JP2023521886A - 蛍光消光イムノアッセイ - Google Patents

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Abstract

本発明は、試料中の分析物の存在または量を決定するための方法および試薬に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０１１４０３号および２０２１年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１５２３６５号の出願日の利益を主張する。
本発明は、試料中の分析物の濃度を決定するための蛍光消光イムノアッセイに関する。本発明はまた、イムノアッセイでトレーサーとして使用することができる新たなクラスのフルオレセイン誘導体に関する。
イムノアッセイは、物質の複雑な混合物を頻繁に含有する試験試料、典型的には溶液中の物質の存在または濃度を測定する技術である。典型的には、試験試料は血清または尿などの生体液である。イムノアッセイは、抗体または他のタンパク質が、１種または極めて限られたグループの分子に高い特異性で結合するユニークな能力に基づく。抗体に結合する分子は抗原と呼ばれる。イムノアッセイを行って抗原または抗体のいずれかの存在または濃度を測定することができる（すなわち、抗原または抗体のいずれかが分析物であり得る）。いずれの場合でも、アッセイの特異性は、分析物が、分析される試料中に存在し得る他の物質を除外して、その特異的結合パートナーに結合することができる程度に依存する。特異性の必要性に加えて、正確な測定を可能にするのに十分に高い分析物に対する親和性を有する結合パートナーを選択しなければならない。
イムノアッセイの要件は、特異的結合イベントに応じて測定可能なシグナルを生成する手段である。これは、分析物がその結合パートナーに結合すると起こる、光散乱または屈折率などの一部の物理学的特性の変化を測定することによって達成することができる。ほとんどのイムノアッセイは、検出可能な標識と会合している結合パートナーの使用に依存する。検出可能な標識と会合した結合パートナーはしばしばトレーサーと呼ばれる。放射性元素（ラジオイムノアッセイで使用される）；酵素；蛍光、燐光、および化学発光色素；ラテックスおよび磁性粒子；色素結晶子；金、銀、およびセレンコロイド粒子；金属キレート；補酵素；電気活性基；オリゴヌクレオチド、安定なラジカルなどを含む多種多様な検出可能な標識が使用されている。このような検出可能な標識は、遊離トレーサーと結合トレーサーの分離後に、または結合イベントがトレーサーによって生成されるシグナルの変化をもたらすように系を設計することによって、結合イベントの検出および定量化を可能にする。
しばしば分離イムノアッセイまたは不均一イムノアッセイと呼ばれる、分離ステップを要するイムノアッセイは、複数のステップ、例えば、未結合トレーサーからその結合パートナーに結合しているトレーサーを分離するための表面の慎重な洗浄を頻繁に要する。シグナルが結合によって影響を受けるイムノアッセイは、しばしば分離ステップなしで実行することができる。このようなアッセイは、単に試薬と試料を混合し、物理的測定を行うことによって頻繁に行うことができる。このようなアッセイは均一イムノアッセイと呼ばれ、不均一イムノアッセイよりも実施するのが容易である。
使用される方法にかかわらず、イムノアッセイで生成されるシグナルの解釈には、試料媒体の特性を模倣した標準を参照することが要求される。定性的アッセイの場合、標準は、分析物を含まない参照試料および検出可能と考えられる最低濃度の分析物を有する陽性試料からなり得る。定量的アッセイには、公知の分析物濃度を有する追加の標準が要求される。試験試料のアッセイ反応と標準によって生成されるアッセイ反応の比較によって、試料中の分析物の存在または濃度に関してシグナル強度を解釈することが可能になる。
イムノアッセイは競合であっても非競合であってもよい。競合イムノアッセイでは、試料中の抗体が、抗原と結合するのにトレーサー（すなわち、検出可能な標識に連結した抗体）と競合する。そのため、抗体に結合したトレーサーの量を測定する。競合イムノアッセイでは、抗体に結合したトレーサーの量が、試料中の抗体の濃度に反比例する。これは、試料中に大量の抗体がある場合、より多くの抗原が試料中の抗体に結合し、トレーサーに結合するために利用可能な抗原が少なくなるからである。
非競合イムノアッセイでは、試料中の抗原が抗体に特異的に結合しているか、または試料中の抗体が抗原に特異的に結合している。そのため、抗原または抗体の量を測定する。競合イムノアッセイと異なり、非競合イムノアッセイでは、反応が試料中の抗原の濃度に正比例する。これは、抗原が試料中に存在しない場合、二次抗体上の検出可能な標識は結合しないからである。
蛍光偏光は、例えば、試料中の抗体または抗原の濃度を決定するための検出技術として使用されている。蛍光偏光技術は、直線偏光の光によって励起されると蛍光を発する基を含有する化合物（すなわち、蛍光トレーサー）が、その回転速度に反比例した偏光度を有する蛍光を発するという原理に基づく。したがって、蛍光抗原－抗体複合体は、そのサイズのために、光が吸収される時間と放出される時間との間で回転を制限されるので、抗体に結合している蛍光抗原が直線偏光の光により励起されると、放出される光は高度に偏光したままである。未結合蛍光抗原（すなわち、抗体に結合していない）が直線偏光の光によって励起されると、その回転は対応する蛍光抗原－抗体複合体の回転よりもはるかに速く、未結合蛍光抗原分子はよりランダムに配向され、したがって、放出される光は偏光解消している。蛍光偏光は、イムノアッセイで生成される蛍光抗原－抗体複合体の量を測定するための定量的手段を提供する。
蛍光消光技術も蛍光トレーサーの使用を伴うが、蛍光抗原が抗体に結合していると、蛍光抗原の蛍光が消光されるという原理に基づく。したがって、抗体に結合している蛍光抗原が光により励起されると、未結合蛍光抗原から放出される光の強度と比較して、放出される光の強度が減少する。よって、蛍光消光もイムノアッセイで生成される蛍光抗原－抗体複合体の量を測定する定量的手段を提供する。典型的なアッセイでは、濃度を決定する抗体を含有する試験試料を蛍光抗原と混合し、得られた混合物を光により励起し、放出される光の強度を測定する。試料中に存在する抗体は蛍光抗原に結合する。対照（抗体を含まない）と比較した混合物の放出される光の強度の減少は、試料中の抗原の濃度に反比例する。
別の蛍光消光アッセイでは、濃度を決定する抗原を含有する試験試料を蛍光抗原と蛍光抗原の抗原部分に特異的な抗体の混合物と合わせる。試験試料中に存在する抗原と蛍光抗原が限られた数の抗体について競合する。試験試料中の抗原の濃度が高いほど、試験試料からの抗原に結合する抗体が多くなり、蛍光抗原に結合する抗体が少なくなる（すなわち、より多くの未結合蛍光抗原をもたらす）。蛍光抗原および抗体の濃度を一定に維持することによって、試料抗原－抗体複合体と蛍光抗原－抗体複合体の比が試料中に存在する抗原の量に正比例する。同様に、未結合蛍光抗原の量が試料中に存在する抗原の量に正比例する。したがって、混合物を光により励起し、放出される光の強度を測定することによって、試料中の抗原の量を定量的に決定することができる。試験試料中の抗原の濃度は放出される光の強度に正比例する。
これらの技術は抗体－抗原結合パートナーに限定されない。同様のアッセイを、タンパク質（抗体ではない）を使用して実施して、タンパク質に特異的に結合する基質の存在または濃度を決定することができる。これらのアッセイにおけるトレーサーは、例えば、タンパク質に連結した検出可能な標識またはタンパク質に結合する分子に連結した検出可能な標識であり得る。
イムノアッセイは、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの、試験試料中の物質の存在または濃度を測定する他の分析方法にしばしば関連する抽出および他の複雑な試料後処理手順および長いアッセイ時間を回避するので、これらの他の分析方法よりも有利である。
しかしながら、より高い感度を示し、実施がより容易であり、実施があまり高価でないイムノアッセイが当技術分野で依然として必要とされている。
本出願におけるいずれの参考文献の引用も、このような参考文献が本出願に対する先行文献であるものと解釈されるべきではない。
本発明のこれらのおよび他の特徴および利点は、本開示の残りの部分、特にその全てが本発明の原理を例として示す好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるだろう。
本発明は、試料中の分析物の存在または量を決定する方法に関する。本方法は、
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料を蛍光トレーサーおよび結合パートナーと接触させてアッセイ組成物を得るステップであって、結合パートナーは分析物および蛍光トレーサーに特異的である、ステップと；
（ｉｉｉ）アッセイ組成物を直線偏光されていない第１の波長の光で照射するステップと；
（ｉｖ）第２の波長で放出される光の強度を測定するステップと
を伴い、
第２の波長で放出される光の強度が試料中の分析物の濃度に比例する。
本方法は溶液中でまたは乾式スライドアッセイとして実施され得る。一実施形態では、分析物がＳＤＭＡである。一実施形態では、本方法が分離ステップを伴わない。
本発明はまた、本発明の方法に使用することができる蛍光トレーサーを包含する。一実施形態では、蛍光トレーサーが、
Figure 2023521886000001
（式中、Ｘ＝－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、または－ＳＯ３Ｈである）
からなる群から選択される。
本発明はまた、本方法に使用することができるスライドを包含する。
本発明はまた、本発明の方法に使用することができる置換蛍光トレーサーを合成するための中間体として有用な誘導体化フルオレセイン分子を包含する。
本方法の一般原理を示す概略図である。 フルオレセイン分子の４’位を官能化するための合成スキームを示す概略図である。 実施例１５に記載される、様々なＭｅｌ－トレーサーについての［抗Ｍｅｌ－Ａｂ］／［Ｍｅｌ－トレーサー］の比の関数としての蛍光変化パーセントのプロットである。 実施例１６に記載される、メラミンをＭｅｌ－Ｆおよび抗Ｍｅｌ－Ａｂの溶液に添加した場合の、蛍光強度対メラミン濃度のプロットである。 実施例１７に記載される、様々な液体中のＭｅｌ－Ｆ、Ｍｅｌ－Ｆ＋抗Ｍｅｌ－ＡＢ、およびＭｅｌ－Ｆ＋抗Ｍｅｌ－ＡＢ＋Ｍｅｌ溶液についての蛍光強度のプロットである。 実施例１８に記載される、メラミン濃度の関数としてのメラミンを含有する牛乳を添加したＭｅｌと抗Ｍｅｌ－Ａｂの混合物の蛍光のプロットである。 実施例１９に記載される、ストレプトアビジンをビオチン－Ｆの溶液およびビオチン－ＥＤの溶液に添加した場合の、蛍光変化パーセンテージ対ストレプトアビジンとトレーサーのモル比のプロットである。 実施例２０に記載される、Ｔ３－Ｆ（コンジュゲートのみ）；Ｔ３－Ｆおよび抗Ｔ４－Ｍａｂ（コンジュゲートとモノクローナル抗体）；およびＴ３－Ｆ、抗Ｔ４－Ｍａｂ（コンジュゲートとモノクローナル抗体）、およびＴ４の溶液の相対蛍光のプロットである。 実施例２０に記載される、時間の関数としての、Ｔ３－ＦをＰＢＳおよびＰＢＳ＋抗Ｔ４－Ｍａｂ（すなわち、ＡＢ）に添加した場合の蛍光変化パーセンテージならびにＴ４添加後（ＰＢＳ＋Ａｂ＋Ｔ４）の消光回復のプロットである。 実施例２１に記載される、様々な濃度のＴ４をＴ３－Ｆおよび抗Ｔ４－Ｍａｂの溶液に添加した場合の、蛍光強度対Ｔ４濃度のプロットである。 実施例２２に記載される、凍結乾固前および後のＴ３－ＦまたはＴ３－Ｆと抗Ｔ４－Ｍａｂの様々な溶液についての蛍光強度のプロットである。 実施例２２に記載される、Ｔ４－５とＡｂ－Ｃｙ５の比の関数としての、Ｔ４－５およびＡｂ－Ｃｙ５を含有する溶液に蛍光強度のプロットである。 実施例２３に記載される、Ｔ４－５とＡｂ－Ｃｙ５の比の関数としての、Ｔ４－５およびＡｂ－Ｃｙ５を含有する溶液の蛍光変化パーセンテージのプロットである。 実施例２３に記載される、Ｔ４を添加したＴ４－ＦおよびＡｂ－Ｃｙ５の溶液の蛍光強度対Ｔ４濃度のプロットである。 実施例２３に記載される、Ｔ４を添加したＴ４－ＦおよびＡｂ－Ｃｙ５の蛍光回復パーセンテージ対Ｔ４濃度のプロットである。 実施例２４に記載される、Ｔ４を添加したＴ３－ＦおよびＡｂ－Ｃｙ３を含有する様々な溶液の蛍光強度対Ｔ４濃度のプロットである。 実施例２４に記載される、Ｔ４を添加したＴ４－ＦおよびＡｂ－Ｃｙ３を含有する様々な溶液の蛍光強度対Ｔ４濃度のプロットである。 実施例２４に記載される、溶液を４９０ｎｍで励起し、発光を６１５ｎｍで測定した場合の、Ｔ４を添加したＴ４－ＦおよびＡｂ－Ｃｙ３を含有する様々な溶液の蛍光強度対Ｔ４濃度のプロットである。 実施例２５に記載される、蛍光トレーサーに連結した様々なベータ－ラクタム抗生物質の溶液；トレーサーおよび抗体（すなわち、Ａｂ）の溶液；ならびにトレーサー、抗体、およびアンピシリンまたはセフォタキシムの溶液の蛍光変化パーセンテージのプロットである。 実施例２６に記載される、ＳＤＭ－ＦまたはＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆの溶液；ＳＤＭ－ＦまたはＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆおよび抗スルファジメトキシンモノクローナル抗体（Ａｂ）の溶液；ならびにＳＤＭ－ＦまたはＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆ、Ａｂ、およびＳＤＭの溶液の相対蛍光パーセンテージのプロットである。 実施例２７に記載される、Ｔ３－Ｆおよびモノクローナル抗Ｔ４－Ｍａｂの様々な溶液の蛍光強度対モノクローナル抗Ｔ４－ＭａｂとＴ３－Ｆのモル比のプロットである。 本明細書に記載される乾式スライドアッセイ方法に使用されるスライドの様々な実施形態の構造を示す図である。 同上。 同上。 本明細書に記載される乾式スライドアッセイ方法に使用されるスライドの例示的な実施液体を示す図である。 同上。 本明細書に記載される乾式スライドアッセイ方法を図１８Ｃに示される乾式スライドを使用してどのように実施するかを示す図である。 実施例２８に記載される、抗体：コルチゾール－４－Ｆｌの比に対する蛍光消光パーセントのプロットである。 実施例２８に記載される、抗体：コルチゾール－４－Ｆｌの比に対する、および抗体：コルチゾール－５－Ｆｌの比に対する蛍光消光パーセントのプロットである。 抗体にコンジュゲートしたＢＨＱ１０クエンチャーの当量の関数としての、蛍光トレーサーＡ３がＳＤＭＡに対する抗体と複合体を形成した場合の蛍光の減少を示す図である。 試料が様々な濃度のアッセイに潜在的に干渉し得る化合物（すなわち、干渉物質）を含む、一定量のＳＤＭＡ（μｇ／ｄＬ）を含有する試料中のＳＤＭＡの濃度を決定するためのアッセイ（フィルタリング層を有するスライドを使用）の結果を示す図である。干渉物質は（Ａ）溶血（０～５００ｍｇ／ｄＬ）、（Ｂ）ビリルビン（０～３０ｍｇ／ｄＬ）、（Ｃ）イントラリピッド（０～１０００ｍｇ／ｄＬ）および（Ｄ）全血（０～１０％）である。 同上。 同上。 同上。 実施例３３に記載される、ＤＦＦ、ＳＤＭＡ－ＤＦＦ、ＤＣＦ、ＳＤＭＡ－ＤＣＦ、Ｆｌ、およびＳＤＭＡ－ＦＬの吸収スペクトルを示す図である。 実施例３３に記載される、ＳＤＭＡ－ＤＦＦ、ＳＤＭＡ－ＤＣＦ、Ｆｌ、およびＳＤＭＡ－ＦＬの発光スペクトルを示す図である。 実施例３４に記載される、増加する抗体濃度の関数としての異なるＳＤＭＡトレーサーについての蛍光消光パーセントを示す図である。 実施例３４に記載される、ＢＨＱ１０（４当量）にコンジュゲートした増加する濃度の抗ＳＤＭＡ抗体の関数としての異なるＳＤＭＡトレーサーについての蛍光消光パーセントを示す図である。 実施例３４に記載される、ＳＤＭＡをＳＤＭＡ－ＤＦＦトレーサー／ＳＤＭＡ抗体溶液と合わせた場合の、ＳＤＭＡ濃度の関数としての蛍光強度の増加を示す図である。 実施例３４に記載される、ＳＤＭＡをＳＤＭＡ－ＤＣＦトレーサー／ＳＤＭＡ抗体溶液と合わせた場合の、ＳＤＭＡ濃度の関数としての蛍光強度の増加を示す図である。 実施例３４に記載される、ＳＤＭＡをＳＤＭＡ－ＤＣＦトレーサー／ＳＤＭＡ抗体溶液と合わせた場合の、ＳＤＭＡ濃度の関数としての蛍光強度の増加を示す図である。 実施例３６に記載される、リボフラビン結合タンパク質の関数としての牛乳におけるリボフラビン蛍光を示す図である。 実施例３７に記載される乾式スライドを使用したＳＭＤＡ分析からの出力を示す図である。 実施例４０に記載される、蛍光消光パーセント対抗体：ＣＡ－Ｆｌの比のプロットである。 実施例４０に記載される、コール酸をＣＡ－Ｆｌおよびα－コール酸抗体のＰＢＳ中溶液に添加した場合の、蛍光強度対コール酸濃度のプロットである。 実施例４０に記載される、タウロコール酸をＣＡ－Ｆｌおよびα－コール酸抗体のＰＢＳ中溶液に添加した場合の、蛍光強度対コール酸濃度のプロットである。 実施例４２に記載される、異なる濃度のコール酸を含有するＣＡ－Ｆｌおよびα－コール酸抗体の溶液の蛍光対胆汁酸の濃度のプロットである。 実施例４２に記載される、異なる濃度のタウロコール酸を含有するＣＡ－Ｆｌおよびα－コール酸抗体の溶液の蛍光対胆汁酸の濃度のプロットである。 実施例４７に記載される、蛍光強度（λｅｘ＝４７０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）対ＣｙｓＢ濃度（μｇ／ｍＬ）のプロットである。 実施例４８に記載される、乾式スライドフォーマットでの蛍光強度の増加率（時間間隔３０～１００秒にわたって測定される）対ＣｙｓＢの濃度のプロットである。 実施例５１に記載される、抗ＣｙｓＢ抗体とＣｙｓＢペプチドＰ６－Ｆｌの比に対する、および抗体とＰ７－Ｆｌの比に対する蛍光消光パーセントのプロットである。 実施例５１に記載される、抗ＣｙｓＢ抗体とＣｙｓＢペプチドＰ６－ＤＦＦの比に対する、および抗体とＰ７－ＤＦＦの比に対する蛍光消光パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、抗ＣｙｓＢ抗体とＣｙｓＢペプチドＰ６－ＦｌまたはＰ６－ＤＦＦの比に対する、および抗体とＰ６－４－ＦｌまたはＰ－４－ＤＦＦの比に対する蛍光消光パーセントのプロットである。 抗ＣｙｓＢ抗体（Ａｂ）とＣｙｓＢペプチドＰ６－Ｆｌの比に対する、および抗体－ＢＨＱ１０（Ａｂ－ＢＨＱ１０）とＰ６－Ｆｌの比に対する蛍光消光パーセントのプロットである。 抗ＣｙｓＢ抗体とＣｙｓＢペプチドＰ６－ＤＦＦの比に対する、および抗体－ＢＨＱ１０（Ａｂ－ＢＨＱ１０）とＰ６－ＤＦＦの比に対する蛍光消光パーセントのプロットである。 実施例５１に記載される、ＣｙｓＢペプチドＰ６、Ｐ７またはＰ１４濃度の関数としての、Ｐ６、Ｐ７、またはＰ１４をＰ６－Ｆｌおよび抗ＣｙｓＢ抗体の溶液、またはＰ６－ＤＦＦおよび抗ＣｙｓＢ抗体の溶液に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５１に記載される、ＣｙｓＢタンパク質濃度の関数としての、ＣｙｓＢ完全長タンパク質を洗浄剤サルコシルの存在下でＰ６－Ｆｌおよび抗ＣｙｓＢ抗体の溶液に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５１に記載される、ＣｙｓＢタンパク質濃度の関数としての、ＣｙｓＢ完全長タンパク質を洗浄剤サルコシルの存在下でＰ６－ＤＦＦおよび抗ＣｙｓＢ抗体の溶液に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５１に記載される、ＣｙｓＢタンパク質濃度の関数としての、血清中に添加されたＣｙｓＢ完全長タンパク質を洗浄剤サルコシルの存在下でＰ６－Ｆｌおよび抗ＣｙｓＢ抗体（Ａｂ）の溶液、またはＰ６－ＦｌおよびＢＨＱ１０にコンジュゲートした抗ＣｙｓＢ抗体（Ａｂ－ＢＨＱ１０）の溶液に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５１に記載される、ＣｙｓＢタンパク質濃度の関数としての、血清中に添加されたＣｙｓＢ完全長タンパク質を洗浄剤サルコシルの存在下でＰ６－ＤＦＦおよび抗ＣｙｓＢ抗体（Ａｂ）の溶液、またはＰ６－ＤＦＦおよびＢＨＱ１０にコンジュゲートした抗ＣｙｓＢ抗体（Ａｂ－ＢＨＱ１０）の溶液に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体とＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１－Ｆｌ（Ａｂ）の比に対する、および抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体－ＢＨＱ１０とペプチドＰ１－Ｆｌの比に対する蛍光消光パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体とＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１－ＤＦＦの比（Ａｂ）に対する、および抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体－ＢＨＱ１０とＰ１－ＤＦＦの比（Ａｂ－ＢＨＱ１０）に対する蛍光消光パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、Ｐ１濃度の関数としての、ＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１をＰ１－Ｆｌおよび抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の溶液（Ａｂ）、またはＰ１－Ｆｌおよび抗体－ＢＨＱ１０の溶液（Ａｂ－ＢＨＱ１０）に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、Ｐ１濃度の関数としての、ＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１をＰ１－ＤＦＦおよび抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の溶液（Ａｂ）、またはＰ１－ＤＦＦおよび抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体－ＢＨＱ１０の溶液に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、Ｐ１濃度の関数としての、チャコール処理血清（ｃｈａｒｃｏａｌ ｓｔｒｉｐｐｅｄ ｓｅｒｕｍ）に添加されたＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１をＰ１－Ｆｌおよび抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の溶液に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、Ｐ１濃度の関数としての、チャコール処理血清に添加されたＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１をＰ１－ＤＦＦおよび抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の溶液に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、ＮＴ－プロＢＮＰタンパク質濃度の関数としての、ＰＢＳ中ＮＴ－プロＢＮＰ完全長タンパク質をＰ１－Ｆｌおよび抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の溶液（Ｐ１－Ｆｌ／Ａｂ＝１：１）に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、ＮＴ－プロＢＮＰタンパク質濃度の関数としての、ＰＢＳ中ＮＴ－プロＢＮＰ完全長タンパク質をＰ１－ＤＦＦおよび抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の溶液（Ｐ１－ＤＦＦ／Ａｂ＝１：１）に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、ＮＴ－プロＢＮＰタンパク質濃度の関数としての、血清中ＮＴ－プロＢＮＰ完全長タンパク質をＰ１－Ｆｌおよび抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の溶液（Ｐ１－Ｆｌ／Ａｂ＝２：１）に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 実施例５２に記載される、ＮＴ－プロＢＮＰタンパク質濃度の関数としての、血清中ＮＴ－プロＢＮＰ完全長タンパク質をＰ１－ＤＦＦおよび抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の溶液（Ｐ１－ＤＦＦ／Ａｂ＝２：１）に添加した場合の蛍光回復パーセントのプロットである。 本明細書に記載される乾式スライドアッセイ方法に使用されるスライドの例示的な実施形態を示す図である。 本明細書に記載される乾式スライドアッセイ方法に使用されるスライドの例示的な実施形態を示す図である。
本発明は、試料中の分析物の存在または量を決定する方法に関する。
本発明はまた、本方法に使用することができるスライドを包含する。
本発明はまた、本発明の方法に使用することができる置換蛍光トレーサーを包含する。
本発明はまた、本発明の方法に使用することができる置換蛍光トレーサーを合成するための中間体として有用な誘導体化フルオレセイン分子を包含する。
１．定義
「分析物」という用語は、この用語が本明細書で使用される場合、試料中のその存在または濃度を決定することを意図しており、結合パートナー（例えば、抗原または抗体）に結合する（すなわち、これと複合体を形成する）、生体液などの試料中に存在する分子（例えば、抗体または抗原）を指す。分析物は、例えば、タンパク質、糖タンパク質、糖類、多糖、アミノ酸、置換アミノ酸、メチル化アミノ酸、ホルモン、抗生物質、核酸、代謝産物、または前記のいずれかの誘導体であり得る。
「複合体」は、この用語が本明細書で使用される場合、分子実体間の共有結合を伴わない２つ以上の分子実体（イオン性であっても帯電していなくてもよい）の会合によって形成される種である。複合体の例は、抗体と抗原（または抗原誘導体）の会合およびペプチドと受容体の会合である。
「ハプテン」という用語は、この用語が本明細書で使用される場合、動物に注射した場合に抗体形成を誘導しないが、動物に注射した場合に担体タンパク質に連結して免疫応答を誘発する抗原（免疫原）を提供して、抗体の形成をもたらすことができる分子である。得られた抗体は、公知の抗体単離技術によって単離され得る。ハプテンは得られた抗体に結合する。
「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野で認識されている意味を有する、すなわち、体に導入した場合に、抗体の産生を刺激する物質である。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、当技術分野で認識されている意味を有する、すなわち、抗原の体への導入のために産生されるタンパク質である。抗体はインビボで、インビトロで、組換え的に、または合成的に産生され得る。「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、または抗体の抗原結合フラグメントを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、インタクト抗体の抗原結合部位または可変領域を含むインタクト抗体の一部であって、インタクト抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメインを含まない一部である。抗原結合抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む任意の抗体クラスであり得る。
「ｍＡｂ」または「Ｍａｂ」という用語は、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体の略語である。
「結合パートナー」という句は、この句が本明細書で使用される場合、特異性を有して第２の分子に結合する分子を意味する。例えば、第２の分子が抗原／抗体であり得、「結合パートナー」が抗体／抗原であり得る。同様に、第２の分子が受容体の基質であり得、「結合パートナー」が受容体であり得るか、または第２の分子が受容体であり得、「結合パートナー」が基質であり得る。さらに、結合パートナーがアプタマーであり得る。結合パートナーがレクチンであり得、第２の分子が炭水化物であり得る。第２の分子が分析物であり得る。
「特異性を有して」、「特異的に結合する」、「特異性を有して分析物に結合する」、「分析物に特異的である」という句、および同様の句は、本明細書で使用される場合、当技術分野で認識されている意味を有する、すなわち、結合パートナーが、分析物（または分析物のクラス）を認識し、他の非特異的分子に結合するよりも高い親和性でこれに結合する。例えば、他の非特異的分子よりも効率的に抗原に結合する、抗原に対して産生される抗体は、抗原に特異的に結合すると記載され得る。結合特異性は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはウエスタンブロットアッセイなどの当技術分野で公知の方法論を使用して試験することができる。非特異的分子は、結合パートナーとその対応する分析物との間で示される反応性の２５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満で結合パートナーに結合する分子である。
「分析物－コンジュゲート」という用語は、本明細書で使用される場合、第２の分子に連結している結合パートナー（例えば、抗体または抗原）によって認識され、これに結合する分子（例えば、抗原または抗体）を指す。分析物－コンジュゲートの特性は、これが分析物に対する結合パートナーによって認識され、これに結合するように、目的の分析物に対する十分な構造類似性を有することである。
例えば、分析物が抗原である場合、かなりの割合の分析物－コンジュゲートが、分析物－コンジュゲートが抗体の結合部位（複数可）について抗原と競合することができるように、１つまたは複数の決定基またはエピトープ部位（以下、「エピトープ部分」と呼ばれる）を定義するような抗原と実質的に同じ構造、空間、および極性配置を有する。ほとんどの場合、分析物－コンジュゲートは、試料中のアッセイされる分析物と、かなりの割合の分子表面について同じまたは実質的に同じ構造および電荷分布（空間的および極性配置）を有する。
分析物－コンジュゲートは、「トレーサー」を提供するように検出可能な標識に連結しているエピトープ部分であり得る（すなわち、第２の分子部分が検出可能な標識である）。
分析物－コンジュゲートは、トレーサーを提供するように検出可能な標識に連結したハプテンであり得る。換言すれば、トレーサーを提供するように検出可能な標識に連結しているエピトープ部分がハプテンの部分、すなわち、免疫応答をもたらすために使用されたハプテンの部分である。ハプテン上の官能基を化学修飾してハプテンを検出可能な標識に連結することができる。
分析物－コンジュゲートは、トレーサーを提供するように検出可能な標識に連結している抗体などの結合タンパク質であり得る。
「トレーサー」は、この用語が本明細書で使用される場合、検出可能な標識を含む分析物－コンジュゲートである。
フルオレセインは、以下の構造：
Figure 2023521886000002
を有する分子である。以下に示されるように、フルオレセインは開いた形態および閉じた形態で存在することができ、開いた形態は回転異性体のペアとして存在することが認識されるだろう：
Figure 2023521886000003
フルオレセインという用語は、本明細書で使用される場合、開いた形態および閉じた形態ならびに開いた形態の両回転異性体を含む。フルオレセインという用語は、本明細書で使用される場合、イオン形態および／または塩形態も含む。フルオレセイン分子の炭素原子のナンバリングは、分子の開いた形態を考慮するか閉じた形態を考慮するかに応じて、当技術分野で変化する。したがって、フルオレセインおよびフルオレセインの誘導体に関する文献は、炭素原子ナンバリングに関して均一ではない。上に示されるナンバリングが本開示の目的のために使用される。
「蛍光トレーサー」という用語は、この用語が本明細書で使用される場合、エピトープ部分が、直接または連結基により蛍光を発する分子に連結している、分析物－コンジュゲートを意味する。ある実施形態では、エピトープ部分がフルオレセインから誘導される分子に連結している。好ましくは、エピトープ部分がフルオレセインまたはジフルオロフルオレセインに連結している。
「エピトープ部分」という句は、本明細書で使用される場合、分析物がその結合パートナーによって認識され、これに特異的に結合することができるように、分析物の１つまたは複数の決定基またはエピトーブ部位を定義するような構造、空間、および極性配置を有する分析物の一部を意味する。「エピトープ部分」という句は、本明細書で使用される場合、エピトープ部分またはエピトープ部分を含む分子実体を意味する。
一実施形態では、蛍光トレーサーが、
Figure 2023521886000004
（式中、Ｔはエピトープ部分をフルオレセイン分子に連結する結合または二価基（すなわち、連結基）であり、くねった線はＴ－エピトープ部分がフルオレセイン分子の炭素に結合した任意の水素に取って代わることができることを示す）
である。
「クエンチャー」という用語は、本明細書で使用される場合、蛍光消光イムノアッセイにおいて、結合パートナーに連結すると、同じ結合パートナーに複合体化しているが、クエンチャーに連結していない場合に蛍光トレーサーによって放出される光の強度と比較して、結合パートナーに複合体化している蛍光トレーサーによって放出される光の強度を低下させる部分を意味する。
「約」という用語は、本明細書で使用される場合、±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±２％、最も好ましくは±１％を意味する。
「実質的に含まない」という句は、本明細書で使用される場合、１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは２％未満、最も好ましくは１％未満を意味する。
「比例する」という句は、本明細書で使用される場合、測定された値と何かの量との間の対応または関係が存在することを意味する。例えば、「第２の波長で放出される光の強度が試料中の分析物の濃度に比例する」という句は、第２の波長で放出される光の強度が試料中の分析物の濃度に対応することを意味する。測定された値および量は線形相関し得る。
「高分子」という用語は、本明細書で使用される場合、約５００ダルトンより高い分子量を有する化合物を意味する。一実施形態では、分子量が約２２００ダルトンより高い。一実施形態では、分子量が約５５００ダルトンより高い。一実施形態では、分子量が約１１０００ダルトンより高い。高分子の分子量は典型的には約２００キロダルトン未満である。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約３アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約５アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約１０アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約２０アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約５０アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約１００アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約２００アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約３００アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約４００アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約５００アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約６００アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約７００アミノ酸より長いポリペプチドである。一実施形態では、高分子が、アミノ酸長が約８００アミノ酸より長いポリペプチドである。高分子がポリペプチドである場合、アミノ酸長は典型的には約１０００アミノ酸未満である。ポリペプチドはグリコシル化されていてもよい。ポリペプチドは抗体であり得る。他の実施形態では、高分子が炭水化物、多糖、脂質または核酸であり得る。
「ＳＤＭＡ」という用語は、遊離ＳＤＭＡとしても公知である、対称性ジメチルアルギニン、およびその誘導体を意味する。ＳＤＭＡの誘導体の例としては、アルキル化ＳＤＭＡおよびアシル化ＳＤＭＡが挙げられる。ＳＤＭＡに特異的な一定の抗体は米国特許第９９７０９２７号に記載されている。
２．方法の説明
本発明の方法は、
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料を蛍光トレーサーおよび結合パートナーと接触させてアッセイ組成物を得るステップであって、結合パートナーは分析物および蛍光トレーサーに特異的である、ステップと；
（ｉｉｉ）アッセイ組成物を直線偏光されていない第１の波長の光で照射するステップと；
（ｉｖ）第２の波長で放出される光の強度を測定するステップと
を含み、
第２の波長で放出される光の強度が試料中の分析物の濃度に比例する。
本発明の別の実施形態では、本方法が、
（ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
（ｉｉ）試料を蛍光トレーサーおよび結合パートナーと接触させてアッセイ組成物を得るステップであって、結合パートナーは分析物および蛍光トレーサーに特異的である、ステップと；
（ｉｉｉ）アッセイ組成物を直線偏光されていない第１の波長の光で照射するステップと；
（ｉｖ）第２の波長で放出される光の強度を測定するステップと
を含み、
第２の波長で放出される光の強度が試料中の分析物の濃度に比例する。
よって、一実施形態では、第１の波長の光が直線偏光されておらず、別の実施形態では、第１の波長の光が直線偏光されている。
一実施形態では、第２の波長で放出される光の強度と試料中の分析物の濃度との間に線形関係が存在する。
理論によって拘束されることを望むものではないが、本方法の基礎は、トレーサーが結合パートナーに結合している場合に、蛍光トレーサーの蛍光が消光されることである。したがって、蛍光トレーサーが結合パートナーに結合している場合、これが第１の波長の光により励起されると、第２の波長で放出される光の強度が、トレーサーが結合パートナーに結合していない場合に放出される強度と比較して、低下する（消光される）。試料中に存在する分析物および蛍光トレーサーは結合パートナー上の限られた数の結合部位について競合して、分析物－結合パートナー複合体およびトレーサー－結合パートナー複合体の形成をもたらす。試料中の分析物の濃度が高いほど、結合パートナーに結合することができる蛍光トレーサー分子の数が少なくなり、したがって、未結合になる蛍光トレーサー分子が多くなる。したがって、第２の波長で放出される光の強度は、試料中の分析物の量に正比例する。この一般原理を図１に示す。分析物に対する結合パートナーの親和性および蛍光トレーサーに対する結合パートナーの親和性は異なり得る。
一実施形態では、分析物が抗原であり、蛍光トレーサーが、蛍光標識に連結した抗原のエピトープ部分を含む分析物－コンジュゲートであり、結合パートナーが抗原に対する抗体である。
一実施形態では、蛍光トレーサーが４’－置換蛍光トレーサー、４’－置換蛍光トレーサー誘導体、５－置換蛍光トレーサー、および５－置換蛍光トレーサー誘導体からなる群から選択される。
一実施形態では、蛍光トレーサーが４’－置換蛍光トレーサーである。
一実施形態では、蛍光トレーサーが４’－置換蛍光トレーサー誘導体である。
好ましくは、蛍光トレーサーが４’－置換蛍光トレーサーまたは４’－置換蛍光トレーサー誘導体であり、最も好ましくは、蛍光トレーサーが４’－置換蛍光トレーサーである。
一実施形態では、４’－置換蛍光トレーサーが構造Ａ１である。
一実施形態では、４’－置換蛍光トレーサーが構造Ａ２である。
一実施形態では、４’－置換蛍光トレーサーが構造Ａ３である。
一実施形態では、蛍光トレーサーが５－置換蛍光トレーサーである。
一実施形態では、蛍光トレーサーが５－置換蛍光トレーサー誘導体である。
一実施形態では、５－置換蛍光トレーサーが構造Ａ４である。
一実施形態では、５－置換蛍光トレーサーが構造Ａ５である。
一実施形態では、５－置換蛍光トレーサーが構造Ａ６である。
一実施形態では、トレーサーが以下の構造：
Figure 2023521886000005
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する４’－置換フルオレセイントレーサーまたは４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体である。
一実施形態では、トレーサーが以下の構造：
Figure 2023521886000006
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する４’－置換フルオレセイントレーサーまたは４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体である。
一実施形態では、トレーサーが以下の構造：
Figure 2023521886000007
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する４’－置換フルオレセイントレーサーまたは４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体である。
一実施形態では、トレーサーが以下の構造：
Figure 2023521886000008
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する５－置換フルオレセイントレーサーまたは５－置換フルオレセイントレーサー誘導体である。
一実施形態では、トレーサーが以下の構造：
Figure 2023521886000009
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する５－置換フルオレセイントレーサーまたは５－置換フルオレセイントレーサー誘導体である。
一実施形態では、トレーサーが以下の構造：
Figure 2023521886000010
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する５－置換フルオレセイントレーサーまたは５－置換フルオレセイントレーサー誘導体である。
分析物の分子量は広範囲にわたって変化し得る。典型的には、分析物の分子量が５０ダルトンより高い。低分子である分析物については、分析物の分子量が典型的には約５０～約４０００ダルトン、好ましくは約１００～約２０００ダルトンの間である。分析物がタンパク質などのより大型の分子である場合、分子量は２０００ダルトンより高くてもよい。分析物がタンパク質などのより大型の分子である場合、分子量は４０００ダルトンダルトンより高いこともあり得る。
本発明の方法を使用して多種多様な分析物をアッセイすることができる。例示的な分析物には、それだけに限らないが、低分子（例えば、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、モノメチルアルギニン（ＭＭＡ）、メラミン、抗生物質、Ｔ４、β－ラクタム抗生物質（ペニシリンなど）、サルファ薬、セファロスポリン、およびステロイド（例えば、プロゲステロンおよびコルチゾール）、ならびにタンパク質（例えば、シスタチン－Ｂ）および抗体などの高分子が含まれる。
一実施形態では、分析物がＳＤＭＡである。
一実施形態では、分析物がメラミンである。
一実施形態では、分析物がＴ４である。
一実施形態では、分析物がコルチゾールである。別の実施形態では、分析物が胆汁酸である。
一実施形態では、分析物がプロゲステロンである。
一実施形態では、分析物がシスタチン－Ｂである。特定の実施形態では、分析物がイヌまたはネコシスタチン－Ｂである。一実施形態では、分析物がＮＴ－プロＢＮＰである。特定の実施形態では、分析物がイヌまたはネコＮＴ－プロＢＮＰである。
一実施形態では、分析物が抗生物質である。
例示的な抗生物質には、それだけに限らないが、アモキシシリン、アンピシリン、セファセトリル、セフキノム、セファゾリン、セフォペラゾン、セフチオフル、セファレキシン、セファロニウム、クロキサシリン、デスアセチルセファピリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、オキサシリン、セファピリン、デスフロイルセフチオフル、セフロキシム、およびペニシリンが含まれる。
一実施形態では、分析物が、欧州連合によって要求される、牛乳において試験しなければならない抗生物質からなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
一実施形態では、分析物が、ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）、アンピシリン、アモキシシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、セファピリン、デスアセチルセファピリン、セフチオフル、デスフロイルセフチオフル、セフキノム、セファロニウム、セファゾリン、セファセトリル、セファレキシン、セフロキシム、およびセフォペラゾンからなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
一実施形態では、分析物が、米国食品医薬品局によって要求される、牛乳において試験しなければならない抗生物質からなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
一実施形態では、分析物が、ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）、アンピシリン、アモキシシリン、クロキサシリン、セファピリン、セフチオフル、およびデスフロイルセフチオフルからなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
一実施形態では、分析物が高分子である。一実施形態では、高分子がポリペプチドである。
一実施形態では、アッセイ組成物が溶液である。一実施形態では、アッセイ組成物が水溶液である。
試料は、典型的には液体であり、一般的にはそれだけに限らないが、尿、血清、牛乳、唾液、血漿、全血、汗、涙、および脊髄液などの生体液である。試料は、典型的には液体であるが、固体試料も本発明の方法に使用され得る。固体材料には、それだけに限らないが、糞便試料および固形組織試料、固体材料の抽出物、および乾燥液体試料が含まれる。一実施形態では、固体試料が液体に溶解または懸濁される。
一実施形態では、試料が水溶液である。
一実施形態では、試料が尿である。
一実施形態では、試料が血清である。
一実施形態では、試料が牛乳である。
一実施形態では、試料が唾液である。
一実施形態では、試料が血漿である。
一実施形態では、試料が全血である。
一実施形態では、試料が汗である。
一実施形態では、試料が涙である。
一実施形態では、試料が脊髄液である。
一実施形態では、試料が糞便試料または糞便抽出物である。
典型的には、試料サイズが約１μＬ～約５ｍＬの範囲である。一実施形態では、試料サイズが好ましくは約２μＬ～約２０μＬ、より好ましくは約２μＬ～約１５μＬ、最も好ましくは約２μＬ～約１０μＬである。一実施形態では、試料サイズが約５０μＬ～約２００μＬの範囲である。一実施形態では、試料サイズが約７５μＬ～約１５０μＬである。一実施形態では、試料サイズが約１００μＬである。
アッセイ溶液中の分析物の濃度は広範囲にわたって変化し得る。一般的に、アッセイ溶液中の分析物の濃度は約０．１ｎＭ～約１０００ｎＭの範囲であり、典型的には約１０ｎＭ～約１００ｎＭである。より濃縮された試料を適切な希釈剤で簡単に希釈してアッセイに適した濃度を有する希釈された試料を得ることができることが容易に理解されるだろう。本発明の方法は極めて感受性であり、一部の分析物については、４ｐｐｂという低い濃度の分析物を検出するために使用することができる。
アッセイ溶液中の結合パートナーの濃度は、典型的には約０．１ｎＭ～約２０００ｎＭの範囲である。一実施形態では、アッセイ溶液中の結合パートナーの濃度が約１ｎＭ～約１０００ｎＭの範囲である。一実施形態では、アッセイ溶液中の結合パートナーの濃度が約５ｎＭ～約５００ｎＭの範囲である。一実施形態では、アッセイ溶液中の結合パートナーの濃度が約１０ｎＭ～約２００ｎＭの範囲である。
様々な実施形態では、結合パートナーが固体支持体に連結している。固体支持体の例としては、それだけに限らないが、反応容器、粒子、微粒子、マイクロビーズ、バーコードビーズ、磁性粒子、または磁性バーコードビーズが挙げられる。
アッセイ溶液中の蛍光トレーサーの濃度は、典型的には約０．１～約１０００ｎＭの範囲である。一実施形態では、アッセイ溶液中の蛍光トレーサーの濃度が約１ｎＭ～約５００ｎＭの範囲である。一実施形態では、アッセイ溶液中の蛍光トレーサーの濃度が約１０ｎＭ～約２００ｎＭの範囲である。
典型的には、アッセイ溶液中の結合パートナーと蛍光トレーサーの比が約０．０５～約１０の範囲である。一実施形態では、アッセイ溶液中の結合パートナーと蛍光トレーサーの比が約０．１～約８の範囲である。一実施形態では、アッセイ溶液中の結合パートナーと蛍光トレーサーの比が約０．５～約５の範囲である。しかしながら、アッセイの精度は、結合パートナーとトレーサーについて、および結合パートナーと分析物についての正確な比を有することに依存することが理解されよう。適切な比は、結合パートナーに対する分析物（およびトレーサー）の親和性に依存する。当業者であれば、適切な比が何であるかを容易に決定することができるだろう。
一実施形態では、結合パートナーと蛍光トレーサーの比が約１：１である。一実施形態では、結合パートナーとトレーサーが、複合体中の結合パートナーと蛍光トレーサーの比が約１：１である複合体として提供される。一実施形態では、複合体が固体として提供される。例えば、結合パートナーと蛍光トレーサーを水性溶媒中で合わせて、複合体の水溶液を得て、複合体を固体として提供するように凍結乾燥によって溶液から水を除去する。
典型的には、試料を、前もって合わせた結合パートナーおよび蛍光トレーサーと混合することによってアッセイを行う。典型的には、約２５μｌの結合パートナーの溶液を約２５μｌの蛍光トレーサーの溶液と合わせ、次いで、得られた溶液を約５０μｌの、分析物を含有することが疑われる試料の溶液に添加して、アッセイ組成物を得る。しかしながら、結合パートナーの溶液、蛍光トレーサーの溶液、および試料溶液の体積は広範囲にわたって変化し得る。蛍光トレーサーを、前もって合わせた結合パートナーおよび試料と混合することによってアッセイを行うこともできる。結合パートナーを、前もって合わせた蛍光トレーサーおよび試料と混合することによってアッセイをさらに行うことができる。
一実施形態では、試料および蛍光トレーサーおよび結合パートナーを穏やかに回旋または振盪することによって混合して、溶液としてのアッセイ組成物を調製する。試料、蛍光トレーサー、および結合パートナーを混合したら、得られたアッセイ溶液は、典型的には、アッセイ溶液を第１の波長の光で照射する前に短期間だけ平衡化しなければならない。一般的に、アッセイ溶液を１分間未満平衡化することが必要である。ほとんどの場合、アッセイ溶液を１５秒間未満平衡化することが必要である。
第１の波長および第２の波長は、蛍光トレーサーの励起スペクトルおよび発光スペクトルに依存する。当業者であれば、適切な第１の波長および適切な第２の波長が何であるかを容易に決定することができるだろう。第１の波長という用語は、本明細書で使用される場合、波長の範囲を包含することができる。同様に、第２の波長という用語は、本明細書で使用される場合、波長の範囲を包含することができる。典型的には、第１の波長および第２の波長はそれぞれ約２００ｎｍ～約９００ｎｍの間である。一実施形態では、第１の波長（λｅｘ）が約４９０ｎｍであり、第２の波長（λｅｍ）が約５２０ｎｍである。
一実施形態では、試料が牛乳である。一実施形態では、試料が、リボフラビン結合タンパク質（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）と接触させた牛乳である。理論によって拘束されることを望むものではないが、牛乳をリボフラビン結合タンパク質で処理すると、牛乳試料に関連する自己蛍光が減少すると考えられる。理論によって拘束されることを望むものではないが、牛乳試料で観察される自己蛍光は牛乳中のリボフラビンによって引き起こされ、リボフラビン結合タンパク質が、リボフラビンに結合することによって、自己蛍光を減少させると考えられる。自己蛍光を減少させることにより、第２の波長で放出される光のより正確な測定が有利に提供される。典型的には、リボフラビン結合タンパク質は、約１００μｇ／ｍＬより高い、好ましくは約１００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬのアッセイ溶液中のリボフラビン結合タンパク質の濃度を提供するのに十分な量で牛乳に添加される。
一実施形態では、試料が牛乳であり、牛乳が試料の第１の側で第１の波長の光で照射され、第２の波長で放出される光の強度が第１の側とは異なる試料の第２の側から測定される。
一実施形態では、試料が牛乳であり、牛乳が試料の一方の側で第１の波長の光で照射され、第２の波長で放出される光の強度が試料の反対側から測定される。
一実施形態では、試料が牛乳であり、牛乳が試料の一方の側で第１の波長の光で照射され、第２の波長で放出される光の強度が試料の同じ側から測定される。
試料が牛乳である場合、牛乳は全乳（生乳）または脱脂乳（すなわち、脂肪が除去された牛乳）であり得る。試料が牛乳である場合、例えば、遠心分離によって、牛乳からクリームを除去するための前処理ステップの要件はない。
一実施形態では、試料が牛乳であり、分析物がメラミンである。
一実施形態では、試料が牛乳であり、分析物が抗生物質である。例示的な抗生物質には、それだけに限らないが、β－ラクタム抗生物質（ペニシリンなど）、セファロスポリン、サルファ薬、フルオロキノロン、クロラムフェニコール、およびフルオラムフェニコールが含まれる。
一実施形態では、試料が牛乳であり、分析物が、欧州連合によって要求される、牛乳において試験しなければならない抗生物質からなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
一実施形態では、抗生物質がペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）、アンピシリン、アモキシシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、セファピリン、デスアセチルセファピリン、セフチオフル、デスフロイルセフチオフル、セフキノム、セファロニウム、セファゾリン、セファセトリル、セファレキシン、セフロキシム、およびセフォペラゾンからなる群から選択される。
一実施形態では、試料が牛乳であり、分析物が、米国食品医薬品局によって要求される、牛乳において試験しなければならない抗生物質からなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
一実施形態では、試料が牛乳であり、分析物が、ペニシリンＧ（ベンジルペニシリン）、アンピシリン、アモキシシリン、クロキサシリン、セファピリン、セフチオフル、およびデスフロイルセフチオフルからなる群から選択される１種または複数の抗生物質である。
アッセイを行うために使用することができる適切な計装には、Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ＋分光計（日本のＨｏｒｉｂａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）およびＳｙｎｅｒｇｙ ４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（バーモント州ウィヌースキのＢｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）などの任意の商業的に入手可能な蛍光分光計が含まれる。
本方法は、ただ１つのステップのみ（すなわち、試料を蛍光トレーサーおよび結合パートナーと合わせる）を伴い、有利には、洗浄ステップなどの、いずれの分離ステップ（すなわち、未結合トレーサーからその結合パートナーに結合しているトレーサーを分離するステップ）も要しない。
３．乾式スライドアッセイ法
一実施形態では、本方法が、本明細書で「スライド」とも呼ばれる、乾式スライド上の試料中の分析物の存在または量を決定するステップを伴う。本方法は、単純に、試料をスライドに適用するステップと、スライドを第１の波長の光で照射するステップと、第２の波長で放出される光の強度を測定するステップとを伴う。本発明はまた、本方法に使用されるスライドを包含する。スライドは２つ以上の層を含む。
スライドの一般的な構造を図１８Ａに示す。スライドは、インジケーター層が上に適用されている支持層を含む。
支持層は、スライドに支持を提供する固体である。支持層は、第１の波長および第２の波長に対して光学的に透明である、すなわち、第１および第２の波長の光を実質的に吸収しない。好ましくは、支持層は水不溶性であり、水不透過性である。好ましくは、支持層は機械的および熱的に安定性であり、耐引っかき性である。支持層は、これらの基準を満たす任意の適切なポリマーであり得る。
例示的な支持層には、それだけに限らないが、ガラス、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース誘導体（酢酸セルロースなど）、ポリエチレンテレフタレート、およびこれらの混合物が含まれる。
一実施形態では、支持層がポリエチレンテレフタレート層である。
一実施形態では、支持層がポリエステル層である。一実施形態では、支持層が、商品名Ｍｅｌｉｎｅｘ（登録商標）（ウィスコンシン州ベルリンのＥＩＳ，Ｉｎｃ．の事業部、Ｔｅｋｒａから商業的に入手可能）で商業的に入手可能なポリエステルである。一実施形態では、支持層が、商品名ＥＳＴＡＲ（商標）（ニューヨーク州ロチェスターのＥａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に入手可能）で商業的に入手可能なポリエステルである。
支持層の厚さは、典型的には約１５μｍ～約２００μｍ、好ましくは約５０μｍ～約１５０μｍ、より好ましくは約７０μｍ～約１３０μｍの範囲である。一実施形態では、支持層の厚さが約１２５μｍである。一実施形態では、支持層の厚さが約７５μｍである。
インジケーター層は、ポリマーに分散した蛍光トレーサーおよび結合パートナーを含む。蛍光トレーサーと結合パートナーは複合体として存在し得る。
一実施形態では、蛍光トレーサーおよび結合パートナーを液体中で合わせ、液体を除去して固体を得て、得られた固体をポリマーに分散または溶解し、これを使用してインジケーター層を得る。一実施形態では、蛍光トレーサーおよび結合パートナーを水中で合わせ、水を凍結乾燥によって除去し、得られた固体凍結乾燥物をポリマーに溶解または分散してインジケーター層を得る。一実施形態では、蛍光トレーサーと結合パートナーが前もって形成された複合体として提供される。
一実施形態では、蛍光トレーサーおよび結合パートナー（好ましくは前もって形成された複合体として）ならびにポリマーを溶媒に溶解または懸濁してコーティング液を得て、コーティング液を支持層上にコーティングして湿潤インジケーター層を得て、次いで、溶媒を除去して蛍光トレーサーおよび結合パートナーがポリマーに分散した乾燥インジケーター層を得ることによって、インジケーター層が得られる。好ましくは、溶媒が水性溶媒である。
湿潤インジケーター層の厚さは、典型的には約３０μｍ～約２００μｍ、好ましくは約５０μｍ～約１５０μｍ、より好ましくは約８０μｍ～約１２０μｍの範囲である。乾燥している場合、インジケーター層の厚さは、典型的には約１５μｍ～約１００μｍ、好ましくは約１０～約７５μｍ、より好ましくは約２０μｍ～約６０μｍの範囲である。一実施形態では、乾燥インジケーター層の厚さが約３０μｍ～約４０μｍである。一実施形態では、乾燥インジケーター層の厚さが約５０μｍである。インジケーター層の厚さは、一部は、試料体積に依存する。例えば、試料が分析物の非常に希薄な溶液である場合、アッセイはより大きな試料体積を要し、より大きな試料体積を収容するようにより厚いインジケーター層が好まれる。
一実施形態では、結合パートナーが抗体である。湿潤インジケーター層中の蛍光トレーサーおよび抗体の濃度は、典型的には、それぞれ、層の約４×１０－６重量％～約４×１０－２重量％および約４×１０－４重量％～約４重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤インジケーター層中の蛍光トレーサーおよび抗体の濃度が、それぞれ、層の約８×１０－６重量％～約２×１０－２重量％および約８×１０－４重量％～約２重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤インジケーター層中の蛍光トレーサーおよび抗体の濃度が、それぞれ、層の約１．６×１０－５重量％～約１×１０－２重量％および約１．６×１０－３重量％～約１重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤インジケーター層中の蛍光トレーサーおよび抗体の濃度が、それぞれ、層の約４×１０－５重量％～約４×１０－３重量％および約４×１０－３重量％～約４×１０－１重量％の範囲である。乾燥インジケーター層中の蛍光トレーサーおよび抗体の濃度は、典型的には、それぞれ、層の約１×１０－５重量％～約１×１０－１重量％および約１×１０－４重量％～約１重量％の範囲である。一実施形態では、乾燥インジケーター層中の蛍光トレーサーおよび抗体の濃度が、それぞれ、層の約２×１０－５重量％～約５×１０－２重量％および約２×１０－４重量％～約５×１０－１重量％の範囲である。一実施形態では、乾燥インジケーター層中の蛍光トレーサーおよび抗体の濃度が、それぞれ、層の約４×１０－５重量％～約２．５×１０－２重量％および約４×１０－４重量％～約２．５５×１０－１重量％の範囲である。一実施形態では、乾燥インジケーター層中の蛍光トレーサーおよび抗体の濃度が、それぞれ、層の約１×１０－４重量％～約１×１０－２重量％および約１×１０－３重量％～約１×１０－１重量％の範囲である。
インジケーター層は水透過性である。インジケーター層に適したポリマーには、それだけに限らないが、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース）、多糖（デキストラン、アラビアガム、アガロース、およびプルランなど）、ゼラチンおよびゼラチン誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アクリルアミドポリマー、ポリウレタン、アルギネート、キサンタム、ならびにこれらの混合物が含まれる。
一実施形態では、インジケーター層が多糖を含む。一実施形態では、インジケーター層が直鎖状のポリグルカンを含む。一実施形態では、多糖がマルトトリオース単位を含む。好ましい実施形態では、インジケーター層がプルランを含む。理論によって拘束されることを望むものではないが、多糖はインジケーター層に安定性および完全性を提供する結合剤として作用すると考えられる。
多糖は、典型的には湿潤層の約０．５重量％～約４０重量％、好ましくは約１重量％～約３０重量％、より好ましくは約５重量％～約２０重量％、最も好ましくは約６重量％～約１５重量％の範囲の量で湿潤インジケーター層中に存在する。乾燥インジケーター層中、多糖は、典型的には乾燥層の約１重量％～約６０重量％、好ましくは約５重量％～約５０重量％、より好ましくは約１０重量％～約４０重量％、最も好ましくは約２０重量％～約３５重量％の範囲の量で存在する。
好ましくは、インジケーター層がプルランを含む。一実施形態では、インジケーター層がプルラン、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびこれらの混合物を含む。
一実施形態では、インジケーター層がプルラン、セルロース、界面活性剤、緩衝液、ならびに蛍光トレーサーおよび結合パートナーを含む。
プルランは、構造：
Figure 2023521886000011
を有するマルトトリオース単位からなる多糖ポリマーである。
プルランは、典型的には湿潤層の約０．５重量％～約４０重量％、好ましくは約１重量％～約３０重量％、より好ましくは約５重量％～約２０重量％、最も好ましくは約６重量％～約１５重量％の範囲の量で湿潤インジケーター層中に存在する。乾燥インジケーター層中、プルランは、典型的には乾燥層の約１重量％～約６０重量％、好ましくは約５重量％～約５０重量％、より好ましくは約１０重量％～約４０重量％、最も好ましくは約２０重量％～約３５重量％の範囲の量で存在する。
理論によって拘束されることを望むものではないが、プルランはインジケーター層に安定性を提供し、有利には、蛍光トレーサーと結合パートナーの複合体、蛍光トレーサー、または結合パートナーの分解をもたらさない結合剤として作用すると考えられる。プルランは、水溶性であり、したがって、最小量の、蛍光トレーサーおよび／または結合パートナーの分解をもたらし得る有機溶媒（例えば、エタノール）と、主に水性である溶液を使用してインジケーター層を形成することを可能にするので、インジケーター層を形成するのに特に有利なポリマーである。プルランは、タンパク質などの生物試薬を安定化する。一実施形態では、プルランが約２５ｋＤａの分子量を有する。
界面活性剤は任意である。好ましくは、インジケーター層が界面活性剤を含む。好ましくは、界面活性剤が非イオン性界面活性剤である。例示的な界面活性剤には、それだけに限らないが、Ｉｇｅｐａｌ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）またはＭｅｒｐｏｌ Ａ（イリノイ州ノースフィールドのＳｔｅｐａｎ Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に入手可能）が含まれる。界面活性剤は、典型的には湿潤インジケーター層の約０．０５重量％～約２．０重量％、好ましくは約０．１重量％～約１．０重量％、より好ましくは約０．２重量％～約０．６重量％、最も好ましくは約０．３重量％～約０．５重量％の範囲の量で湿潤インジケーター層中に存在する。乾燥インジケーター層中、界面活性剤は、典型的には乾燥インジケーター層の約０．１重量％～約４．０重量％、好ましくは約０．２重量％～約３．０重量％、より好ましくは約０．４重量％～約２．５重量％、最も好ましくは約０．５重量％～約２．０重量％の範囲の量で存在する。理論によって拘束されることを望むものではないが、界面活性剤はより均一な層を提供するようにインジケーター層のより良好な湿潤を提供すると考えられる。
例示的な緩衝液には、それだけに限らないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）が含まれる。緩衝液は、典型的には約１０ｍＭ～約３００ｍＭ、好ましくは約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ、より好ましくは約５０ｍＭ～約２００ｍＭ、最も好ましくは約７５ｍＭ～約１７５ｍＭの範囲の量で湿潤インジケーター層中に存在する。好ましくは、緩衝液が、約４．５～約９．５、より好ましくは約５～約９、最も好ましくは約６～約８．５の間の水溶液のｐＨ値を提供する緩衝液である。一実施形態では、緩衝液が、約８の水溶液のｐＨ値を提供する緩衝液である。
セルロースは、典型的には湿潤インジケーター層の約２重量％～約４０重量％、好ましくは約５重量％～約３５重量％、より好ましくは約１０重量％～約３０重量％、最も好ましくは約１５重量％～約２５重量％の範囲の量で湿潤インジケーター層中に存在する。乾燥インジケーター層中、セルロースは、典型的には乾燥層の約３０重量％～約９０重量％、好ましくは約４０重量％～約８５重量％、より好ましくは約４５重量％～約８５重量％、最も好ましくは約５０重量％～約７５重量％の範囲の量で存在する。一実施形態では、セルロースが約３５０ｋＤａの分子量を有する微結晶セルロースである。好ましくは、セルロースの粒径が約５μｍ～約３０μｍ、好ましくは約１０μｍ～約２５μｍの範囲である。一実施形態では、セルロースの粒径が約２０μｍである。理論によって拘束されることを望むものではないが、セルロースポリマーの量および粒径は本方法の感度を最大化するのに重要であると考えられる。
インジケーター層はヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）をさらに含有し得る。ＨＰＣは、存在する場合、典型的には湿潤層の約２重量％～約１０重量％、好ましくは、約３重量％～約７．５重量％、より好ましくは約５重量％の範囲の量で湿潤層中に存在する。理論によって拘束されることを望むものではないが、ＨＰＣが層の拡散を改善するように湿潤層の粘度を増加させると考えられる。ＨＰＣがインジケーター層の完全性を改善するとも考えられる。
一実施形態では、約１８重量％のセルロース、約９重量％のプルラン、約０．４重量％のＭｅｒｐｏｌ Ａ、約５２重量％のＨＥＰＥＳの水溶液（脱イオン水中２５０ｍＭ、ｐＨ８）、約２０重量％のクエンチャーにコンジュゲートした抗体の溶液（２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中２．３１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８）および約１．５重量％の蛍光トレーサーの溶液（脱イオン水中０．２５ｍｇ／ｍＬ）を含有する溶液／懸濁液を支持層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、インジケーター層を形成した。得られた乾燥インジケーター層は、約５７．０重量％のセルロース、約２８．５重量％のプルラン、約１．２重量％のＭｅｒｐｏｌ Ａ、約０．１４重量％のクエンチャーにコンジュゲートした抗体、約１．１×１０－３重量％の蛍光トレーサー、および約１３．２重量％のＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する。一実施形態では、蛍光トレーサーが構造Ａ３を有し、抗体がＳＤＭＡに対する抗体であり、クエンチャーがＢＨＱ１０である。ＳＤＭＡに対する抗体は、例えば、米国特許第８４８１６９０号に記載されている。
インジケーター層を形成するために使用される溶液／懸濁液は、溶液／懸濁液中の細菌増殖を防止するのに適した量の保存剤をさらに含有し得る。一実施形態では、保存剤が、溶液／懸濁液中０．０５重量％の濃度のＰｒｏｃｌｉｎ（商標）３００（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、マサチューセッツ州バーリントン）である。当業者であれば、他の適切な保存剤を容易に識別することができるだろう。
典型的には、成分を溶媒、好ましくは水性溶媒中で合わせ、これらを混合することを可能にすることによってインジケーター層を調製する。添加の順序は特に重要ではない。一般的に、各成分を添加した後、得られた溶液／懸濁液を混合する。典型的には、最終溶液を支持層上にコーティングする前に約１／２時間混合する。次いで、溶液を支持層に適用し、支持層の上にインジケーター層を提供するように溶媒を除去する。蛍光トレーサーおよび結合パートナーを個別にまたは蛍光トレーサーと結合パートナーの予め形成された複合体として溶液に添加することができる。好ましくは、蛍光トレーサーと結合パートナーの予め形成された複合体を溶液に添加する。
一実施形態では、スライドが拡散層をさらに含む。拡散層はインジケーター層の上にコーティングされる。拡散層は水透過性である。拡散層は水透過性であり、等方的で多孔性である、すなわち、層内のあらゆる方向に多孔性である。
一実施形態では、スライドがフィルタリング層をさらに含む。フィルタリング層はインジケーター層の上にコーティングされる。
一実施形態では、スライドが拡散層およびフィルタリング層をさらに含む。スライドが拡散層およびフィルタリング層をさらに含む場合、フィルタリング層がインジケーター層の上にコーティングされ、次いで、拡散層がフィルタリング層の上にコーティングされる。拡散層およびフィルタリング層をさらに含むスライドの一般的な構造を図１８Ｂに示す。
拡散層およびフィルタリング層はインジケーター層が提供される方法と同様に提供される、すなわち、層の成分を混合しながら溶媒中で合わせて溶液／懸濁液を得て、溶液／懸濁液をスライドの適切な層に適用し、適切な層の上に拡散層またはフィルタリング層を提供するように溶媒を除去する。
湿潤拡散層の厚さは、典型的には約１００μｍ～約５００μｍ、好ましくは約１５０μｍ～約４５０μｍ、より好ましくは約２００μｍ～約４００μｍ、最も好ましくは約２５０μｍ～約３５０μｍの範囲である。乾燥の場合、拡散層の厚さは、典型的には約２５μｍ～約２５０μｍ、好ましくは約５０μｍ～約２００μｍ、より好ましくは約７５μｍ～約１５０μｍの範囲である。拡散層の厚さは、一部は、試料体積に依存する。例えば、試料が分析物の非常に希薄な溶液である場合、アッセイはより大きな試料体積を要し、より大きな試料体積を収容するようにより厚い拡散層が好まれる。
拡散層は、典型的には親水性ポリマーマトリックス中のセルロースの混合物である。適切な親水性ポリマーには、それだけに限らないが、ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、およびポリエチレンイミンが含まれる。拡散層は、有利には液体試料をスライド上に均一に拡散および分散させる。
湿潤拡散層中のセルロースの量は、典型的には層の約１重量％～約２０重量％、好ましくは５重量％～約１５重量％、より好ましくは約１０重量％の範囲である。乾燥の場合、湿潤拡散層中のセルロースの量は、典型的には層の約５０重量％～約９８重量％、好ましくは約６０重量％～約９５重量％、より好ましくは約７０重量％～約９０重量％の範囲である。一実施形態では、拡散層が１００％セルロースである。一実施形態では、セルロースが約３００μｍの粒径を有する。
拡散層はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含み得る。湿潤拡散層中の重量によるＰＶＰの量は、典型的には層の約０．５重量％～約１０重量％、好ましくは約１重量％～約５重量％、より好ましくは約１．５重量％～約３重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤拡散層中のＰＶＰの量が約２重量％である。乾燥拡散層中の重量によるＰＶＰの量は、典型的には層の約１重量％～約３０重量％、好ましくは約５重量％～約２５重量％、より好ましくは約１０重量％～約２０重量％の範囲である。一実施形態では、乾燥拡散層中のＰＶＰの量が約１７重量％である。
拡散層はテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）または他の適切な塩基を含み得る。ＴＭＡＨは拡散層のｐＨを調整するのに役立ち得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、ＴＭＡＨが、拡散層がスライド全体にわたって試料を迅速に吸収および拡散する能力を増加させると考えられる。湿潤拡散層中の重量によるＴＭＡＨの量は、典型的には約０．０１重量％～約０．５重量％、好ましくは約０．０２５重量％～約０．２５重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤拡散層中のＴＭＡＨの量が約０．０５重量％である。乾燥拡散層中の重量によるＴＭＡＨの量は、典型的には約０．０８重量％～約４重量％、好ましくは約０．２重量％～約２重量％、より好ましくは約１０重量％の範囲である。一実施形態では、乾燥拡散層中のＴＭＡＨの量が約０．４重量％である。
一実施形態では、約１０重量％のセルロース、約２重量％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、約６８重量％の水、約２０重量％のエタノール、約０．０６重量％のポリアクリル酸（ＰＡＡ）、および約０．０５重量％のテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）を含有する溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、拡散層を形成する。得られた乾燥拡散層は、約８２．６重量％のセルロース、約１６．５重量％のＰＶＰ、約０．５重量％のＰＡＡ、および約０．４重量％のＴＭＡＨを含有する。
フィルタリング層は、アッセイに潜在的に干渉し得る分析物以外の試料中に存在する化合物に結合し、これらの他の化合物がインジケーター層に拡散するのを防ぐ。
湿潤フィルタリング層の厚さは、典型的には約５０μｍ～約２５０μｍ、好ましくは約７５μｍ～約２２５μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約２００μｍの範囲である。乾燥の場合、フィルタリング層の厚さが、典型的には約５μｍ～約５０μｍ、好ましくは約７μｍ～約４０μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約３０μｍの範囲である。フィルタリング層の厚さは、一部は、試料体積に依存する。例えば、試料が分析物の非常に希薄な溶液である場合、アッセイはより大きな試料体積を要し、より大きな試料体積を収容するようにより厚いフィルタリング層が好まれる。
フィルタリング層は、典型的には水分を保持する別の親水性ポリマー（複数可）と組み合わせてポリウレタンを含む。一実施形態では、フィルタリング層はポリウレタンおよびセルロースを含む。適切なポリウレタンはＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４（マサチューセッツ州ウィルミントンのＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐから商業的に入手可能）である。一実施形態では、ポリウレタンが低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物である。一実施形態では、ポリウレタンがほぼ等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物である。
湿潤フィルタリング層中のポリウレタンの量は、典型的には層の約２重量％～約４０重量％、好ましくは約５重量％～約３０重量％、より好ましくは約１０重量％～約２０重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤フィルタリング層中のポリウレタンの量が層の約１５重量％である。乾燥の場合、フィルタリング層中のポリウレタンの量が、典型的には層の約４０重量％～約９５重量％、好ましくは約５０重量％～約８０重量％、より好ましくは約５５重量％～約７５重量％の範囲である。一実施形態では、乾燥フィルタリング層中のポリウレタンの量が層の約６５重量％である。
湿潤フィルタリング層中のセルロースの量は、典型的には層の約２重量％～約６０重量％、好ましくは約４重量％～約５０重量％、より好ましくは約６重量％～約４０重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤フィルタリング層中のセルロースの量が約８重量％である。乾燥の場合、フィルタリング層中のセルロースの量は、典型的には層の約１０重量％～約６０重量％、好ましくは約２０重量％～約５０重量％、より好ましくは約２５重量％～約４５重量％の範囲である。一実施形態では、乾燥フィルタリング層中のセルロースの量が層の約３５重量％である。
図２４は、試料が様々な濃度のアッセイに潜在的に干渉し得る化合物（すなわち、干渉物質）を含む、一定量のＳＤＭＡ（μｇ／ｄＬ）を含有する試料中のＳＤＭＡの濃度を決定するためのアッセイ（以下に記載される、約２０重量％のセルロース、約４２重量％の二酸化チタン、および約３８重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４を含有するフィルタリング層を有するスライドを使用）の結果を示す。干渉物質は（Ａ）溶血（０～５００ｍｇ／ｄＬ）、（Ｂ）ビリルビン（０～３０ｍｇ／ｄＬ）、（Ｃ）イントラリピッド（０～１０００ｍｇ／ｄＬ）および（Ｄ）全血（０～１０％）である。実験を実施例３９に記載する。
一実施形態では、フィルタリング層が酸化チタン（ＴｉＯ２）をさらに含む。典型的には、二酸化チタンが、湿潤フィルタリング層の約２重量％～約３０重量％、好ましくは約５重量％～約２０重量％、より好ましくは約１０重量％～約２０重量％の範囲の量で湿潤フィルタリング層中に存在する。一実施形態では、酸化チタンが、湿潤フィルタリング層の約１４重量％の量で湿潤フィルタリング層中に存在する。典型的には、二酸化チタンが、乾燥フィルタリング層の約２０重量％～約６０重量％、好ましくは約２５重量％～約５５重量％、より好ましくは約３０重量％～約５０重量％の範囲の量で乾燥フィルタリング層中に存在する。一実施形態では、酸化チタンが、湿潤フィルタリング層の約４２重量％の量で湿潤フィルタリング層中に存在する。
酸化チタン粒子の平均粒径は、典型的には約１０μｍ未満、好ましくは約５μｍ未満である。一実施形態では、酸化チタン粒子の平均粒径が約０．３５μｍである。
スライドが以下に記載されるカーボンブラック層を含む場合、カーボンブラック層が散乱光を吸収するので、酸化チタンを含むフィルタリング層が特に有利である。酸化チタン層は、有利にはカーボンブラック層が散乱光を吸収するのを防ぎ、感度の改善をもたらすように、カーボンブラック層から離れて検出器に戻る光を反射する。
一実施形態では、約７重量％のセルロース、約１４重量％の二酸化チタン、および約７９重量％のＤ４ヒドロゲル溶液（約１６重量％の等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物、約９０重量％のエタノール、および約１０重量％の水を含有する）を含有する溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、フィルタリング層を形成する。得られた乾燥フィルタリング層は、約２０重量％のセルロース、約４２重量％の二酸化チタン、および約３８重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４を含有する。
一実施形態では、スライドがプライマー層をさらに含む。プライマー層は支持層の上に積層され、支持層とインジケーター層との間に配置される。支持層およびインジケーター層に加えて、拡散層、フィルタリング層、およびプライマー層をさらに含むスライドの一般的な構造を図１８Ｃに示す。
プライマー層は、有利には支持層の上へのインジケーター層のコーティングを促進する。理論によって拘束されることを望むものではないが、支持層は疎水性であり、インジケーター層は親水性であるので、結果として両者は特に適合性ではないと考えられる。プライマー層はこの不適合性を克服する。プライマー層は、好ましくはＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４などのポリウレタンを含む。一実施形態では、ポリウレタンが低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物である。一実施形態では、ポリウレタンがほぼ等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物である。
湿潤プライマー層の厚さは、典型的には約５μｍ～約６０μｍ、好ましくは約１０μｍ～約５５μｍ、より好ましくは約２０μｍ～約５０μｍの範囲である。一実施形態では、プライマー層の湿潤厚さが約４０μｍである。乾燥の場合、プライマー層の厚さは、典型的には約１μｍ～約２０μｍ、好ましくは約１．５～約１５μｍ、より好ましくは約２μｍ～約１０μｍの範囲である。一実施形態では、プライマー層の乾燥厚さが約４μｍである。
一実施形態では、約９０重量％のエタノールおよび約１０重量％の水の溶媒中、約１０重量％の等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物を含有する溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、プライマー層を形成する。得られた乾燥プライマー層は約１００重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４を含有する。
一実施形態では、スライドがカーボンブラック層をさらに含む。カーボンブラック層はフィルタ層の上にコーティングされ、フィルタ層と拡散層との間に配置される。カーボンブラック層は、有利には第２の波長の放出される光の測定に干渉する環境からの迷光をフィルタリングする光バリアとして作用する。カーボンブラック層はまた、潜在的にアッセイに干渉し得る分析物以外の試料中に存在する化合物に結合するように機能し、これらの他の化合物がインジケーター層に拡散するのを防ぐ。よって、カーボンブラック層の機能はフィルタリング層の機能と同様である。
カーボンブラックは、迷光をフィルタリングするための他の材料で置き換えることができるか、またはこれと組み合わせて使用することができる。例示的な他の材料には、それだけに限らないが、黒ラテックスビーズ、黒シリカビーズ、活性炭、Ｃ６０、グラフェン、または赤ラテックスビーズなどの他の有色材料が含まれる。
カーボンブラック層はポリマーに分散したカーボンブラックを含む。カーボンブラック層に適したポリマーには、それだけに限らないが、ポリウレタン（ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４など）、ポリエチレンオキシド、シリコーン、ポリビニルアルコール、およびポリアクリルアミドが含まれる。一実施形態では、ポリマーがＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４である。
湿潤カーボンブラック層中のカーボンブラックの量は、典型的には層の約１重量％～約２０重量％、好ましくは約１．５重量％～約１５重量％、より好ましくは約２重量％～約１０重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤カーボンブラック層中のカーボンブラックの量が層の約５重量％である。乾燥の場合、カーボンブラック層中のカーボンブラックの量は、典型的には層の約１０重量％～約４０重量％、好ましくは約１５重量％～約３５重量％、より好ましくは約２０重量％～約３０重量％の範囲である。一実施形態では、湿潤カーボンブラック層中のカーボンブラックの量が層の約２５重量％である。
湿潤カーボンブラック層の厚さは、典型的には約５０μｍ～約３００μｍ、好ましくは約７５μｍ～約２５０μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約２００μｍの範囲である。一実施形態では、湿潤カーボンブラックの厚さが約１４０μｍである。乾燥の場合、カーボンブラック層の厚さは、典型的には約５μｍ～約３０μｍ、好ましくは約７．５μｍ～約２５μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約２０μｍの範囲である。一実施形態では、湿潤カーボンブラックの厚さが約１４μｍである。
一実施形態では、約４．７重量％のカーボンブラック、約９５．３重量％のＤ４ヒドロゲル溶液（約１６重量％の等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物、約９０重量％のエタノール、および約１０重量％の水を含有する）を含有する溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、カーボンブラック層を形成する。得られた乾燥カーボンブラック層は、約２４重量％のカーボンブラックおよび約７６重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４を含有する。
上記のように、スライドがカーボンブラック層を含む場合、スライドが好ましくはフィルタリング層中に酸化チタンを含む。
あるいは、スライドがフィルタリング層中に酸化チタンを含むのではなく、スライドがカーボンブラック層を含む場合、スライドはインジケーター層とフィルタリング層との間、またはフィルタリング層とカーボンブラック層との間に配置された別個の酸化チタン層を含むことができる。スライドが別個の酸化チタン層を含む場合、湿潤酸化チタン層の厚さは、典型的には約５０μｍ～約２５０μｍ、好ましくは約７５μｍ～約２２５μｍ、より好ましくは約１００μｍ～約２００μｍの範囲である。乾燥の場合、二酸化チタン層の厚さが、典型的には約５μｍ～約５０μｍ、好ましくは約７μｍ～約４０μｍ、より好ましくは約１０μｍ～約３０μｍの範囲である。
酸化チタン層はポリマーに分散した酸化チタンを含む。酸化チタン層に適したポリマーには、それだけに限らないが、ポリウレタンポリマー（例えば、ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４）、ポリエチレンオキシド、シリコーン、ポリビニルアルコール、およびポリアクリルアミドが含まれる。一実施形態では、酸化チタンが、ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４などのポリウレタンポリマーに分散している。一実施形態では、ポリウレタンが低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物である。一実施形態では、ポリウレタンがほぼ等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物である。
スライドが別個の酸化チタン層を含む場合、二酸化チタンは、典型的には湿潤二酸化チタン層の約２重量％～約３０重量％、好ましくは約５重量％～約２５重量％、より好ましくは約１０重量％～約２０重量％の範囲の量で湿潤二酸化チタン層中に存在する。一実施形態では、酸化チタンが、湿潤層の約１４重量％の量で湿潤層中に存在する。典型的には、二酸化チタンは、乾燥層の約２０重量％～約６０重量％、好ましくは約２５重量％～約５５重量％、より好ましくは約３０重量％～約５０重量％の範囲の量で乾燥層中に存在する。一実施形態では、酸化チタンが乾燥層の約４２重量％の量で乾燥層中に存在する。
酸化チタン粒子の平均粒径は、典型的には約２０μｍ未満、好ましくは約１５μｍ未満、より好ましくは約１０μｍ未満、最も好ましくは約５μｍ未満である。
酸化チタンは、他の反射材料で置き換えることができるか、またはこれと組み合わせて使用することができる。例示的な他の反射材料には、それだけに限らないが、硫酸バリウム、酸化亜鉛、粘土、およびケイ酸アルミニウムが含まれる。一実施形態では、反射材料が完全または部分的金属コーティング粒子である。適切な金属には、それだけに限らないが、アルミニウム、金、ニッケルまたは銀が含まれる。銀が好ましいコーティングである。これらの粒子は単独で、またはＴｉＯ２などの他の光反射材料と組み合わせて使用することができる。粒子（すなわち、コーティングされるコア）は、それだけに限らないが、固体および中空ガラス、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ならびにシリカを含む様々な材料であり得る。適切な金属コーティング粒子は、例えば、Ｃｏｓｐｈｅｒｉｃ ＬＬＣ（米国カリフォルニア州サンタバーバラ）から商業的に入手可能である。好ましい粒子は、例えばＣｏｓｐｈｅｒｉｃ ＬＬＣ製の銀コーティングシリカミクロスフェアである。
別の実施形態では、スライドが別個のカーボンブラック層を含まない。むしろ、カーボンブラックが拡散層に含まれる。拡散層に含まれるカーボンブラックの量は、別個のカーボンブラック層に含まれるカーボンブラックの量と同様である。
支持層で始めて、支持層の上に各層を順次コーティングすることによってスライドを調製する。各層の成分を適切な溶媒に溶解または懸濁して溶液または懸濁液を得て、次いで、得られた溶液または懸濁液を前の層に適用して所望の湿潤層を得て、所望の乾燥層を提供するように溶媒を除去する。好ましくは、溶液が水溶液である。任意のコーティング方法を使用して、所望の厚さでスライドの各層を提供することができる。適切なコーティング技術は、「Ｌｉｑｕｉｄ Ｆｉｌｍ Ｃｏａｔｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、編者Ｓｔｅｐｈａｎ Ｆ．ＫｉｓｔｌｅｒおよびＰｅｔｅｒ Ｍ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、第１版、著作権１９９７ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔに記載されている。
典型的には、スライドの厚さは約３００μｍを超えず、好ましくは、スライドの厚さは約２５０μｍを超えず、より好ましくは、スライドの厚さは約２００μｍを超えない。一実施形態では、スライドの厚さが約１８５μｍである。
図１９はスライドの例示的な実施形態を示す。
図１９Ａは、Ｍｅｌｉｎｅｘ支持層がプライマー層、インジケーター層、酸化チタンも含むフィルタリング層、カーボンブラック層、および拡散層で順次コーティングされている実施形態を示す。一実施形態では、図１９Ａに示されるように、約１０重量％のセルロース、約２重量％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、約０．１重量％のテトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）、約０．０１重量％のポリアクリル酸（ＰＡＡ）、および約６８重量％の水、および２０重量％のエタノールを含有する水性エタノール溶液／懸濁液を適用し、次いで、溶液／懸濁液から水およびエタノールを除去することによって、拡散層を形成する。湿潤拡散層は約３１０μｍの厚さを有する。得られた乾燥拡散層は、約８２．６重量％のセルロース、約１６．５重量％のＰＶＰ、約０．４２重量％のＴＭＡＨ、および約０．４６重量％のＰＡＡを含有する。乾燥拡散層は約１００μｍの厚さを有する。
約９５重量％のＤ４ヒドロゲル溶液（約９０重量％のエタノールおよび約１０重量％の水の溶媒に溶解／懸濁した、約１６重量％の等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物を含有する）および約５重量％のカーボンブラックを含有する水溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、カーボンブラック層を形成する。湿潤カーボンブラック層は約１４０μｍの厚さを有する。得られた乾燥カーボンブラック層は、約７６．３重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４および２３．７重量％のカーボンブラックを含有する。乾燥カーボンブラック層は約１４μｍの厚さを有する。
約７９重量％のＤ４ヒドロゲル溶液（約９０重量％のエタノールおよび約１０重量％の水の溶媒に溶解／懸濁した、約１６重量％の等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の混合物を含有する）、約７重量％のセルロース、および約１４重量％の酸化チタンを含有する溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、フィルタリング層を形成する。湿潤フィルタリング層は約１３０μｍの厚さを有する。得られた乾燥フィルタリング層は、約３７．９重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４、約２０．０重量％のセルロース、および約４２．１重量％の酸化チタンを含有する。乾燥フィルタリング層は約２０μｍの厚さを有する。
約１８．７重量％のセルロース、約９．３重量％のプルラン、約０．４重量％のＭｅｒｐｏｌ Ａ、約４．３重量％のＨＥＰＥＳ緩衝液（５２重量％の２５０ｍＭ水溶液として添加）、約４．０×１０－４重量％の蛍光トレーサー、および約０．０４重量％のクエンチャーにコンジュゲートした抗体を含有する水溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、インジケーター層を形成する。湿潤インジケーター層は約９３μｍの厚さを有する。得られた乾燥インジケーター層は、約５７．０重量％のセルロース、約２８．５重量％のプルラン、約１．２重量％のＭｅｒｐｏｌ Ａ、約１３．２重量％のＨＥＰＥＳ緩衝液、約０．１４重量％のクエンチャーにコンジュゲートした抗体、および約１．１×１０－３重量％の蛍光トレーサーを含有する。乾燥インジケーター層は約３０～４０μｍの厚さを有する。一実施形態では、蛍光トレーサーがＡ４であり、抗体がＢＨＱ１０にコンジュゲートしたＳＤＭＡに対する抗体であり、Ａ４を２０当量のＢＨＱ１０と合わせることによって得られる。
約９０重量％のエタノールおよび約１０重量％の水の溶媒に溶解／懸濁した、約１０重量％のＤ４ヒドロゲル（等量の低粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４と高粘度ＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４を含有する）を含有する水溶液／懸濁液を適用することによって、プライマー層を形成する。湿潤プライマー層は約４０μｍの厚さを有する。乾燥プライマー層は１００重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４である。乾燥プライマー層は約４μｍの厚さを有する。
図１９Ｂは、Ｍｅｌｉｎｅｘ支持層がプライマー層、インジケーター層、酸化チタン含有層、フィルタリング層、カーボンブラック層、および拡散層で順次コーティングされている実施形態を示す。一実施形態では、図１９Ｂに示されるように、約１０重量％のセルロース、約１重量％のＰＶＰ、約１重量％のＴＭＡＨ、約０．０１重量％のＰＡＡ、および約８８重量％の水を含有する水溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から水を除去することによって、拡散層を形成する。湿潤拡散層は約３５０μｍの厚さを有する。得られた乾燥拡散層は、約８３．２重量％のセルロース、約８．３重量％のＰＶＰ、約８．３重量％のＴＭＡＨ、および約０．１重量％のＰＡＡを含有する。
約９５重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の（９０重量％の水および１０重量％のエタノール中）１０％溶液および約５重量％のカーボンブラックを含有する溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、カーボンブラック層を形成する。湿潤カーボンブラック層は約２５０μｍの厚さを有する。得られた乾燥カーボンブラック層は、約６５．５重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４および３４．５重量％のカーボンブラックを含有する。
約９５重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の（９０重量％の水および１０重量％のエタノール中）１０％溶液および約５重量％のセルロースを含有する水溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、フィルタリング層を形成する。湿潤フィルタリング層は約２５０μｍの厚さを有する。得られた乾燥フィルタリング層は、約６５．５重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４および約３４．５重量％のセルロースを含有する。
約９５重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４の（９０重量％の水および１０重量％のエタノール中）９．１３％溶液および約５重量％の酸化チタンを含有する水溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、酸化チタン含有層を形成する。湿潤酸化チタン含有層は約１００μｍの厚さを有する。得られた乾燥酸化チタン含有層は、約６３．５重量％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４および約３６．５重量％の酸化チタンを含有する。
約１４重量％のセルロース、約１４重量％のプルラン、約０．１重量％のＩｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、約５８重量％のＰＢＳ水溶液（１００ｍＭ）、および約１４．５重量％の蛍光トレーサーとその結合パートナーとの間の複合体を含有する水溶液／懸濁液を適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、インジケーター層を形成した。湿潤インジケーター層は約１００μｍの厚さを有する。得られた乾燥インジケーター層は、約３２．８重量％のセルロース、約３２．８重量％のプルラン、約０．２重量％のＩｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０、約３４．０重量％の複合体、およびリン酸緩衝液を含有する。一実施形態では、複合体が、Ａ４と、ＢＨＱ１０とコンジュゲートしたＳＤＭＡに対する抗体の複合体であり、抗体を４当量のＢＨＱ１０と合わせることによって得られる。
湿潤プライマー層の厚さは約３５μｍである。乾燥プライマー層は１００％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４である。
単純に目的の分析物を含有する試料をスライドの上部（すなわち、支持層から最も遠いスライドの層）に添加し、スライドをスライドの底部（すなわち、支持層を有するスライドの層）から第１の波長の光で照射し、スライドの底部から第２の波長で放出される光の強度を測定することによって、アッセイを実施する。図２０は、図１８Ｃに示されるスライドを使用したアッセイ方法を示す。
典型的には、試料を、中に溶解した分析物を含有する液体としてスライドの上部に添加する。典型的には、試料サイズが約０．５μＬ～約３０μＬの範囲である。一実施形態では、試料サイズが約１μＬ～約２０μＬの範囲である。一実施形態では、試料サイズが約２μＬ～約１５μＬの範囲である。一実施形態では、試料サイズが約３μＬ～約１２μＬの範囲である。
一実施形態では、スライドが「ポップオフ」層（ｐｏｐ－ｏｆｆ ｌａｙｅｒ）をさらに含む。ポップオフ層は、分析物が結合タンパク質などの別の分子と複合体化すると、分析物を遊離する試薬を含む。分析物（例えば、コルチゾール）はしばしば結合タンパク質（例えば、コルチゾール結合タンパク質）に複合体化される。ポップオフ層は、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬を含む。一実施形態では、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がサルコシルである。サルコシルの構造は、
Figure 2023521886000012
である。分析物がコルチゾールである場合、サルコシルが特に有用である。コルチゾール結合タンパク質からコルチゾールを遊離するために潜在的に使用することができる他の試薬には、プレドニゾロン、プレドニゾン、１１－デオキシコルチコステロン、コルチゾン、および１１－デオキシコルチゾールが含まれる。別の実施形態では、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がドクサート（ジオクチルソジウムスルホサクシネート）である。分析物がコルチゾールである場合、サルコシルが好ましい。
一実施形態では、スライドが追加のポップオフ層を含まないが、スライド上に既に存在する層の１つまたは複数、例えば拡散層、フィルタリング層、および／またはインジケーター層に結合タンパク質から分析物を遊離する試薬を含む。
結合タンパク質から分析物を遊離する試薬を含むスライド構成の例示的な例を以下に記載する。分析物がコルチゾールである場合に、これらの実施形態が特に有用である。
図５７に示される、一実施形態では、支持層（例えば、Ｍｅｌｉｎｅｘ）がプライマー層、インジケーター層（蛍光トレーサーと結合パートナーを含む）、フィルタリング層（場合により二酸化チタンまたは他の反射材料を含む）、ポップオフ層、および拡散層で順次コーティングされる。
一実施形態では、約９～１０％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４（マサチューセッツ州ウィルミントンのＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐから商業的に入手可能）を含有する溶液／懸濁液を支持層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによってプライマー層を形成し；約１２％のポリビニルピロリドン、約６％のセルロース、約１％のＴｗｅｅｎ－２０、ならびに蛍光トレーサーおよび結合パートナーを含有する溶液／懸濁液をプライマー層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、インジケーター層を形成し；約１０％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４、約１０％のＴｉＯ２、および約５％のセルロースを含有する溶液／懸濁液を検出層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、フィルタリング層を形成し；約１２％のプルラン、約６％のセルロース、約１％の、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬、および約１％のＭｅｒｐｏｌ Ａを含有する溶液／懸濁液をフィルタリング層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、ポップオフ層を形成し；拡散層に適した成分を含有する溶液／懸濁液をポップオフ層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、拡散層を形成する。
一実施形態では、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がサルコシルである。一実施形態では、分析物がコルチゾールであり、結合パートナーがコルチゾールに対する抗体であり、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がサルコシルである。
図５８に示される、一実施形態では、支持層（例えば、Ｍｅｌｉｎｅｘ）がプライマー層、検出層、フィルタリング層（場合により二酸化チタンまたは他の反射材料を含む）、インジケーター層、および拡散層で順次コーティングされる。この実施形態では、拡散層が、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬を含む。
一実施形態では、約９～１０％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４（マサチューセッツ州ウィルミントンのＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐから商業的に入手可能）を含有する溶液／懸濁液を支持層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、プライマー層を形成し；約１２％のポリビニルピロリドン、約６％のセルロース、および約１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有する溶液／懸濁液をプライマー層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、検出層を形成し；約１０％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４、約１０％のＴｉＯ２、および約５％のセルロースを含有する溶液／懸濁液を検出層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、フィルタリング層を形成し；約１２％のプルラン、約６％のセルロース、約１％のＴｗｅｅｎ－２０、ならびに蛍光トレーサーおよび結合パートナーを含有する溶液／懸濁液をフィルタリング層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、インジケーター層を形成し；約１％の、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬、約１％のＭｅｒｐｏｌ Ａ、および適切な拡散層の成分を含有する溶液／懸濁液をインジケーター層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、拡散層を形成する。
一実施形態では、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がサルコシルである。一実施形態では、分析物がコルチゾールであり、結合パートナーがコルチゾールに対する抗体であり、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がサルコシルである。
図５８に示される、別の実施形態では、インジケーター層が、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬を含む。
一実施形態では、約９～１０％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４を含有する溶液／懸濁液を支持層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、プライマー層を形成し；約１２％のポリビニルピロリドン、約６％のセルロース、および約１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有する溶液／懸濁液をプライマー層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、検出層を形成し；約１０％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４、約１０％のＴｉＯ２、および約５％のセルロースを含有する溶液／懸濁液を検出層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、フィルタリング層を形成し；約１２％のプルラン、約６％のセルロース、約１％のサルコシル、約１％のＭｅｒｐｏｌ Ａ、ならびに蛍光トレーサーおよび結合パートナーを含有する溶液／懸濁液をフィルタリング層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、インジケーター層を形成し；適切な拡散層の成分を含有する溶液／懸濁液をインジケーター層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、拡散層を形成する。
一実施形態では、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がサルコシルである。一実施形態では、分析物がコルチゾールであり、結合パートナーがコルチゾールに対する抗体であり、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がサルコシルである。
図５８に示される、別の実施形態では、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬が拡散層と検出層の両方に含まれる。一実施形態では、約９～１０％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４を含有する溶液／懸濁液を支持層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、プライマー層を形成し；約１２％のポリビニルピロリドン、約６％のセルロース、および約１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有する溶液／懸濁液をプライマー層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、検出層を形成し；約１０％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４、約１０％のＴｉＯ２、および約５％のセルロースを含有する溶液／懸濁液を検出層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、フィルタリング層を形成し；約１２％のプルラン、約６％のセルロース、約０．５％のサルコシル、約０．５％のＭｅｒｐｏｌ Ａ、ならびに蛍光トレーサーおよび結合パートナーを含有する溶液／懸濁液をフィルタリング層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、インジケーター層を形成し；適切な拡散層の成分、約０．５％のサルコシル、および約０．５％のＭｅｒｐｏｌ Ａを含有する溶液／懸濁液をインジケーター層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、拡散層を形成する。
一実施形態では、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がサルコシルである。一実施形態では、分析物がコルチゾールであり、結合パートナーがコルチゾールに対する抗体であり、結合タンパク質から分析物を遊離する試薬がサルコシルである。
さらなる実施形態では、プライマー層と検出層を合わせる。約９～１０％のＨｙｄｒｏＭｅｄ Ｄ４および約１０％のセルロースを含有する溶液／懸濁液を支持層に適用し、溶液／懸濁液から溶媒を除去することによって、合わせたプライマー／検出層を形成する。一実施形態では、図５８に示されるスライドのプライマー層と検出層を合わせる。
一部の実施形態では、層の１つまたは複数がガラスビーズを含んでもよい。ガラスビーズを含有する層を形成するために、この層を形成するために使用される溶液／懸濁液は約６％のガラスビーズを含有する。好ましい実施形態では、ガラスビーズがインジケーター層および／またはフィルタリング層に含まれる。
層の１つまたは複数がＭｅｐｏｌ Ａを含んでもよい。分析物を遊離する試薬がサルコシルである場合に、Ｍｅｒｐｏｌ Ａの添加が好ましい。サルコシルが分析物を遊離する試薬として使用される場合、Ｍｅｒｐｏｌ Ａを、少なくともサルコシルを含有する層に含めることが好ましい。
試料は、それだけに限らないが、尿、血清、牛乳、唾液、血漿、全血、汗、涙、糞便、および脊椎液を含む上記の試料のいずれかであり得る。
分析物は、それだけに限らないが、ＳＤＭＡ、メラミン、抗生物質、Ｔ４、β－ラクタム抗生物質（ペニシリンなど）、サルファ薬、セファロスポリン、プロゲステロン、コルチゾール、胆汁酸、タンパク質、ＮＴ－プロＢＮＰ、およびシスタチン－Ｂを含む上記の分析物のいずれかであり得る。
一実施形態では、乾式スライドが、目的の分析物を含有する液体試料を装置の開口部に適用し、次いで、液体を、毛管輸送ゾーンを介して乾式スライドに運搬する装置の一部である。このような装置の例示的な例は、米国特許第４３２３５３６号および同第５７２６０１０号に記載される。スライドは、スライドがフレーム、ハウジングまたはケースによって規定される開口または空洞内に配置されている装置の一部であり得る。一実施形態では、スライドが、米国特許第９９３３４２８号に開示されるようにハウジングまたはケース内に配置される。ハウジングまたはケースを含む乾式スライド装置の他の例は、Ｃａｔａｌｙｓｔ（登録商標）スライド、例えばＣａｔａｌｙｓｔ（登録商標）ＦｒｕｃｔｏｓａｍｉｎｅスライドまたはＣａｔａｌｙｓｔ（登録商標）Ｔｏｔａｌ Ｔ４（ＴＴ４）スライド（メイン州ウェストブルックのＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）である。
一実施形態では、アッセイが、乾式化学分析計器、例えば、Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｏｎｅ（登録商標）またはＣａｔａｌｙｓｔ Ｄｘ（登録商標）分析装置（メイン州ウェストブルックのＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）を使用して実施される。
４．蛍光トレーサー
蛍光を放出し、Ｔ－エピトープ部分に連結され得る任意の分子を使用して蛍光トレーサーを得ることができる。蛍光を発する適切な分子の例としては、それだけに限らないが、フルオレセイン、クマリン、およびローダミン色素が挙げられる。
一実施形態では、蛍光トレーサーが、フルオレセイン分子に連結したＴ－エピトープ部分を有する。好ましくは、Ｔ－エピトープ部分がフルオレセイン分子の４’位または５’位に連結している。より好ましくは、Ｔ－エピトープ部分がフルオレセイン分子の４’位に連結している。
具体的には、本発明は、４’－置換フルオレセイントレーサー、すなわち、Ｔ－エピトープ部分がフルオレセイン分子の４’位に付着している蛍光トレーサーを企図する。４’－置換フルオレセイントレーサーの一般的な構造は、
Figure 2023521886000013
（式中、Ｔは結合または連結基である）
である。
本発明はまた、４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体を企図する。「４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体」という句は、本明細書で使用される場合、フルオレセインコア構造の炭素に結合している水素原子の１個または複数が別の官能基で置き換えられている、４’－置換フルオレセイントレーサー分子を意味する。一実施形態では、フルオレセインコア構造の炭素に結合している水素原子の１個または複数が、それだけに限らないが、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、および－ＯＨなどの電子供与基で置き換えられている。一実施形態では、フルオレセインコア構造の炭素に結合している水素原子の１個または複数が、それだけに限らないが、－Ｆ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、および－Ｃｌなどの電子求引基で置き換えられている。一実施形態では、官能基がフルオレセイン分子の２’位および／または７’位の水素に取って代わる。
例示的な４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体は、
Figure 2023521886000014
である。
本発明はまた、５－置換フルオレセイントレーサー、すなわち、Ｔ－エピトープ部分がフルオレセイン分子の５位に付着しているフルオレセイントレーサーを企図する。５－置換フルオレセイントレーサーの一般的な構造は、
Figure 2023521886000015
である。
本発明はまた、５－置換フルオレセイントレーサー誘導体を企図する。「５－置換フルオレセイントレーサー誘導体」という句は、本明細書で使用される場合、フルオレセインコア構造の炭素に結合している水素原子の１個または複数が別の官能基で置き換えられている、５－置換フルオレセイントレーサー分子を意味する。一実施形態では、フルオレセインコア構造の炭素に結合している水素原子の１個または複数が、それだけに限らないが、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、および－ＯＨなどの電子供与基で置き換えられている。一実施形態では、フルオレセインコア構造の炭素に結合している水素原子の１個または複数が、それだけに限らないが、－Ｆ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、および－Ｃｌなどの電子求引基で置き換えられている。一実施形態では、官能基がフルオレセイン分子の２’位および／または７’位の水素に取って代わる。
例示的な５－置換フルオレセイントレーサー誘導体は、
Figure 2023521886000016
である。
エピトープ部分はフルオレセインコア構造に直接結合していてもよいし、リンカーＴによってフルオレセインコア構造から分離されていてもよい。一般的に、エピトープ部分は、リンカーによってフルオレセインコア構造から分離されている。一般的に、リンカーは８原子長未満、好ましくは６原子長未満、より好ましくは４原子長未満、最も好ましくは２原子長未満である。一実施形態では、リンカーは１原子長である。
一実施形態では、蛍光トレーサーが、クマリン分子に連結したＴ－エピトープ部分を有する。
例示的なリンカーには、それだけに限らないが、－ＣＨ２－、－Ｃ（Ｏ）－、－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＮＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＨ－、－ＣＨ２－ＮＨ－、－ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）－、および－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２ＣＨ２－Ｃ（Ｏ）－が含まれる。
一実施形態では、以下に示されるように、フルオレセインの４’位をアルデヒド基で官能化し、次いで、これをエピトープ部分上の官能基（アミンなど）と反応させて、連結基が－ＣＨ２－部分である４’－置換フルオレセイントレーサーを得ることによって、４’－置換フルオレセイントレーサーを得る：
Figure 2023521886000017
別の実施形態では、アルデヒド基を、図２に示されるように、当業者に周知の化学を使用して別の官能基に変換し、次いで、得られた４’－置換フルオレセイン分子を、当業者に公知の化学を使用して、アミンまたはカルボン酸基などの、エピトープ部分上の官能基と反応させて、４’－置換フルオレセイントレーサーを得る。
別の実施形態では、以下に示されるように、アルデヒドをカルボン酸に変換し、得られたカルボン酸をＮ－ヒドロキシスクシンイミドと反応させ、次いで、得られたＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルをエピトープ部分上の官能基（アミンなど）と反応させて、連結基が－Ｃ（Ｏ）－部分である４’－置換フルオレセイントレーサーを得る：
Figure 2023521886000018
アルデヒドをカルボン酸に変換するのに適した試薬には、それだけに限らないが、過マンガン酸カリウムおよび二クロム酸ナトリウムが含まれる。
別の実施形態では、以下に示されるように、エピトープ部分上のアミン基を２，２－ジメトキシアセトアルデヒドと反応させてアセタール誘導体化エピトープ部分を得て、アセタール誘導体化エピトープ部分のアセタール基をアルデヒドに変換し、次いで、得られたアルデヒド誘導体化エピトープ部分を、４’位が－ＣＨ２－ＮＨ２－基または－ＮＨ２基で置換されているフルオレセイン誘導体と縮合して、連結基が－ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２－または－ＮＨＣＨ２ＣＨ２－部分である４’－置換フルオレセイントレーサーを得る：
Figure 2023521886000019
アルデヒド基で４’位において置換されているフルオレセイン（実施例１に記載されるように調製）の３位のカルボン酸基を最初に保護し（例えば、エステルとして）、アルデヒド基をカルボン酸に変換して、４’位にカルボン酸基および３位に保護カルボン酸を有するフルオレセインを得ることによって、－ＮＨ２基で４’位において置換されているフルオレセイン分子を調製することができる。次いで、４位のカルボン酸を酸塩化物に変換し（例えば、塩化チオニルとの反応によって）、酸塩化物をアンモニアと反応させてアミドを得て、アミドをＢｒ２／ＮａＯＨと反応させてアミンを得る（すなわち、ホフマンブロモアミド分解）。次いで、酸保護基を除去する。一般的な反応スキームを以下に示す。
Figure 2023521886000020
Figure 2023521886000021
別の実施形態では、以下に示されるように、エピトープ分子上のアミン基を無水コハク酸（ジヒドロフラン－２，５－ジオン）と反応させて－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ誘導体化エピトープ部分を得て、次いで、誘導体化エピトープ部分をＮ－ヒドロキシスクシンイミドと反応させて無水物を得て、次いで、無水物を、４’位が－ＣＨ２－ＮＨ２－基または－ＮＨ２基で置換されているフルオレセイン誘導体と反応させて、連結基が－ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－または－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）－である４’－置換フルオレセイントレーサーを得る：
Figure 2023521886000022
別の実施形態では、以下に示されるように、エピトープ分子上の酸基をＮ－ヒドロキシスクシンイミドと反応させて無水物を得て、次いで、無水物を、４’位が－ＣＨ２－ＮＨ２－基（カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）または－ＮＨ２基で置換されているフルオレセイン誘導体と反応させて、連結基が－ＣＨ２－ＮＨ２－基または－ＮＨ２基である４’－置換蛍光トレーサーを得る：
Figure 2023521886000023
４’－置換フルオレセイントレーサーを合成する場合、一定の官能基が望ましくない反応を受けるのを防ぐために慣用的な保護基が必要となり得ることが理解される。特定の官能基に適した保護基ならびに保護および脱保護に適した条件の選択は当技術分野で公知である。例えば、多数の保護基、ならびにその導入および除去は、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ、ニューヨーク、１９９１、およびその中に引用されている参考文献に記載されている。
同様の化学を使用して４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体を得ることができる。
一実施形態では、－ＮＨ２基を有するエピトープ分子が対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）である。ＳＤＭＡの構造は、
Figure 2023521886000024
である。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
Figure 2023521886000025
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する４’－置換フルオレセイントレーサーまたは４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体に関する。
一実施形態では、本発明は、上で同定される構造から選択される４’－置換フルオレセイントレーサーまたは４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体とＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
Figure 2023521886000026
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する４’－置換フルオレセイントレーサーまたは４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体に関する。
一実施形態では、本発明は、上で同定される構造から選択される４’－置換フルオレセイントレーサーまたは４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体とＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
Figure 2023521886000027
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する４’－置換フルオレセイントレーサーまたは４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体に関する。
一実施形態では、本発明は、上で同定される構造から選択される４’－置換フルオレセイントレーサーまたは４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体とＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
Figure 2023521886000028
を有する４’－置換フルオレセイントレーサーに関する。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
Figure 2023521886000029
を有する４’－置換フルオレセイントレーサーに関する。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
Figure 2023521886000030
を有する４’－置換フルオレセイントレーサーに関する。
一実施形態では、本発明は、構造Ａ１の４’－置換トレーサーとＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は、構造Ａ２の４’－置換トレーサーとＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は、構造Ａ３の４’－置換トレーサーとＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
同様に、以下に示されるように、フルオレセインの５位をアルデヒド基で官能化し、次いで、これをエピトープ部分上の官能基（アミンなど）と反応させて、連結基が－ＣＨ２－部分である５－置換フルオレセイントレーサーを得ることによって、５－置換フルオレセイントレーサーを得る：
Figure 2023521886000031
カルボン酸基で５位において置換されたフルオレセイン分子のカルボン酸基をアルコール（－ＣＨ２ＯＨ）に還元し、次いで、得られたアルコールをアルデヒドに酸化することによって、アルデヒド基で５位において官能化されたフルオレセインを得ることができる。カルボン酸基で５位において官能化されたフルオレセインは、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能である。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
Figure 2023521886000032
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する５－置換フルオレセイントレーサーまたは５－置換フルオレセイントレーサー誘導体に関する。
一実施形態では、本発明は、上で同定される構造から選択される５－置換フルオレセイントレーサーまたは５－置換フルオレセイントレーサー誘導体とＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
Figure 2023521886000033
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する５－置換フルオレセイントレーサーまたは５－置換フルオレセイントレーサー誘導体に関する。
一実施形態では、本発明は、上で同定される構造から選択される５－置換フルオレセイントレーサーまたは５－置換フルオレセイントレーサー誘導体とＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は、以下の構造：
Figure 2023521886000034
（式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
を有する５－置換フルオレセイントレーサーまたは５－置換フルオレセイントレーサー誘導体に関する。
一実施形態では、本発明は、上で同定される構造から選択される５－置換フルオレセイントレーサーまたは５－置換フルオレセイントレーサー誘導体とＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は構造Ａ４の５－置換フルオレセイントレーサーに関する。
Figure 2023521886000035
一実施形態では、本発明は構造Ａ５の５－置換フルオレセイントレーサーに関する。
Figure 2023521886000036
一実施形態では、本発明は構造Ａ６：
Figure 2023521886000037
の５－置換フルオレセイントレーサーに関する。
一実施形態では、本発明は、構造Ａ４の５－置換フルオレセイントレーサーとＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は、構造Ａ５の５－置換フルオレセイントレーサーとＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
一実施形態では、本発明は、構造Ａ６の５－置換フルオレセイントレーサーとＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
メラミンについてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000038
である。
一実施形態では、本発明は、Ｍｅｌ－ＦまたはＭｅｌ－Ｓｕ－Ｆとメラミンに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
ビオチンについてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000039
である。
一実施形態では、本発明は、ビオチン－Ｆとビオチンに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
チロキシンについてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000040
である。
一実施形態では、本発明は、Ｔ２－Ｆ、Ｔ３－Ｆ、Ｔ４－Ｆ、またはＴ３－Ｅ－Ｆとチロニンに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
アモキシシリンについてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000041
である。
一実施形態では、本発明は、ＡＭＯ－Ｆとアモキシシリンに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
アンピシリンについてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000042
である。
一実施形態では、本発明は、ＡＭＰ－Ｆとアンピシリンに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
セフォタキシムについてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000043
である。
一実施形態では、本発明は、ＣＥＦ－Ｆとセフォタキシムに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
スルファジメトキシンについてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000044
である。
一実施形態では、本発明は、ＳＤＭ－Ｓｕ－ＦまたはＳＤＭ－Ｆとスルファジメトキシンに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
コルチゾールについてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000045
である。
一実施形態では、本発明は、コルチゾール－４－Ｆｌとコルチゾールに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
プロゲステロンについてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000046
である。
一実施形態では、本発明は、プロゲステロン－４－Ｆｌとプロゲステロンに対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
胆汁酸についてのアッセイに使用することができる例示的な４’－置換フルオレセイントレーサーは、
Figure 2023521886000047
である。
一実施形態では、本発明は、ＣＡ－Ｆｌと胆汁酸に対する抗体とを含む複合体に関する。一実施形態では、抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
例示的な胆汁酸には、それだけに限らないが、コール酸およびタウロコール酸が含まれる。
Figure 2023521886000048
一実施形態では、蛍光を発する分子が、以下に示される、例えば、アルデヒド基、－ＣＯＯＨ基、または－ＣＨ２ＮＨ２基で、４’位と５’位の両方において官能化されているフルオレセインである：
Figure 2023521886000049
（式中、Ｘは－Ｃ（Ｏ）Ｈ、－ＣＯＯＨ、または－ＣＨ２ＮＨ２である）。
Ｔ－エピトープ部分は、４’位、５’位のいずれか、または４’位と５’位の両方でフルオレセインコア構造に付着することができる。Ｔ－エピトープ部分は、上記の化学を使用してフルオレセインコア構造に付着することができる。
一実施形態では、本発明は、ＡＭＯ－Ｆ、ＡＭＰ－Ｆ、またはＣＥＦ－Ｆとペニシリン結合タンパク質を含む複合体に関する。一実施形態では、ペニシリン結合タンパク質が、クエンチャーにコンジュゲートしている。
５．結合パートナー
分析物および蛍光トレーサーに特異的な結合パートナーは、例えば、抗体であり得る。当技術分野で認識されている技術を使用して、分析物に対する動物での免疫応答を発生させることによって抗体を得ることができる。典型的には、ハプテン（目的の分析物と共通のエピトープ部分を有する）をウシ血清アルブミンなどの担体タンパク質にコンジュゲートして免疫原（抗原）を得て、これを、一連の注射によって、ウサギ、マウス、またはヒツジなどの動物に投与し、次いで、慣用的な技術を使用して得られた抗体を単離する。免疫原を形成するために使用することができる他の例示的なタンパク質担体には、それだけに限らないが、キーホールリンペットヘモシアニン、卵オボアルブミン、ウシガンマ－グロブリン、およびチロキシン結合グロブリンが含まれる。あるいは、ハプテンを、ハプテンと反応性の官能基を含有する合成または天然ポリマー材料にコンジュゲートすることによって、抗原を形成することができる。
結合パートナーはまた、抗体ではないタンパク質であり得る。タンパク質は慣用的な技術によって単離することができる。分析物は、タンパク質に特異的な基質である。例えば、分析物はペニシリン、エストラジオール、およびプロゲステロンからなる群から選択され得、結合パートナーはそれぞれペニシリン結合タンパク質、エストラジオール結合タンパク質、およびプロゲステロン結合タンパク質からなる群から選択され得る。
一実施形態では、結合パートナーが磁気バーコードビーズに連結している。
一実施形態では、結合パートナーが、クエンチャーにコンジュゲートしている。理論によって拘束されることを望むものではないが、蛍光トレーサーが結合パートナーに結合しており、結合パートナーが、クエンチャーにコンジュゲートしており、第１の波長の光で照射することによって蛍光トレーサーが励起される場合、エネルギーが蛍光トレーサーからクエンチャーに移動し、次いで、クエンチャーがエネルギーを熱的に、または第２の波長以外の波長の光を発することによって失うと考えられる。よって、クエンチャーは、結合パートナーが、クエンチャーにコンジュゲートしていない場合に観察されるよりも大きな蛍光強度の減少をもたらす。
クエンチャーにコンジュゲートしている結合パートナーと複合体を形成した場合の蛍光トレーサーの蛍光の減少は、結合パートナーにコンジュゲートしているクエンチャー分子の当量の関数である。クエンチャー分子が結合パートナーに結合すればするほど、蛍光の減少が大きくなる。これは、２、４、６、および８個のＢＨＱ１０クエンチャー分子にコンジュゲートしている抗体についての蛍光対抗体：蛍光トレーサーの比のプロットとして図２３に示される。図２３は、蛍光トレーサーＡ３がＳＤＭＡに対する抗体と複合体を形成すると、蛍光が減少し、蛍光の最大の減少は、抗体にコンジュゲートしたクエンチャー分子（ＢＨＱ１０）の当量に比例することを示している。図２３は、抗体が２当量のＢＨＱ１０にコンジュゲートしている場合、蛍光の最大の減少が約５０％であり、抗体が８当量のＢＨＱ１０にコンジュゲートしている場合、蛍光の最大の減少が約７０％であることを示している。
結合パートナーに結合し得る適切なクエンチャーには、それだけに限らないが、以下に示されるものが含まれる：
Figure 2023521886000050
（式中、対イオンは上記構造に示されておらず、結合パートナーは、
Figure 2023521886000051
でクエンチャーに連結している）。
追加の適切なクエンチャーには、それだけに限らないが、ＤＡＢＣＹＬおよびＤＡＢＣＹＬ－Ｐｌｕｓ（商標）（カリフォルニア州フリーモントのＡｎａＳｐｅｃ Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）；Ｐｒｏｃｉｏｎ（登録商標）ＭＸ－５Ｂ、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ ４、およびＲｅａｃｔｉｖｅ Ｒｅｄ １２０（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）；ＤｙｌｉｇｈｔＱ５４３（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）；ＴＩＤＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）２ＷＳ（カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）；ＰＡＤＡ（ピリジン－２－アゾ－ｐ－ジメチルアニリン）（マサチューセッツ州ケンブリッジのＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａから商業的に入手可能）；ＱＳＹ（商標）クエンチャー（ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、およびＱＳＹ２１を含む、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）；ＱＸＬ（商標）クエンチャー（ＱＸＬ４９０、ＱＸＬ５７０、ＱＸＬ６１０、およびＱＸＬ６７０を含む、カリフォルニア州フリーモントのＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）；Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）クエンチャー（Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱおよびＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱを含む、アイオワ州コーラルビルのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）；ならびにジュロリジン誘導体（ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（登録商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０を含む、ミシガン州デクスターのＢｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）が含まれる。
結合パートナー－クエンチャーコンジュゲートは、商業的に入手可能な試薬を使用して調製される。例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５に結合した結合パートナーは、結合パートナーを、それぞれ、イリノイ州シカゴのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから商業的に入手可能な
Figure 2023521886000052
（対イオンは示していない）
と反応させることによって調製され；ＩＲＤｙｅＱＣ１に結合した結合パートナーは、結合パートナーを、ネブラスカ州リンカーンのＬｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に入手可能な
Figure 2023521886000053
（対イオンは示していない）
と反応させることによって調製され；ＢＨＱ１に結合した結合パートナーは、結合パートナーを、カリフォルニア州ペタルーマのＬＧＣ Ｂｉｏｓｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能な
Figure 2023521886000054
（対イオンは示していない）
と反応させることによって調製され；ＢＨＱ１０の結合パートナーは、結合パートナーを、カリフォルニア州ペタルーマのＬＧＣ Ｂｉｏｓｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能な
Figure 2023521886000055
（対イオンは示していない）
と反応させることによって調製される。
結合パートナーは、結合パートナーを供給業者の指示に従ってＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによってクエンチャーにコンジュゲートされる。あるいは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを対応するカルボン酸から調製することができる。
Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルと結合パートナーの比は、典型的には約１～約３０、好ましくは約１～約２０、より好ましくは約１～約１２の範囲である。この比は、蛍光トレーサーを調製するために使用される蛍光分子、クエンチャー、分析物、および結合パートナーの選択に応じて変化する。好ましい比は、異なる濃度のこれらの分子の各々の蛍光の消光を測定することによって決定される。
理論によって拘束されることを望むものではないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルは、アミン基などの結合パートナー上の１つまたは複数の基をアシル化して、クエンチャーＣＹ３について以下に示されるような構造をもたらすと考えられる：
Figure 2023521886000056
好ましくは、クエンチャーがＣＹ３、ＣＹ５、ＢＨＱ１、またはＢＨＱ１０である。より好ましくは、クエンチャーがＢＨＱ１０である。
クエンチャーは、蛍光トレーサーから放出される光がクエンチャーを励起し得るか、またはクエンチャーによって吸収され得るように選択される。クエンチャーは、クエンチャーによって放出される光の波長が照射光の波長と実質的に重複しないように選択される。
一実施形態では、分析物が抗原であり、蛍光トレーサーが蛍光標識に連結した抗原のエピトープ部分を含む分析物－コンジュゲートであり、結合パートナーが抗原に対する抗体である。
一実施形態では、分析物がＳＤＭＡであり、蛍光トレーサーがＳＤＭＡのエピトープ部分を含む分析物－コンジュゲートであり、結合パートナーがＢＨＱ１０にコンジュゲートしているＳＤＭＡに対する抗体である。好ましくは、ＢＨＱ１０と抗体の比が２０：１である。一実施形態では、ＢＨＱ１０と抗体の比が１２：１である。
一実施形態では、分析物がＳＤＭＡであり；蛍光トレーサーがＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、およびＡ６からなる群から選択され；結合パートナーがＢＨＱ１０にコンジュゲートしているＳＤＭＡに対する抗体である。一実施形態では、分析物がＳＤＭＡであり；蛍光トレーサーがＡ１、Ａ２、およびＡ３からなる群から選択され；結合パートナーがＢＨＱ１０にコンジュゲートしているＳＤＭＡに対する抗体である。一実施形態では、分析物がＳＤＭＡであり、蛍光トレーサーがＡ３であり；結合パートナーがＢＨＱ１０にコンジュゲートしているＳＤＭＡに対する抗体である。
６．分析物が高分子である蛍光消光アッセイの例示的な実施形態
一実施形態では、分析物がタンパク質などの高分子である。例示的なタンパク質はシスタチンである。
一実施形態では、分析物がシスタチン－Ｂ（すなわち、Ｃｙｓ－ＢまたはＣｙｓＢ）であり；蛍光トレーサーがＣｙｓＢに付着した蛍光部分であり；結合パートナーが１つまたは複数のクエンチャーにコンジュゲートしている抗シスタチン－Ｂ抗体（すなわち、抗Ｃｙｓ－Ｂまたは抗ＣｙｓＢ抗体）である。
一実施形態では、蛍光トレーサーが、１個または複数のリジン残基を通してフルオレセインにコンジュゲートしたＣｙｓＢである。１個または複数のリジン残基を通してフルオレセインにコンジュゲートした蛍光トレーサーを提供するために、ＣｙｓＢを様々な当量のフルオレセイン－ＮＨＳ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能なフルオレセインのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（すなわち、５－（および６－）カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステル））と反応させて、リジン残基を通してＦＬにコンジュゲートしたＣｙｓＢ－Ｆｌを得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、フルオレセイン－ＮＨＳはＣｙｓＢ上のリジン残基と反応して、リジン残基を通してＦＬにコンジュゲートしたＣｙｓＢ－ＦＬをもたらすと考えられる。典型的には、リジン残基を通してＦＬにコンジュゲートしたＣｙｓＢ－ＦＬは、ＣｙｓＢを１～４当量の間のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、リジン残基を通してＦＬにコンジュゲートしたＣｙｓＢ－Ｆｌが、ＣｙｓＢを２当量のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、リジン残基を通してＦＬにコンジュゲートしたＣｙｓＢが、ＣｙｓＢを４当量のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。
一実施形態では、蛍光トレーサーが、１個または複数のシステイン残基を通してフルオレセインにコンジュゲートしたＣｙｓＢである。１個または複数のシステイン残基を通してフルオレセインにコンジュゲートした蛍光トレーサーを提供するために、ＣｙｓＢを様々な当量のフルオレセイン－５－マレイミド（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）と反応させる。理論によって拘束されることを望むものではないが、フルオレセイン－５－マレイミドがＣｙｓＢ上のシステイン残基と反応して、システイン残基を通してフルオレセインにコンジュゲートしたＣｙｓＢ－ＦＬをもたらすと考えられる。典型的には、システイン残基を通してＦＬにコンジュゲートしたＣｙｓＢは、ＣｙｓＢを１～４当量の間のフルオレセイン－５－マレイミドと反応させることによって得られる。一実施形態では、システイン残基を通してコンジュゲートしたＣｙｓＢ－ＦＬは、ＣｙｓＢを２当量のフルオレセイン－５－マレイミドと反応させることによって得られる。
一実施形態では、蛍光トレーサーが、フルオレセインにコンジュゲートしたＣｙｓＢ－ペプチド９、すなわち、ＣｙｓＢ－ペプチド９－ＦＬである。ＣｙｓＢ－ペプチド９－ＦＬは、ＣｙｓＢ－ペプチド９をフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。理論によって拘束されることを望むものではないが、フルオレセイン－ＮＨＳはＣｙｓＢ－ペプチド９上のリジン残基と反応して、ＣｙｓＢ－ペプチド９－ＦＬをもたらすと考えられる。典型的には、ＣｙｓＢ－ペプチド９－ＦＬは、ＣｙｓＢ－ペプチド９を１～４当量の間のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、ＣｙｓＢ－ペプチド９－ＦＬは、ＣｙｓＢ－ペプチド９を４当量のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。
一実施形態では、結合パートナーが、１個または複数のＢＨＱ１０分子にコンジュゲートしている抗シスタチン－Ｂ抗体（すなわち、抗ＣｙｓＢ抗体）、すなわち、抗ＣｙｓＢ－ＢＨＱである。抗ＣｙｓＢ－ＢＨＱは、抗ＣｙｓＢ抗体をＢＨＱ１０－ＮＨＳ（ＢＨＱ１０のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、カリフォルニア州ペタルーマのＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能）と反応させることによって得ることができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、ＢＨＱ１０－ＮＨＳは抗ＣｙｓＢ抗体上のリジン残基と反応して抗ＣｙｓＢ－ＢＨＱをもたらすと考えられる。典型的には、抗ＣｙｓＢ－ＢＨＱは、ＣｙｓＢを１～１６当量の間のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。ＣｙｓＢ抗体の例示的な例としては、それだけに限らないが、３Ｈ４－抗シスタチン－Ｂ抗体、Ｒａ３５５ポリクローナル－抗ＣｙｓＢ抗体、および７Ｃ２－抗ＣｙｓＢ抗体（これらの抗体の各々はカスタムメイドであり；Ｒａ３５５は、ニューアーク、デラウェア１９７０２所在のＳＤＩＸによって作製されたウサギポリクローナル抗ＣｙｓＢ抗体であり、３Ｈ４－抗シスタチン－Ｂ抗体および７Ｃ２－抗ＣｙｓＢ抗体は、カナダ、ブリティッシュコロンビア州バンクーバー所在のＩｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＬＬＣによって作製されたマウスモノクローナル抗ＣｙｓＢ抗体である）が挙げられる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＢＨＱが、３Ｈ４－抗シスタチン－Ｂ抗体を２当量のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＢＨＱが、３Ｈ４－抗シスタチン－Ｂ抗体を４当量のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＢＨＱは、Ｒａ３５５ポリクローナル－抗ＣｙｓＢ抗体を４当量のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＢＨＱが、７Ｃ２－抗ＣｙｓＢ抗体を４当量のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。
一実施形態では、結合パートナーが、１個または複数のホウ素－ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）分子にコンジュゲートしている抗ＣｙｓＢ抗体、すなわち、抗ＣｙｓＢ－ＢＯＤＩＰＹである。抗ＣｙｓＢ－ＢＯＤＩＰＹは、抗ＣｙｓＢ抗体をＢＯＤＩＰＹ－ＮＨＳ（ＢＯＤＩＰＹのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）と反応させることによって得ることができる。典型的には、抗ＣｙｓＢ－ＢＯＤＩＰＹは、ＣｙｓＢを１～４当量の間のＢＯＤＩＰＹ－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＢＯＤＩＰＹが、３Ｈ４－抗シスタチン－Ｂ抗体を２当量のＢＯＤＩＰＹ－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＢＯＤＩＰＹが、３Ｈ４－抗シスタチン－Ｂ抗体を４当量のＢＯＤＩＰＹ－ＮＨＳと反応させることによって得られる。好ましくは、抗ＣｙｓＢ－ＢＯＤＩＰＹは、３Ｈ４－抗ＣｙｓＢ抗体を４当量のＢＯＤＩＰＹ－ＮＨＳと反応させることによって得られる。
一実施形態では、分析物がＣｙｓＢであり；蛍光トレーサーが抗ＣｙｓＢ抗体に付着した蛍光部分であり；結合パートナーが１つまたは複数のクエンチャーにコンジュゲートしているＣｙｓＢである。
一実施形態では、蛍光トレーサーが、抗ＣｙｓＢ－ＦＬを提供するために様々な当量のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させられた抗ＣｙｓＢ抗体である。理論によって拘束されることを望むものではないが、フルオレセイン－ＮＨＳは抗ＣｙｓＢ抗体上のリジン残基と反応して抗ＣｙｓＢ－ＦＬをもたらすと考えられる。典型的には、抗ＣｙｓＢ－ＦＬが、抗ＣｙｓＢ抗体を１～４当量の間のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＦＬが、３Ｈ４－抗ＣｙｓＢ抗体をフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。ＣｙｓＢ抗体の例示的な例としては、それだけに限らないが、３Ｈ４－抗シスタチン－Ｂ抗体、Ｒａ３５５ポリクローナル－抗ＣｙｓＢ抗体、および７Ｃ２－抗ＣｙｓＢ抗体が挙げられる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＦＬが、３Ｈ４－抗ＣｙｓＢ抗体を２当量のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。好ましくは、抗ＣｙｓＢ－ＦＬが、３Ｈ４－抗ＣｙｓＢ抗体を２当量のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＦＬが、３Ｈ４－抗ＣｙｓＢ抗体を４当量のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＦＬが、Ｒａ３５５ポリクローナル－抗ＣｙｓＢ抗体を２当量のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＦＬが、７Ｃ２－抗ＣｙｓＢ抗体を２当量のフルオレセイン－ＮＨＳと反応させることによって得られる。
一実施形態では、蛍光トレーサーが、フルオレセインアルデヒドとコンジュゲートした抗ＣｙｓＢ－ＦＬを提供するために、様々な当量のフルオレセインアルデヒド、すなわち、アルデヒド基で４’位において官能化されているフルオレセインと反応させられた抗ＣｙｓＢ抗体、すなわち、抗ＣｙｓＢ－ＦＬ－Ａｌｄである。理論によって拘束されることを望むものではないが、フルオレセインアルデヒドは抗ＣｙｓＢ抗体上のリジン残基と反応して抗ＣｙｓＢ－ＦＬ－Ａｌｄをもたらすと考えられる。一実施形態では、抗ＣｙｓＢ－ＦＬ－Ａｌｄが、３Ｈ４－抗ＣｙｓＢ抗体を２当量のフルオレセインアルデヒドと反応させることによって得られる。好ましくは、抗ＣｙｓＢ－ＦＬ－Ａｌｄが、３Ｈ４－抗ＣｙｓＢ抗体を２当量のフルオレセインアルデヒドと反応させることによって得られる。
一実施形態では、結合パートナーが、１個または複数のＢＨＱ１０分子にコンジュゲートしているＣｙｓＢ、すなわち、ＣｙｓＢ－ＢＨＱである。ＣｙｓＢ－ＢＨＱは、ＣｙｓＢをＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得ることができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、ＢＨＱ１０－ＮＨＳはＣｙｓＢ上のリジン残基と反応してＣｙｓＢ－ＢＨＱをもたらすと考えられる。典型的には、ＣｙｓＢ－ＢＨＱが、ＣｙｓＢを１～１６当量の間のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、ＣｙｓＢ－ＢＨＱが、ＣｙｓＢを４当量のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、ＣｙｓＢ－ＢＨＱが、ＣｙｓＢを８当量のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。好ましくは、ＣｙｓＢ－ＢＨＱが、ＣｙｓＢを８当量のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。一実施形態では、ＣｙｓＢ－ＢＨＱが、ＣｙｓＢを１２当量のＢＨＱ１０－ＮＨＳと反応させることによって得られる。
一実施形態では、分析物がポリペプチドであり、蛍光トレーサーがポリペプチドのアミノ酸長より短いアミノ酸長を有するペプチド鎖に連結した蛍光を発する分子である。一実施形態では、ペプチド鎖が２０アミノ酸未満のアミノ酸長を有する。一実施形態では、ペプチド鎖が１５アミノ酸未満のアミノ酸長を有する。一実施形態では、ペプチド鎖が１０アミノ酸未満のアミノ酸長を有する。一実施形態では、ペプチド鎖が７アミノ酸未満のアミノ酸長を有する。一実施形態では、ポリペプチドが高分子（例えば、タンパク質）である。一実施形態では、ペプチド鎖のアミノ酸配列が、ポリペプチド上のエピトープ部分のアミノ酸配列に対応する。
一実施形態では、分析物がタンパク質などの高分子であり；蛍光トレーサーが、タンパク質のアミノ酸長より短いアミノ酸長を有するアミノ酸鎖に付着した蛍光部分である。アミノ酸鎖のアミノ酸配列は、結合パートナーとの複合体化を担うタンパク質上のエピトープのアミノ酸配列に対応する。一実施形態では、結合パートナーが、クエンチャーにコンジュゲートしている。
蛍光トレーサーを完全なタンパク質に連結するのではなく、蛍光部分をタンパク質のアミノ酸長より短いアミノ酸長を有するアミノ酸鎖に連結することの利点は、これにより、蛍光を発する分子とクエンチャーとの間の距離が、効率的な消光が存在するのに十分に近くなることが保証されるということである。蛍光トレーサーが完全なタンパク質に付着している場合、完全なタンパク質上のエピトープ部位のみが結合パートナーと相互作用する。したがって、タンパク質上の蛍光部分がエピトープ部位に近くなければ、複合体を形成する場合のタンパク質上の蛍光部分と結合パートナー上のクエンチャーとの間の分離が、有効な消光が存在するには大きくなりすぎる可能性がある。蛍光部分をタンパク質のアミノ酸長より短いアミノ酸長を有するアミノ酸鎖に連結することによって、この問題が最小化される。
一実施形態では、アミノ酸配列（すなわち、アミノ酸配列を有するポリペプチド）がフルオレセインの５位に付着される。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着される。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。
一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
例として、分析物はイヌＣｙｓＢであり；蛍光トレーサーは５～１５個の間のアミノ酸、好ましくは５～１０個の間のアミノ酸のアミノ酸配列に付着した蛍光部分であり；結合パートナーは場合により１つまたは複数のクエンチャーにコンジュゲートしている抗シスタチン－Ｂ抗体（すなわち、抗Ｃｙｓ－Ｂまたは抗ＣｙｓＢ抗体）である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列ＱＴＮＫＡＫＨＤＥＬＡＹＦ（Ｐ９）［配列番号：２］に付着している（すなわち、アミノ酸配列を有するポリペプチドに付着している）。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＹＱＴＮＫＡＫＨＤＥＬＡＹＦ（Ｐ１４）［配列番号：３］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＧＨＤＥＬＡＹＦ（Ｐ７）［配列番号：４］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＧＤＥＬＡＹＦ（Ｐ６）［配列番号：５］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＧＥＬＡＹＦ（Ｐ５）［配列番号：６］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＧＬＡＹＦ（Ｐ４）［配列番号：７］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＭＭＣＧＡＰＳＡＳＱＰＡＴＡＤＴＱＡＩＡＤＱＶＫＡＱＬＥＥＲＥＮＫＫＹＴＴＦＫＡＶＴＦＲＳＱＶＶＡＧＴＰＹＦＩＫＶＱＶＤＤＤＥＦＶＨＬＲＶＦＱＳＬＰＨＥＮＫＰＬＡＬＳＳＹＱＴＮＫＡＫＨＤＥＬＡＹＦ［配列番号：１］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
別の例としては、分析物がイヌＮＴ－プロＢＮＰ（ＮＴ－プロ－Ｂ型ナトリウム利尿タンパク質）であり；蛍光トレーサーが５～１５個の間のアミノ酸、好ましくは５～１０個の間のアミノ酸のアミノ酸配列に付着した蛍光部分であり；結合パートナーが場合により１つまたは複数のクエンチャーにコンジュゲートしている抗ＮＴ－プロＢＮＰ Ｍａｂである。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＡＥＱＬＡＬＥＰＬＨＲＳ（Ｐ１）［配列番号：８］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＡＥＱＬＡＬ（Ｐ２）［配列番号：９］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＥＰＬＨＲＳ（Ｐ３）［配列番号：１０］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＬＡＬＥＰＬ（Ｐ４）［配列番号：１１］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＡＥＱＬＡＬＥ（Ｐ５）［配列番号：１２］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＬＥＰＬＨＲＳ（Ｐ６）［配列番号：１３］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＧＲＳＰＡＳＥＡＳＥＡＳＥＡＳＧＬＷＡＶＱ［配列番号：１５］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＳＨＳＰＡＥＡＰＥＡＧＧＴＰＲＧＶＬＡＰＨＤＳＶＬＱ［配列番号：１６］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
一実施形態では、蛍光部分がアミノ酸配列：ＨＰＬＧＧＲＳＰＡＳＥＡＳＥＡＳＥＡＳＧＬＷＡＶＱＥＬＬＧＲＬＫＤＡＶＳＥＬＱＡＥＱＬＡＬＥＰＬＨＲＳＨＳＰＡＥＡＰＥＡＧＧＴＰＲＧＶＬＡＰＨＤＳＶＬＱＡＬＲ［配列番号：１４］に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの５位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－である。一実施形態では、アミノ酸配列がフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、アミノ酸配列がリンカーによりフルオレセインの４’位に付着している。一実施形態では、リンカーが－ＣＨ２－である。
蛍光部分は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８６２８９７３号；同第８７７８６９９号；同第９６０５０６８号；同第９００５９８４号；および同第１０７２５０５２号に開示されるポリペプチドのいずれかに付着され得る。各得られたポリペプチドトレーサーは、米国特許第８６２８９７３号；同第８７７８６９９号；同第９６０５０６８号；同第９００５９８４号；および同第１０７２５０５２号に開示される対応する抗体のいずれかから選択される結合パートナーと合わせて本発明の方法に使用され得る。
実施例
本発明は、本発明の数個の態様の例示として意図されている実施例に開示される具体的な実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的な等価ないずれの実施形態も本発明の範囲内にある。実際、本明細書に示され、記載されるものに加えた本発明の様々な修正が当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲の範囲に入ることが意図されている。当業者の眼内にある、現在公知であるまたは後に開発される全ての等価物の置換を含む、本発明のこのようなバリエーション、および実験設計における配合の変更または微量の変更は、本明細書に組み込まれる本発明の範囲に入ると考えられる。
フルオレセインアルデヒドの調製
フルオレセインアルデヒドを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000057
フルオレセイン（４ｇ、１２ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）を水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）４０ｍＬに溶解し、次いで、７０℃に加熱した。加温した溶液に、クロロホルム（８ｍＬ、４５ｍｍｏｌ）を１滴ずつ添加し、得られた混合物を同じ温度で３時間維持した。室温に冷却した後、反応混合物を１Ｍ ＨＣｌ溶液２５０ｍＬに注ぎ入れて沈殿を得た。沈殿を濾過によって回収し、水で数回洗浄し、乾燥させ、光から保護した。
次いで、得られた粗生成物を、ジクロロメタン／アセトニトリル（１５：１）で溶出するシリカゲルカラム（２．５ｃｍ×３０ｃｍ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。フルオレセインアルデヒドを含有する画分を、１％酢酸を含有する水中４０％～８０％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラムを装備したＬＣ／ＭＳを使用して同定した。フルオレセインアルデヒドを含有する画分を合わせ、溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物を高真空下で乾燥させると、淡黄色結晶０．２８ｇが得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝３６１．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
メラミン－フルオレセイン（Ｍｅｌ－Ｆ）の調製
Ｍｅｌ－Ｆを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000058
２－クロロ－４，６－ジアミノ－１，３，５－トリアジン（４．５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）および４’－アミノメチルフルオレセイン（７．９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１ｍＬ）に溶解した。得られた溶液に、無水炭酸カリウム（５．５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を９５℃に加熱し、溶液をこの温度で一晩撹拌させた。次いで、溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する３０％アセトニトリル水溶液に溶解した。得られた溶液を、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル水溶液で溶出するＣ１８逆相カラム（１０ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。３０％アセトニトリルから６０％アセトニトリルの勾配を勾配に使用した。純粋なＭｅｌ－Ｆを含有する画分を合わせ、凍結乾燥するとＭｅｌ－Ｆが黄色粉末として得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝４７１．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
メラミン－コハク酸－フルオレセイン（Ｍｅｌ－Ｓｕ－Ｆ）の調製
Ｍｅｌ－Ｓｕ－Ｆを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000059
メラミン（４１６ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）および無水コハク酸（０．５ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（８ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を１００℃に加熱し、この温度で一晩撹拌させた。次いで、溶媒を減圧下で除去すると、メラミン－コハク酸誘導体（Ｍｅｌ－Ｓｕ）が得られた。
Ｍｅｌ－Ｓｕ（２７０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ’，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（２６８ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）、およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（０．１５ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去すると、（Ｍｅｌ－Ｓｕ－ＮＨＳ）が得られ、これをさらに精製することなく使用した。
Ｍｅｌ－Ｓｕ－ＮＨＳ（８ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）および４’－アミノメチル－フルオレセイン（１０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）を無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。得られたＤＭＦ溶液にＮ’Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（１０μＬ）を添加し、溶液を室温で２時間撹拌し、溶媒を高真空下で除去して残留物を得た。得られた残留物を、４０％から６０％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（１０ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製すると、Ｍｅｌ－Ｓｕ－Ｆが得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝５７０．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
ビオチン－フルオレセイン（ビオチン－Ｆ）の調製
ビオチン－Ｆを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000060
４’－アミノメチルフルオレセイン（３ｍｇ、７．５４μｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミドビオチン（２．５ｍｇ、７．５４μｍｏｌ、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。ＤＭＦ溶液にＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４μＬ）を添加し、得られた溶液を室温で２時間撹拌させた。次いで、溶液を、０．１％ギ酸を含有する水中４０％アセトニトリルで希釈し、０．１％ギ酸を含有する水中４０％アセトニトリルの移動相で溶出するＣ１８逆相カラム（１ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製すると、ビオチン－Ｆ ３ｍｇが黄色固体（収率：６８％）として得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝５８８．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
スルファジメトキシン－コハク酸－フルオレセイン（ＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆ）の調製
ＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000061
スルファジメトキシン（ＳＤＭ、１．０ｇ、３．２ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）および無水コハク酸（０．４９ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を１００℃に加熱し、この温度で２時間維持し、その後、溶媒を減圧下で除去して残留物を得た。得られた残留物をエタノール：水（１：１）から再結晶すると、ＳＤＭ－コハク酸（ＳＤＭ－Ｓｕ）１ｇが得られた。
ＳＤＭ－Ｓｕ（０．５１ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）、Ｎ’，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．２８ｍＬ、１．３６ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（０．１５ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）を合わせ、アルゴン雰囲気下で無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を室温で一晩撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、得られた生成物（ＳＤＭ－Ｓｕ－ＮＨＳ）をさらに精製することなく使用した。
ＳＤＭ－Ｓｕ－ＮＨＳ（１５．２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）および４’－アミノメチル－フルオレセイン（８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）を無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。ＤＭＦ溶液にＮ’Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（７μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で２時間撹拌した。次いで、溶媒を高真空下で除去し残留物を得た。得られた残留物を、４０％アセトニトリルで溶出するＣ１８逆相カラム（１０ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製すると、ＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆが黄色粉末として得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝７５４．８（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｔ３－エチル－フルオレセイン（Ｔ３－Ｅ－Ｆ）の調製
Ｔ３－Ｅ－Ｆを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000062
トリヨードチロニン（１００ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）をメタノール（５ｍＬ）に溶解した。次いで、メタノール溶液に水酸化ナトリウム（４５μＬ、１０Ｍ）およびジメトキシアセタールアルデヒド（２３０ｍＬ、６０％水溶液、１．５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で３０分間維持した。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（５０ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を２時間撹拌させた。次いで、水酸化ナトリウム（０．１ｍＬ、１Ｍ）を添加し、得られた反応混合物をさらに２時間撹拌させた。次いで、１Ｍ ＨＣｌを反応混合物に添加してＴ３－エチルアセタール（１００ｍｇ）、質量スペクトルｍ／ｚ＝７４０．３（Ｍ＋Ｈ）＋を沈殿させ、これをさらに精製することなく使用した。
Ｔ３－エチルアルデヒド
Ｔ３－エチルアセタールをテトラヒドロフランおよび硫酸（ＴＨＦ／Ｈ２ＳＯ４）中で一晩加水分解した。次いで、溶媒を減圧下で除去して残留物を得た。得られた残留物を、１％酢酸を含有する２０％アセトニトリル水溶液に溶解し、水中２０％から５０％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。Ｔ３－エチル－アルデヒドを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると白色粉末が得られた。
Ｔ３－Ｅ－Ｆ
Ｔ３－エチルアルデヒド（３ｍｇ、０．００４２ｍｍｏｌ）および４’－アミノメチルフルオレセイン（０．９ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）をＴＨＦ（１ｍＬ）および酢酸（１２μＬ）に溶解し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）（２ｍｇ）を添加した。得られた溶液を室温で一晩撹拌した。翌日、溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物を、水中２０％から６０％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラムを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製すると、Ｔ３－Ｅ－Ｆが得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝１０３９．４（Ｍ＋Ｈ）＋。
スルファジメトキシン－フルオレセイン（ＳＤＭ－Ｆ）の調製
ＳＤＭ－Ｆを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000063
スルファジメトキシン（８．６ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）およびフルオレセインアルデヒド（８ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）をメタノール（２ｍＬ）に溶解した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）および酢酸（４μＬ）を添加し、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。次いで、反応溶液を、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する水中４０％アセトニトリルで希釈し、０．１％ＴＦＡを含有する水中４０％から６０％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＭ－Ｆ生成物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＳＤＭ－Ｆ １ｍｇが黄色粉末として得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝６２３．７（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｔ３－Ｆの調製
Ｔ３－Ｆを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000064
重炭酸ナトリウム緩衝液４０ｍｌ（ｐＨ８．０で１００ｍＭ）とジオキサン２０ｍＬの混合物を含有する１００ｍＬフラスコに、フルオレセインアルデヒド（１８０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびトリヨードチロキシン（３９０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）を添加し、得られた溶液を室温で１時間撹拌させた。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（４００ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、得られた混合物を暗所中、室温で一晩撹拌した。次いで、１Ｍ ＨＣｌを使用して、得られた混合物のｐＨをｐＨ５．０に調整し、溶媒を凍結乾燥によって除去した。
Ｃ１８逆相シリカ１００ｇを使用して、直径３８ｍｍおよび長さ２００ｍｍを有するフラッシュカラムを調製した。少なくとも３カラム体積の０．１％酢酸を含有する水中３０％アセトニトリルを使用してカラムを平衡化した。次いで、粗Ｔ３－Ｆ生成物を、０．１％酢酸を含有する水中３０％アセトニトリルに溶解し、カラムに適用し、カラムを、０．１％酢酸を含有する水中３０％アセトニトリルで溶出した。溶出した画分を、２２０ｎｍで操作されるＵＶ検出器を装備したＨＰＬＣ（４．６ｍｍ×１００ｍｍ ＸＴｅｒｒａｏ Ｃ１８逆相カラム）を使用して、Ｔ３－Ｆの存在について監視した。Ｔ３－Ｆを含有する画分を合わせた。合わせた画分は、２２０ｎｍでのＵＶ検出を使用したＨＰＬＣ分析に基づいて、９５％より高い純度を示す。合わせた画分を凍結乾燥すると、生成物３５０ｍｇが得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝９９６．６（Ｍ＋Ｈ）＋。全体的な収率は約５０％であった。
同様の方法を使用してＴ２－ＦおよびＴ４－Ｆを調製した。生成物をその質量スペクトルによって特徴付けた。Ｔ２－Ｆ、ｍ／ｚ＝８６９．８（Ｍ＋Ｈ）＋およびＴ４－Ｆ、ｍ／ｚ＝１１２２．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
アモキシシリン－フルオレセイン（ＡＭＯ－Ｆ）の調製
ＡＭＯ－Ｆを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000065
重炭酸ナトリウム緩衝液４０ｍｌ（ｐＨ８．０で１００ｍＭ）とジオキサン２０ｍｌの混合物を含有する１００ｍＬフラスコに、フルオレセインアルデヒド（３６０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびアモキシシリン（５４７ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）を添加し、得られた溶液を、氷浴を使用して４℃に冷却し、４０分間撹拌した。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（３１４ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を暗所中４℃で撹拌させた。約２時間後、さらなるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１２５ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を暗所中４℃で撹拌させた。ＨＰＬＣを使用して反応混合物を監視した。反応が完了したら（少なくとも９０％の生成物形成によって示される）、１Ｍ ＨＣｌにより反応混合物のｐＨをｐＨ５．５に調整し、次いで、溶媒を凍結乾燥によって除去して粗生成物を得た。粗生成物の３分の１を、０．１％酢酸を含有する水中３０％アセトニトリル５０ｍＬに溶解すると、ｐＨ５．４を有する透明な黄色溶液が得られ、得られた溶液を、０．１％酢酸を含有する水中３０％アセトニトリルの移動相で溶出するＣ１８逆相カラムを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。ＡＭＯ－Ｆを含有する画分を合わせた。合わせた画分を、２２０ｎｍで操作するＵＶ検出器を装備したＨＰＬＣによって分析すると、２２０ｎｍでの吸収に基づいて、９５％より高い純度を示した。次いで、合わせた画分を凍結乾燥すると、生成物６１ｍｇが得られた。生成物の全体的な収率は約４２％であった。質量スペクトルｍ／ｚ＝７１０．１７９５（Ｍ＋Ｈ）＋。
同様の方法を使用してアンピシリン－フルオレセイン（ＡＭＰ－Ｆ）を調製した。質量スペクトルｍ／ｚ＝６９４．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
ＡＭＯ－ＦＩＴＣの調製
ＡＭＯ－ＦＩＴＣを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000066
アモキシシリン（９．４ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａから商業的に入手可能）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（１０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）、およびトリエチルアミン（５．６μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で一晩撹拌させた。次いで、溶液を、０．１％酢酸を含有する水中３０％アセトニトリルで希釈し、Ｃ１８逆相カラムに適用した。カラムを、０．１％酢酸を含有する水中３０％から５０％アセトニトリルの勾配で溶出した。ＡＭＯ－ＦＩＴＣを含有する画分を合わせ、合わせた画分を凍結乾燥すると、黄色粉末が得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝７５５．２（Ｍ＋Ｈ）＋。
セフォタキシム－フルオレセイン（ＣＥＦ－Ｆ）の調製
ＣＥＦ－Ｆを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000067
セフォタキシム酸（６３ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ、ミネソタ州セントポールのＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）、４’－アミノメチルフルオレセイン（５０ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）、および無水炭酸カリウム（５２ｍｇ、０．３７８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で１０分間撹拌した。２－（１Ｈ－７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（５３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、得られた混合物を室温で６時間撹拌させた。次いで、溶媒を減圧下で除去して残留物を得た。次いで、残留物を、０．１％酢酸を含有する水中３０％アセトニトリルに溶解し、得られた溶液をＣ１８逆相カラム（１００ｇ）に適用し、０．１％酢酸を含有する水中４０％から５０％アセトニトリルの勾配で溶出した。ＣＥＦ－Ｆ生成物を含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、生成物１０５ｍｇが得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝７９９．１４７７（Ｍ＋Ｈ）＋。
ＣＹ３－、ＣＹ５－、ＩＲＤｙｅＱＣ１、およびＢＨＱ１－標識抗Ｔ４－Ｍａｂの調製
モノクローナル抗Ｔ４抗体（抗Ｔ４－Ｍａｂ）（４ｍｇ、テネシー州メンフィスのＭｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）から商業的に入手可能）を、ＤＭＳＯ（０．２５ｍＬ）中０．５ｍｇのＣｙｓ３－ＮＨＳ（すなわち、Ｃｙ３のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、イリノイ州シカゴのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから商業的に入手可能）、Ｃｙ５－ＮＨＳ（Ｃｙ５のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、イリノイ州シカゴのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから商業的に入手可能）、ＩＲＤｙｅＱＣ１－ＮＨＳ（ＩＲＤｙｅＱＣ１のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、ネブラスカ州リンカーンのＬｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから商業的に入手可能）、またはＢＨＱ１－ＮＨＳ（ＢＨＱ１のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、カリフォルニア州ペタルーマのＬＧＣ Ｂｉｏｓｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能）と混合して溶液を得た。得られた溶液を４℃で一晩撹拌した。次いで、クエンチャー標識抗体を、ＰＢＳ移動相で溶出するＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラムを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。ＢＣＡキット（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を使用してタンパク質濃度を決定した。
Ｔ３－ＦＩＴＣの調製：
Ｔ３－ＦＩＴＣを以下に提供される反応スキームに示されるように調製した：
Figure 2023521886000068
トリヨードチロキシン（１６．７ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、１０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）、およびトリエチルアミン（５．６μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で一晩撹拌させた。次いで、溶液を、０．１％酢酸を含有する水中３０％アセトニトリルで希釈し、得られた溶液を、０．１％酢酸を含有する水中３０％から７０％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラムを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。Ｔ３－ＦＩＴＣを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、黄色粉末が得られた。質量スペクトルｍ／ｚ＝１０４０．８２９５（Ｍ＋Ｈ）＋。
メラミン－ＥＤ－Ｆおよびメラミン－ＯＧの調製：
Figure 2023521886000069
２－クロロ－４，６－ジアミノ－１，３，５－トリアジン（３６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）およびエチレンジアミン（３０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解し、無水炭酸カリウム（８２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた懸濁液を９５℃に加熱し、アルゴン雰囲気下、この温度で一晩維持した。次いで、溶媒を減圧下で除去して残留物を得た。得られた残留物を、水中５０％アセトニトリルで溶出するＣ１８逆相カラム（１０ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製すると、メラミン－エチルアミンが得られた。
メラミン－エチルアミン（０．５ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）およびＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ－ＮＨＳエステル（１ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能）または５－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を、トリエチルアミン（８μＬ）を含有するＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解し、室温で６時間インキュベートした。得られた溶液を、１％酢酸を含有する水中３０％アセトニトリルで希釈し、Ｃ１８逆相カラムを使用したカラムクロマトグラフィーによって精製すると、メラミン－ＥＤ－Ｆまたはメラミン－ＯＧが得られた。メラミン－ＥＤ－Ｆ、ｍ／ｚ＝５２８．２（Ｍ＋Ｈ）＋；メラミン－ＯＧ、ｍ／ｚ＝５６４．１（Ｍ＋Ｈ）＋。
様々な蛍光トレーサーと抗メラミン抗体の混合物の蛍光
メラミンがフルオレセインにコンジュゲートしている様々な置換蛍光トレーサーをＤＭＳＯ（１ｍＭ）に溶解し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．３）に希釈して、メラミントレーサー溶液（１．２μＭ）を得た。以下のメラミントレーサーを使用した：
Figure 2023521886000070
ポリクローナル抗メラミン抗体（抗Ｍｅｌ－Ａｂ、４．６５ｍｇ／ｍｌ、テネシー州メンフィスのＭｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）から商業的に入手可能）をＰＢＳに希釈し、段階希釈して、０～３００ｎＭの範囲の抗Ｍｅｌ－Ａｂ濃度を有する抗Ｍｅｌ－Ａｂ溶液を得た。メラミントレーサー溶液（５μＬ）を、非結合表面を有する９６ウェル黒色アッセイプレート（ニューヨーク州コーニングのＣｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）中で各抗Ｍｅｌ－Ａｂ溶液（１９５μｌ）と混合して、異なるモル比の抗Ｍｅｌ－Ａｂとメラミントレーサーを有する溶液を得た。メラミントレーサーの濃度は３０ｎＭであった。プレートを室温で３０分間穏やかに振盪した。次いで、４９０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍでの発光読み取りを使用して、蛍光プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ４ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、バーモント州ウィヌースキのＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）を使用して各溶液の蛍光強度を測定した。結果を図３に示す。
図３は、異なるメラミン－フルオレセインコンジュゲートが蛍光を異なる程度に消光し、消光の量が抗Ｍｅｌ－Ａｂとメラミントレーサーのモル比の関数であることを示している。抗Ｍｅｌ－Ａｂとメラミントレーサーの比が高いほど、消光の量が大きくなる。これらの結果はまた、他のメラミントレーサーと比較して、４’－置換トレーサー（すなわち、ＭｅｌＦ）が最高の消光度を示し、抗Ｍｅｌ－Ａｂとメラミントレーサーのモル比が６：１である場合に、飽和点に達したことを実証している。これらの結果は、消光効率（すなわち、抗体の非存在下での蛍光と比較した、１：１の蛍光抗体：抗原比での蛍光の減少パーセンテージ）が、リガンドがフルオレセイン分子に付着している位置に依存し、４’－置換トレーサーが５－置換トレーサーよりも優れた消光効率を示すことを示している。これらの結果はまた、リンカーが短い場合に、消光効率が高いことを実証している。
特に指示しない限り、４９０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍでの発光読み取りを、実施例全体を通して使用した。特に指示しない限り、全ての結果は３連測定の平均である。
メラミン濃度の関数としてのＭｅｌ－Ｆおよび抗Ｍｅｌ－Ａｂの溶液の蛍光
ＰＢＳ中Ｍｅｌ－Ｆのアリコート（１．２μＭ、５μＬ）および抗Ｍｅｌ－Ａｂ溶液（６μＭ、５μＬ）を９６ウェル黒色アッセイプレートに添加し、穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。メラミン標準溶液を、０～２０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でＰＢＳ中に調製した。次いで、各メラミン標準溶液を、９６ウェルアッセイプレート中ＭｅｌＦおよび抗Ｍｅｌ－Ａｂの溶液に添加した。次いで、プレートを室温で１時間インキュベートし、蛍光強度を測定した。結果を、メラミン濃度の関数としての蛍光回復を示す図４に示す。図４中、Ｍｅｌ－Ｆの濃度は３０ｎＭであり、抗Ｍｅｌ－Ａｂの濃度は１５０ｎＭである。結果は、メラミンのダイナミックレンジがＰＢＳ溶液中約０～８ｎｇ／ｍＬであることを示している。
メラミンの存在下および非存在下でのＭｅｌ－Ｆおよび抗Ｍｅｌ－Ａｂの血清溶液の蛍光
リン酸緩衝液を使用して、未処理イヌ血清をｐＨ７．３に調整し、ＰＢＳで１０倍希釈した。Ｍｅｌ－ＦのＰＢＳ中溶液（１μＭ、６μＬ）およびＰＢＳ中Ｍｅｌ－Ｆ（１μＭ、６μＬ）と抗Ｍｅｌ－Ａｂ（１μＭ、６μＬ）の混合物に、メラミン（２μＭ、６μＬ）の非存在下および存在下で、ＰＢＳ、血清、または希釈血清（すなわち、ＰＢＳで１０分の１に希釈した血清）を添加して最終体積２００μＬにした。得られた溶液を室温で１時間インキュベートし、次いで、蛍光強度を測定した。結果を図５に示す。
これらの結果は、各溶液について、Ｍｅｌ－Ｆの蛍光が抗Ｍｅｌ－Ａｂによって元の値の約２分の１まで消光され、メラミンの添加によって蛍光が回復することを実証している。
メラミンの存在下での抗Ｍｅｌ－ＡｂおよびＭｅｌ－Ｆの牛乳溶液の蛍光
生乳試料をＰＢＳで１０倍希釈した。０～２５０μＭの範囲のメラミン濃度を有する、ＰＢＳで１０倍希釈した生乳中メラミン標準溶液を段階希釈によって調製した。９６ウェル黒色アッセイプレートのウェルに、ＰＢＳ中Ｍｅｌ－Ｆ（２μＭ、５μＬ）および抗Ｍｅｌ－Ａｂ（１０μＭ、５μＬ）を添加した。次いで、各ウェルにメラミン標準溶液（１９０μＬ）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートし、蛍光強度を記録した。結果を図６に示す。
図６は、様々な濃度のメラミンでの抗Ｍｅｌ－Ａｂ（２５０ｎＭ）の存在下でのＭｅｌ－Ｆ（５０ｎＭ）の溶液（ＰＢＳ中１０％生乳）についての蛍光強度を示す。結果は、メラミン検出についてのダイナミックレンジが約０～３０μｇ／Ｌであることを示している。
ビオチン－Ｆまたはビオチン－ＥＤおよびストレプトアビジンの存在下での溶液の蛍光
ビオチン－Ｆまたはビオチン－ＥＤ（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）をＤＭＳＯに溶解してＤＭＳＯ溶液（８．５μＭ）を得た。ビオチンＥＤの構造は、
Figure 2023521886000071
である。
次いで、ＤＭＳＯ溶液をＰＢＳで希釈して、１００ｎＭのビオチン－Ｆまたはビオチン－ＥＤ濃度を有する溶液を得た。次いで、得られたＰＢＳ中ビオチン－Ｆまたはビオチン－ＥＤ溶液の２０μＬアリコートを９６ウェル黒色アッセイプレートのウェルに添加した。０～１００ｎＭの範囲のストレプトアビジン濃度を有するストレプトアビジンのＰＢＳ中溶液を調製し、プレート中のビオチン－Ｆまたはビオチン－ＥＤ溶液に添加した（１８０μＬ）。プレートを室温で３０分間インキュベートし、次いで、蛍光強度を記録した。結果を、ストレプトアビジンとトレーサーのモル比の関数としての蛍光強度の変化パーセンテージを示す図７に示す。
図７の結果は、ビオチンＦの蛍光がビオチンＥＤの蛍光よりも効率的に消光されることを示している。飽和点（１：１モル比）で、ビオチン－Ｆの消光効率はビオチン－ＥＤの消光効率より７０％高い。結果は、４’－置換蛍光トレーサーについての蛍光の変化が５－置換蛍光トレーサーより大きいことを示している。
Ｔ４の存在下でのＴ３－Ｆおよび抗Ｔ４－Ｍａｂの溶液の蛍光
ＰＢＳ中Ｔ３－Ｆ（１μＭ、６μＬ）と抗モノクローナル抗チロキシン抗体（抗Ｔ４－Ｍａｂ（コロラド州デンバーのＢｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）（１μＭ、６μＬ）の混合物を、Ｌ－チロキシン（Ｔ４、２μＭ、６μＬ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）の非存在下および存在下でＰＢＳに添加して最終体積２００μＬにした。得られた溶液を室温で１時間インキュベートし、次いで、蛍光強度を測定した。
Ｔ３－ＦをＴ３－５－Ｆ、Ｔ３－Ｅ－ＦおよびＴ３－ＦＩＴＣで置き換えたことを除いて、同様に溶液を調製し、蛍光を測定した。
以下の手順を使用してＴ３－５－Ｆを合成した：
Ｔ３－５－フルオレセイン（Ｔ３－５－Ｆ）の調製
Figure 2023521886000072
トリヨードチロキシン（８．２ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）、５－カルボキシルフルオレセインＮ－ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）（５．９ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）、およびＮ’Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（６．５μＬ、０．０４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で一晩撹拌させた。溶液を、０．１％酢酸を含む水中４０％アセトニトリルで溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製すると、Ｔ３－５－Ｆが得られた。
各トレーサーについての構造を以下に示す：
Figure 2023521886000073
結果を図８に示す。図８は、Ｔ３－ＦＩＴＣとＴ３－５－Ｆの両方について、蛍光が抗Ｔ４－Ｍａｂによって消光されなかったことを示している。Ｔ３－Ｅ－ＦおよびＴ３－Ｆについて、蛍光は抗Ｔ４－Ｍａｂによって消光された。これは、消光が５－置換蛍光トレーサーより４’－置換蛍光トレーサーについて効率的であることを示している。
図９は、Ｔ３－Ｆを抗Ｔ４－Ｍａｂに添加した場合の消光の量および時間の関数としてのＴ４の添加後の消光回復を示す。結果は、安定な蛍光シグナルが１０分以内に得られることを示している。
ＰＢＳ中でのＴ４用量反応
ＰＢＳ中Ｔ３－Ｆ（１．０μＭ、８μＬ）とＰＢＳ中抗Ｔ４－Ｍａｂ（１μＭ、８μＬ）の混合物を、９６ウェル黒色アッセイプレートのウェル中、室温で３０分間インキュベートした。次いで、０～３２μｇ／ｄＬの範囲のＴ４濃度を有する一連のＴ４標準溶液（１８４μＬ）をＰＢＳ中Ｔ３－Ｆと抗Ｔ４ Ｍａｂの混合物に添加した。次いで、プレートを室温で３０分間インキュベートし、蛍光強度を記録した。結果を図１０に示す。
図１０は、Ｔ４をＴ３－Ｆ（５０ｎＭ）および抗Ｔ４－Ｍａｂ（５０ｎＭ）の溶液に添加した場合に、蛍光が記録されることを示している。結果は、ＰＢＳ中でのＴ４検出についてのダイナミックレンジが約０～１５μｇ／ｄＬの範囲であることを示している。
凍結乾燥後のＴ４の存在下でのＴ３－Ｆおよび抗Ｔ４－Ｍａｂの溶液の蛍光
Ｔ３－Ｆ（１．７ｍｇ）をＤＭＳＯ ０．８５ｍｌに溶解してストック溶液（２ｍＭ）を得た。次いで、Ｔ３－Ｆストック溶液をＰＢＳに希釈して１μＭ作業溶液を得て、これを２つのバイアルに分離した（それぞれ１ｍＬ）。第１のバイアルにＰＢＳ（９ｍＬ）を添加し、第２のバイアルにＰＢＳ（８．９ｍＬ）＋抗Ｔ４ Ｍａｂ（１５μＭ、０．１ｍＬ）を添加した。バイアルをよく混合し、室温で３０分間インキュベートした。各溶液（２００μＬ）についての蛍光強度を決定した。次いで、各溶液（２００μＬ）のアリコートを９６ウェル黒色アッセイプレートのウェルに入れ、凍結乾固した。乾燥残留物にＰＢＳ２００μＬ、チャコールで処理したウマ血清（すなわち、血清を、チャコールを含有するＰＢＳ緩衝液に少なくとも３回の緩衝液交換にわたって透析して血清から小分子を除去することによって血清を「チャコール処理」した）、またはチャコール含有Ｔ４（１０μｇ／ｄＬ）で処置したウマ血清を添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。次いで、蛍光強度を再度記録した。結果を図１１に示す。
図１１は、Ｔ３－Ｆおよび／または抗Ｔ４－Ｍａｂを凍結した場合でさえ、アッセイが有効であることを示している。
Ｔ４の存在下でのＴ４－ＦとＡｂ－Ｃｙ５の混合物の蛍光
Ｔ４－ＦをＤＭＳＯに溶解し（１ｍＭ）、ＰＢＳで希釈してストック溶液（４μＭ）を得た。０～４００ｎＭの範囲のＡｂ－Ｃｙ５濃度を有するＣｙ５コンジュゲート抗体（Ａｂ－Ｃｙ５、実施例１２のように調製）の一連のＰＢＳ溶液を段階希釈によって調製した。９６ウェル黒色アッセイプレートのウェル中でＰＢＳ中Ｔ４－Ｆ（５μＬ）および段階希釈Ａｂ－Ｃｙ５溶液（９５μＬ）を合わせ、プレートを室温で３０分間振盪した。４９０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長を使用して蛍光強度を測定した。図１２Ａおよび図１２Ｂは、Ｔ４－Ｆの蛍光がＡｂ－Ｃｙ５の存在下で消光されることを示している（約１：１のＴ４－Ｆ：Ａｂ－Ｃｙ５の比で消光効率約７０％）。Ｃｙ５単独（すなわち、抗Ｔ４－Ｍａｂにコンジュゲートしていない）では蛍光を消光しなかった。
蛍光がＴ４の存在下で回復され得ることを実証する実験のために、ＰＢＳ中Ｔ４－Ｆ（５μＬ、４μＭ）とＡｂ－Ｃｙ５溶液（５μｌ、８μＭ）の混合物のアリコートを９６ウェル黒色アッセイプレートのウェルに添加した。次いで、各ウェルにＰＢＳ中Ｔ４溶液９０μＬ（０、１、２、４、６、８、１０、１２μｇ／ｄＬ）を添加した。得られた１００μＬ溶液を３０分間インキュベートし、蛍光を測定した。結果を図１３に示す。
図１３Ａは、Ｔ４をＴ４－ＦおよびＡｂ－Ｃｙ５の溶液（Ａｂ－Ｃｙ５：Ｔ４－Ｆ約２：１）に添加すると蛍光が増加し、蛍光の増加が添加されるＴ４の量に比例することを示している。ダイナミックレンジは約０～１２μｇ／ｄＬである。図１３Ｂは、Ｔ４－Ｆ濃度の関数としての蛍光回復パーセンテージを示す。
Ｔ４の存在下でのＴ３－ＦまたはＴ４－ＦとＡｂ－Ｃｙ３の混合物の蛍光
チャコールで処理したウマ血清（５０μＬ）に８－アミノ－ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を添加して０．５ｍＭのＡＮＳ濃度を得て、水酸化ナトリウムによりｐＨを７．３に調整した。段階希釈によって、０～６４μｇ／ｄＬの範囲の濃度を有する一連のＰＢＳまたは血清中Ｔ４標準溶液を調製した。９６ウェル黒色アッセイプレートで、各Ｔ４標準（ＰＢＳまたは血清中、８０μＬ）をＰＢＳ中Ｔ３－Ｆ（またはＴ４－Ｆ）（４μＭ、５μＬ）とＰＢＳ中Ｃｙ３にコンジュゲートした抗Ｔ４－Ｍａｂ（Ａｂ－Ｃｙ３、実施例１２に記載されるように調製）（４μＭ、５μＬ）の混合物に添加した。得られた溶液を室温で３０分間インキュベートし、次いで、蛍光強度を測定した。結果を図１４に示す。
図１４Ａは、Ｔ４をＴ３－Ｆ（２００ｎＭ）およびＡｂ－Ｃｙ３（２００ｎＭ）のＰＢＳおよび血清中溶液に添加した場合のＴ４濃度の関数としての蛍光強度を示している。結果は、ＰＢＳおよび血清中でのＴ４検出についてのダイナミックレンジが約０～６４μｇ／Ｌであることを示している。
図１４Ｂは、Ｔ４をＴ４－Ｆ（２００ｎＭ）およびＡｂ－Ｃｙ３（２００ｎＭ）のＰＢＳおよび血清中溶液に添加した場合のＴ４濃度の関数としての蛍光強度を示している。結果は、ＰＢＳおよび血清中でのＴ４検出についてのダイナミックレンジが約０～６４μｇ／Ｌであることを示している。
図１４Ｃは、試料を４９０ｎｍで励起し、発光を６１５ｎｍで測定する場合、Ｔ４をＴ４－Ｆ（２００ｎＭ）およびＡｂ－Ｃｙ３（２００ｎＭ）のＰＢＳ中溶液に添加した場合のＴ４濃度の関数としての蛍光強度を示している。発光のこの減少は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の喪失に起因する。ＦＲＥＴは、非放射手段を通して励起状態のドナー色素からアクセプター色素へのエネルギー移動を伴う。この例では、４９０ｎｍでのドナー（Ｔ４－Ｆ）の励起が、アクセプター色素（Ａｂ－Ｃｙ３）への効率的なエネルギー移動をもたらし、６１５ｎｍでの励起をもたらした。ＦＲＥＴプロセスは、極めて距離依存性であり、Ａｂ－Ｃｙ３がＴ４－Ｆに結合している場合にのみ起こる。Ｔ４を添加すると、Ｔ４－Ｆに結合したＡｂ－Ｃｙ３の解離が、ドナー（Ｔ４－Ｆ）とアクセプター（Ａｂ－Ｃｙ３）との間の距離増加によりＦＲＥＴ効率の低下をもたらす。
遊離抗生物質の存在下でのフルオレセインにコンジュゲートしたベータラクタム抗生物質と抗体の混合物の蛍光
ＰＢＳ中フルオレセインにコンジュゲートしたベータラクタム抗生物質（すなわち、ＡＭＯ－ＦＩＴＣ、ＡＭＯ－Ｆ、ＡＭＰ－Ｆ、およびＣＥＦ－Ｆ）（４００ｎＭ、１００μＬ）を、９６ウェル黒色アッセイプレート中、遊離ベータラクタム抗生物質の非存在下および存在下で抗ペニシリンまたは抗セフォタキシムポリクローナル抗体（４００ｎＭ、１００μＬ、コロラド州センテニアルのＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＬＬＣから商業的に入手可能）と混合した（アンピシリン（４００ｎＭ）をＡＭＰ－Ｆに添加し、セフォタキシム（４００ｎＭ）をＣＥＦ－Ｆに添加した）。溶液は２００ｎＭのトレーサーおよび抗体の濃度を有していた。溶液を室温で５分間インキュベートし、蛍光強度を測定した。結果を図１５に示す。
これらの結果は、抗ペニシリン抗体を添加することによって、ＡＭＯ－ＦＩＴＣの蛍光は消光されなかったが、ＡＭＯ－ＦおよびＡＭＰ－Ｆの蛍光が同抗体によって消光されたことを示している。結果はまた、アンピシリンを抗ペニシリン抗体およびＡＭＰ－Ｆの溶液に添加すると、蛍光強度の増加（すなわち、回復）が引き起こされることを示している。同様に、ＣＥＦ－Ｆの蛍光は抗セフォタキシム抗体によって消光され、セフォタキシムを抗セフォタキシム抗体およびＣＥＦ－Ｆの溶液に添加すると、蛍光強度の増加（すなわち、回復）が引き起こされる。
スルファジメトキシンの存在下でのＳＤＭ－ＦまたはＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆと抗スルファジメトキシンモノクローナル抗体の混合物の蛍光
ＰＢＳ中ＳＤＭ－ＦまたはＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆ（４００ｎＭ、１００μＬ）を、スルファジメトキシン（ＳＤＭ）（４００ｎＭ）の非存在下および存在下で、抗スルファジメトキシンモノクローナル抗体（４００ｎＭ、１００μＬ、カリフォルニア州サンディエゴのＧｅｎｗａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈから商業的に入手可能）と混合した。得られた溶液を室温で５分間インキュベートし、次いで、蛍光強度を測定した。結果を図１６に示す。
これらの結果は、ＳＤＭ－ＦおよびＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆを抗スルファジメトキシンモノクローナル抗体と合わせると、これらの蛍光が消光されることを示している。ＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆと比較してＳＤＭ－Ｆについての消光の量が大きいことは、リンカーの長さが消光に影響を及ぼすことを示している。結果はまた、抗スルファジメトキシン抗体およびＳＤＭ－ＦまたはＳＤＭ－Ｓｕ－Ｆの溶液にＳＤＭを添加することによって、蛍光強度の増加が引き起こされることを示している。
抗Ｔ４－ＭａｂによるＴ３－Ｆの蛍光消光
Ｔ３－ＦをＤＭＳＯ（１ｍＭ）に溶解し、ＰＢＳで希釈してストック溶液（４μＭ）を得た。モノクローナル抗Ｔ４抗体（抗Ｔ４－Ｍａｂ、テネシー州メンフィスのＭｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）から商業的に入手可能）（４．６５ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳ緩衝液に段階希釈して、０～１０００ｎＭの範囲の抗Ｔ４－Ｍａｂ濃度を有する溶液を得た。段階希釈抗Ｔ４－Ｍａｂ溶液（１９５μＬ）を含有する９６ウェル黒色アッセイプレートに、Ｔ３－Ｆ溶液（５μＬ）を添加し、よく混合し、３０分間インキュベートし、蛍光強度を記録した。結果を図１７に提供する。
図１７は、Ｔ３－Ｆの蛍光が抗Ｔ４－Ｍａｂの存在下で消光されることを示している。約１：１の抗体とトレーサーのモル比で最大消光に達する。抗Ｔ４－Ｍａｂとトレーサーの比を２０：１まで増加させても消光の量のさらなる増加を示さなかった。
別の実験では、トレーサーＴ２－Ｆ、Ｔ３－Ｆ、またはＴ４－ＦをＤＭＳＯに溶解して、１ｍＭのトレーサー濃度のＤＭＳＯ溶液を得た。次いで、ＤＭＳＯ溶液をリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）で希釈して、１０μＭの濃度の各トレーサーのストック溶液を得た。モノクローナル抗Ｔ４－Ｍａｂまたはクエンチャーにコンジュゲートした抗Ｔ４－Ｍａｂ（Ｃｙ３－Ａｂ、ＩＲｄｙｅＱＣ１－Ａｂ、Ｃｙ５－Ａｂ、ＢＨＱ１－Ａｂ）をＰＢＳに段階希釈して、０～２μＭの範囲の濃度の抗Ｔ４－Ｍａｂまたはクエンチャーにコンジュゲートした抗Ｔ４－Ｍａｂを有する溶液を得た。段階希釈した抗Ｔ４－Ｍａｂまたはクエンチャーにコンジュゲートした抗Ｔ４－Ｍａｂ（９５μＬ）を含有する９６ウェル黒色アッセイプレートに、トレーサーＴ２－Ｆ、Ｔ３－Ｆ、またはＴ４－Ｆ溶液（５μＬ）を添加し、よく混合し、３０分間インキュベートし、次いで、蛍光強度を４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長で記録した。異なるトレーサーおよびクエンチャー修飾抗体についての最大蛍光消光パーセンテージの結果を以下の表に提供する：
クエンチャーの標識有りまたは無しの抗Ｔ４抗体によるフルオレセイン－コンジュゲートの蛍光消光のパーセンテージ
Figure 2023521886000074
結果は、Ｃｙ３－Ａｂが３種全てのフルオレセイン－コンジュゲート（Ｔ２－Ｆ、Ｔ３－Ｆ、およびＴ４－Ｆ）の蛍光の５０％より多くを消光し、ＩＲｄｙｅＱＣ１－ＡｂがＴ３－ＦおよびＴ４－Ｆの蛍光の５０％より多くを消光したことを示している。標識抗体とフルオレセイン－コンジュゲートのこれらの組合せは、これらをＴ４アッセイのための試薬として有用にする。データはまた、Ｔ３－Ｆが、Ｔ２－ＦおよびＴ４－Ｆと比較して、Ｔ４アッセイに最適なコンジュゲートであることを示した。
コルチゾール抗体によるコルチゾール－４－Ｆｌおよびコルチゾール－５－Ｆｌの蛍光消光
ヒドロコルチゾン－３－（カルボキシメチル）オキシム（３０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）、４’－アミノメチルフルオレセイン（２５ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム－３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ（２９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、マサチューセッツ州バーリントンのＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから商業的に入手可能）、およびＮ’Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２４ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１．５ｍＬ）に溶解することによって、コルチゾール－４－Ｆｌ、すなわち：
Figure 2023521886000075
を調製した。得られた混合物を室温で１８時間より長い時間にわたって撹拌し、次いで、５０％アセトニトリル水溶液（０．１％酢酸を含む）２５ｍＬに希釈し、水中６０％から７０％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。コルチゾール－４－Ｆｌを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１：７７９．４）によって確認される、黄色固体生成物が得られた。
ヒドロコルチゾン－３－（カルボキシメチル）オキシム（１２ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）、５－アミノメチルフルオレセイン（１０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）、ＨＡＴＵ（１１ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、マサチューセッツ州バーリントンのＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから商業的に入手可能）、およびＮ’Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解することによって、コルチゾール－５－Ｆｌ、すなわち：
Figure 2023521886000076
を調製した。得られた混合物を室温で１８時間より長い時間にわたって撹拌し、次いで、水中５０％アセトニトリル（０．１％酢酸を含む）１５ｍＬに希釈し、水中６０％から７０％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。コルチゾール－５－Ｆｌを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１：７７９．４）によって確認される、黄色固体生成物が得られた。
コルチゾール－４－ＦＬを、様々な当量のＨｙＴｅｓｔ（フィンランド、トゥルク）、Ａｂｃａｍ（英国、ケンブリッジ）、およびＢｉｏ－Ｃｏｎｎｅｃｔ ＢＶ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）（オランダ）から商業的に入手可能な様々なα－コルチゾール抗体と合わせた。蛍光を抗体（Ａｂ）とコルチゾール－４－ＦＬの比の関数として測定した。結果を図２１に示す。
結果は、コルチゾール－４－Ｆｌが抗体と複合体を形成すると、その蛍光が消光されることを示している。約１：１の抗体／コルチゾール－４－Ｆｌの比で最大消光が観察される。
図２２は、コルチゾール－４－Ｆｌおよびコルチゾール－５－Ｆｌを様々な当量のＨｙＴｅｓｔ（フィンランド、トゥルク）から商業的に入手可能なα－コルチゾール抗体と合わせた場合の蛍光の消光を示す。結果は、４’－置換フルオレセイントレーサーについての蛍光変化が５－置換フルオレセイントレーサーについての蛍光変化よりも大きいことを示している。
４’－アミノメチルジフルオロフルオレセイン（４－ＡＭＤＦＦ）の合成
以下の合成スキームに従って、４－ＡＭＤＦＦ、すなわち：
Figure 2023521886000077
を調製した：
Figure 2023521886000078
濃硫酸（１．５ｍＬ）中クロロアセトアミドメタノール０．１ｇ（ＣＬＡＭ、０．８２ｍｍｏｌ）を２’，７’－ジフルオロフルオレセイン（スイスのＣｈｅｍｏｄｅｘ Ｌｔｄ．から商業的に、０．３ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）の硫酸（４ｍＬ）中溶液に添加した。光から保護して１８時間撹拌した後、反応混合物を氷（２５ｍＬ）上に注いで橙色着色沈殿を形成した。橙色沈殿を、濾過を介して溶けた氷から回収し、水で洗浄し、乾燥させると、生成物０．３ｇが得られた。生成物をＬＣＭＳ（［Ｍ＋１］＝４７４．５）によって特徴付けた。
上記生成物０．２５ｇを約１６０℃で２０時間、ジグリム（１１ｍＬ）中濃ＨＣｌ（３ｍＬ）で還流した。減圧下で溶媒を除去した後、残留物をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、水／アセトニトリル勾配で溶出する逆相クロマトグラフィーシステムを使用して精製した。適切な画分を回収し、真空下で蒸発乾固し、ＬＣＭＳ（［Ｍ＋１］＝３９８．４）によって特徴付けた。
４’－アミノメチルジクロロフルオレセイン（４－ＡＭＤＣＦ）の合成
以下の合成スキームに従って、４－ＡＭＤＣＦ、すなわち：
Figure 2023521886000079
を調製した：
Figure 2023521886000080
濃硫酸（４ｍＬ）中クロロアセトアミドメタノール０．３１ｇ（ＣＬＡＭ、２．５ｍｍｏｌ）を２’，７’－ジクロロフルオレセイン（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能、１ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の硫酸（１２ｍＬ）中溶液に添加した。光から保護して１８時間撹拌した後、反応混合物を氷（１００ｍＬ）上に注いで橙色着色沈殿を形成した。橙色沈殿を、濾過を介して溶けた氷から回収し、水で洗浄し、乾燥させると、生成物１ｇが得られた。生成物をＬＣＭＳ（純度９０％より高い、［Ｍ＋１］＝５０５．８）によって特徴付けた。
上記生成物１．０ｇを約１６０℃で２０時間、ジグリム（１１ｍＬ）中濃ＨＣｌ（３ｍＬ）で還流した。減圧下で溶媒を除去した後、残留物をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、水／アセトニトリル勾配で溶出する逆相クロマトグラフィーシステムを使用して精製した。適切な画分を回収し、真空下で蒸発乾固し、ＬＣＭＳ（［Ｍ＋１］＝４３０．４）によって特徴付けた。
ＳＤＭＡ－ＤＦＦの合成
以下の合成スキームに従って、ＳＤＭＡ－ＤＦＦ、すなわち：
Figure 2023521886000081
を調製した：
Figure 2023521886000082
Figure 2023521886000083
Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－ＤＦＦの合成
２ｍＬガラスバイアルに、Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－ＯＨ（９．６ｍｇ、０．０１４８ｍｍｏｌ）、４’－アミノメチル２’，７’－ジフルオロフルオレセイン（５．６ｍｇ、０．０１４１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（６．２ｍｇ、０．０１６２ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（８．５６μＬ、０．０４５ｍｍｏｌ）、および無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）を添加した。得られた反応混合物をよく混合し、室温で１８時間撹拌した。反応混合物を、逆相カラムを装備した自動精製システムにロードし、水／アセトニトリル勾配（０．１％ギ酸を含有する）で溶出した。適切な画分を回収し、溶媒を蒸発によって除去すると、生成物約１０ｍｇが赤色粉末として得られた。生成物を、ＬＣＭＳ（［Ｍ＋１］＝１００４．６）を使用して特徴付けた。
ＳＤＭＡ－ＤＦＦの合成
Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－ＤＦＦ（１０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）に、ＤＭＦ中２０％ピペリジン５ｍＬを添加し、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。次いで、反応混合物を、逆相カラムを装備した自動精製システムにロードし、水／アセトニトリル勾配（０．１％ギ酸を含有する）で溶出した。適切な画分を回収し、溶媒を蒸発によって除去すると、赤色固体が得られた。赤色固体をジオキサン１ｍＬおよびジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ ０．２８ｍＬと合わせ、室温で一晩撹拌し、溶媒を蒸発によって除去して粗生成物を得た。粗生成物を水に溶解し、逆相カラムを装備した自動精製システムを使用して精製し、水／アセトニトリル勾配（０．１％ギ酸を含有する）で溶出した。適切な画分を回収し、溶媒を蒸発によって除去すると、黄色着色結晶が得られ、これをＬＣＭＳ（［Ｍ＋１］＝５８２．２）によって特徴付けた。
ＳＤＭＡ－ＤＣＦの合成
以下の合成スキームに従って、ＳＤＭＡ－ＤＣＦ、すなわち：
Figure 2023521886000084
を調製した：
Figure 2023521886000085
Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－ＤＣＦの合成
２ｍＬガラスバイアルに、Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－ＯＨ（２０ｍｇ、０．０３０８ｍｍｏｌ）、４’－アミノメチル２’，７’－ジクロロフルオレセイン（１２．６ｍｇ、０．０２９４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１３ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１７．８μＬ、０．０８８ｍｍｏｌ）、および無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）を添加した。得られた反応混合物をよく混合し、室温で１８時間撹拌した。反応混合物を、逆相カラムを装備した自動精製システムにロードし、水／アセトニトリル勾配（０．１％ギ酸を含有する）で溶出した。適切な画分を回収し、溶媒を蒸発によって除去すると、生成物約２５ｍｇが赤色粉末として得られた。生成物を、ＬＣＭＳ（［Ｍ＋１］＝１０３６．５）を使用して特徴付けた。
ＳＤＭＡ－ＤＣＦの合成
Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－ＤＣＦ（１５ｍｇ、０．０１４５ｍｍｏｌ）にＤＭＦ中２０％ピペリジン５ｍＬを添加し、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を、逆相カラムを装備した自動精製システムにロードし、水／アセトニトリル勾配（０．１％ギ酸を含有する）で溶出した。適切な画分を回収し、溶媒を蒸発によって除去すると、赤色固体が得られた。赤色固体をジオキサン１ｍＬおよびジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ ０．２８ｍＬと合わせ、室温で一晩撹拌し、溶媒を蒸発によって除去して粗生成物を得た。粗生成物を水に溶解し、逆相カラムを装備した自動精製システムを使用して精製し、水／アセトニトリル勾配（０．１％ギ酸を含有する）で溶出した。適切な画分を回収し、溶媒を蒸発によって除去すると、橙色固体が得られ、これをＬＣＭＳ（［Ｍ＋１］＝６１５．６）によって特徴付けた。
ＤＦＦ、ＳＤＭＡ－ＤＦＦ、ＤＣＦ、ＳＤＭＡ－ＤＣＦ、Ｆｌ、およびＳＤＭＡ－ＦＬの吸収スペクトルおよび発光スペクトル
ＰＢＳ緩衝液中のフルオレセイン（Ｆｌ）の最大吸収は４８９ｎｍであり、最大蛍光発光は５１５ｎｍである。フルオレセイン分子を、－ＣＨ２ＮＨ－リンカーを介してＳＤＭＡ分子とコンジュゲートする（すなわち、ＳＤＭＡ－Ｆｌを得る）場合、その最大吸収および発光がそれぞれ４９５ｎｍおよび５２５ｎｍにシフトする。フルオレセイン分子を２’位および７’位でフッ素によって置換する（すなわち、ＤＦＦを得る）場合、非置換フルオレセインと比較して最大吸収および発光の変化はない。フルオレセイン分子を２’位および７’位で塩素によって置換する（すなわち、ＤＣＦを得る）場合、最大吸収および発光はそれぞれ５００ｎｍおよび５２５ｎｍに赤色シフトする。－ＣＨ２ＮＨ－リンカーを介してＤＦＦまたはＤＣＦをＳＤＭＡにコンジュゲートしても（すなわち、それぞれＳＤＭＡ－ＤＦＦおよびＳＤＭＡ ＤＣＦを得る）、最大吸収および発光が赤色シフトする。フルオレセイン（ＦＬ）、２’，７’－ジフルオロフルオレセイン（ＤＦＦ）、２’，７’－ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）、および－ＣＨ２－ＮＨ－リンカーを介したＳＤＭＡとのコンジュゲート（すなわち、ＳＤＭＡ－Ｆｌ（すなわち、構造Ａ３）、ＳＤＭＡ－ＤＦＦ、およびＳＤＭＡ－ＤＣＦ）の最大吸収および発光波長を以下に提供される表に列挙する。ＤＦＦ、ＳＤＭＡ－ＤＦＦ、ＤＣＦ、ＳＤＭＡ－ＤＣＦ、Ｆｌ、およびＳＤＭＡ－ＦＬの吸収スペクトルを図２５Ａに示し、ＳＤＭＡ－ＤＦＦ、ＳＤＭＡ－ＤＣＦ、Ｆｌ、およびＳＤＭＡ－ＦＬの発光スペクトルを図２５Ｂに示す。
Figure 2023521886000086
様々なＳＤＭＡ蛍光トレーサーと抗ＳＤＭＡ抗体の混合物の蛍光
抗ＳＤＭＡ抗体またはＢＨＱ１０（４当量）にコンジュゲートした抗ＳＤＭＡ抗体のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中溶液を０、０．２５、０．５、１、２、４、８、および１６μＭの濃度で調製した（抗体溶液）。ＳＤＭＡ蛍光トレーサー（すなわち、ＳＤＭＡ－Ｆｌ、ＳＤＭＡ－ＤＦＦ、またはＳＤＭＡ－ＤＣＦ）のＰＢＳ中溶液を１００ｎＭの濃度で調製した（トレーサー溶液）。抗体溶液５０μＬとトレーサー溶液５０μＬを９６ウェルＵＶプレート中で合わせ、室温で３０分間インキュベートした。４９０ｎｍの励起波長、ならびにＳＤＭＡ－ＤＦＦおよびＳＤＭＡ－Ｆｌコンジュゲートについては５２５ｎｍの発光波長およびＳＤＭＡ－ＤＣＦについては５３５ｎｍの発光波長を使用して、各混合物の蛍光強度を読み取った。結果を図２６および図２７に示す。
図２６は、増加する抗体濃度の関数としての異なるＳＤＭＡトレーサーについての蛍光消光パーセントを示す。図２６は、抗ＳＤＭＡ抗体を添加することによって、ＳＤＭＡ－ＤＦＦトレーサーの蛍光の約５０％が消光され、抗ＳＤＭＡ抗体を添加することによって、ＳＤＭＡ－Ｆｌトレーサーの蛍光の約３０％が消光されることを示している。図２６は、ＳＤＭＡ－ＤＦＦでは、抗体とＳＤＭＡ－ＤＦＦのモル比が２：１より大きい場合に、消光効率がほぼ飽和していることを示している。抗ＳＤＭＡ抗体（クエンチャーにコンジュゲートしていない）およびＳＤＭＡ－ＤＦＦトレーサーの消光効率は、ＳＤＭＡ－ＤＦＦトレーサーを、均一ＳＤＭＡアッセイにアッセイ試薬として、クエンチャーにコンジュゲートしていない抗ＳＤＭＡ抗体と使用することができることを示している。
図２７は、増加する濃度のＢＨＱ１０（４当量）にコンジュゲートした抗ＳＤＭＡ抗体の関数としての異なるＳＤＭＡトレーサーについての蛍光消光パーセントを示す。図２７は、消光効率が、ＳＤＭＡ－Ｆｌと比較してＳＤＭＡ－ＤＦＦについてわずかに大きいことを示している。
様々なＳＤＭＡトレーサー（ＳＤＭＡ－Ｆｌ、ＳＤＭＡ－ＤＦＦ、およびＳＤＭＡ－ＤＣＦ）のＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む）中溶液を４００ｎＭの濃度で調製した。抗ＳＤＭＡ抗体またはＢＨＱ１０（４当量）にコンジュゲートした抗ＳＤＭＡ抗体のＰＢＳ中溶液をそれぞれ４００ｎＭおよび８００ｎＭの濃度で調製した。ＳＤＭＡトレーサーの溶液を抗ＳＤＭＡ抗体またはＢＨＱ１０にコンジュゲートした抗ＳＤＭＡ抗体の溶液と１：１（ｖ／ｖ）の比で混合し、室温で６０分間インキュベートしてＳＤＭＡトレーサー／ＳＤＭＡ抗体溶液を得た。
ＳＤＭＡをＰＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む）に段階希釈して、１００、５０、２５、１２．５、６．２６、０μｇ／ｄＬの最終ＳＤＭＡ濃度にすることによって、ＳＤＭＡ標準溶液を調製した。
各ＳＤＭＡ標準溶液５０μｌを９６ウェルＵＶ透明プレートのウェルに添加した。次いで、ＳＤＭＡトレーサー／ＳＤＭＡ抗体溶液５０μｌを各ウェルに添加し、得られた溶液を振盪によってよく混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、４９０ｎｍの励起波長ならびにＳＤＭＡ－ＤＦＦおよびＳＤＭＡ－Ｆｌについては５２５ｎｍの発光波長およびＳＤＭＡ－ＤＣＦについては５３５ｎｍの発光波長を使用して、プレートリーダーを使用して各溶液の蛍光を読み取った。
結果を図２８～図３０に示す。図２８～図３０は、ＳＤＭＡ濃度の関数としての蛍光強度の増加がある、すなわち、用量反応が観察されることを示している。
図２８は、ＳＤＭＡトレーサーがＳＤＭＡ－ＤＦＦである場合の蛍光強度の増加を示している。図２８は、ＳＤＭＡトレーサー／ＳＤＭＡ抗体溶液がＳＤＭＡ－ＤＦＦおよび抗体（すなわち、ＢＨＱ１０にコンジュゲートしていない抗体）である場合、抗体／ＳＤＭＡ－ＤＦＦの比が２：１である場合に、比が１：１である場合よりも蛍光強度の増加が大きいことを示している。図２８は、ＳＤＭＡトレーサー／ＳＤＭＡ抗体溶液がＳＤＭＡ－ＤＦＦおよびＢＨＱ１０にコンジュゲートした抗体である場合に、蛍光強度の増加が観察されることをさらに示している。
図２９はＳＤＭＡトレーサーがＳＤＭＡ－ＤＣＦである場合の蛍光強度の増加を示しており、図３０はＳＤＭＡトレーサーがＳＤＭＡ－ＤＦｌである場合の蛍光強度の増加を示している。図２９および図３０は、ＢＨＱ１０にコンジュゲートしていないＳＤＭＡ抗体と比較して、ＳＤＭＡ抗体がＢＨＱ１０にコンジュゲートしている場合に蛍光強度の増加が大きいことを示している。
ＳＤＭＡ－Ｆｌの合成
以下の合成スキームに従って、ＳＭＤＡ－Ｆｌ、すなわち：
Figure 2023521886000087
を調製した：
Figure 2023521886000088
Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－Ｆｌ
Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－ＯＨ（４７ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈの事業部であるＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから商業的に入手可能）、４－アミノメチルフルオレセイン（２５ｍｇ、０．０６３、カリフォルニア州サニーベールのＡＴＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）、ＨＡＴＵ（２８．７ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）、Ｎ’Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２３．６ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）に溶解した。得られた混合物を室温で１８時間撹拌し、次いで、水（０．１％酢酸を含む）中４０％アセトニトリル１５ｍＬに希釈し、水中２０％から５０％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－Ｆｌを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１：９６８．３）によって確認される、黄色固体生成物が得られた。
ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－Ｆｌ
Ｆｍｏｃ－ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－Ｆｌ（４５ｍｇ、０．０４６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中２０％ピペリジン（８ｍＬ）中で１時間脱保護した。次いで、溶媒を減圧下で除去して残留物を得た。得られた残留物を、０．１％酢酸を含有する水中４０％アセトニトリルに溶解し、０．１％酢酸を含有する水中４０％アセトニトリルで溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－Ｆｌを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、橙色粉末が得られた。
ＳＤＭＡ－Ｆｌ
ＳＤＭＡ（Ｂｏｃ）２－Ｆｌ（２１ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）をジオキサン（２ｍＬ）に溶解し、ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（０．２８ｍＬ）を溶液に添加した。得られた混合物を一晩撹拌した。溶媒を除去し、残留物を水中２０％アセトニトリルに溶解し、水中２０％アセトニトリルで溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＭＡ－Ｆｌを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＳＤＭＡ－Ｆｌが黄色粉末として得られ、構造をＬＣＭＳ（Ｍ＋１：５４６．９）によって確認した。
リボフラビン結合タンパク質による牛乳におけるリボフラビン蛍光の消光
以下の実施例は、ニワトリ卵白から精製した「社内」リボフラビン結合タンパク質（すなわち、「ＩＤＥＸＸ社内」リボフラビン結合タンパク質）および商業的に入手可能な（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）リボフラビン結合タンパク質を使用した。
牛乳にリボフラビンのストック溶液（１ｍＭ）を添加して４μＭの最終リボフラビン濃度にした。ＩＤＥＸＸ社内または商業的に入手可能（Ｓｉｇｍａ）のいずれかの、リボフラビン結合タンパク質（「ＲＢＰ」、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）中４９．２ｍｇ／ｍＬ）のストック溶液をＰＢＳに段階希釈して、０～１６００μＭの範囲のＲＢＰ濃度を有する溶液を得た。段階希釈ＲＰＢ溶液２０μＬをリボフラビン添加牛乳２ｍＬに添加して０～２０μＭのＲＢＰ濃度にした。得られた溶液を室温で１時間インキュベートし、９０μＬ体積の得られた溶液の蛍光強度を３５０ｎｍの励起波長および５３８ｎｍの発光波長で測定した。図３１は、リボフラビン結合タンパク質の濃度の関数としての牛乳におけるリボフラビン蛍光を示す。
結果は、リボフラビン結合タンパク質を牛乳に５μＭの濃度で添加すると、リボフラビンの蛍光の９５％より多くが消光され、牛乳蛍光バックグラウンドが有意に減少したことを示している。結果を図３１に示す。
ＳＤＭＡをアッセイするための乾式スライドの調製
ＳＤＭＡをアッセイするための乾式スライドを以下の方法で調製した：
Ｍｅｌｉｎｅｘ（厚さ１０’’×１２５μｍ×長さ２４’）シート（英国、スティーブニッジのＨｉＦｉ Ｆｉｌｍから商業的に入手可能、部品番号５０６）上に、約４０μｍの厚さを有する湿潤プライマー層が得られるように、重量によりほぼ等量のＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（高粘度ポリマー）およびＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（低粘度ポリマー）（共にマサチューセッツ州ウィルミントンのＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐから商業的に入手可能）を含有する溶液をコーティングした。溶媒を蒸発させて、重量によりほぼ等量のＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（高粘度ポリマー）およびＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（低粘度ポリマー）を含有する乾燥プライマー層を得た。
乾燥プライマー層上に、約９３μｍの厚さを有する湿潤インジケーター層が得られるように、ＳＤＭＡ－フルオレセイン（実施例３５において上に記載されるように調製）および抗ＳＤＭＡ抗体－ＢＨＱ１０コンジュゲート（実施例３８において以下に記載されるように調製）のＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）中溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）、Ｍｅｒｐｏｌ Ａ、プルラン、およびセルロースを含有する溶液をコーティングした。溶媒を蒸発させて、約１．４×１０－１重量％の抗ＳＤＭＡ抗体－ＢＨＱ１０コンジュゲート、約１．１×１０－３重量％のＳＤＭＡ－フルオレセイン、約１３重量％のＨＥＰＥＳ緩衝液、約１．２重量％のＭｅｒｐｏｌ Ａ、約２８．５重量％のプルラン、および約５７重量％のセルロースを含有する乾燥インジケーター層を得た。
乾燥インジケーター層上に、約１３０μｍの厚さを有する湿潤酸化チタン層が得られるように、重量によりほぼ等量のＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（高粘度ポリマー）およびＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（低粘度ポリマー）（共にマサチューセッツ州ウィルミントンのＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐから商業的に入手可能）、セルロース（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）、ならびにチタニア微粒子（ノースカロライナ州フェイエットビルのＣｈｅｍｏｕｒｓから商業的に入手可能、部品番号Ｒ－７０６）を含有する溶液をコーティングした。溶媒を蒸発させて、約３７重量％のＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（重量によりほぼ等量の低粘度および高粘度Ｄ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌとして）、約２０重量％のセルロース、および約４３重量％の二酸化チタンを含有する乾燥酸化チタン層を得た。
乾燥酸化チタン層上に、約１４０μｍの厚さを有する湿潤カーボンブラック層が得られるように、ほぼ等量のＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（高粘度ポリマー）およびＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（低粘度ポリマー）（共にマサチューセッツ州ウィルミントンのＡｄｖａｎＳｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐから商業的に入手可能）ならびにカーボンブラック、Ｌａｍｐ Ｂｌａｃｋ １０１粉末（オハイオ州ベルプレのＯｒｉｏｎ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃａｒｂｏｎ Ｂｌａｃｋｓから商業的に入手可能）を含有する溶液をコーティングした。溶媒を蒸発させて、約９５重量％のＤ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ（重量によりほぼ等量の低粘度および高粘度Ｄ４ Ｈｙｄｒｏｇｅｌとして）および約５重量％のカーボンブラックを含有する乾燥カーボンブラック層を得た。
乾燥カーボンブラック層上に、約３１０μｍの厚さを有する湿潤拡散層が得られるように、セルロース、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）；ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、分子量約１００万；およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含有する溶液をコーティングした。溶媒を蒸発させて、約８３重量％のセルロース、約０．５重量％のＰＡＡ、約０．４重量％のＴＭＡＨ、および約１６重量％のＰＶＰを含有する乾燥拡散層を得た。
乾燥トンネルおよび加熱パッドを有するＳｌｏｔ Ｄｉｅ Ｌｏｏｐ Ｃｏａｔｅｒを使用して、各湿潤層をコーティングした。
プライマー層、インジケーター層、酸化チタン層、カーボンブラック層、および拡散層でコーティングされた得られたＭｅｌｉｎｅｘシートを、穿孔器を使用して６．５ｍｍディスクに形成し、得られたディスクを、スライドが得られるように、ＩＤＥＸＸ Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（メイン州ウェストブルックのＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）に使用するためのスライドハウジングの接着パッドに入れ、これに接着させ、得られたスライドをパッケージングに包んだ。
スライドを使用した様々なレベルのＳＤＭＡを添加した血清のパネルのアッセイ
ＩＤＥＸＸ Ｃａｔａｌｙｓｔピペットチップ（メイン州ウェストブルックのＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）、ＩＤＥＸＸ Ｃａｔａｌｙｓｔ試料カップ（メイン州ウェストブルックのＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）、および上記スライドで構成されたＩＤＥＸＸ Ｃａｔａｌｙｓｔ計器（メイン州ウェストブルックのＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能）を使用して、チャコール処理イヌ血清（０μｇ／ｄＬ ＳＤＭＡ）、ＳＤＭＡ（５μｇ／ｄＬ）を添加したチャコール処理イヌ血清、およびＳＤＭＡ（１５、３０、６０、１００μｇ／ｄＬ）を添加したイヌ血清を分析した。以下の手順に従った：
パッケージングからＳＤＭＡスライドを取り出し、ＩＤＥＸＸ Ｃａｔａｌｙｓｔ計器に入れる；
パネル３００μｌを試料カップにピペットで入れる；
ＩＤＥＸＸ Ｃａｔａｌｙｓｔ計器にスライドを３７℃まで加温させる；
加温後、計器により乾式スライドの蛍光強度（λｅｘ＝４７０ｎｍ、λｅｍ＝５２５ｎｍ）を１５秒間隔で１．５分間測定および記録する；
次いで、ＩＤＥＸＸ Ｃａｔａｌｙｓｔ計器により、試料８μｌをスライド上にピペットでのせ、次いで、１５秒間隔で４００秒間、上記のように蛍光強度を測定および記録する；
記録した測定値を、ＳＤＭＡ用量レベルを生成する較正曲線と比較する。
図３２はアッセイ結果を示す。図３２は、異なるレベルのＳＤＭＡを分注した場合の経時的なＣａｔａｌｙｓｔ計器で観察されるスライドにおける蛍光強度（凡例）を示す。ｙ軸は強度（相対蛍光単位（無単位））であり、ｘ軸は時間（秒）である。最初に、乾式スライドの蛍光強度読み取りをとり、次いで、湿式スライドの蛍光強度読み取りをｔ＝０（すなわち、試料を分注する時）で測定する。蛍光強度を１５秒毎に読み取る。各トレースはｎ＝１０反復の平均である。
抗ＳＤＭＡ抗体－ＢＨＱ１０コンジュゲートの調製
抗ｍＡｂ ＳＤＭＡをｐＨ８の２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび４０％スクロースで２．５ｍｇ／ｍｌに希釈して、２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび２０％スクロース中抗体溶液を得ることによって、５ｍｇ／ｍＬの濃度の抗ｍＡｂ ＳＤＭＡ（ミズーリ州フェントンのＬｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりカスタムメイド）の２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）中ストック溶液を作製する。凍結乾燥ＢＨＱ１０－ＮＨＳエステル（英国、ミドルセックスのＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能、番号ＢＨＱ１０Ｓ）を無水ＤＭＳＯで溶媒和させて、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度にする。次いで、無水ＤＭＳＯ中２０モル当量のＢＨＱ１０を、穏やかに混合しながら抗体溶液に（例えば、ＢＨＱ－１０溶液５２μＬを抗ｍＡｂ ＳＤＭＡ溶液１ｍＬに）添加する。得られた溶液を混合しないで室温で１時間インキュベートし、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（マサチューセッツ州テュークスベリーのＡｌｆａ Ａｅｓａｒから商業的に入手可能）１０μＬを添加することによって反応物をクエンチした。得られた溶液を室温で１０分間インキュベートし、遠心分離して沈殿を除去し、さらに調整することなく使用した。
様々な干渉物質の存在下でのＳＤＭＡの決定
乾式スライド性能に対する干渉物質（脂肪血症、ビリルビン、溶血、および全血）の影響を評価するために、ＳＤＭＡのプールしたチャコール処理雑種血清（ニューヨーク州ウェストバリーのＢｉｏＩＶＴから商業的に入手可能、番号ＤＯＧ４２５７７）中新鮮な試料溶液をある範囲の干渉物質レベルで調製した。希釈を通して各ＳＤＭＡ濃度での各干渉物質レベルを作製した。所望のＳＤＭＡ濃度（例えば、１００μｇ／ｄＬ）および最高干渉物質レベル、１０００ｍｇ／ｄＬ脂肪血症（イントラリピッド２０％エマルジョン、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能、番号１００２６７５５３）を有するチャコール処理血清中ストック溶液を形成することによって、干渉物質として脂肪血症を有する試料を作製した。次いで、得られたストック溶液をチャコール処理血清中１００μｇ／ｄＬ ＳＤＭＡの対照溶液で段階希釈して、０、２５０、５００、７５０、および１０００ｍｇ／ｄＬの脂肪血症濃度を有する溶液を作製した。このようにして、異なる干渉物質レベルの溶液を、０、１５、３０、および１００μｇ／ｄＬのＳＤＭＡ濃度で調製して、ある範囲のＳＤＭＡ濃度にわたる干渉物質の効果を評価した。各溶液について、ＳＤＭＡ濃度をＬＣＭＳによって決定し、脂肪血症濃度をＢｅｃｋｍａｎ ＡＵ５８１２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（カリフォルニア州ブレアのＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから商業的に入手可能）で確認した。
同様の希釈プロトコルを使用して、０、１５、３０、および１００μｇ／ｄＬのＳＤＭＡ濃度ならびに０、７．５、１５、２２．５、および３０ｍｇ／ｄＬビリルビンのビリルビン濃度のビリルビン（ビリルビンコンジュゲート、カリフォルニア州ラホヤのＳｃｒｉｐｐｓから商業的に入手可能、番号Ｂ０１１４９０６０４）溶液を調製した。ビリルビン濃度をＢｅｃｋｍａｎ ＡＵ５８１２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（カリフォルニア州ブレアのＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから商業的に入手可能）で確認した。ＳＤＭＡ濃度をＬＣＭＳによって決定した。
溶血干渉物質溶液を、新たに採取し、溶血させた血液試料（サウスカロライナ州ワードのＰｅｔ Ｆｏｏｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから商業的に入手可能）から調製し、上記のように希釈して０、１２５、２５０、３７５、および５００ｍｇ／ｄＬの溶血血液濃度にした。溶血血液濃度をＢｅｃｋｍａｎ ＡＵ５８１２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（カリフォルニア州ブレアのＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから商業的に入手可能）で確認した。ＳＤＭＡ濃度をＬＣＭＳによって決定した。
全血混入試料を作製するために、リチウム－ヘパリン処理抗凝固剤処理全血（サウスカロライナ州ワードのＰｅｔ Ｆｏｏｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから商業的に入手可能）を処理血清で希釈して０、１５、６０、および１００μｇ／ｄＬのＳＤＭＡ濃度ならびに１、５、および１０％の全血パーセンテージにした。各溶液について、ヘマトクリットを測定することによって全血パーセンテージを決定し、ＬＣＭＳによってＳＤＭＡ濃度を決定した。
図２４は、一定量のＳＤＭＡを含有する試料中のＳＤＭＡの濃度を決定するためのアッセイ（フィルタリング層を有するスライドを使用）の結果を示す。結果は、干渉物質がＳＤＭＡの分析に干渉しないことを示している。
コール酸－フルオレセインコンジュゲート（ＣＡ－Ｆｌ）の合成
Figure 2023521886000089
コール酸（２８ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）、４’－アミノメチルフルオレセイン（２５ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）、ＨＡＴＵ（２９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）、およびＮ’Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２９ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を室温で２０時間より長く撹拌し、０．１％ギ酸を含有する水中５０％から１００％アセトニトリルの勾配の移動相で溶出するＴｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ ＲｅｄｉＳｅｐ ＲＦ Ｇｏｌｄ Ｃ１８ＡＱ ５．５ｇｍカラムを使用したＢｉｏｔａｇｅ Ｓｅｌｅｋｔ Ｓｙｓｔｅｍ（スウェーデンのＢｉｏｔａｇｅから商業的に入手可能）を使用して粗生成物を精製した。ＣＡ－Ｆｌを含有する画分を回収し、凍結乾燥すると黄色固体が得られ、これを、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１：７５２．４）を使用して特徴付けた。
ＰＢＳ中での抗コール酸抗体によるＣＡ－Ｆｌの蛍光消光
ＣＡ－ＦｌのＰＢＳ中作業溶液（１００ｎＭ）を調製した。次いで、作業溶液を様々な当量のα－コール酸抗体（１：１、ｖ／ｖ）（オランダのＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから商業的に入手可能）と合わせた。蛍光を抗体（Ａｂ）とＣＡ－Ｆｌの比の関数として測定した。結果を図３３に示す。結果は、ＣＡ－Ｆｌが抗体と複合体を形成すると、その蛍光が消光され、消光量が抗体とＣＡ－Ｆｌトレーサーのモル比の関数であることを示している。抗体とＣＡ－Ｆｌトレーサーの比が高くなるほど、消光量が大きくなる。結果はまた、抗体とＣＡ－Ｆｌトレーサーのモル比が約８：１である場合に消光が飽和したことを実証している。
ＰＢＳ（０．１％ｔｗｅｅｎ ２０を含む）中ＣＡ－Ｆｌ（２００ｎＭ）のアリコートを、２００、４００、または８００ｎＭの濃度の抗体の溶液と１：１（ｖ／ｖ）混合し、得られた混合物を４℃で３０分間インキュベートして３種のアッセイ試薬：試薬１（Ａｂ １００ｎＭ／ＣＡ－Ｆｌ １００ｎＭ）、試薬２（Ａｂ ２００ｎＭ／ＣＡ－Ｆｌ １００ｎＭ）、および試薬３（Ａｂ ４００ｎＭ／ＣＡ－Ｆｌ １００ｎＭ）を得た。
０～８０μＭの範囲の濃度の胆汁酸（コール酸またはタウロコール酸）標準溶液をＰＢＳ（０．１％ｔｗｅｅｎ ２０を含む）中に調製した。次いで、各胆汁酸標準溶液（５μｌ）を９６ウェルアッセイプレート中の試薬１、２、または３（９５μｌ）に添加し、得られた溶液を穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。次いで、４９０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長を使用して蛍光強度を測定した。結果を図３４Ａ（コール酸）および図３４Ｂ（タウロコール酸）に示す。図３４Ａおよび図３４Ｂは、胆汁酸濃度の関数としての蛍光回復を示す。結果は、４：１の抗体：ＣＡ－Ｆｌ比を有する試薬３が、０～８０μＭの範囲の濃度のＰＢＳ中胆汁酸についての最も広いダイナミックレンジを示すことを示している。
血清中の胆汁酸濃度の関数としての抗コール酸抗体によるＣＡ－Ｆｌの蛍光消光
チャコール処理イヌ血清をリン酸緩衝液によりｐＨ７．３に調整した。次いで、血清に胆汁酸（コール酸またはタウロコール酸）を添加して、０～４０μＭの間の範囲の胆汁酸濃度にした。
ＣＡ－ＦｌのＰＢＳ中溶液（２００ｎＭ）をα－コール酸抗体の溶液（４００ｎＭ）と１：１（ｖ／ｖ）の比で混合し、４℃で３０分間インキュベートしてアッセイ試薬を得た。
次いで、胆汁酸を含有するイヌ血清の溶液（５μｌ）を９６ウェルアッセイプレート中のアッセイ試薬（９５μｌ）に添加し、得られた混合物を穏やかに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。
４９０ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長を使用して、蛍光強度を測定した。結果を、コール酸（図３５Ａ）およびタウロコール酸（図３５Ｂ）について図３５に示す。図３５Ａおよび図３５Ｂは、血清胆汁酸濃度の関数としての蛍光回復を示す。結果は、血清中のコール酸およびタウロコール酸についてのアッセイが０～４０μＭのダイナミックレンジを有することを示している。
ＢＨＱ１０標識シスタチン－Ｂ（ＣｙｓＢ）：ＣｙｓＢ－ＢＨＱの合成
ＰＢＳ（１ｍＬ）中組換えシスタチン－Ｂタンパク質（４．０ｍｇ）を、ＤＭＳＯ（０．２５ｍＬ）に溶解したＢＨＱ１０－ＮＨＳ（ＢＨＱ１０のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、カリフォルニア州ペタルーマのＬＧＣ Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能）２．０ｍｇ（８当量、１０ｍｇ／ｍＬストック２０４μＬ）と混合した。得られた溶液を２時間くるくる回転させた。次いで、クエンチャー標識タンパク質を各交換について最小２時間、３×４ＬのＰＢＳに対する透析によって精製した。透析中、１０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルタ（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＧ２カセット）を使用した。ＢＣＡキット（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を使用して、得られた生成物のタンパク質濃度を決定した。
フルオレセイン標識抗ＣｙｓＢ（３Ｈ４）－ｍＡｂ、ＮＨＳエステル経路：抗ＣｙｓＢ－ＦＬの合成
ＰＢＳ（１ｍＬ）中モノクローナル抗ＣｙｓＢ抗体（抗ＣｙｓＢ（３Ｈ４）－ｍＡｂ）（５ｍｇ）を、ＤＭＳＯに溶解したフルオレセイン－ＮＨＳ（フルオレセインのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）０．０２５ｍｇ（２当量、２ｍｇ／ｍＬストック１２．５μＬ）と混合した。得られた溶液を２時間くるくる回転させた。次いで、フルオレセイン標識抗体を各交換について最小２時間、３×４ＬのＰＢＳに対する透析によって精製した。透析中、１０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルタ（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＧ２カセット）を使用した。ＢＣＡキット（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を使用して、得られた生成物のタンパク質濃度を決定した。
フルオレセイン標識抗ＣｙｓＢ（３Ｈ４）－ｍＡｂ、フルオレセインアルデヒド経路：抗ＣｙｓＢ－ＦＬ－Ａｌｄの合成
ＰＢＳ（１ｍＬ）中モノクローナル抗ＣｙｓＢ抗体（抗ＣｙｓＢ（３Ｈ４）－ｍＡｂ）（５ｍｇ）を、ＤＭＳＯに溶解したフルオレセインアルデヒド０．０２４ｍｇ（２当量）と混合した。得られた溶液に、１Ｎ ＮａＯＨに溶解したシアノ水素化ホウ素ナトリウム０．０２ｍｇ（１０当量）を添加した。混合物を２時間くるくる回転させた。次いで、フルオレセイン標識抗体を各交換について最小２時間、３×４ＬのＰＢＳに対する透析によって精製した。透析中、１０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルタ（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＧ２カセット）を使用した。ＢＣＡキット（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を使用して、得られた生成物のタンパク質濃度を決定した。
ＢＯＤＩＰＹ標識抗ＣｙｓＢ（３Ｈ４）－ｍＡｂ：抗ＣｙｓＢ－ＢＯＤＩＰＹの合成
ＰＢＳ（１ｍＬ）中モノクローナル抗ＣｙｓＢ抗体（抗ＣｙｓＢ（３Ｈ４）－ｍＡｂ）（５ｍｇ）をＤＭＳＯに溶解したＢＯＤＩＰＹ－ＮＨＳ（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）０．０２６ｍｇ（２当量）と混合した。得られた溶液を２時間くるくる回転させた。次いで、フルオレセイン標識抗体を各交換について最小２時間、３×４ＬのＰＢＳに対する透析によって精製した。透析中、１０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルタ（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＧ２カセット）を使用した。ＢＣＡキット（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を使用して、得られた生成物のタンパク質濃度を決定した。
ＣｙｓＢについての９６ウェルプレート消光および用量反応アッセイ
以下の実施例は、実施例４１に記載されるように調製したＣｙｓＢ－ＢＨＱおよび実施例４２に記載されるように調製した抗ＣｙｓＢ－ＦＬを使用する。
１．ＢＨＱ－およびフルオレセイン－コンジュゲート、ストック溶液から１０倍を、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ＝７．４に希釈して、中間ストック溶液を得た。
２．中間ストック溶液を、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ＝７．４に４倍作業濃度まで希釈した。［抗ＣｙｓＢ－ＦＬ］＝４００ｎＭおよび［ＣｙｓＢ－ＢＨＱ］＝８００ｎＭ。
３．ＣｙｓＢ－ＢＨＱ溶液５０μＬおよび抗ＣｙｓＢ－ＦＬ溶液５０μＬを、９６ウェル黒色底プレートのウェルに添加した。９６ウェルプレートを３０秒間穏やかに振盪し、室温で５分間インキュベートし、３７℃で、プレートリーダーで読み取った。最終［抗ＣｙｓＢ－ＦＬ］＝２００ｎＭ、最終［ＣｙｓＢ－ＢＨＱ］＝２００ｎＭ；励起波長：４７０ｎｍ、および発光波長：５２０ｎｍ。
４．異なる濃度のＣｙｓＢ組換え標準（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）の２倍作業溶液１００μＬをウェルに添加した。次いで、９６ウェルプレートを３０秒間穏やかに振盪し、３７℃で３０分間インキュベートし、蛍光を測定する。最終［抗ＣｙｓＢ－ＦＬ］＝１００ｎＭ、［ＣｙｓＢ－ＢＨＱ］＝２００ｎＭ、［ＣｙｓＢ］＝０、０．２５、０．５、１、２、５μｇ／ｍＬ。励起波長：４７０ｎｍ、発光波長：５２０ｎｍ。
図３６は、蛍光強度（λｅｘ＝４７０ｎｍ、λｅｘ＝５２０ｎｍ）対ＣｙｓＢ濃度（μｇ／ｍＬ）のプロットである。図３６は、ＣｙｓＢ濃度の関数としての蛍光回復を示し、アッセイを使用して試料中のＣｙｓＢ濃度を測定することができることを示している。アッセイは１２５ｎｇ／ｍＬまでの感度を有し、臨床的に関連する範囲を網羅する。蛍光シグナルの最大回復は、未結合抗ＣｙｓＢ－ＦＬ蛍光の７５％であった。
触媒スライド用量反応試験
以下の手順によってスライドを調製した：
１．０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中の実施例４１に記載されるように調製したＣｙｓＢ－ＢＨＱ（１６００ｎＭ）、および実施例４２に記載されるように調製した抗ＣｙｓＢ－ＦＬ（８００ｎＭ）、または実施例４４に記載されるように調製した抗ＣｙｓＢ－ＢＯＤＩＰＹ（８００ｎＭ）の混合物を、プラスチックスライドハウジング上にマウントされた７ｍｍ直径Ｆｕｓｉｏｎ ５膜上にスポットした（１２μＬ）。
２．スポットしたスライドを、光から保護して、４０℃で３０分間乾燥させた。
３．次いで、スライドを室温に冷却し、Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｄｘ計器（メイン州ポートランドのＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから商業的に入手可能）にロードした。
４．血清試料に０、２５０、５００、１０００、および２０００ｎｇ／ｍＬ組換えＣｙｓＢタンパク質を添加し、Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｄｘ計器にロードした。
５．次いで、試料をスライド（１０μＬ）に分注し、蛍光強度を経時的に測定した。
図３７は、乾式スライドフォーマットにおける蛍光強度の増加率（時間間隔３０～１００秒にわたって測定される）対ＣｙｓＢの濃度のプロットである。これらの結果は、抗ＣｙｓＢ－ＦＬ／ＣｙｓＢ－ＢＨＱ免疫複合体が、固体支持体上で乾燥後にインタクトなままであり、試料を乾式スライドに添加すると臨床的に関連する範囲の用量反応をもたらすことができることを示している。
リジン残基を通してＦＬにコンジュゲートしたフルオレセイン標識シスタチン－Ｂの合成
ＰＢＳ（１ｍＬ）中組換えシスタチン－Ｂタンパク質（４．０ｍｇ）を、ＤＭＳＯに溶解したフルオレセイン－ＮＨＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）０．３４ｍｇ（２当量、２０ｍｇ／ｍＬストック１７μＬ）と混合した。得られた溶液を２時間くるくる回転させた。次いで、フルオレセイン標識ＣｙｓＢ（リジン修飾）を、各交換について最小２時間、３×４ＬのＰＢＳに対する透析によって精製した。透析中、１０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルタ（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＧ２カセット）を使用した。ＢＣＡキット（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を使用して、得られた生成物のタンパク質濃度を決定した。
システイン残基を通してＦＬＴにコンジュゲートしたフルオレセイン標識シスタチン－Ｂの合成
ＰＢＳ（１ｍＬ）中組換えシスタチン－Ｂタンパク質（４．０ｍｇ）に、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（マサチューセッツ州ヘーバリルのＡｌｆａ Ａｅｓａｒから商業的に入手可能）１０μＬを添加して、５ｍＭ ＥＤＴＡの最終濃度にした。得られた溶液を、０．２μｍフィルタを含有する遠心管中のＴＣＥＰ結合樹脂（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）０．５ｍＬに添加し、室温で２時間くるくる回転させた。次いで、反応混合物を８０００ｒｐｍで１分間手短に遠心分離した。フロースルーを回収して４ｍｇ／ｍＬの濃度の還元ＣｙｓＢ（１個の活性化システイン残基を含有する）を得た。この活性化ＣｙｓＢを、ＤＭＳＯに溶解したフルオレセイン－マレイミド（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから商業的に入手可能）０．３１ｍｇ（２当量、２０ｍｇ／ｍＬストック１５μＬ）と混合した。得られた溶液を２時間くるくる回転させた。次いで、フルオレセイン標識ＣｙｓＢ（システイン修飾）を、各交換について最小２時間、３×４ＬのＰＢＳに対する透析によって精製した。透析中、１０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルタ（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＧ２カセット）を使用した。ＢＣＡキット（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから商業的に入手可能）を使用して、得られた生成物のタンパク質濃度を決定した。
ＣｙｓＢペプチド－フルオロフォアコンジュゲート
フルオレセインの５位でコンジュゲートしたペプチド
Figure 2023521886000090
フルオレセインの４’位でコンジュゲートしたペプチド
Figure 2023521886000091
イヌＣｙｓＢ配列
イヌシスタチン－Ｂ、完全長：
MMCGAPSASQPATADTQAIADQVKAQLEERENKKYTTFKAVTFRSQVVAGTPYFIKVQVDDDEFVHLRVFQSLPHENKPLALSSYQTNKAKHDELAYF［配列番号：１］
P9: QTNKAKHDELAYF［配列番号：２］
P14: YQTNKAKHDELAYF［配列番号：３］
P7: GHDELAYF［配列番号：４］
P6: GDELAYF［配列番号：５］
P5: GELAYF［配列番号：６］
P4: GLAYF［配列番号：７］
５位でコンジュゲートしたイヌＣｙｓＢペプチド－Ｆｌコンジュゲートの調製
ＣｙｓＢペプチドＰ７、Ｐ６、Ｐ５、およびＰ４をそれぞれ以下のようにフルオレセインの５位にコンジュゲートした：ＧＤＥＬＡＹＦ［配列番号：６］のアミノ酸配列を有するＣｙｓＢペプチドＰ６（１５ｍｇ、０．０１８４ｍｍｏｌ、ニュージャージー州ピスカタウェイのＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってカスタム合成）、５－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（９．２ｍｇ、０．０１９４ｍｍｏｌ、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから商業的に入手可能）、およびＮ’Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（９．６７μｌ、０．０５５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、水（０．１％ギ酸を含有する）中３０％ＡＣＮ １ｍｌに希釈し、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）精製システムにおいて水中３０％から１００％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。画分を、２５７ｎｍと４７０ｎｍの両方で吸収を監視することによって自動的に回収した。４７０ｎｍで吸収を有する画分をＬＣＭＳによって分析して、標的ペプチドＰ６－Ｆｌコンジュゲートを含有する画分を同定し、所望の画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１１７２）によって確認される最終黄色固体生成物が得られた。
ＣｙｓＢペプチドＰ６について上に記載されるのと実質的に同じ合成および精製手順を使用して、５位でのフルオレセインとのＣｙｓＢペプチドＰ７、Ｐ５、およびＰ４コンジュゲートを合成した。最終コンジュゲートをＬＣＭＳによって、ＧＨＤＥＬＡＹＦ、Ｐ７－Ｆｌ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１３０９）；ＧＥＬＡＹＦ、Ｐ５－Ｆｌ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１０５７）；ＧＬＡＹＦ、Ｐ４－Ｆｌ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝９２８）として特徴付けた。
５位でコンジュゲートしたイヌＣｙｓＢペプチド－ＤＦＦコンジュゲートの調製
ＣｙｓＢペプチドＰ７、Ｐ６、Ｐ５、およびＰ４をそれぞれ以下のようにＤＦＦの５位にコンジュゲートした：ＧＤＥＬＡＹＦ［配列番号：６］のアミノ酸配列を有するＣｙｓＢペプチドＰ６（４．２ｍｇ、０．００５２ｍｍｏｌ、ニュージャージー州ピスカタウェイのＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってカスタム合成）、５－ジフルオロカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（２．５ｍｇ、０．００４９ｍｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＴＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）、およびＮ’Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４．２９μｌ、０．０２４５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、水（０．１％ギ酸を含有する）中３０％ＡＣＮ １ｍｌに希釈し、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）精製システムにおいて水中３０％から１００％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。画分を、２５７ｎｍと４７０ｎｍの両方で吸収を監視することによって自動的に回収した。４７０ｎｍで吸収を有する画分をＬＣＭＳによって分析して、標的ペプチドＰ６－ＤＦＦコンジュゲートを含有する画分を同定し、所望の画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１２０８）によって確認される最終黄色固体生成物が得られた。上記のＣｙｓＢペプチドＰ６について記載されるのと実質的に同じ合成および精製手順ならびに適切な出発物質を使用して、ＣｙｓＢペプチドＰ７、Ｐ５、およびＰ４と５位でのＤＦＦとのコンジュゲートを合成した。最終コンジュゲートをＬＣＭＳによって、ＧＨＤＥＬＡＹＦ、Ｐ７－ＤＦＦ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１３４５）；ＧＥＬＡＹＦ、Ｐ５－ＤＦＦ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１０９３）；ＧＬＡＹＦ、Ｐ４－ＤＦＦ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝９６４）として特徴付けた。
４’位でコンジュゲートしたイヌＣｙｓＢペプチド－４－Ｆｌコンジュゲートの調製
ＣｙｓＢペプチドＰ６、Ｐ５、およびＰ４をそれぞれ以下のようにフルオレセインの４’位にコンジュゲートした：メタノール１ｍＬを含有する２ｍＬガラスバイアルに、フルオレセインアルデヒド（２．２１ｍｇ、０．００６１ｍｍｏｌ）、ＣｙｓＢペプチドＰ６（５ｍｇ、０．００６１ｍｍｏｌ）（ニュージャージー州ピスカタウェイのＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってカスタム合成）、および炭酸カリウム（４．２５ｍｇ、０．０３０７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で１時間撹拌させた。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．７７ｍｇ、０．０１２３ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、得られた混合物を暗所中室温で一晩撹拌した。得られた粗生成物を水（０．１％ギ酸を含有する）中３０％ＡＣＮ １ｍｌに希釈し、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）精製システムにおいて水中３０％から１００％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。画分を、２５７ｎｍと４７０ｎｍの両方で吸収を監視することによって自動的に回収した。４７０ｎｍで吸収を有する画分をＬＣＭＳによって分析して、標的ペプチドＰ６－４－Ｆｌコンジュゲートを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１１５８）によって確認される最終黄色固体生成物が得られた。ＣｙｓＢペプチドＰ６について上に記載されるのと実質的に同じ合成および精製手順を使用して、ＣｙｓＢペプチドＰ５およびＰ４と４’位でのフルオレセインとのコンジュゲートを合成した。最終コンジュゲートをＬＣＭＳによって、ＧＥＬＡＹＦ、Ｐ５－４－Ｆｌ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１０４３）；ＧＬＡＹＦ、Ｐ４－４－Ｆｌ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝９１４）として特徴付けた。
４’位でコンジュゲートしたイヌＣｙｓＢペプチド－４－ＤＦＦコンジュゲートの調製
ＣｙｓＢペプチドＰ６、Ｐ５、およびＰ４をそれぞれ以下のようにＤＦＦの４’位にコンジュゲートした：メタノール１ｍＬを含有する２ｍＬガラスバイアルに、ジフルオロフルオレセインアルデヒド（２．４３ｍｇ、０．００６１ｍｍｏｌ）、ＣｙｓＢペプチドＰ６（５ｍｇ、０．００６１ｍｍｏｌ）（ニュージャージー州ピスカタウェイのＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってカスタム合成）、および炭酸カリウム（４．２５ｍｇ、０．０３０７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で１時間撹拌させた。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．７７ｍｇ、０．０１２３ｍｍｏｌ）を溶液に添加し、得られた混合物を暗所中室温で一晩撹拌した。得られた粗生成物を水（０．１％ギ酸を含有する）中３０％ＡＣＮ １ｍｌに希釈し、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）精製システムにおいて水中３０％から１００％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。画分を、２５７ｎｍと４７０ｎｍの両方で吸収を監視することによって自動的に回収した。４７０ｎｍで吸収を有する画分をＬＣＭＳによって分析して、標的ペプチドＰ６－４－ＤＦＦコンジュゲートを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１１９４）によって確認される最終黄色固体生成物が得られた。上記のＣｙｓＢペプチドＰ６について記載されるのと実質的に同じ合成および精製手順ならびに適切な出発物質を使用して、ＣｙｓＢペプチドＰ５およびＰ４と４’位でのＤＦＦとのコンジュゲートを合成した。最終コンジュゲートをＬＣＭＳによって、ＧＥＬＡＹＦ、Ｐ５－４－ＤＦＦ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝１０７９）；ＧＬＡＹＦ、Ｐ４－４－ＤＦＦ、ＬＣＭＳ（Ｍ＋１＝９５０）として特徴付けた。
抗ＣｙｓＢ Ｍａｂまたは抗ＣｙｓＢ Ｍａｂ－ＢＨＱ１０によるイヌＣｙｓＢ Ｐ６－ＦｌおよびＰ６－ＤＦＦの蛍光消光
ＣｙｓＢペプチド－フルオレセイン（Ｆｌ）または－ジフルオロフルオレセイン（ＤＦＦ）コンジュゲートをＤＭＳＯに溶解し（０．５ｍＭ）、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０で５０ｎＭ）で希釈してストック溶液（１００ｎＭ）を得た。モノクローナル抗ＣｙｓＢ抗体（７Ｃ２、配列番号：１４のアミノ酸配列を有するペプチドに対して生成される）（８ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ緩衝液に段階希釈して、Ｔｒｉｓ緩衝液（０．５％サルコシル（ラウロイルサルコシンナトリウム）を含む、ｐＨ８．０で５０ｍＭ）中０～８００ｎＭの範囲の抗ＣｙｓＢ－Ｍａｂ濃度を有する溶液を得た。段階希釈した抗ＣｙｓＢ－Ｍａｂ溶液（５０μＬ）を含有する９６ウェル黒色アッセイプレートに、ペプチド－Ｆｌまたはペプチド－ＤＦＦ溶液（５０μＬ）を添加し、よく混合し、３０分間インキュベートし、蛍光強度を記録した。結果を図３８、図３９、図４０、および表１に提供する。
図３８は、Ｐ６－Ｆｌの蛍光は抗ＣｙｓＢ－Ｍａｂの存在下で消光され、Ｐ７－Ｆｌについてはより弱い消光が観察されたことを示している。約８：１の抗体とＰ６－Ｆｌのモル比で高い消光（約３０％）が観察された。図３９は、Ｐ６－ＤＦＦの蛍光が抗ＣｙｓＢ－Ｍａｂの存在下で消光されたことを示している。約４：１の抗体とＰ７－Ｆｌのモル比で最大消光（約４５％）が観察された。図４０は、Ｐ６－Ｆｌの蛍光が抗ＣｙｓＢ Ｍａｂ－ＢＨＱ１０の存在下で消光されたことを示している。抗ＣｙｓＢ Ｍａｂ－ＢＨＱ１０の存在下での消光は、未修飾ｍＡｂで観察されたものよりわずかに高かった。Ａｂ－ＢＨＱ１０の存在下でのＰ６－ＤＦＦについての同様の結果を図４１および図４２に示す。
ＣｙｓＢペプチドＰ６、Ｐ５、およびＰ４のトレーサーをフルオレセイン（Ｆｌ）またはジフルオロフルオレセイン（ＤＦＦ）の４’位にコンジュゲートした。抗ＣｙｓＢ Ｍａｂによる他のＣｙｓＢペプチド－フルオロフォアコンジュゲートの蛍光消光を表１に要約する。
表１に示されるように、抗ＣｙｓＢ ｍＡｂを添加した場合に、フルオロフォアの４’位でコンジュゲートしたペプチド－ＦｌまたはＤＦＦの蛍光消光が観察された。一般的に、フルオロフォアの４’位でコンジュゲートしたペプチドの消光は、４’コンジュゲートフルオレセインでより高い消光を示したＰ５－Ｆｌを除いて、フルオロフォアの５位でコンジュゲートしたペプチドの消光より低かった。
Figure 2023521886000092
Ｔｒｉｓ緩衝液および血清中でのペプチド／完全長イヌＣｙｓＢタンパク質用量反応
０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液中ＣｙｓＢ Ｐ６－ＦｌまたはＰ６－ＤＦＦ（２００ｎＭ、２５μＬ）と０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴｒｉｓ緩衝液中抗Ｃｙｓ－Ｍａｂ（４００ｎＭ、２５μＬ）の混合物を、９６ウェル黒色アッセイプレートのウェル中室温で３０分間インキュベートした。次いで、０～３２００ｎＭの範囲のペプチド濃度を有する一連のＣｙｓＢペプチドＰ６、Ｐ７、およびＰ１４標準溶液（５０μＬ）を、Ｔｒｉｓ緩衝液中のＰ６－ＦｌまたはＰ６－ＤＦＦと抗ＣｙｓＢ Ｍａｂの混合物に添加した。次いで、プレートを室温で３０分間インキュベートし、蛍光強度を４８５ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光で記録した。結果を図４３、図４４、図４５、および図４６に示す。
図４３は、増加する濃度のＣｙｓＢペプチドＰ６、Ｐ７、またはＰ１４の関数としての蛍光強度の増加がある、すなわち、これらのペプチドの各々を抗体とＰ６－ＦｌまたはＰ６－ＤＦＦの混合物に添加した場合、用量反応が観察されたことを示している。図４４は、増加する濃度のＣｙｓＢ完全長タンパク質の関数としての蛍光強度の増加、すなわち、このタンパク質を様々な濃度のサルコシルの存在下で抗体とＰ６－Ｆｌ（図４４Ａ）またはＰ１－ＤＦＦ（図４４Ｂ）の混合物に添加した場合、用量反応が観察されたことを示している。用量反応の大きさは、サルコシル濃度の増加と共に増加した。血清中ＣｙｓＢ完全長タンパク質を洗浄剤サルコシル（１％）の存在下で抗体または抗体－ＢＨＱ１０とＰ６－Ｆｌ（図４５）またはＰ６－ＤＦＦ（図４６）の混合物に添加した場合にも用量反応が観察された。
イヌＮＴ－プロＢＮＰペプチドコンジュゲート：
イヌＮＴ－プロＢＮＰ配列：
P1: AEQLALEPLHRS［配列番号：８］
P2: AEQLAL［配列番号：９］
P3: EPLHRS［配列番号：１０］
P4: LALEPL［配列番号：１１］
P5: AEQLALE［配列番号：１２］
P6: LEPLHRS［配列番号：１３］
イヌＮＴ－プロＰＮＰ、完全長：
HPLGGRSPASEASEASEASGLWAVQELLGRLKDAVSELQAEQLALEPLHRSHSPAEAPEAGGTPRGVLAPHDSVLQALR［配列番号：１４］
イヌＮＴ－プロＰＮＰ安定エピトープ：GRSPASEASEASEASGLWAVQ［配列番号：１５］
イヌＮＴ－プロＰＮＰ、安定エピトープ２：SHSPAEAPEAGGTPRGVLAPHDSVLQ［配列番号：１６］
５位でコンジュゲートしたイヌＮＴ－プロＢＮＰペプチド－Ｆｌコンジュゲートの調製
ＡＥＱＬＡＬＥＰＬＨＲＳ［配列番号：８］のアミノ酸配列を有するＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１（３．０２ｍｇ、０．００２２ｍｍｏｌ、ニュージャージー州ピスカタウェイのＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってカスタム合成）、５－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（１ｍｇ、０．００２１ｍｍｏｌ、マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから商業的に入手可能）、およびＮ’Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．６μＬ、０．００８９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、水（０．１％ギ酸を含有する）中３０％ＡＣＮ １ｍｌに希釈し、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）精製システムにおいて水中３０％から１００％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。画分を、２５７ｎｍと４７０ｎｍの両方で吸収を監視することによって自動的に回収した。４７０ｎｍで吸収を有する画分をＬＣＭＳによって分析して、標的ペプチドＰ１－Ｆｌコンジュゲートを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＬＣＭＳ（Ｍ２＋＝８６１．７）によって確認される最終黄色固体生成物が得られた。ＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１について上に記載されるのと実質的に同じ合成および精製手順ならびに出発物質を使用して、ＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ２：ＡＥＱＬＡＬ［配列番号：９］；Ｐ３：ＥＰＬＨＲＳ［配列番号：１０］；Ｐ４：ＬＡＬＥＰＬ［配列番号：１１］；Ｐ５：ＡＥＱＬＡＬＥ［配列番号：１２］；およびＰ６：ＬＥＰＬＨＲＳ［配列番号：１３］と５位でのフルオレセインとのコンジュゲートを合成した。最終コンジュゲートをＬＣＭＳによって、Ｐ２－Ｆｌ（Ｍ＋１＝１００２．５）；Ｐ３－Ｆｌ（Ｍ＋１＝１０９６．７）；Ｐ４－Ｆｌ（Ｍ＋１＝１０１３．４）：Ｐ５－Ｆｌ（Ｍ＋１＝１１３１．８）；Ｐ６－Ｆｌ（Ｍ＋１＝１２０９．９）として特徴付けた。
５位でコンジュゲートしたイヌＮＴ－プロＢＮＰペプチド－ＤＦＦコンジュゲートの調製
ＡＥＱＬＡＬＥＰＬＨＲＳのアミノ酸配列を有するＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１（２．８１ｍｇ、０．００２１ｍｍｏｌ、ニュージャージー州ピスカタウェイのＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってカスタム合成）、５－ジフルオロカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（１．０ｍｇ、０．００２１ｍｍｏｌ、カリフォルニア州サニーベールのＡＴＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔから商業的に入手可能）、およびＮ’Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．５μｌ、０．００８９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（０．５ｍｌ）に溶解した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、水（０．１％ギ酸を含有する）中３０％ＡＣＮ １ｍｌに希釈し、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）精製システムにおいて水中３０％から１００％アセトニトリルの勾配で溶出するＣ１８逆相カラム（５ｇ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって精製した。画分を、２５７ｎｍと４７０ｎｍの両方で吸収を監視することによって自動的に回収した。４７０ｎｍで吸収を有する画分をＬＣＭＳによって分析して、標的ペプチドＰ１－ＤＦＦコンジュゲートを含有する画分を合わせ、凍結乾燥すると、ＬＣＭＳ（Ｍ２＋＝８７９．８）によって確認される最終黄色固体生成物が得られた。上記のＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１について記載されるのと実質的に同じ合成および精製手順ならびに出発物質を使用して、ＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ２：ＡＥＱＬＡＬ［配列番号：９］；Ｐ３：ＥＰＬＨＲＳ［配列番号：１０］；Ｐ４：ＬＡＬＥＰＬ［配列番号：１１］；Ｐ５：ＡＥＱＬＡＬＥ［配列番号：１２］；およびＰ６：ＬＥＰＬＨＲＳ［配列番号：１３］と５位でのＤＦＦとのコンジュゲートを合成した。最終コンジュゲートをＬＣＭＳによって、Ｐ２－ＤＦＦ（Ｍ＋１＝１０３９．１）；Ｐ３－ＤＦＦ（Ｍ＋１＝１１３２．２）；Ｐ４－ＤＦＦ（Ｍ＋１＝１０４９．５）：Ｐ５－ＤＦＦ（Ｍ＋１＝１１６７．９）；Ｐ６－ＤＦＦ（Ｍ＋１＝１２４５．９）として特徴付けた。
抗ＮＴ－プロＢＮＰ ＭａｂおよびＡｂ－ＢＨＱ１０によるイヌＮＴ－プロＢＮＰ Ｐ１－Ｆ１およびＰ１－ＤＦＦの蛍光消光
ＮＴ－プロＢＮＰ－ペプチド－フルオレセイン（Ｆｌ）または－ジフルオロフルオレセイン（ＤＦＦ）コンジュゲートをＤＭＳＯに溶解し（０．４ｍＭ）、ＰＢＳで希釈してストック溶液（１００ｎＭ）を得た。モノクローナル抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体（ＡＤＸ－１５ Ｍａｂ、メイン州ウェストブルックのＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）（６．８４ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ緩衝液に段階希釈して、ＰＢＳ中０～８００ｎＭの範囲の抗体濃度を有する溶液を得た。段階希釈抗体溶液（５０μＬ）を含有する９６ウェル黒色アッセイプレートに、Ｐ１－ＦｌもしくはＰ１－ＤＦＦ、または他のペプチド－Ｆｌもしくはペプチド－ＤＦＦ溶液（５０μＬ）を添加し、よく混合し、３０分間インキュベートし、蛍光強度を記録した（４８５ｎｍでの励起および５２０ｎｍでの発光）。結果を図４７、図４８、および表２に提供する。
図４７は、抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の添加によるＰ１－Ｆｌの蛍光消光が最大７０％に達し、抗ＮＴ－プロＢＮＰ ＡｂとＰ１－Ｆｌのモル比が２：１である場合に消光が飽和点に接近したことを示している。抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体－ＢＨＱ１０の添加によるＰ１－Ｆｌの蛍光消光は最大４０％に達し、抗ＮＴ－プロＢＮＰ Ａｂ－ＢＨＱ１０とＰ１－Ｆｌのモル比が２：１である場合に、消光が飽和点に接近した。図４８は、Ｐ１－ＤＦＦの蛍光が、抗ＮＴ－プロＢＮＰ－Ｍａｂの存在下で最大およそ７０％まで消光され、１：１の抗体とＰ１－ＤＦＦのモル比で消光が飽和に接近したことを示している。Ｐ１－ＤＦＦの蛍光は、抗ＮＴ－プロＢＮＰ Ａｂ－ＢＨＱ１０の存在下で最大およそ６５％まで消光された。他の全てのＮＴ－プロＢＮＰペプチド－Ｆｌまたは－ＤＦＦコンジュゲート（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５）は、１：１～８：１のいずれのモル比においても抗体または抗体－ＢＨＱ１０の添加で消光を示さなかった。ＮＴ－プロＢＮＰ Ｐ６－ＦｌおよびＰ６－ＤＦＦは、１：１の比でわずかな蛍光消光（１．０～３．７％）を示し、８：１の比でおよそ１０％まで増加した。１：１モル比での結果を表２に要約する。
Figure 2023521886000093
ＰＢＳおよび血清中でのイヌＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１用量反応
ＰＢＳ中ＮＴ－プロＢＮＰ Ｐ１－ＦｌまたはＰ１－ＤＦＦ（１００ｎＭ、２５μＭ）とＰＢＳ中抗ＮＴ－プロＢＮＰ－Ｍａｂ（１００ｎＭ、２５μＬ）の混合物を９６ウェル黒色アッセイプレートのウェル中室温で３０分間インキュベートした。次いで、０～３２０ｎＭの範囲のペプチドまたはタンパク質濃度を有する一連のＰＢＳまたはチャコール処理血清中ＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１標準溶液（５０μＬ）を、ＰＢＳ中Ｐ１－ＦｌまたはＰ１－ＤＦＦと抗ＮＴ－プロＢＮＰ Ｍａｂの混合物に添加した。次いで、プレートを室温で３０分間インキュベートし、蛍光強度を４８５ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光で記録した。結果を図４９、図５０、図５１、および図５２に示す。
図４９は、増加するＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１濃度の関数としての蛍光強度の増加、すなわち、ペプチドをＰ１－Ｆｌと抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体（Ａｂ）、または抗体－ＢＨＱ１０（Ａｂ－ＢＨＱ１０）の混合物に添加した場合、用量反応が観察されたことを示している。図５０はまた、増加するＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１濃度の関数としての蛍光強度の増加、すなわち、ペプチドをＰ１－ＤＦＦと抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体（Ａｂ）、または抗体－ＢＨＱ１０（Ａｂ－ＢＨＱ１０）の混合物に添加した場合、用量反応が観察されたことを示している。Ｐ１ペプチドはまた、抗体または抗体－ＢＨＱ１０とＰ１－Ｆｌ（図５１）またはＰ１－ＤＦＦ（図５２）の混合物を含む血清中で用量反応をもたらした。
イヌＮＴ－プロＢＮＰ完全長タンパク質用量反応
ＰＢＳ中ＮＴ－プロＢＮＰ Ｐ１－ＦｌまたはＰ１－ＤＦＦ（２００ｎＭ、１０μＬ）とＰＢＳ中抗ＮＴ－プロＢＮＰ Ｍａｂ（２００ｎＭ、１０μＬ）の混合物を９６ウェル黒色アッセイプレートのウェル中室温で３０分間インキュベートした。次いで、０～３２０ｎＭの範囲の濃度でＮＴ－プロＢＮＰ完全長タンパク質（マサチューセッツ州イプスウィッチのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓによって合成された凍結乾燥粉末）を有する一連のＰＢＳ中ＮＴ－プロＢＮＰペプチドＰ１標準溶液（８０μＬ）を、ＰＢＳ中Ｐ１－ＦｌまたはＰ１－ＤＦＦと抗ＮＴ－プロＢＮＰ Ｍａｂの混合物に添加した。次いで、プレートを室温で３０分間インキュベートし、蛍光強度を４８５ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光で記録した。結果を図５３および図５４に示す。
図５３は、増加する濃度の完全長ＮＴ－プロＢＮＰタンパク質の関数としての蛍光強度の増加、すなわち、タンパク質を１：１のＰ１－Ｆｌ／Ａｂの比のＰ１－Ｆｌと抗ＮＴ－プロＢＮＰ抗体の混合物に添加した場合、用量反応が観察されたことを示している。同様に、図５４に示されるように、タンパク質を１：１の比のＰ１－ＤＦＦと抗体の混合物に添加した場合に、用量反応が観察された。完全長ＮＴ－プロＢＮＰをチャコール処理血清に添加し、Ｐ１－Ｆｌ／Ａｂ（図５５）またはＰ１－ＤＦＦ／Ａｂ（図５６）のいずれかの混合物に添加した場合にも、用量反応が観察された。Ｐ１－Ｆｌ／Ａｂ＝２：１については図５５、および２：１のＰ１－ＤＦＦ／Ａｂについては図５６に示されるように、混合物中の抗体の相対量を減少させることによって、アッセイ感度が改善される。
引用されている全ての参考文献の開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (209)

  1. Figure 2023521886000094
    （式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
    からなる群から選択される化合物。
  2. 請求項１に記載の化合物と対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）に対する抗体とを含む複合体。
  3. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項２に記載の複合体。
  4. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項３に記載の複合体。
  5. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０である、請求項４に記載の複合体。
  6. Figure 2023521886000095
    （式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－Ｃｌ、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
    からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  7. 請求項６に記載の化合物と対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）に対する抗体とを含む複合体。
  8. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項７に記載の複合体。
  9. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項８に記載の複合体。
  10. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０である、請求項９に記載の複合体。
  11. 構造：
    Figure 2023521886000096
    を有する、請求項６に記載の化合物。
  12. 請求項１１に記載の化合物とＳＤＭＡに対する抗体とを含む複合体。
  13. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１２に記載の複合体。
  14. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１３に記載の複合体。
  15. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０である、請求項１４に記載の複合体。
  16. 試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）の存在または量を決定する方法であって、
    （ｉ）ＳＤＭＡを含有することが疑われる試料を用意するステップと；
    （ｉｉ）前記試料を、
    （ａ）
    Figure 2023521886000097
    （式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
    からなる群から選択される蛍光トレーサー、および
    （ｂ）ＳＤＭＡに対する抗体
    と混合してアッセイ溶液を得るステップと；
    （ｉｉｉ）前記アッセイ溶液を第１の波長で偏光されていない光で照射するステップと；
    （ｉｖ）第２の波長で放出される光の強度を測定するステップと
    を含み、前記第２の波長で放出される光の強度が前記試料中のＳＤＭＡの濃度に比例する、方法。
  17. 分離ステップを伴わない、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＳＤＭＡに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000098
    （式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
    からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  22. 分離ステップを伴わない、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＳＤＭＡに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000099
    である、請求項２１に記載の方法。
  27. 分離ステップを伴わない、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＳＤＭＡに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０である、請求項２９に記載の方法。
  31. 試料中の分析物の存在または量を決定する方法であって、
    （ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
    （ｉｉ）前記試料を、
    （ａ）蛍光トレーサー、および
    （ｂ）結合パートナー
    と混合してアッセイ溶液を得るステップであって、前記結合パートナーは前記分析物および前記蛍光トレーサーに特異的である、ステップと；
    （ｉｉｉ）前記アッセイ溶液を第１の波長で偏光されていない光で照射するステップと；
    （ｉｖ）第２の波長で放出される光の強度を測定するステップと
    を含み、前記第２の波長で放出される光の強度が前記試料中の前記分析物の濃度に比例する、方法。
  32. 試料中の分析物の存在または量を決定する方法であって、
    （ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
    （ｉｉ）前記試料を、
    （ａ）蛍光トレーサー、および
    （ｂ）結合パートナー
    と混合してアッセイ溶液を得るステップであって、前記結合パートナーは前記分析物および前記蛍光トレーサーに特異的である、ステップと；
    （ｉｉｉ）前記アッセイ溶液を第１の波長で偏光されていない光で照射し、第２の波長で放出される光の強度を測定することによって、前記結合パートナーに結合した蛍光トレーサーの量を決定するステップと
    を含む方法。
  33. 前記分析物が、メラミン、抗生物質、Ｔ３、Ｔ４、ペニシリン、サルファ薬、セファロスポリン、プロゲステロン、コルチゾール、およびシスタチン－Ｂからなる群から選択される、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 前記結合パートナーが前記分析物に対する抗体である、請求項３１または３２に記載の方法。
  35. 分離ステップを伴わない、請求項３１または３２に記載の方法。
  36. 乾式スライドアッセイを使用する、請求項３１または３２に記載の方法。
  37. 前記蛍光トレーサーが、４’－置換フルオレセイントレーサー、４’－置換フルオレセイントレーサー誘導体、５－置換フルオレセイントレーサー、および５－置換フルオレセイントレーサー誘導体からなる群から選択される、請求項３１または３２に記載の方法。
  38. 前記分析物がメラミンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000100
    からなる群から選択され、前記結合パートナーがメラミンに対する抗体である、請求項３１または３２に記載の方法。
  39. 前記分析物がビオチンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000101
    であり、前記結合パートナーがビオチンに対する抗体である、請求項３１または３２に記載の方法。
  40. 前記分析物がチロキシンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000102
    からなる群から選択され、前記結合パートナーがチロキシンに対する抗体である、請求項３１または３２に記載の方法。
  41. 前記分析物がアモキシシリンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000103
    であり、前記結合パートナーがアモキシシリンに対する抗体である、請求項３１または３２に記載の方法。
  42. 前記分析物がアンピシリンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000104
    であり、前記結合パートナーがアンピシリンに対する抗体である、請求項３１または３２に記載の方法。
  43. 前記分析物がセフォタキシムであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000105
    であり、前記結合パートナーがセフォタキシムに対する抗体である、請求項３１または３２に記載の方法。
  44. 前記分析物がスルファジメトキシンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000106
    からなる群から選択され、前記結合パートナーがスルファジメトキシンに対する抗体である、請求項３１または３２に記載の方法。
  45. 前記分析物がコルチゾールであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000107
    であり、前記結合パートナーがコルチゾールに対する抗体である、請求項３１または３２に記載の方法。
  46. Figure 2023521886000108
    からなる群から選択される化合物。
  47. 請求項４６に記載の化合物とメラミンに対する抗体とを含む複合体。
  48. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項４７に記載の複合体。
  49. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項４８に記載の複合体。
  50. 式：
    Figure 2023521886000109
    の化合物。
  51. 請求項５０に記載の化合物とビオチンに対する抗体とを含む複合体。
  52. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項５１に記載の複合体。
  53. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項５２に記載の複合体。
  54. Figure 2023521886000110
    からなる群から選択される化合物。
  55. 請求項５４に記載の化合物とチロキシンに対する抗体とを含む複合体。
  56. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項５５に記載の複合体。
  57. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項５６に記載の複合体。
  58. 式：
    Figure 2023521886000111
    の化合物。
  59. 請求項５８に記載の化合物とアモキシシリンに対する抗体とを含む複合体。
  60. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項５９に記載の複合体。
  61. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項６０に記載の複合体。
  62. 式：
    Figure 2023521886000112
    の化合物。
  63. 請求項６２に記載の化合物とアンピシリンに対する抗体とを含む複合体。
  64. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項６３に記載の複合体。
  65. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項６４に記載の複合体。
  66. 式：
    Figure 2023521886000113
    の化合物。
  67. 請求項６６に記載の化合物とセフォタキシムに対する抗体とを含む複合体。
  68. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項６７に記載の複合体。
  69. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項６８に記載の複合体。
  70. Figure 2023521886000114
    からなる群から選択される化合物。
  71. 請求項７０に記載の化合物とスルファジメトキシンに対する抗体とを含む複合体。
  72. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項７１に記載の複合体。
  73. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項７２に記載の複合体。
  74. 式：
    Figure 2023521886000115
    の化合物。
  75. 請求項７４に記載の化合物とコルチゾールに対する抗体とを含む複合体。
  76. 前記抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項７５に記載の複合体。
  77. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項７６に記載の複合体。
  78. 前記結合パートナーが、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項３１または３２に記載の方法。
  79. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
  80. 第１の層と第２の層とを含むスライドであって、
    前記第１の層がポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース誘導体、ポリエチレンテレフタレート、およびこれらの混合物からなる群から選択される第１のポリマーを含み、
    前記第２の層が、蛍光トレーサーおよび結合パートナーが中に分散した第２のポリマーを含み、
    前記結合パートナーが前記蛍光トレーサーに特異的である、スライド。
  81. 前記第２の層がプルランを含む、請求項８０に記載のスライド。
  82. 前記第２の層が、前記第２の層の約２重量％～約４０重量％の範囲の量のセルロースおよび前記第２の層の約０．５重量％～約４０重量％の範囲の量のプルランを含む、請求項８０に記載のスライド。
  83. 前記第１の層の厚さが約１５μｍ～約２００μｍの範囲であり、前記第２の層の厚さが約３０μｍ～約２００μｍの範囲である、請求項８０に記載のスライド。
  84. 結合パートナーが抗体であり、前記第２の層中の前記蛍光トレーサーの濃度が前記第２の層の約１×１０－５重量％～約１×１０－１重量％の範囲であり、抗体の濃度が前記第２の層の約１×１０－４重量％～約１重量％の範囲である、請求項８０に記載のスライド。
  85. 前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000116
    であり、前記結合パートナーがＳＤＭＡに対する抗体である、請求項８０に記載のスライド。
  86. ポリウレタン、セルロース、およびこれらの混合物からなる群から選択される第３のポリマーを含む第３の層をさらに含み、前記第３の層が前記第２の層の上にコーティングされている、請求項８０に記載のスライド。
  87. 前記ポリウレタンが前記第３の層の約４０重量％～約９５重量％の範囲の量で存在し、前記セルロースが前記第３の層の約５重量％～約６０重量％の範囲の量で存在する、請求項８６に記載のスライド。
  88. 前記第３の層の厚さが約５μｍ～約５０μｍの範囲である、請求項８６に記載のスライド。
  89. セルロースおよび親水性ポリマーを含む第４の層をさらに含み、前記第４の層が前記第３の層の上にコーティングされている、請求項８６に記載のスライド。
  90. 前記親水性ポリマーがポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、およびこれら混合物からなる群から選択される、請求項８９に記載のスライド。
  91. 前記第４の層がポリビニルピロリドンをさらに含む、請求項９０に記載のスライド。
  92. 前記セルロースが約５０重量％～約９８重量％の範囲の量で存在する、請求項８９に記載のスライド。
  93. 前記セルロースが前記第４の層の約５０重量％～約９８重量％の範囲の量で存在し、前記ポリビニルピロリドンが前記第４の層の約１重量％～約３０重量％の範囲の量で存在する、請求項９１に記載のスライド。
  94. 前記第４の層の厚さが約２５μｍ～約２５０μｍの範囲である、請求項８６に記載のスライド。
  95. ポリウレタンを含む第５の層をさらに含み、前記第５の層が前記第１の層と前記第２の層との間に配置されている、請求項８０、８６および８９に記載のスライド。
  96. 前記第５の層の厚さが約１μｍ～約２０μｍの範囲である、請求項９５に記載のスライド。
  97. ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、シリコーン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、およびこれらの混合物からなる群から選択される第６のポリマーに分散したカーボンブラックを含む第６の層をさらに含み、前記第６の層が前記第３の層と前記第４の層との間に配置されている、請求項９５に記載のスライド。
  98. カーボンブラックの量が前記第６の層の約１０重量％～約４０重量％の範囲である、請求項９７に記載のスライド。
  99. 前記第６の層が約５μｍ～約３０μｍの範囲の厚さを有する、請求項９７に記載のスライド。
  100. ポリウレタン、ポリエチレンオキシド、シリコーン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、およびこれらの混合物からなる群から選択される第７のポリマーに分散した酸化チタンを含む第７の層をさらに含み、前記第７の層が前記第２の層と前記第３の層との間に配置されている、請求項９５に記載のスライド。
  101. 前記酸化チタンが前記第７の層の約２０重量％～約６０重量％の範囲の量で存在する、請求項１００に記載のスライド。
  102. 前記第７の層の厚さが約５０μｍ～約２５０μｍの範囲である、請求項１００に記載のスライド。
  103. 前記酸化チタンが約２０μｍ未満の平均粒径を有する粒子として提供される、請求項１００に記載のスライド。
  104. 前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000117
    であり、前記結合パートナーがＳＤＭＡに対する抗体である、請求項８６に記載のスライド。
  105. 前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000118
    であり、前記結合パートナーがＳＤＭＡに対する抗体である、請求項８９に記載のスライド。
  106. 前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000119
    であり、前記結合パートナーがＳＤＭＡに対する抗体である、請求項９５に記載のスライド。
  107. 前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000120
    であり、前記結合パートナーがＳＤＭＡに対する抗体である、請求項９７に記載のスライド。
  108. 前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000121
    であり、前記結合パートナーがＳＤＭＡに対する抗体である、請求項１００に記載のスライド。
  109. 試料中の分析物の存在または量を決定する方法であって、
    試料を請求項８０から１０８のいずれか一項に記載のスライドの最上層に堆積させ、前記スライドの前記最上層が前記第１の層から最も遠い層であるステップと；
    前記スライドの前記第１の層を第１の波長で偏光されていない光で照射するステップと；
    前記スライドの前記第１の層からの前記第２の波長で放出される光の強度を測定するステップと
    を含み、
    前記第２の波長で放出される光の強度が前記試料中の前記分析物の濃度に比例し、
    前記スライドの前記第１の層が前記第１の波長および前記第２の波長に対して光学的に透明であり、
    前記結合パートナーが前記分析物に特異的である、方法。
  110. 分離ステップを伴わない、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記分析物がＳＤＭＡであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000122
    であり、前記結合パートナーがＳＤＭＡに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  112. 前記ＳＤＭＡに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
  114. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０である、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記第１の波長が約４９０ｎｍであり、前記第２の波長が約５２０ｎｍである、請求項１１１に記載の方法。
  116. 前記分析物がメラミンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000123
    からなる群から選択され、前記結合パートナーがメラミンに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  117. 前記メラミンに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記分析物がビオチンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000124
    であり、前記結合パートナーがビオチンに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  120. 前記ビオチンに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記分析物がチロキシンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000125
    からなる群から選択され、前記結合パートナーがチロキシンに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  123. 前記チロキシンに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記分析物がアモキシシリンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000126
    であり、前記結合パートナーがアモキシシリンに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  126. 前記アモキシシリンに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記分析物がアンピシリンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000127
    であり、前記結合パートナーがアンピシリンに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  129. 前記アンピシリンに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記分析物がセフォタキシムであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000128
    であり、前記蛍光パートナーがセフォタキシムに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  132. 前記セフォタキシムに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記分析物がスルファジメトキシンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000129
    からなる群から選択され、前記結合パートナーがスルファジメトキシンに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  135. 前記スルファジメトキシンに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記分析物がコルチゾールであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000130
    であり、前記結合パートナーがコルチゾールに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  138. 前記コルチゾールに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１３８に記載の方法。
  140. 前記分析物がプロゲステロンであり、前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000131
    であり、前記結合パートナーがプロゲステロンに対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  141. 前記プロゲステロンに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１４１に記載の方法。
  143. 順番に：
    （ｉ）ポリエステルを含む第１の層と、
    （ｉｉ）ポリウレタンを含む第２の層と、
    （ｉｉｉ）
    （ａ）前記第２の層の約５７重量％の量のセルロース、
    （ｂ）前記第２の層の約２８重量％の量のプルラン、
    （ｃ）前記第２の層の約１３重量％の量のＨＥＰＥＳ緩衝液であって、その水溶液が約８のｐＨを有するＨＥＰＥＳ緩衝液、
    （ｄ）前記第２の層の約１．１７重量％の量の非イオン性界面活性剤、
    （ｅ）前記第２の層の約１．０×１０－３重量％の量の構造：
    Figure 2023521886000132
    を有する蛍光トレーサー、および
    （ｆ）前記第２の層の約１．４×１０－２重量％の量のＳＤＭＡに対する抗体
    を含む第３の層と、
    （ｉｖ）第４の層の約２０重量％の量のセルロース、第４の層の約３８重量％の量のポリウレタン、および第４の層の約４２重量％の量の二酸化チタンを含む第４の層と、
    （ｖ）第５の層の約７６重量％の量のポリウレタンに分散した第５の層の約２４重量％の量のカーボンブラックを含む第５の層と、
    （ｖｉ）第６の層の約８３重量％の量のセルロース、第６の層の約０．４重量％の量のテトラメチルアンモニウムヒドロキシド、第６の層の約０．５重量％の量のポリアクリル酸、および第６の層の約１６重量％の量のポリビニルピロリドンを含む第６の層と
    を含むスライド。
  144. 前記第１の層の厚さが約７５μｍであり、前記第２の層の厚さが約４μｍであり、前記第３の層の厚さが約３５μｍであり、前記第４の層の厚さが約２０μｍであり、前記第５の層の厚さが約１４μｍであり、前記第６の層の厚さが約１００μｍである、請求項１４３に記載のスライド。
  145. 試料中の対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）の存在または量を決定する方法であって、
    （ｉ）ＳＤＭＡを含有することが疑われる試料を用意するステップと、
    （ｉｉ）前記試料を請求項１４４または１４５に記載のスライドの前記第６の層と接触させるステップと、
    （ｉｉｉ）前記スライドの前記第１の層を第１の波長で偏光されていない光で照射するステップと；
    （ｉｖ）第２の波長で放出される光の強度を測定するステップと
    を含む方法。
  146. 前記第１の波長が約４９０ｎｍであり、前記第２の波長が約５２０ｎｍである、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記蛍光トレーサーおよび結合パートナーが、前記蛍光トレーサーと結合パートナーを含む複合体として存在する、請求項８０に記載のスライド。
  148. 前記蛍光トレーサーが４’－置換フルオレセイントレーサーである、請求項８０、８６、および８９、９５、または１００のいずれか一項に記載のスライド。
  149. 前記蛍光トレーサーが４’－置換フルオレセイントレーサーである、請求項１０９に記載の方法。
  150. 前記蛍光トレーサーが４’－置換フルオレセイントレーサーである、請求項３１または３２に記載の方法。
  151. （ｉ）蛍光トレーサーと結合パートナーを含む複合体と、（ｉｉ）プルランを含むポリマーとを含むマトリックスであって、前記複合体が前記ポリマーに分散している、マトリックス。
  152. 前記ポリマーがセルロースをさらに含む、請求項１５１に記載のマトリックス。
  153. マトリックスの約１重量％～約６０重量％の量のプルランを含む、請求項１５１に記載のマトリックス。
  154. 前記セルロースが約３０重量％～約９０重量％の量で存在する、請求項１５２または１５３に記載のマトリックス。
  155. 水を実質的に含まない、請求項１５１から１５４のいずれか一項に記載のマトリックス。
  156. 前記分析物がタンパク質であり、前記蛍光トレーサーが前記タンパク質に付着した蛍光部分であり；前記結合パートナーが前記タンパク質に対する抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  157. 前記タンパク質に対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１５６に記載の方法。
  158. 前記クエンチャーがＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、ＢＨＱ１０、およびＢＯＤＩＰＹからなる群から選択される、請求項１５７に記載の方法。
  159. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０およびＢＯＤＩＰＹからなる群から選択される、請求項１５８に記載の方法。
  160. 前記分析物がシスタチン－Ｂであり、前記蛍光トレーサーが前記シスタチン－Ｂに付着した蛍光部分であり；前記結合パートナーが抗シスタチン－Ｂ抗体である、請求項１０９に記載の方法。
  161. 前記抗シスタチン－Ｂ抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１６０に記載の方法。
  162. 前記クエンチャーがＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、ＢＨＱ１０、およびＢＯＤＩＰＹからなる群から選択される、請求項１６１に記載の方法。
  163. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０およびＢＯＤＩＰＹからなる群から選択される、請求項１６２に記載の方法。
  164. 前記蛍光部分がフルオレセインである、請求項１６０に記載の方法。
  165. 前記フルオレセインが１個または複数のリジン残基を通して前記シスタチン－Ｂにコンジュゲートしている、請求項１６４に記載の方法。
  166. 前記フルオレセインが１個または複数のシステイン残基を通して前記シスタチン－Ｂにコンジュゲートしている、請求項１６４に記載の方法。
  167. 前記蛍光部分がフルオレセインにコンジュゲートしたＣｙｓＢ－ペプチド９である、請求項１６０に記載の方法。
  168. 前記フルオレセインが１個または複数のリジン残基を通して前記ＣｙｓＢ－ペプチド９にコンジュゲートしている、請求項１６７に記載の方法。
  169. 前記結合パートナーが、１個もしくは複数のＢＨＱ１０分子または１個もしくは複数のホウ素－ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）分子にコンジュゲートしている抗シスタチン－Ｂ抗体である、請求項１６４に記載の方法。
  170. 前記結合パートナーが、１個もしくは複数のＢＨＱ１０分子または１個もしくは複数のホウ素－ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）分子にコンジュゲートしている抗シスタチン－Ｂ抗体である、請求項１６５に記載の方法。
  171. 前記結合パートナーが、１個もしくは複数のＢＨＱ１０分子または１個もしくは複数のホウ素－ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）分子にコンジュゲートしている抗シスタチン－Ｂ抗体である、請求項１６６に記載の方法。
  172. 前記結合パートナーが、１個もしくは複数のＢＨＱ１０分子または１個もしくは複数のホウ素－ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）分子にコンジュゲートしている抗シスタチン－Ｂ抗体である、請求項１６７に記載の方法。
  173. 前記結合パートナーが、１個もしくは複数のＢＨＱ１０分子または１個もしくは複数のホウ素－ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）分子にコンジュゲートしている抗シスタチン－Ｂ抗体である、請求項１６８に記載の方法。
  174. 前記分析物がタンパク質であり、前記蛍光トレーサーが抗タンパク質抗体に付着した蛍光部分であり；前記結合パートナーが１個または複数のクエンチャーにコンジュゲートしたタンパク質である、請求項１０９に記載の方法。
  175. 前記クエンチャーがＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、ＢＨＱ１０、およびＢＯＤＩＰＹからなる群から選択される、請求項１７４に記載の方法。
  176. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０およびＢＯＤＩＰＹからなる群から選択される、請求項１７５に記載の方法。
  177. 前記分析物がシスタチン－Ｂであり、前記蛍光トレーサーが抗Ｃシスタチン－Ｂ抗体に付着した蛍光部分であり；前記結合パートナーが１個または複数のクエンチャーにコンジュゲートしているシスタチン－Ｂである、請求項１０９に記載の方法。
  178. 前記クエンチャーがＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、ＢＨＱ１０、およびＢＯＤＩＰＹからなる群から選択される、請求項１７７に記載の方法。
  179. 前記クエンチャーがＢＨＱ１０およびＢＯＤＩＰＹからなる群から選択される、請求項１７８に記載の方法。
  180. 前記蛍光トレーサーが、抗ＣｙｓＢ抗体をフルオレセイン－ＮＨＳまたはフルオレセインアルデヒドと反応させることによって得られる、請求項１７７に記載の方法。
  181. 前記蛍光トレーサーが、抗ＣｙｓＢ抗体をフルオレセイン－ＮＨＳまたはフルオレセインアルデヒドと反応させることによって得られる、請求項１７８に記載の方法。
  182. 前記蛍光トレーサーが、抗ＣｙｓＢ抗体をフルオレセイン－ＮＨＳまたはフルオレセインアルデヒドと反応させることによって得られる、請求項１８１に記載の方法。
  183. 試料中の分析物の存在または量を決定する方法であって、
    （ｉ）分析物を含有することが疑われる試料を用意するステップと；
    （ｉｉ）前記試料を蛍光トレーサーおよび結合パートナーと接触させてアッセイ組成物を得るステップであって、前記結合パートナーは前記分析物および前記蛍光トレーサーに特異的である、ステップと；
    （ｉｉｉ）前記アッセイ組成物を第１の波長の光で照射するステップと；
    （ｉｖ）第２の波長で放出される光の強度を測定するステップと
    を含み、
    前記第２の波長で放出される光の強度が前記試料中の前記分析物の濃度に比例している、方法。
  184. 前記分析物が高分子である、請求項１８３に記載の方法。
  185. 前記分析物がタンパク質である、請求項１８４に記載の方法。
  186. （ｉ）前記蛍光トレーサーがアミノ酸鎖に付着した蛍光部分であり、前記アミノ酸鎖の長さが前記タンパク質のアミノ酸長より短く、前記アミノ酸鎖のアミノ酸配列が前記結合パートナーとの複合体化を担う前記タンパク質上のエピトープのアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）前記結合パートナーが場合によりクエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１８５に記載の方法。
  187. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項１８６に記載の方法。
  188. 前記結合パートナーが抗体である、請求項１８６に記載の方法。
  189. 前記タンパク質がイヌＣｙｓＢタンパク質およびイヌＮＴ－プロＢＮＰからなる群から選択される、請求項１８６に記載の方法。
  190. 前記タンパク質がイヌＣｙｓＢタンパク質である、請求項１８９に記載の方法。
  191. 前記結合パートナーが抗シスタチン－Ｂ抗体であり、前記蛍光トレーサーが配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列に付着したフルオレセインである、請求項１９０に記載の方法。
  192. 前記アミノ酸配列が前記フルオレセインの５位に付着している、請求項１９１に記載の方法。
  193. 前記アミノ酸配列が－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－リンカーにより前記フルオレセインの５位に付着している、請求項１９２に記載の方法。
  194. 前記抗シスタチン－Ｂ抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１９２に記載の方法。
  195. 前記アミノ酸配列が前記フルオレセインの４’位に付着している、請求項１９１に記載の方法。
  196. 前記アミノ酸配列が－ＣＨ２－リンカーにより前記フルオレセインの４’位に付着している、請求項１９５に記載の方法。
  197. 前記抗シスタチン－Ｂ抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１９５に記載の方法。
  198. 前記アミノ酸配列が前記フルオレセインの５位に付着している、請求項１８６に記載の方法。
  199. 前記アミノ酸配列が－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－リンカーにより前記フルオレセインの５位に付着している、請求項１９８に記載の方法。
  200. 前記抗シスタチン－Ｂ抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項１９８に記載の方法。
  201. 前記第１の波長の光が直線偏光されていない、請求項１８３に記載の方法。
  202. 前記分析物が抗原であり、前記結合パートナーが抗体である、請求項２０１に記載の方法。
  203. 前記抗原がＳＤＭＡであり、前記抗体がＳＤＭＡに対する抗体である、請求項２０２に記載の方法。
  204. 前記蛍光トレーサーが、
    Figure 2023521886000133
    （式中、Ｘは－Ｈ、－Ｆ、－ＣＨ３、－ＯＣＨ３、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、－ＣＯＯＨ、および－ＳＯ３Ｈからなる群から選択される）
    からなる群から選択される、請求項２０３に記載の方法。
  205. 前記ＳＤＭＡに対する抗体が、クエンチャーにコンジュゲートしている、請求項２０４に記載の方法。
  206. 前記クエンチャーが、ＣＹ３、ＣＹ５、ＩＲＤｙｅＱＣ１、ＢＨＱ１、およびＢＨＱ１０からなる群から選択される、請求項２０５に記載の方法。
  207. Figure 2023521886000134
    からなる群から選択される化合物。
  208. （Ａ）順次に、
    （ｉ）ガラス、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース誘導体、ポリエチレンテレフタレート、およびこれらの混合物からなる群から選択される支持層であって、
    前記第１の波長および前記第２の波長に対して光学的に透明である、支持層；
    （ｉｉ）ポリウレタンを含むプライマー層；
    （ｉｉｉ）第２のポリマーに分散した前記蛍光トレーサーおよび前記結合パートナーを含むインジケーター層であって、前記第２のポリマーがセルロース、セルロース誘導体、多糖、ゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アクリルアミドポリマー、ポリウレタン、アルギネート、キサンタム、およびこれらの混合物からなる群から選択される、インジケーター層；
    （ｉｖ）ポリウレタンおよびセルロースを含むフィルタリング層；および
    （ｖ）セルロースと親水性ポリマーの混合物を含む拡散層であって、前記親水性ポリマーがポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、およびポリエチレンイミンからなる群から選択される、拡散層
    を含むスライドを用意するステップと；
    （Ｂ）前記試料を前記スライドの前記拡散層に堆積させるステップと；
    （Ｃ）前記スライドの前記支持層を第１の波長で偏光されていない光で照射するステップと；
    （Ｄ）前記スライドの前記支持層から前記第２の波長で放出される光の強度を測定するステップと
    を含む、請求項２０１に記載の方法。
  209. 前記抗原がＳＤＭＡであり、前記抗体がＳＤＭＡに対する抗体である、請求項２８に記載の方法。
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