que não está ligado ao suporte sólido e medir a quantidade do marcador associada à fase sólida para determinar a presença ou a quantidade da SDMA na amostra.

[000117] Como foi descrito anteriormente, a detecção da SDMA livre em uma amostra biológica de um animal pode fornecer uma indicação da função renal nos animais. Além disso, um animal pode sofrer tanto de hipertireoidismo quanto de doença renal. O hipertireoidismo pode levar a uma perda de massa muscular. A creatinina é um marcador insuficiente da doença renal em pacientes com hipertireoidismo porque a massa muscular diminuída leva a valores de creatinina mais baixos. A creatinina também é reduzida pela hiperfiltração associada ao aumento do estado metabólico no hipertireoidismo (veja Jepson R. Hiper- tireoidismo felino e doença renal crônica. Em: Procedimentos do Con- gresso BSAVA; 9-12 de abril de 2015; Birmingham, UK). Por conse-guinte, o hipertireoidismo pode mascarar a presença de doença renal quando os níveis de creatinina são usados para monitorar a função renal (Williams T. Chronic kidney disease in cats with hyperthyroidism. Clin Brief. Setembro de 2015: 10-12). A SDMA é um marcador superior para a detecção da doença renal em pacientes com hipertireoidismo porque os valores da SDMA não são afetados pela massa muscular. Por essas razões, para fins de diagnóstico, é vantajoso combinar um ensaio para um marcador da tireoide - tal como a tiroxina (T4) - com um ensaio para SDMA. Como usado neste documento, um ensaio para T4 pode incluir um ensaio para T4 livre, T4 ligada ou T4 total. Em algumas configurações de ensaio, é vantajoso combinar os reagentes necessários para T4 e ensaios para SDMA em um único recipiente. Combinar os reagentes desta forma reduz a complexidade, os custos e simplifica os fluxos de trabalho dos ensaios.

[000118] Assim, em uma modalidade, a invenção se refere a um método de determinação da combinação da SDMA em uma amostra biológica de um paciente. O método inclui colocar a amostra em contato com um anticorpo anti-T4 e um anticorpo anti-SDMA e determinar a ligação entre a T4 e o anticorpo anti-T4 e determinar a ligação entre a SDMA e o anticorpo anti-SDMA. Em algumas modalidades, ou o anticorpo anti-T4 ou o anticorpo anti-SDMA, ou ambos, são acoplados a um marcador detectável. Para facilitar o método, um aspecto da invenção inclui uma composição de reagentes, incluindo tanto o anticorpo anti-T4 quanto o anti-SDMA. A invenção também se refere a um kit incluindo um recipiente contendo a composição de reagentes, quer para armazenamento ou para fins de realização dos ensaios em combinação para T4 e SDMA. Em outra modalidade, a composição de reagentes e seus componentes podem ser liofilizados, os quais podem estar no recipiente. O kit pode ainda incluir um recipiente contendo uma solução de lavagem adequada tanto para um ensaio para T4 quanto um ensaio para SDMA. O kit também pode incluir um substrato para um marcador enzimático, em que o marcador pode ser acoplado aos anticorpos ou ele pode ser conjugado a um análogo da SDMA ou T4 que é adequado para um ensaio para T4 e um ensaio para SDMA, dependendo do formato do ensaio.

[000119] Sem maior elaboração, acredita-se que um versado na técnica usando a descrição anterior possa utilizar a invenção em toda sua extensão. Outras características e vantagens da invenção serão evi-dentes a partir dos Exemplos a seguir. O conteúdo a seguir é fornecido para fins de exemplificação apenas e não há a intenção de limitar o escopo da invenção descrita acima em termos gerais. Todas as refe-rências citadas neste documento são aqui incorporadas por referência. EXEMPLOS

Exemplo 1: PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE MMA, ADMA E SDMA COM G6PDH

[000120] Os conjugados de MMA, ADMA ou SDMA e G6PDH foram preparados por conjugação da MMA-SH, ADMA-SH ou SDMA-SH com G6PDH ativada por iodoacetato de succinimidila (SIA). O reticulador SIA contém um éster de N-hidroxissuccimida (NHS) reativo à amina e um grupo iodoacetila reativo à sulfidrila. Os ésteres de NHS reagem com grupos amino (-NH2) presentes nos resíduos lisina (K) da cadeia lateral e no terminal N da glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Após purificação por diálise, os grupos iodoacetila reagem com os grupos sulfidrila da MMA (MMA-SH), ADMA (ADMA-SH) ou SDMA (SDMA-SH) ativada, resultando em um tioéter estável ligado ao conjugado G6PDH-MMA ou G6PDH-SDMA. Mais detalhes dos procedimentos de conjugação são mostrados abaixo.

SÍNTESE DO CONJUGADO G6PDH-MMA

[000121] O conjugado G6PDH-MMA tem a seguinte estrutura:

[000122] O conjugado foi preparado de acordo com o procedimento a seguir. Primeiro, 108 mg de G6PDH em pó foram dissolvidos em 33 ml de tampão MES (50 mM a pH 6,5) e incubados por 10 min a 25°C para preparar 2,11 mg/ml de solução estoque de G6PDH (medida pelo kit BCA). 28,4 ml da solução estoque de G6PDH foram adicionados a 9,1 ml de tampão MES (50 mM a pH 6,5) para formar uma solução de reação de G6PDH. 50 mg da SIA foram dissolvidos em 1 ml de DMSO para preparar uma solução estoque de SIA a uma concentração de 50 mg/ml. Uma quantidade de 84,9 μl da solução estoque de SIA (50 mg/ml em DMSO) foi adicionada à solução de reação de G6PDH mencionada acima (37,5 ml) e foi misturada rapidamente e girada de ponta a ponta por 2,0 horas a 25°C. A mistura reacional foi dialisada contra PBS (4L) duas vezes a 4°C e contra o tampão MES (50 mM a pH 8,0) uma vez a 4°C. EDTA (0,5 M a pH 8,0) foi, então, adicionado à mistura reacional a uma concentração final de EDTA de 5 mM.

[000123] 25 mg do composto MMA-SH.2HC1 foram dissolvidos em 8,4 ml de solução de EDTA a 5 mM e bem misturados. 5,76 ml da so-lução de MMA-SH foram, então, adicionados à solução acima de G6PDH ativada com SIA e girados ponta a ponta a 4°C por 24 horas. O conjugado G6PDH-MMA foi, então, dialisado a 4°C três vezes contra PBS e uma vez contra o tampão MES (50 mM a pH 5,0). A concentração do conjugado G6PDH-MMA foi medida por um kit BCA e, em seguida, armazenada a -80°C para uso posterior.

SÍNTESE DO CONJUGADO G6PDH-ADMA

[000124] O conjugado G6PDH-ADMA tem a seguinte estrutura:

[000125] O conjugado foi preparado de acordo com o procedimento a seguir. Primeiro, 32,3 mg de G6PDH em pó foram dissolvidos em 10 ml de tampão MES (50 mM a pH 6,5) e incubados por 10 min a 25°C para preparar 2,2 mg/ml de solução estoque de G6PDH (medida pelo kit BCA). 50 mg da SIA foram dissolvidos em 1 ml de DMSO para preparar uma solução estoque de SIA a uma concentração de 50 mg/ml. Uma quantidade de 18,1 μl da solução estoque de SIA (50 mg/ml em DMSO) foi adicionada à solução estoque de G6PDH (8 mg) acima mencionada e foi misturada rapidamente e girada de ponta a ponta por 2,0 horas a 25°C. A mistura reacional foi dialisada contra PBS (4L) duas vezes a 4°C e contra o tampão MES (50 mM a pH 8,0) uma vez a 4°C. EDTA (0,5 M a pH 8,0) foi, então, adicionado à mistura reacional a uma concentração final de EDTA de 5 mM. 2,7 ml da MMA-SH sintetizada como a seguir e dissolvidos em 5 mM da solução de EDTA (3,8 mM) foram, então, adicionados à solução acima de G6PDH ativada com SIA e girados ponta a ponta a 4°C por 24 horas. O conjugado G6PDH-ADMA foi, então, dialisado a 4°C três vezes contra PBS e uma vez contra o tampão MES (50 mM a pH 5,0). A concentração do conjugado G6PDH-ADMA foi medida por um kit BCA e, em seguida, armazenada a -80°C para uso posterior.

[000126] ADMA-SH.2TFA foi sintetizado acordo com o procedimento a seguir. A um frasco de 20 ml, foram adicionadas as resinas 4- metoxitritil cisteamina (0,9 g; 0,74 mmol), Fmoc-ADMA(pdb)-OH (1,0 g; 1,5 mmol; 2,0 equivalentes), HATU (0,7 g; 1,8 mmol; 2,5 equivalentes), di-isopropil etilamina (0,6 mL; 3,7 mmols; 5,0 equivalentes) e DMF anidra (20 mL). A mistura foi tampada e girada de ponta a ponta a 25°C por 16 horas. O líquido foi, então, removido por filtração e as resinas foram lavadas com DMF (20 mL, 4 vezes) e metanol (20 mL, 4 vezes). As resinas foram, então, tratadas com 20 ml de piperidina a 20% em DMF três vezes e 30 min de incubação para cada tempo. As resinas foram lavadas com DMF (20 mL, 4 vezes) e metanol (20 mL, 4 vezes), e secas sob vácuo. Para clivar a ADMA-SH a partir das resinas, 3 ml de TFA foram adicionados às resinas acima mencionada e girados de ponta a ponta por 3 horas a 25°C. Após remoção das resinas por filtração, o líquido de TFA foi evaporado à secura sob vácuo e foi obtido um produto semelhante a xarope de ADMA-SH.2TFA. O produto AD- MA-SH.2TFA foi dissolvido em solução de EDTA a 5 mM como solução estoque de ADMA-SH a 3,8 mM medida pelo reagente de Ellman.

SÍNTESE DO CONJUGADO G6PDH-SDMA

[000127] Um conjugado G6PDH-SDMA tem a seguinte estrutura:

[000128] O conjugado foi preparado de acordo com o procedimento a seguir. Um frasco de glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) (12 mg) foi dissolvido em 3 ml de tampão MES (50 mM, pH 8,0) e girado por 1 hora para garantir que a enzima seja totalmente dissolvida no tampão. A solução de enzima preparada foi mantida em gelo até o necessário. Um adicional de 4,5 ml do tampão MES (50 mM; pH 8,0) foi adicionado à solução de enzima, bem misturado através de centrifugação (5 segundos) e mantido em gelo por 10 minutos. 100 mg de G6P foram dissolvidos em 1 mL de água deionizada e mantidos em gelo por 10 min. 200 mg de NADH foram dissolvidos em 1 ml de água deio- nizada e mantidos em gelo por 10 min. 0,68 ml da solução de G6P e 0,34 ml da solução de NADH foram adicionados à solução de enzimas, bem misturadas através de centrifugação (5 segundos) e também mantidos em gelo por 10 min. Um frasco da SIA (50 mg) foi dissolvido em 0,5 ml de DMSO (100 mg/ml) e 0,14 ml da solução de SIA formada foi adicionado à solução enzimática, bem misturado através de centri-fugação (5 segundos), coberto com folha de alumínio e girado à tem-peratura ambiente por 2 horas. A solução foi, então, transferida para um Cassete de Diálise G2 Slide-A-Lyzer e dialisada durante cinco horas contra o tampão PBS (4 L) a 4°C no escuro. Após troca do tampão de diálise para PBS fresco (4 L), a solução foi dialisada novamente a 4°C no escuro durante a noite. O tampão de diálise foi, então, alterado para MES (4 L, 25 mM, pH 8,0) e a solução foi dialisada por 3 horas a 4°C. 12,5 ml da solução de enzimas foram removidos do cassete de diálise e 0,32 ml de tampão MES (1M; pH 8,0) e 0,32 ml de EDTA (0,2 M; pH 8,0) foram adicionados para trazer a concentração final da solução a 50 mM de MES e 5 mM de EDTA. Se necessário, por exemplo, se a solução de enzimas for inferior a 12,5 ml, o volume de MES e EDTA pode ser ajustado em conformidade. A solução foi desgaseifica- da com argônio por 5 minutos.

EXEMPLO 2: SÍNTESE DO CONJUGADO KLH-MMA

[000129] Um conjugado KLH-MMA tem a seguinte estrutura:

[000130] O conjugado foi preparado de acordo com o procedimento a seguir. 5 mg de proteína KLH ativada com maleimida foram dissolvidos em 2,0 ml de tampão MES (50 mM a pK 8,0) com 5 mM de EDTA e, em seguida, misturados com 2,5 ml de MMA-SH (5 mg/ml em solução de EDTA a 5 mM). A mistura reacional foi girada de ponta a ponta a 4°C durante mais de 36 horas e a eficiência de acoplamento foi me- dida. A mistura reacional foi, então, girada de ponta a ponta por mais 24 horas, e a eficiência do acoplamento foi medida novamente. O conjugado KLH-MMA preparado foi, então, dialisado com um corte de peso molecular de 10K contra PBS (4L) três vezes a 4°C. O conjugado KLH-MMA foi dialisado contra um tampão MES (25 mM a pH 5,0). EXEMPLO 3: SÍNTESE DO CONJUGADO KLH-SDMA

[000131] Um conjugado KLH-SDMA tem a seguinte estrutura:

[000132] O conjugado foi preparado de acordo com o procedimento a seguir. 5 mg de proteína KLH ativada com maleimida foram dissolvidos em tampão MES a 2,0 ml (50 mM a pH 8,0) com 5 mM de EDTA e, em seguida, misturados com 2,5 ml de solução de SDMA-SH (3,6 mM em EDTA a 5 mM). A mistura reacional preparada foi girada de ponta a ponta a 4°C durante mais de 36 horas, a eficiência de acoplamento foi medida, a mistura foi, então, girada de ponta a ponta por mais 24 horas e a eficiência de acoplamento foi novamente medida. O conjugado KLH-MMA preparado foi, então, dialisado com um corte de peso molecular de 10K contra PBS (4L) três vezes a 4°C. O conjugado foi, então, dialisado contra um tampão MES (25 mM a pH 5,0).

EXEMPLO 4: SÍNTESE DO CONJUGADO BSA-MMA

[000133] Um conjugado BSA-MMA tem a seguinte estrutura:

[000134] O conjugado foi preparado de acordo com o procedimento a seguir. 25 mg de MMA-SH foram dissolvidos em DMSO para produzir 50 mM de solução estoque de MMA-SH, e a concentração foi de-terminada por meio de um reagente de Ellman. A solução estoque de MMA-SH foi diluída em tampão MES (50 mM a pH 8,0 e EDTA a 5 mM) a uma concentração final de 3,6 mM. 2,5 ml da solução de MMA- SH a 3,6 mM foram adicionados a 5 mg da BSA ativada com maleimi- da, bem misturados e, em seguida, girados de ponta a ponta a 4°C por 36 horas. O conjugado BSA-MMA preparado foi, então, dialisado contra PBS três vezes (4 L) a 4°C, e contra um tampão MES (25 mM a pH 5,0) uma vez a 4°C.

EXEMPLO 5: SÍNTESE DO CONJUGADO BSA-SDMA

[000135] Um conjugado BSA-SDMA tem a seguinte estrutura:

[000136] O conjugado foi preparado de acordo com o procedimento a seguir. SDMA-SH (100 mg) recém-clivada a partir de SDMA-tiol- resina foi dissolvida em um tampão MES (50 mM a pH 8,0 com EDTA a 5 mM) e a concentração de SDMA-SH líquido foi determinada por meio de um kit de reagente Ellman como sendo 3,6 mM. 2,5 ml da solução de SDMA-SH foram adicionados a 5 mg da BSA ativada com maleimida, bem misturados e, em seguida, girados de ponta a ponta a 4°C por 36 horas. O conjugado BSA-MMA preparado foi dialisado contra PBS três vezes (4 l) a 4°C. O conjugado foi, então, dializado contra um tampão MES (25 mM a pH 5,0) uma vez.

EXEMPLO 6: REVESTIMENTO PASSIVO DO CONJUGADO G6PDH- MMA E G6PDH-ADMA EM PARTÍCULAS DE LÁTEX

[000137] O procedimento a seguir foi usado para preparar partículas de látex tendo conjugados G6PDH-MMA revestidos de forma passiva.Um procedimento semelhante foi usado para preparar partículas de látex tendo conjugados G6PDH-ADMA passivamente revestidos. Um procedimento semelhante pode ser usado para revestir partículas de forma passiva com conjugados de G6PDH e outros derivados de argi- nina. Além disso, um procedimento semelhante pode ser usado para revestir partículas com os conjugados contendo outras proteínas.

[000138] 500 μl de uma suspensão de partículas de látex, (5% p/v;tamanho de partículas a 0,52 μm) foram adicionados a um tubo de plástico de 2 ml e centrifugados a 10.000 rpm por 5 minutos, e o líquido sobrenadante foi removido e descartado. 500 μl de um tampão de revestimento foram adicionados aos péletes de partículas e bem mis-turadas por pipetagem. A mistura foi, então, centrifugada para remover o sobrenadante.

[000139] 1,48 mL de G6PDH-MMA (0,638 mg/mL em tampão de revestimento (MES 25 mM a pH 5,0)) foram adicionados ao pélete de partículas, e as partículas foram ressuspensas e bem misturadas. Para revestir as partículas de látex a 0,5 μM com uma monocamada de con-jugado, foram usados 34,3 μg de conjugado por mg de esfera. A sus-pensão de partículas e a mistura de conjugado foi girada de ponta a ponta a 4°C por 16 horas. A suspensão de partículas foi, então, centri-fugada a 10.000 rpm por 5 minutos. O líquido sobrenadante foi removido e filtrado com um filtro de 0,2 μm. O resíduo de conjugados foi medido usando um Kit de Ensaio de Proteína BCA (Thermo Fischer) para determinar a eficiência do revestimento. As partículas foram lavadas duas vezes com o tampão de revestimento e, em seguida, ressus- pensas em tampão de revestimento e armazenadas a 4°C. A concen-tração de partículas revestidas foi determinada por diluição de 5 μl da suspensão de partículas acima em 995 μl de água (diluição x200) e leitura a 650 nm. O A650 foi de 0,348, correspondente a 1,8% das partí-culas sólidas (p/v).

EXEMPLO 7: SÍNTESE DE PARTÍCULAS DE MMA-AMINO QUIMI-CAMENTE MODIFICADAS

[000140] A preparação partículas de MMA-amino quimicamente mo-dificadas é mostrada com o esquema a seguir e nos procedimentos a seguir. Esse procedimento pode ser geralmente usado com outros de-rivados de arginina:

ATIVAÇÃO DE PARTÍCULAS AMINO COM SM(PEG)12

[000141] Dez 10 ml de uma suspensão de partículas de poliestireno modificadas com amina (5% p/v; tamanho de partículas a 0,55 μm) foram adicionados a um tubo Falcon de 50 ml e centrifugados a 7000 rpm por 25 min e, em seguida, o sobrenadante foi descartado. O péle- te de partículas foi lavado com 20 ml de tampão fosfato (50 mM a pH 7,4) duas vezes e, em seguida, ressuspenso em 20 ml de tampão fosfato a pH 7,4. 100 mg do SM(PEG)12 (Thermo Fischer Pierce) foram dissolvidos em 1 ml de DMSO a uma concentração final de 100 mg/ml. Em um agitador, a solução de SM(PEG)12 foi adicionada à suspensão de partículas de amina gota a gota e, então, girada de ponta a ponta por 4 horas a 25°C. A mistura de partículas foi lavada quatro vezes por centrifugação a 7000 rpm por 20 min, ressuspensa em tampão fosfato (40 ml) por sonicação durante 1 min e incubada por 20 minutos. Após a quarta lavagem, as partículas foram ressuspensas em 20 ml de tampão fosfato com EDTA a 5 mM.

MMA-SH CONJUGADO A PARTÍCULAS DE SM(PEG)12

[000142] 25 mg de MMA-SH-2TFA foram dissolvidos em 4,2 ml de solução de EDTA a 5 mM para preparar uma solução estoque de MMA- SH a 12,5 mM. A solução estoque de MMA-SH (12,5 mM) foi diluída a 1,25 mM para preparar uma solução de MMA-SH intermediária, então diluída mais uma vez a 0,05 mM para preparar uma solução de trabalho de MMA-SH. A solução de partículas ativadas com SM(PEG)12 acima (10 ml) foi agitada, e um volume correspondente da solução de trabalho de MMA-SH (0,05 mM) foi adicionada gota a gota à solução de partícu-las. As partículas foram bem misturadas por sonicação e, em seguida, giradas de ponta a ponta a 25°C por 15 horas. Cisteamina a 5 mM foi adicionada e incubada com as partículas por mais uma hora. As partícu-las foram, então, centrifugadas a 6000 rpm por 15 min e lavadas com 12 ml de tampão fosfato cinco vezes por sonicação e ressuspensão. As partículas foram ressuspensas em 10 ml de tampão fosfato. Para medir a concentração de partículas, a suspensão foi diluída 200 vezes em água deionizada e o OD foi lido a 650 nm.

EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO DO DILUENTE DE MARCAÇÃO DE PARTÍCULAS

[000143] Para escala de 500 ml, os seguintes materiais foram mistu-rados, e o pH final do líquido foi ajustado para 7,4. 50 ml de Tampão Fosfato a 1 M 50 gramas de sacarose 20 μl de Tensoativo Tween® 20 450 ml de Água Deionizada

EXEMPLO 9: SÍNTESE DE CONJUGADOS ANTICORPO ANTI- SDMA-HRP

[000144] Um esquema de reação de quatro etapas foi usado para preparar conjugados de anticorpos anti-SDMA e HRP via sulfoativação de anticorpos e ativação com o reagente de Traut ou o reagente de SPDP da enzima peroxidase de rábano silvestre (HRP). Na etapa 1, a maleimida foi usada para capear qualquer fragmento de tiol livre na solução de anticorpos para evitar a reticulação de anticorpos durante o processo de ativação com SMCC. Na etapa 2, um agente de reticula- ção de SMCC foi reagido com o anticorpo para produzir um anticorpo ativado com maleimida (SMCC-Mab). Na etapa 3, após remoção do excesso de agente de reticulação não reagido por diálise, anticorpo ativado com SMCC foi reagido com uma HRP ativada com sulfidrila, que foi preparada por ativação da HRP com o reagente de Traut ou por SPDP. O anticorpo ativado com SMCC reage com a enzima HRP por grupos sulfidrila. A via química de síntese do Mab-HRP é mostrada no esquema a seguir (etapas 3 e 4 representadas por ativação da HRP com o reagente de Traut ou por SPDP):

[000145] Como alternativa, as etapas 3 e 4 podem ser concluídas do seguinte modo: ETAPA 3: ATIVAÇÃO POR SPDP DA HRP E REDUÇÃO POR DTT/TCEPETAPA 4: CONJUGAÇÃO DO SMCC-MAB E HRP ATIVADA POR SULFIDRILA

[000146] Os procedimentos para as etapas 1-4 são mostrados mais particularmente abaixo: ETAPA 1: CAPEAMENTO COM MALEIMIDA DE TIÓIS LIVRES DE IMPUREZA

[000147] A 4 ml de 5,6 mg/mL de Mab Anti-SDMA (preparado como na Patente US 8.481.690) (total de 22,4 mg) em PBS, 15 μl de maleimida a 0,5 M em DMSO foram adicionados e, então, girados de ponta a ponta por 45 min à temperatura ambiente. A solução de anticorpos capeada foi dialisada contra PBS (4L) três vezes a 4°C. A concentração de anticor-pos foi determinada por diluição a 10x do anticorpo com PBS e leitura de OD 280 nm (OD280 = 1,37 é igual a mg/ml) como 5,2 mg/ml.ETAPA 2: ATIVAÇÃO COM SMCC DE MAB ANTI-SDMA

[000148] 50 μl de Sulfo-SMCC (frasco equilibrado, Sem Formato de Peso, à temperatura ambiente antes de abrir para evitar condensação de umidade, 2 mg foram adicionados a 100 μl de DMSO para produzir 10,0 mg/ml de solução) foram, em seguida, adicionados a 3,3 ml do Mab capeado com maleimida em PBS a 5,2 mg/ml, que foi suavemente misturado e girado de ponta a ponta (suavemente e à baixa velocidade) à temperatura ambiente por uma hora. O anticorpo ativado com SMCC foi dialisado contra PBS (4L) três vezes a 4°C. A concentração do anticorpo ativado com SMCC (SMCC-Ab) foi determinada por uma diluição a 10x do anticorpo com PBS e, em seguida, leitura de OD a 280 nm como 4,9 mg/ml.ETAPA 3 (ALTERNATIVA 1): ATIVAÇÃO DA HRP COM O REAGENTE DE TRAUT

[000149] 40 mg da HRP foram dissolvidos em 3 ml de PBS com EDTA a 5 mM e a concentração final de HRP foi de 13,3 mg/ml. 0,275 ml do reagente de Traut (20 eq) em água (10 mg/ml) foi adicionado à solução de HRP acima e, em seguida, girado de ponta a ponta por uma hora a 25°C. A solução foi, então, dessalgada por coluna PD-10 e lavada com um tampão PBS incluindo EDTA a 5 mM. Frações com uma cor marrom foram coletados, e o OD a 405 nm foi medido para determinar uma concentração de HRP de 7,8 mg/ml. ETAPA 3 (ALTERNATIVA 1): PREPARAÇÃO DO CONJUGADO AN- TICORPO-HRP TRAUT

[000150] 0,7 ml de SMCC-Mab em PBS (2,23 mg/ml) foi adicionado a uma solução de EDTA (0,5 M a pH 8,0) para obter uma concentração final de EDTA de 5 mM. 0,64 ml de Traut-HRP (12 Eq, 7,8 mg/ml), purificado acima, foi adicionado e, em seguida, a mistura foi girada de ponta a ponta a 4°C por 24 horas. Cisteína (0,5 M) foi adicionada à mistura a uma concentração final de 0,5 mM para arrefecer a reação, e a mistura foi deixada permanecer à temperatura ambiente por duas horas. A solução de conjugado preparada foi, então, filtrada por um filtro de rotação de 0,2 μm. O conjugado foi armazenado a 4°C, e SDS- PAGE e SEC foram usados para caracterizar os conjugados presentes na solução.ETAPA 3 (ALTERNATIVA 2): ATIVAÇÃO DA HRP COM SPDP

[000151] 250 mg da HRP foram dissolvidos em 12,5 ml de PBS para produzir uma solução a 20 mg/ml. 100 mg de PEG4-SPDP (agente de reticulação de SPDP de cadeia longa, peguilado; SPDP é 3-(2- piridilditio)propionato) de succinimidila (Thermo Fisher Scientific) foram deixados esfriar à temperatura ambiente e foram, então, dissolvidos em 1 ml de DMSO para produzir uma solução de PEG4-SPDP a 100 mg/ml. 0,7 ml da solução de SPDP foi, então, adicionado a 12,5 ml da solução de HRP e girado de ponta a ponta por uma hora à temperatura ambiente. O conjugado SPDP-HRP foi dialisado três vezes contra a PBS (4L) a 4°C. A concentração de HRP de 15,2 mg/ml foi determinado através de uma leitura OD a 405 nm de diluição a 20x da solução de SPDP-HRP.

[000152] DECAPEAMENTO (DE-CAPPING) DO SPDP-HRP POR RESINA TCEP

[000153] 6 ml de pasta de resina TCEP foram centrifugados (3000 rpm por 2 min) e o sobrenadante foi descartado. O pélete de resina foi, em seguida, lavado duas vezes com 6 ml de tampão PBS contendo 5 mM de EDTA. 40 μl da solução de EDTA a 0,5 M foram, então, adicionados a 4 ml da solução de SPDP-HRP (15,2 mg/ml), bem misturados e, em seguida, adicionados à resina TCEP. Essa solução foi, em seguida, bem misturada e girada de ponta a ponta por duas horas à temperatura ambiente. Depois que as resinas foram removidas por filtração, a concentração de HRP foi determinada por uma diluição a 20x e um leitura OD a 405 nm, dando uma concentração de 10,5 mg/ml.ETAPA 4 (ALTERNATIVA 2): CONJUGADO ANTICORPO-HRP SPDP

[000154] 2,2 ml de SMCC-mAb em PBS (4,9 mg/ml) foram adiciona dos a EDTA para preparar uma mistura a 5 mM. A essa mistura, 2,2 ml de SPDP-HRP decapeado (de-capped) (10,5 mg/ml, 8 Eq de HRP/Ab) foram adicionados, bem misturados e, então, girados de ponta a ponta por 15 horas a 4°C. Para arrefecer a reação de SMCC, 4,4 μl de Ciste- ína a 0,5 M em água a 0,5 mM foram adicionados e incubados por duas horas a 4°C. Para bloquear os tióis livres, 4,4 μl de Cisteína a 0,5 M em DMSO a 1 mM foram adicionados e, em seguida, incubados por uma hora a 4°C. A solução de conjugado preparada foi, então, filtrada por filtro giratório de 0,2 μm e armazenada a -80°C. SDS-PAGE e SEC foram usados para analisar o conjugado.

EXEMPLO 10: PREPARAÇÃO DO REAGENTE DE CONJUGADO LÍ-QUIDO ANTI-SDMA

[000155] A solução de conjugado a granel anti-SDMA foi preparada em diluente de conjugado conforme descrito no Exemplo 11. O conjugado do anticorpo anti-SDMA foi pré-diluído a 50 μg/mL, usando o di- luente de conjugado. Para preparar a solução de trabalho, a solução de conjugado a granel (50 μg/ml) foi adicionada ao diluente de conju- gado a uma concentração final de 0,3 ou 0,8 μg/ml. A solução de trabalho foi, então, bem misturada por rotação das soluções a 25°C por 30 min. A solução de trabalho foi, então, envolta em papel alumínio e armazenada a 4°C até o uso.

EXEMPLO 11: PREPARAÇÃO DE DILUENTE DO REAGENTE DE CONJUGADO

[000156] Os materiais a seguir foram adicionados a 150 mL do esta- bilizante STABLZYME SELECT® na ordem listada. A mistura foi, então, misturada por rotação a 25°C durante duas horas, e o pH foi ajustado para 7,0. 180 mg de ANS 2,625 g de ácido salicílico 17,5 g de sacarose 16,5 mg de heparina 50 mg HRP inativa 0,5 mL de corante azul

[000157] Os materiais acima foram adicionados a 250 mL do estabi- lizante STABLZYME SELECT® e misturados delicadamente de uma ponta à outra por alguns minutos. O diluente foi filtrado através de um filtro de 0,2 um e, então, coberto com alumínio e armazenado a 4°C.

EXEMPLO 12: PREPARAÇÃO DE LÂMINAS DE ENSAIO DE SDMA PARA O ANALISADOR CATALYST DX®

[000158] Partículas de látex passivamente revestidas com G6PDH- MMA ou G6PDH-ADMA armazenadas foram misturadas em diluente de marcação (Exemplo 8) a uma concentração final de partículas de 0,1%. 35 μL da solução de partículas diluída foram adicionados sobre cada lâmina pré-montada (consulte o Documento US 2014/0315216) com uma membrana de matriz de camada única Fusion 5 (GE Healthcare Life Sciences). As lâminas foram, então, secas em um túnel de secagem a 49°C e uma taxa de fluxo de 745 durante 30 min. As lâmi- nas secas foram colocadas em um saco de alumínio com um dessecante e o saco contendo as lâminas foi vedado e armazenado a 4°C.

[000159] Para preparar a lâmina usando partículas de MMA-amino, as partículas como descrito nos Exemplos 6 e 7 foram diluídas no dilu- ente de marcação a uma concentração final de partículas de 0,1% e, em seguida, marcadas sobre as lâminas e secas usando o procedimento de secagem acima.

EXEMPLO 13: ENSAIO DA SDMA NO ANALISADOR CATALYST DX®

[000160] Os ensaios do Catalyst DX® foram realizados de acordo com o procedimento geral a seguir e de acordo com as instruções do fabricante (TDEXX Laboratories, Inc.). A amostra e o conjugado anti-SDMA-HRP foram incubadas por 2 minutos à temperatura ambiente. Duas alíquotas de 11 μl da mistura foram aplicadas à fase sólida do CATALYST DXR preparada como descrito no Exemplo 12. A fase sólida foi lavada três vezes com 9 μl de tampão de lavagem. Duas alíquotas de 11,5 μl do substrato TMB foram adicionadas. O OD da lâmina foi, em seguida, lido por dois minutos em intervalos de 0,5 segundo a 645 nM.

[000161] A Figura 1 mostra curvas de calibração da SDMA usando partículas de látex passivamente revestidas com a proteína G6PDH- MMA como fase sólida e os conjugados Anti-SDMA-HRP SPDP. Cali-bradores de SDMA foram preparados em um soro canino não esgotado. Fase Sólida: Concentração de partículas (0,1%); Conjugado Líquido = 0,3 μg/ml.

[000162] A Figura 1B mostra um gráfico de calibração da SDMA usando partículas de látex passivamente revestidas com a proteína G6PDH-MMA como fase sólida e conjugado Anti-SDMA-HRP SPDP. Calibradores de SDMA foram preparados em um soro canino não esgotado. Fase Sólida: Concentração de partículas (0,025%); Conjugado Líquido = 0,027 μg/ml. Os dados apresentados representam seis repetições do experimento.

[000163] A Figura 2 mostra curvas de calibração de SDMA usando partículas passivamente revestidas com KLH-MMA como fase sólida e conjugados Anti-SDMA-HRP SPDP. Calibradores de SDMA foram preparados em um soro canino não esgotado. Fase Sólida: Concentração de partículas (0,1%); Conjugado Líquido = 0,8 μg/ml.

[000164] A Figura 3 mostra curvas de calibração de SDMA usando partículas de MMA quimicamente modificadas como fase sólida e con-jugados Anti-SDMA-HRP SPDP. Calibradores de SDMA foram prepa-rados em um soro canino não esgotado. Fase Sólida: Concentração de partículas (0,1%); Conjugado Líquido = 0,8 μg/ml.

[000165] A Figura 4 mostra análise da amostra de SDMA CATALYST DX® de calibradores e amostras de pacientes usando conjugados de partículas passivamente revestidas com G6PDH-MMA como fase sólida e SPDP líquido.

EXEMPLO 14: COMPARAÇÃO DAS PROPRIEDADES DA FASE SÓLIDA DE PARTÍCULAS REVESTIDAS COM SDMA, ADMA e MMA

[000166] Para desenvolver um ensaio de SDMA com base no Analisador Catalyst, diferentes versões de fases sólidas foram desenvolvidas, incluindo fases sólidas tendo partículas imobilizadas passivamente revestidas com conjugados de MMA, ADMA e SDMA à base de proteína, como descrito nos Exemplos 1 e 12. As partículas imobilizadas quimicamente modificadas com MMA e SDMA, como descrito no Exemplo 7, também foram investigadas.

[000167] Um achado é que o desempenho do ensaio é melhorado com a MMA imobilizada e usada na fase sólida. O uso da SDMA imobilizada na fase sólida, quer por partículas de látex passivamente revestidas à base de proteínas ou partículas quimicamente modificadas, resultou apenas em separação limitada entre os painéis de calibrador de SDMA. Partículas de látex quimicamente modificadas com MMA geraram uma curva de calibração com melhor desempenho de ensaio, incluindo a precisão e a exatidão do ensaio, mas sofreram grande in-clinação entre os dois tipos de amostra, soro e plasma. O melhor de-sempenho de ensaio de SDMA Catalyst foi fornecido por conjugados G6PDH-MMA passivamente revestidos em partículas que foram imobi-lizadas na fase sólida. As partículas resultaram em um ensaio com ex-celente precisão, exatidão e estabilidade.

[000168] Os conjugados anti-SDMA-enzima também foram investigados usando o reagente de Traut ou SPDP, como descrito no Exemplo 9. Foi mostrado que os conjugados formados fornecem uma ampla gama dinâmica no ensaio de SDMA e melhor desempenho do ensaio.

[000169] Como mostrado na Tabela 1, a eficiência do revestimento de BSA-MMA/BSA-SDMA sobre partículas de látex (-25%) foi muito menor do que a eficiência do revestimento para KLH-MMA/KLH-SDMA e G6PDH-MM A/G6PDH-SDMA (-95%). As partículas de látex revestidas com KLH-MMA e KLH-SDMA se agregaram sob as condições de armazenamento antes que elas fossem marcadas nas lâminas, resultando em uma grande variação do ensaio, a menos que as partículas fossem bem sonicadas antes da marcação. KLH-MMA foi estável se diretamente marcado sobre as lâminas de Fusion 5 quando as lâminas foram incubadas a 37°C por uma semana, mas não foi estável quando as lâminas foram incubadas por duas semanas. G6PDH-MMA apresentou alta eficiência de revestimento sobre partículas de látex, e foi muito potente sobre lâminas secas, mesmo quando incubadas a 37°C por duas semanas, assim proporcionando a melhor fase sólida para o ensaio de SDMA Catalyst.TABELA 1

[000170] A Tabela 2 mostra uma comparação do desempenho do ensaio usando a fase sólida com partículas de KLH-MMA and KLH- SDMA passivamente revestidas.TABELA 2

[000171] A Tabela 3 mostra uma comparação entre o desempenho do ensaio usando a fase sólida com partículas imobilizadas tendo G6PDH-MMA, G6PDH-ADMA e G6PDH-SDMA passivamente revestidos.TABELA 3

[000172] Como mostrado na Tabela 3, as partículas imobilizadas tendo G6PDH-MMA, G6PDH-ADMA ou G6PDH-SDMA passivamente revestidos podem ser, cada uma, usadas em um ensaio de SDMA Ca-talyst.

[000173] A Tabela 4 mostra uma comparação do desempenho do ensaio usando a fase sólida com partículas imobilizadas tendo BSA- MMA e BSA-SDMA passivamente revestidos. TABELA 4

EXEMPLO 15: ANÁLISE DE DESEMPENHO DO ENSAIO

[000174] O desempenho do teste de SDMA CATALYST DX® foi comparado aos ensaios LC-MS e EMIT* (consulte a Publicação de Pa-tente US N° 2016/245801) tanto para amostras caninas quanto para amostras felinas.

[000175] A Figura 5A mostra a correlação do teste de SDMA CATALYST DX® com os Ensaios de LC-MS para amostras de soro canino (207 amostras). Catalyst [SDMA] (μg/dL) = 1,22065+0,93353 LC-MS [SDMA] μg/dL) com R2 = 0,945. O valor R ao quadrado indica que os resultados do teste foram fortemente correlacionados.

[000176] A Figura 5B mostra a correlação do teste de SDMA CATALYST DX® com os Ensaios de LC-MS para amostras de soro felino (86 amostras). Catalyst [SDMA] (μg/dL) = 1,22065+0,93353 LC-MS [SDMA] μg/dL) com R2 = 0,945. O valor R ao quadrado indica que os resultados do teste foram fortemente correlacionados.

[000177] A Figura 6A mostra a correlação do Teste de SDMA CATALYST DX® com Ensaios EMIT para amostras de soro canino (207 amostras). Catalyst [SDMA] (μg/dL) = 0,56438+0,93980 EMIT [SDMA] μg/dL) com R2 = 0,939. O valor R ao quadrado indica que os resultados do teste foram fortemente correlacionados.

[000178] A Figura 6B mostra a correlação do Teste de SDMA CATALYST DX® com os Ensaios EMIT para amostras de soro felino (86 amostras). Catalyst [SDMA] (μg/dL) = 0,56438+0,93980 EMIT [SDMA] μg/dL) com R2 = 0,939. O valor R ao quadrado indica que os resultados do teste foram fortemente correlacionados.

EXEMPLO 16: COMPARAÇÃO DA TENDÊNCIA SORO-AMOSTRA EM PARTÍCULAS DE AMINA-MMA LIGADAS DE FORMA COVALENTE E PARTÍCULAS DE G6PDH-MMA REVESTIDAS DE FORMA PASSIVA

[000179] O ensaio de SDMA Catalyst DX® foi realizado em amostras correspondentes de soro e plasma, ou com partículas de amina-MMA ligadas de forma covalente ou com partículas de G6PDH-MMA passi-vamente revestidas. Os experimentos foram realizados em duplicidade. A tendência da amostra foi calculada como a seguir: (SDMA do soro (μg/dL) - SDMA do plasma (μg/dL)/(SDMA do soro (μg/dL) + SDMA do plasma (μg/dL)) / 2), que reflete a diferença entre os valores de soro e plasma) divididos pela média dos valores de soro e plasma.

[000180] Como mostrados na Tabela 5 e Figura 7A, foi observada nas amostras caninas uma tendência soro/plasma de 64/82% com as partículas covalentemente ligadas de amina-MMA. Em contraste, uma tendência soro-plasma de 0% a 11% foi observada com as partículas de G6PDH-MMA passivamente revestidas. Portanto, as partículas de G6PDH-MMA passivamente revestidas reduziram grandemente a ten-dência plasma/soro observada nas amostras caninas com partículas de amina-MMA ligadas de forma covalente.

[000181] Como mostrados na Tabela 6 e Figura 7B, foi observada nas amostras felinas uma tendência soro/plasma de -36% a 35% com as partículas covalentemente ligadas de amina-MMA. Em contraste, uma tendência soro-plasma de -3% a 6% foi observada com as partículas de G6PDH-MMA passivamente revestidas. Portanto, as partículas de G6PDH-MMA passivamente revestidas reduziram grandemente a tendência plasma/soro observada nas amostras felinas com partícu- las de amina-MMA ligadas de forma covalente.TABELA 5TABELA 6

EXEMPLO 17: TENDÊNCIA SORO/PLASMA EM PARTÍCULAS DE G6PDH-MMA REVESTIDAS DE FORMA PASSIVA E PARTÍCULAS DE OVALBUMINA-MMA REVESTIDAS DE FORMA PASSIVA

[000182] O ensaio de SDMA Catalyst DX® foi realizado em 20 amostras pareadas de soro a plasma caninos com partículas de G6PDH- MMA (Figura 8) ou partículas de Ovalbumina-MMA (Figura 9). Os eixos Y dos gráficos nas Figuras 8 e 9 ilustram a diferença entre as concentrações de SDMA real e medida em μg/dL. A diferença é mencionada como a "tendência". Os experimentos foram realizados em duplicidade. Ambos os revestimentos com G6PDH e Ovalbumina resultaram em tendência mínima entre os valores de SDMA medidos no soro e no plasma. Em adição, houve uma tendência mínima entre os valores de SDMA atual e medido nas amostras de soro, e uma tendência mínima entre os valores de SDMA real e medido nas amostras de plasma.

EXEMPLO 18: ESTABILIDADE DE PARTÍCULAS DE PROTEÍNA- MMA PASSIVAMENTE REVESTIDAS

[000183] Foi avaliada a estabilidade do revestimento passivo de pro- teína-MMA em partículas.

ESTABILIDADE NA SOLUÇÃO AQUOSA

[000184] Partículas passivamente revestidas (revestidas com G6PDH-MMA; G6PDH-MMA com seus substratos G6P e NAD; ou ovalbumina-MMA) foram incubadas a 4°C em fosfatos de sódio a 50 mM e sacarose a 2,5%, pH 6.4, por vários períodos de tempo, variando de 5 horas a 8 dias. Uma alíquota das partículas que foram incubadas por 5 horas foi sonicada. Além disso, partículas recém-revestidas foram comparadas a partículas revestidas que foram submetidas a um único ciclo de congelamento/descongelamento a -20°C. Após as incubações, as partículas foram usadas no ensaio de SDMA, e os resultados são mostrados na Figura 10. Essas pré-incubações tiveram um efeito maior sobre os valores de SDMA quando as partículas revestidas com ovalbumina-MMA foram usadas, em comparação às partícu- las revestidas com G6PDH-MMA.

[000185] Esses resultados indicam que as partículas revestidas com G6PDH-MMA foram mais estáveis quando incubadas em uma solução aquosa do que as partículas revestidas com ovalbumina-MMA.

ESTABILIDADE EM SOLUÇÃO AQUOSA CONTENDO ALTAS CON-CENTRAÇÕES DE SAL

[000186] A fim de avaliar a tolerância do revestimento passivo contra altas concentrações de sal, o ensaio de SDMA foi realizado com partí-culas passivamente revestidas com G6PDH-MMA e sem pré- tratamento com NaCl a 1 M durante a noite a 4°C. O ensaio foi realizado com padrões SDMA a 0; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 μg/dL de SDMA.

[000187] A Figura 11 mostra curvas de calibração SDMA Catalyst DX® usando partículas passivamente revestidas com G6PDH-MMA, com e sem incubação prévia com NaCl a 1 M. Os experimentos foram realizados em triplicidade. A curva de calibração de SDMA foi indistinta entre as partículas que foram expostas em cloreto de sódio a 1 M (identificadas como "esgotadas") ou as partículas de controle (identifi-cadas como "não esgotadas"). Isto indica que as partículas passiva-mente revestidas com G6PDH-MMA são estáveis em cloreto de sódio a 1 M durante a noite a 4°C.

ESTABILIDADE EM TENSOATIVO

[000188] Partículas passivamente revestidas com G6PDH-MMA foram incubadas durante a noite (> 12 horas) a 4°C em tampão com ou sem 0,1% do tensoativo Tween 20® (monolaurato de polietileno glicol e sorbitano). Após a incubação durante a noite, as partículas foram usadas no ensaio de SDMA Catalyst DX. Calibradores de SDMA foram preparados em soro canino enriquecido com SDMA a uma concentração final de 0, 20, 40, 60, 80 ou 100 μg/dL. As curvas de calibração resultantes são mostradas na Figura 12. Os dados indicam que a pré- incubação com o tensoativo não teve efeito sobre o desempenho das partículas passivamente revestidas com G6PDH-MMA no ensaio.

[000189] Outro experimento foi realizado para comparar a tolerância a tensoativo das partículas de látex passivamente revestidas com G6PDH-MMA, BSA-MMA e KLH-MMA. Cada tipo de partícula de látex revestida com conjugado foi tratado com 0,1% ou 1% de Tween 20 em tampão de armazenamento a 4°C durante a noite. A proteína liberada para o tampão de armazenamento foi medida por kit Micro BCA para determinar o percentual de conjugado restante nas partículas. Como mostrado na Tabela 7, entre os três tipos de conjugados, as partículas de látex revestidas com BSA-MMA foram as menos estáveis na presença de Tween 20. Em contraste, as partículas de látex revestidas com G6PDH-MMA exibiram a maior tolerância, mesmo quando incubadas com Tween 20 a 1%. As partículas revestidas com KLH-MMA foram relativamente tolerantes ao tratamento com tensoativo, mas as partículas se agregaram facilmente durante o armazenamento, resultando em baixa precisão do ensaio.TABELA 7

[000190] Em resumo, os vários experimentos detalhados indicam que as partículas de látex revestidas com G6PDH-MMA mostraram as mais elevadas eficiência e estabilidade do revestimento. As partículas de G6PDH-MMA também permaneceram monodispersas em tampões de armazenamento e de marcação e produziram a melhor o desempenho do ensaio em comparação às partículas revestidas com outros conjugados, como BSA-MMA e KLH-MMA.

EXEMPLO 19: REVESTIMENTO DIRETO DE KLH-MMA SOBRE LÂ-MINAS DE ENSAIO

[000191] A Figura 13 mostra um gráfico de calibração de SDMA usando o conjugado de proteína KLH-MMA (Exemplo 2) diretamente revestido sobre a membrana da lâmina. Uma alíquota de 35 μl do conjugado KLH-MMA (14,3 μg/ml em tampão fosfato com sacarose a 2% e Tween 20 a 0,05%) foi colocado sobre lâminas pré-montadas (consulte o Documento US 2014/0315216) com uma membrana de matriz de camada única Fusion 5 (GE Healthcare Life Sciences). As lâminas foram, então, secas em um túnel de secagem a 49°C e uma taxa de fluxo de 745 durante 30 min. Calibradores de SDMA foram preparados em um soro canino não esgotado. Os calibradores foram incubados com o Conjugado anti-SDMA-HRP a 0,6 μg/ml durante 2 minutos à temperatura ambiente. Duas alíquotas de 11 μL da mistura foram aplicadas à lâmina. A fase sólida foi lavada três vezes com 9 μl de tampão de lavagem. Duas alíquotas de 11,5 μL do substrato TMB foram adicionadas. O OD da lâmina foi, em seguida, lido por dois minutos em intervalos de 0,5 segundo a 645 nM. Cada ponto no gráfico representa a média de resultados de experimentos triplicados.

[000192] Os exemplos dados acima são meramente ilustrativos e não pretende ser uma lista exaustiva de todas as modalidades, aplicações ou modificações possíveis da invenção. Assim, diversas modificações e variações dos métodos descritos e sistemas da invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica, sem afastamento do âmbito e do espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em ligação com modalidades específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser indevidamente limitada às modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para realização da invenção, que são óbvias para aqueles versados em biologia molecular, imunologia, química, bioquímica ou nos campos relevantes, devem ser consideradas dentro do âmbito de aplicação das reivindicações anexas.

[000193] Deve ser entendido que a invenção não é limitada à meto-dologia, protocolos e reagentes em particular, etc., aqui descritos, pois esses podem variar conforme o técnico no assunto irá reconhecer. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada tem a fina-lidade de descrever as modalidades particulares apenas, e não deve ser considerada limitante da abrangência da invenção. Também deve ser notado que, como usado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "uma", "uma" e/ou "o", "a" incluem as referências plurais, a menos que o contexto determine claramente o contrário. Assim, por exemplo, uma referência a "um ligante" é uma referência a um ou mais ligantes e seus equivalentes conhecidos para aqueles com conhecimento na técnica.

[000194] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado co- mumente entendido por aqueles especialistas na técnica à qual pertence a invenção. As modalidades da invenção e os vários recursos e seus detalhes vantajosos são explicados mais detalhadamente com referência às modalidades não limitantes e/ou ilustrados nos desenhos anexos e detalhados na descrição seguinte. Deve-se notar que os recursos ilus-trados nos desenhos não são necessariamente desenhados em escala, e os recursos de uma modalidade podem ser empregados com outras modalidades, como o técnico no assunto irá reconhecer, mesmo quando não expressamente indicado neste documento.

[000195] Quaisquer valores numéricos aqui enumerados incluem todos os valores, desde o valor mais baixo até o valor mais alto em in-crementos de uma unidade, desde que haja uma separação de pelo menos duas unidades entre qualquer valor inferior e qualquer valor superior. Como exemplo, se for indicado que a concentração de um componente ou o valor de uma variável de processo, por exemplo, ta-manho, tamanho de ângulo, pressão, tempo e similares, é, por exemplo, de 1 a 90, especificamente de 20 a 80, mais concretamente de 30 a 70, deve ser considerado que os valores, como de 15 a 85, 22 a 68, 43 a 51, 30 a 32, etc., são expressamente enumerados no presente relatório descritivo. Para valores que são menores do que um, uma unidade é considerada 0,0001; 0,001; 0,01 ou 0,1, conforme apropriado. Estes são apenas exemplos do que deve ser considerado especificamente e todas as combinações possíveis de valores numéricos entre o valor mais baixo e o valor mais alto enumerados devem ser consideradas como se expressamente declaradas neste pedido de maneira semelhante.

[000196] Métodos, dispositivos e materiais específicos são descritos, embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados para a prática ou testes da invenção. As descrições de todas as referências e publicações citadas acima são expressamente incorporadas por referência em suas totalidades, na mesma medida como se cada uma estivesse individualmente incorporada por referência.

Claims (41)

1. Dispositivo para determinação da dimetil arginina simétrica (SDMA) em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende uma matriz sólida compreendendo uma partícula ligado a ela de forma não difusiva em uma zona de reação, em que a partícula compreende um reagente de captura compreendendo (a) um derivado de SDMA covalentemente ligado a uma proteína que está ligada à partícula ou (b) um derivado de SDMA covalentemente ligado à partícula, em que cada uma de (a) e (b) o derivado de SDMA não é SDMA.

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína é acoplada de forma covalente à partícula.

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína é acoplada de forma não covalente à partícula.

4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína é pelo menos uma dentre Albumina de Soro Bovino (BSA), ovalbumina, Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) e Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH).

5. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o derivado de SDMA é um derivado de arginina.

6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o derivado de arginina é selecionado a partir do grupo que consiste em L-arginina, N-metilarginina (MMA), ADMA acilada, L-arginina acilada e MMA acilada.

7. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o derivado de arginina é selecionado a partir da dimetilarginina simétrica (SDMA), SDMA acilada.

8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz é uma matriz porosa.

9. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a matriz é disposta em um cartucho ou alojamento.

10. Reagente de captura, caracterizado pelo fato de que compreende N-metilarginina acilada (MMA) ou MMA acilada acoplado a uma partícula.

11. Reagente de captura, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a N-metilarginina (MMA) ou MMA acilada é ligada à partícula através de um ligante.

12. Reagente de captura, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a N-metilarginina (MMA) ou MMA acilada é acoplada de forma covalente a uma proteína que é acoplada a uma partícula.

13. Reagente de captura, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a proteína é acoplada de forma covalente à partícula.

14. Reagente de captura, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a proteína é acoplada de forma não covalente à partícula.

15. Reagente de captura, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a proteína é pelo menos uma dentre Albumina de Soro Bovino (BSA), ovalbumina, Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) e Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH).

16. Reagente de captura, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende a seguinte estrutura:

17. Reagente de captura, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende:

18. Método de determinação da dimetil arginina simétrica (SDMA) em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar a amostra em contato com o dispositivo como definido na reivindicação 1 e um conjugado marcado não imobilizado compreendendo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador; (b) lavar a zona de reação da matriz sólida para remover o conjugado que não está ligado à matriz sólida em uma zona de reação; e (c) medir a quantidade do marcador associado à zona de reação para determinar a presença ou a quantidade de SDMA na amostra.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende formar uma mistura compreendendo a amostra e o conjugado compreendendo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador, e contatar a amostra com o dispositivo compreendendo o contato da mistura com o dispositivo.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o derivado de arginina é selecionado de dimetilarginina assimétrica (ADMA), L-arginina, N-metilarginina (MMA), ADMA acilada, L-arginina acilada e MMA acilada e o anticorpo anti- SDMA apresenta menos afinidade para o derivado de arginina do que a afinidade paraSDMA.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo anti-SDMA para o derivado de arginina é inferior a 25%, inferior a 10%, inferior a 5%, inferior a 1%, inferior a 0,1%, inferior a 0,01%, ou inferior a 0,001%.

22. Método de determinação da dimetil arginina simétrica (SDMA) em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) formar uma mistura compreendendo a amostra e um anticorpo anti-SDMA; (c) colocar a mistura em contato com uma matriz sólida compreendendo o reagente de captura como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 17; (d) lavar a matriz sólida para remover o anticorpo anti- SDMA que não está ligado à matriz sólida; e (e) medir a quantidade do anticorpo anti-SDMA associado à matriz sólida para determinar a presença ou a quantidade de SDMA na amostra.

23. Método de determinação da dimetil arginina simétrica (SDMA) em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) colocar a amostra em contato com uma matriz sólida e um conjugado não imobilizado compreendendo um anticorpo anti- SDMA, em que a matriz compreende o reagente de captura como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 17 imobilizado em uma zona de reação; (c) lavar a zona de reação para remover o anticorpo anti- SDMA que não está ligado na zona de reação; e (d) medir a quantidade do anticorpo anti-SDMA associado com a matriz sólida para determinar a presença ou a quantidade de SDMA na amostra.

24. Kit para determinação da SDMA em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende o dispositivo como definido na reivindicação 8 e um conjugado compreendendo um anticorpo anti- SDMA conjugado a um marcador, em que a afinidade do anticorpo anti-SDMA para o derivado de arginina é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA.

25. Kit para determinação da SDMA em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende uma matriz sólida compreendendo o reagente de captura como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 17 e um conjugado compreendendo um anticorpo anti-SDMA conjugado a um marcador, em que a afinidade do anticorpo anti-SDMA para o derivado de arginina é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA.

26. Fase sólida, caracterizada pelo fato de que compreende um derivado de arginina selecionado a partir do grupo que consiste em N-metilarginina (MMA), MMA acilada, dimetilarginina assimétrica (ADMA) e ADMA acilada, em que o derivado é acoplado de forma covalente à G6PDH, em que a G6PDH é acoplada de forma não covalente a uma partícula.

27. Fase sólida, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que compreende uma matriz porosa.

28. Fase sólida, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a matriz porosa é montada em um alojamento.

29. Fase sólida, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um anticorpo anti- SDMA ligado ao derivado de arginina, em que o anticorpo tem menos afinidade ao derivado do que tem à SDMA.

30. Fase sólida, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao derivado de arginina é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA.

31. Fase sólida, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-SDMA é marcado.

32. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um derivado de arginina selecionado a partir do grupo que consiste em N-metilarginina (MMA), MMA acilada, dimetilarginina assimétrica (ADMA) ou ADMA acilada imobilizada sobre uma matriz sólida, em que o derivado de arginina é complexado com um anticorpo anti-SDMA.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o anticorpo tem menos afinidade ao derivado de arginina imobilizado do que tem à SDMA em solução.

34. Composição, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a afinidade do anticorpo anti-SDMA ao derivado de arginina de MMA imobilizado é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA em solução.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o anticorpo anti-SDMA é marcado.

36. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o derivado de arginina é acoplado de forma covalente a uma proteína.

37. Composição, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em Albumina de Soro Bovino (BSA), ovalbumina, Hemocianina de Lapa Californiana (KLH) e Glicose-6-Fosfato Desidrogenase (G6PDH).

38. Composição, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a proteína é acoplada de forma não covalente à matriz sólida.

39. Composição, de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de que a proteína é acoplada de forma não covalente a uma partícula, que é ligada de forma não difusa à matriz sólida.

40. Método de determinação da dimetil arginina simétrica (SDMA) em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) formar uma mistura compreendendo a amostra e um anti-anticorpo SDMA; (b) colocar a mistura em contato com uma fase sólida compreendendo um derivado de arginina, em que o anticorpo anti- SDMA tem menos afinidade ao derivado de arginina imobilizado do que tem à SDMA em solução; (c) lavar a fase sólida para remover o anticorpo anti- SDMA que não está ligado à fase sólida; e (d) medir a quantidade do anticorpo anti-SDMA associado à fase sólida para determinar a presença ou a quantidade de SDMA na amostra.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a afinidade do anticorpo anti-SDMA à fase sólida compreendendo o derivado de arginina é inferior a cerca de 25% (por exemplo, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 1%, cerca de 0,1%, cerca de 0,01% ou cerca de 0,001%) da afinidade do anticorpo à SDMA em solução.