JPH05126829A

JPH05126829A - 免疫グロブリンのイムノアツセイ

Info

Publication number: JPH05126829A
Application number: JP8097292A
Authority: JP
Inventors: John J Rejman; ジエイ．レジマンジヨン; Litai Weng; ウエングリタイ; Rudolph Varro; バーロルドルフ
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1991-04-03
Filing date: 1992-04-02
Publication date: 1993-05-21
Also published as: CA2064972A1; EP0507587A2; EP0507587A3

Abstract

(57)【要約】【目的】１）受容体結合支持体はすべてのアッセイに
共通である。２）溶液相における抗体への被検物質の結
合は、固体表面上に固定化された抗体によって達成され
る場合に比較して極めて急速な反応速度を生じる。３）
分離インキュベーションおよび分離洗浄の必要性の排除
により、最小数の手操作工程で効率的なアッセイが提供
される。【構成】免疫グロブリンのイムノアッセイを実施する
方法においては、免疫グロブリンの含有が疑われるサン
プルおよび興味ある免疫グロブリンの検出に有用な試薬
を水性メジウム中に一工程で混合し、この場合、一つの
試薬は免疫グロブリンに対する受容体に結合した小分子
を包含し、一つの試薬は免疫グロブリンに結合できる抗
原を包含し、一つの試薬は免疫グロブリンの結合部位と
は異なる抗原上の部位に結合できる抗原に対する受容体
に結合したシグナル発生手段を包含する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景１．発明の分野免疫グロブリンは、抗体として機能し、生体にとって異
物である分子の存在に応答して免疫適格生物体（すなわ
ち、完全な免疫系を有する生物体）の分化した細胞（β
−リンパ球）によって産生される蛋白質の総称である。

【０００２】免疫グロブリン（Ｉｇ）には、それらの化
学構造およびそれらが免疫系において行う様々な機能に
基づいて５つのクラスに分類される。すなわち、Ｉｇ
Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭである。診断
的な観点からは、生体が抗原物質に暴露されて最初に血
清中に出現することから、興味深いものはＩｇＭであ
る。

【０００３】したがって、免疫グロブリンとくにＩｇＭ
の存在を確認するイムノアッセイは、感染の早期診断に
有用である。肝炎は、免疫グロブリンの検出に基づくイ
ムノアッセイが有用な感染疾患である。このようなアッ
セイは、純粋に診断の手段としてのみでなく、血液の輸
血前スクリーニングおよび血液ドナーとしての適性のス
クリーニングにも有用である。Ａ型肝炎もしくは伝染性
肝炎は、全世界で散発的にまたは流行的に再発を繰り返
す傾向がある。Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）の存在は通
常、急性期のまたは最近罹患した患者の血清中のＩｇＭ
抗体の存在をラジオイムノアッセイまたは酵素イムノア
ッセイによって証明することにより、確立される。Ｂ型
肝炎もしくは血清肝炎も世界的に発症し、薬物濫用者に
共通して認められ、この疾患は皮下注射針を共用するこ
とによって媒介される。Ｂ型肝炎は通常、ウイルス抗原
の存在によって確認される。Ｂ型肝炎ウイルス表面抗
原、コア抗原、およびこれらの抗原に対する抗体用のア
ッセイキットが市販されている。

【０００４】２．関連技術の説明米国特許第４，２９２，４０３号は、結合抗−Ｉｇをサ
ンプルとインキュベートし、ついでＩｇに結合できる抗
原とインキュベートし、最後に標識抗−抗原フラグメン
トとインキュベートするＩｇイムノアッセイに関するも
のである。各インキュベーション後に洗浄工程が行わ
れ、抗体は共有結合または吸着による固体担体へのカッ
プリングで結合される。

【０００５】米国特許第４，２７３，７５６号は、結合
抗−Ｉｇを試験サンプルと接触させ、洗浄しついでＩｇ
に結合できる標識抗原と反応させるＩｇアッセイが記載
されている。

【０００６】米国特許第４，０２０，１５１号は、サン
プル中のＩｇをまず非免疫学的表面上に直接吸着させ、
ついで標識抗−Ｉｇと反応させるＩｇアッセイに関する
ものである。

【０００７】米国特許第４，８３７，１６７号には、高
アフィニティーモノクローナル抗−Ｉｇを用いて多重決
定抗原を定量するための同時サンドイッチアッセイが記
載されている。

【０００８】Ｂｒａｄｌｅｙら：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．５（５）：５２１−５３０（１９７７）
には、ＨＡＶおよび放射標識ＩｇＧ抗−ＨＡＶを、Ｉｇ
Ｍの含有が疑われる患者血清で被覆した試験管に添加す
る、ＨＡＶ関連ＩｇＭクラス免疫グロブリンのアッセイ
が記載されている。

【０００９】米国特許第４，４７４，８７８号は、サン
プルを結合抗体とインキュベートし、ついで酵素標識抗
体とインキュベートする肝炎抗原のサンドイッチ酵素イ
ムノアッセイに関するものである。

【００１０】米国特許第４，８１８，６８８号には、標
識抗体をサンプル中の抗体と固定化Ｂ型肝炎コア抗原
（ＨＢｃＡｇ）への結合に対して競合させる、ＨＢｃＡ
ｇに対する抗体のアッセイが記載されている。

【００１１】米国特許第４，０９８，８７６号は、サン
プルを標識抗体とインキュベートし、ついで固定化抗体
とインキュベートする肝炎関連抗原の逆サンドイッチア
ッセイに関するものである。

【００１２】Ｂｕｓｓｉａｎら：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．
３４（６）：１３１５（１９８８）には、ＨＡＶ対する
ＩｇＭ抗体のアッセイが記載されている。すなわち、サ
ンプルを、ビオチン化抗−ＩｇＭとインキュベートし、
ついでストレプトアビジン被覆固相とインキュベート
し、複合体を洗浄してからＨＡＶと混合し、新しい複合
体を洗浄したのち標識抗−ＨＡＶと混合するものであ
る。

【００１３】米国特許第４，２７１，１４０号は、ビオ
チンとアビジンに非免疫性、可逆的結合系を形成させ
る、ビオチンとアビジンの二重受容体複合体における使
用に関するものである。

【００１４】米国特許第４，２９８，６８５号には、サ
ンプル中に存在する被検物質を抗体に対する結合で非標
識被検物質と競合させる、アビジン被覆固相に結合した
ビオチン化抗体の使用が記載されている。

【００１５】米国特許第４，９３５，３３９号は、ビオ
チン化された第一の免疫学的結合パートナー、試験サン
プル、標識された第二の免疫学的結合パートナーおよび
担体に結合したビオチン結合蛋白質のすべてを混合する
ワンステップイムノアッセイに関するものである。

【００１６】米国特許第４，３４３，８９６号には、同
一の抗原に対して産生された異なる動物種からの２つの
抗体を使用し、一方の抗体は標識し、他方の抗体は第三
の抗体によって不溶化するアッセイが記載されている。

【００１７】１９９１年２月４日出願の米国特許出願第
０７／３８９，６５９号（欧州特許公告第４１１，９４
５号、日本特許出願第２０６６２８／９０号、カナダ特
許出願第２，０２２，５１７−３号に対応）は、特異的
結合対構成要素に結合した小分子と第二の特異的結合対
構成要素に結合した第二の小分子を使用し、両特異的結
合対構成要素が被検物質に結合可能なイムノアッセイに
関するものである。このアッセイでは、支持体に結合し
た第一の小分子に対する受容体および標識に結合した第
二の小分子に対する受容体も使用される。

【００１８】発明の要約以下の成分、すなわち、興味ある免疫グロブリンの含有
が疑われるサンプル、その免疫グロブリンに対する受容
体に結合した小分子、その免疫グロブリンに結合できる
抗原、その免疫グロブリンの結合部位とは異なる抗原上
の部位でその抗原に結合できるその抗原に対する受容体
に結合したシグナル発生手段、および上記小分子に対す
る受容体が結合する支持体を前もってインキュベーショ
ンを行うことなく水性メジウム中に混合し、インキュベ
ートすることによる、特定の免疫グロブリンの定量的イ
ムノアッセイを実施する方法が提供される。ついで、メ
ジウムを支持体から分離する。サンプル中の免疫グロブ
リンの存在または量に関連するシグナル発生手段の存在
または量を、メジウムまたは支持体について観察する。

【００１９】本発明の他の態様では、以下の成分、すな
わち、ＩｇＭの含有が疑われるサンプル、１ｇＭに結合
できるビオチン化抗体、ＩｇＭに結合できる抗原とシグ
ナル発生手段に結合する抗体との抗原：抗体複合体、お
よび支持体に結合したビオチンに対する受容体を、前も
ってインキュベーションを行うことなく水性メジウム中
に混合し、インキュベートすることによる、ＩｇＭ型免
疫グロブリンのイムノアッセイを実施する方法が提供さ
れる。ついで、メジウムを支持体から分離する。サンプ
ル中のＩｇＭの存在または量に関連するシグナル発生手
段の存在または量を、メジウムまたは支持体について観
察する。

【００２０】本発明のさらに他の態様では、サンプル中
の存在が疑われるＩｇＭ型免疫グロブリンを検出するた
めのアッセイにおいて、上記サンプル中の上記ＩｇＭの
量に直接関連して、複合体標識−Ａｂ_Ag：Ａｇ：ＩｇＭ：Ａｂ_IgM−Ｘ：Ｙ−支持
体［式中、標識−Ａｂ_Agは標識に結合した抗原（Ａｇ）に
対する抗体であり、ＡｇはＩｇＭに結合できる抗原であ
って、Ａ型肝炎ウイルス抗原およびＢ型肝炎コア抗原か
らなる群より選ばれ、Ａｂ_IgM−Ｘは上記ＩｇＭに対す
る抗体に結合した小分子（Ｘ）であり、Ｙ−支持体は支
持体に結合した小分子に対する受容体である］を生成さ
せるアッセイが提供される。

【００２１】本発明の他の態様では、免疫グロブリンに
結合したビオチン化抗体の接合体、その免疫グロブリン
に結合した抗原、およびその抗原に結合した標識抗体か
らなる組成物が提供される。

【００２２】本発明のさらに他の態様では、式標識−Ａｂ_Ag：Ａｇ：ＩｇＭ：Ａｂ_IgM−Ｘ：Ｙ−支持
体［式中、標識−Ａｂ_Agは標識に結合した抗原（Ａｇ）に
対する抗体であり、ＩｇＭはＩｇＭ型免疫グロブリンで
あり、ＡｇはＩｇＭに結合できる抗原であって、Ａ型肝
炎ウイルス抗原およびＢ型肝炎コア抗原からなる群より
選ばれ、Ａｂ_1gM−Ｘは上記ＩｇＭに対する抗体に結合
した小分子（Ｘ）であり、Ｙ−支持体は支持体に結合し
た小分子に対する受容体である］表される組成物が提供
される。

【００２３】本発明の他の態様では、免疫グロブリンの
イムノアッセイを実施するためのキットにおいて、小分
子と上記免疫グロブリンに対する受容体の接合体、上記
免疫グロブリンに結合できる抗原、標識と上記抗原に対
する受容体の接合体、および上記小分子に対する受容体
が表面に結合した支持体をパッケージとしたキットが提
供される。

【００２４】発明の詳細な説明本発明は一般的に特定の免疫グロブリン（Ｉｇ）、好ま
しくはＩｇＭクラス、とくにＢ型肝炎コア抗原およびＡ
型肝炎ウイルス抗原に対するＩｇＭのワンステップ同時
イムノアッセイを提供する。Ｉｇ被検物質、抗原：抗体
複合体および抗−Ｉｇ抗体−小分子複合体の間に複合体
を形成させる。小分子は、複合体を、支持体に結合した
小分子に対する受容体によって不溶化することを可能に
する。試薬はすべて前もってインキュベーションするこ
となくアッセイメジウム中に一緒に混合し、ついでイン
キュベートする。この１回のインキュベーション後に洗
浄工程を行い、ついでシグナル生成系の残った構成要素
があれば添加する。抗原：抗体複合体はアッセイメジウ
ムへの添加の前に形成させても、またアッセイメジウム
中で形成させてもよい。

【００２５】本発明にはいくつかの利点がある。一つの
利点は、現在の技術水準に共通してみられる数多くのイ
ンキュベーションおよび洗浄工程の排除である。これら
のいくつかの工程の排除は労力集約性の低いアッセイフ
ォーマットを提供するものである。場合によっては、本
発明はわずかながら多量の試薬を使用するが、これは労
力の節約の利点によって十二分に補われるものである。
他の利点は、いくつかのインキュベーションおよび洗浄
工程の排除により、本発明はアッセイ時間の短縮をもた
らす点にある。いくつものインキュベーションおよび洗
浄工程の排除にもかかわらず、驚くべきことに、被検物
質の検出を可能にする適切なシグナルを得ることができ
る。

【００２６】本発明の特定の実施態様についてさらに説
明する前に、多くの用語について定義する。

【００２７】「免疫グロブリン」は、興味ある物質であ
るサンプル中の測定すべき化合物、すなわち被検物質で
ある。サンプルは好ましくは血清または血漿である。免
疫グロブリン（Ｉｇ）は、疾患状態の病原体に対して産
生されるものであってよい。免疫グロブリンは、特定の
クラスのものであってよく、たとえばＩｇＡ、ＩｇＤ、
ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭで、一般的に、分子量は約
１６０，０００から約１０⁶まで変動する。本明細書に
おいて用いられる「免疫グロブリン」の語は被検物質を
指すものとし、「抗体」の語は試薬を指して用いられる
ものとする。

【００２８】「抗原」は興味ある免疫グロブリンに結合
できる任意の化合物を意味し、それに対する抗体を産生
させることができる。抗原は、たとえば、Ｂ型肝炎コア
抗原またはＡ型肝炎ウイルス抗原であってよい。

【００２９】「リガンド」は、それに対する受容体が天
然に存在するかまたは調製できる任意の有機化合物を意
味する。

【００３０】「受容体」は、分子の特定の空間的および
極性的構成、たとえばエピトープまたは決定部位を認識
できる任意の化合物または組成物を意味する。受容体の
例には、天然に存在する受容体、たとえばサイロキシン
結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レ
クチン、プロテインＡ、補体成分Ｃｌｑ、アビジン、ス
トレプトアビジン等が包含される。小分子がビオチンで
あるならば、ビオチンに対する抗体は好ましくはアビジ
ンまたはストレプトアビジンである。

【００３１】「支持体」は任意の非多孔性または多孔性
表面を意味する。典型的な支持体表面には、ガラスもし
くはプラスチックビーズ、ラテックスもしくはセルロー
ス粒子、ガラスもしくはセルロースフィルターペーパ
ー、ニトロセルロース膜、ポリスチレンプレート、磁性
粒子、プラスチックチューブもしくは容器等が包含され
る。支持体は、受容体が非拡散的に結合可能で、水性メ
ジウムに溶解せず、また水性メジウムと有害な反応をし
ない任意の便利な材料から作られる。通常、支持体は、
プラスチックたとえば、ポリスチレン、ポリカルボネー
ト、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニ
ル、テフロン等であり、また金属材料たとえばスチー
ル、ニッケル、銅、金、二酸化クロムであってもよく、
たとえば石英、ガラス等を含めたセラミックであること
が好ましい。支持体がビーズのマトリックスである場合
は、ビーズは通常、所定のほぼ均一なサイズ、好ましく
は０．２〜２．５mmとし、表面は粗面または平滑面と
し、好ましくは平滑面とする。ビーズは、円形または楕
円形であることが好ましく、通常はほぼ球状で、非特異
的結合を最小にする表面性を有する。本発明のイムノア
ッセイに用いられる場合、支持体はそれに、受容体のよ
うな物質、好ましくは、たとえば抗体、アビジン、アポ
酵素、リプレッサー蛋白質、内因子等を結合させること
になる。

【００３２】支持体または表面への物質の結合は、一般
的に文献にみられるよく知られた技術で行うことができ
る。たとえば、“ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＥｎｚｙｍ
ｅｓ”，ＩｃｈｉｒｏＣｈｉｂａｔａ，Ｈａｌｓｔｅ
ｄＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９７８）および
Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２４５：３０５９（１９７０）が参考になる。表面は多
くの形状のうちの任意のものであってよく、たとえば、
ストリップ、ロッド、粒子たとえばビーズ等である。

【００３３】表面は通常、多官能性であるかもしくは多
官能化可能であるか、またはたとえば共有結合的もしく
は非共有結合的相互作用により受容体に結合可能であ
る。広範囲の官能基が利用でき、また導入できる。官能
基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ
基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基等が包
含される。広範囲の化合物の粒子への結合様式はよく知
られていて、文献に詳細に例示されている。たとえば、
Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２４５：３０５９（１９７０）が参考になる。物質に連
結する連結基の長さは、連結される物質の性質、連結さ
れる物質と粒子の間の距離の配列のハイブリダイゼーシ
ョンに対する効果等に応じて、きわめて広範囲に変動さ
せることができる。連結される物質は実質的に、粒子の
外表面に結合される。

【００３４】表面として使用される粒子は、それ自体
が、または慣用方法で粒子に蛍光性化合物または蛍光体
を結合させることにより、蛍光性であってもよい。蛍光
体は通常、粒子中に溶解させるかまたは共有結合もしく
は非共有結合によって粒子に結合させ、多くの場合、粒
子を通じて実質的に均一に結合される。蛍光化ラテック
ス粒子は米国特許第３，８５３，９８７号に教示されて
いる。

【００３５】「小分子」は、分子量１００〜２０００、
好ましくは１５０〜１０００の有機または有機金属基
で、通常、受容体または支持体に結合していて、それに
対する受容体が天然に存在するかまたは調製できる。本
発明に有用な小分子の例には、ビオチンの誘導体、リゼ
ルグ酸、プルシン、フルオレセイン、ビタミンＢ₁₂、お
よび検定すべきサンプル中には通常高濃度には認められ
ない一般分子が包含される。生物学的サンプルには、高
毒性分子および薬剤以外の合成的に誘導される分子が多
くの場合好ましい。

【００３６】「シグナル発生手段」は、その成分の少な
くとも１つが、サンプル中の免疫グロブリンの存在また
は量に関連するシグナルを生成する標識である１種また
は２種以上の成分を意味する。シグナル発生手段には、
測定可能なシグナルの生成に必要なすべての試薬が包含
される。標識は同位元素または非同位元素であって、通
常は非同位元素であり、触媒たとえば酵素、色原体たと
えば蛍光体、染料もしくは化学発光体、金属粒子等が包
含される。標識は、直接抗原に対する受容体に接合させ
ることも、また小分子に対する受容体に接合させ、小分
子を抗原に対する受容体に接合させることもできる。シ
グナル発生手段の成分は、化学発光体、放射性物質、補
酵素、酵素生成物と反応する物質、酵素、および触媒、
固体粒子、蛍光体、色原体、金粒子等である。シグナル
発生手段は、外部手段によって、好ましくは粒子の凝集
程度の測定または電磁放射線の使用、望ましくは肉眼検
査によって、検出できるシグナルを提供する。多くの場
合、シグナル発生手段は、色原性基質が酵素的に紫外も
しくは可視領域の光を吸収する染料に変換するような色
原性基質と酵素、リン光体、蛍光体もしくは化学発光
体、放射性原子、電気活性基等を包含する。

【００３７】本発明の方法においては、免疫グロブリン
の含有が疑われるアッセイメジウムに、免疫グロブリン
に対する受容体に結合した小分子、免疫グロブリンに結
合できる抗原、免疫グロブリンの結合部位とは異なる抗
原上の部位で上記抗原の部位に結合できる上記抗原に対
する受容体に結合したシグナル発生手段、および上記小
分子に対する受容体が結合する支持体を包含させる。シ
グナル発生手段は、好ましくは酵素、蛍光体、化学発光
体および金属粒子からなる群より選ばれる標識であり、
とくに好ましくは、標識はペルオキシダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼお
よびＱ−β−レプリカーゼからなる群より選ばれる酵素
である。シグナル発生手段はまた、上記抗原に対する受
容体に結合した第二の小分子と、酵素、蛍光体、化学発
光体および金属粒子からなる群より選ばれる標識に結合
した第二の小分子に対する受容体からなってもよい。こ
の場合、好ましくは、第二の小分子はフルオレセインの
誘導体であり、その小分子に対する受容体は抗体であ
り、標識はペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
ウレアーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群よ
り選ばれる酵素である。

【００３８】同様に、ＩｇＭに結合できるビオチン化抗
体、ＩｇＭに結合できる抗原とシグナル発生手段に結合
する抗体との抗原：抗体複合体、および支持体に結合し
たビオチンに対する受容体を包含させる、本発明のＩｇ
Ｍ型免疫グロブリンのイムノアッセイ法においても、シ
グナル発生手段は、酵素、蛍光体、化学発光体および金
属粒子からなる群より選ばれる標識であり、好ましく
は、標識はペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
ウレアーゼ、アルカリホスファターゼおよびＱ−β−レ
プリカーゼからなる群より選ばれる酵素である。すなわ
ち、シグナル発生手段は、抗体に結合した小分子と、酵
素、蛍光体、化学発光体および金属粒子からなる群より
選ばれる標識に結合した小分子に対する受容体からなっ
てもよく、この場合、好ましくは、小分子はフルオレセ
インの誘導体であり、その小分子に対する受容体は抗体
であり、標識はペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼおよびＱ−β
−レプリカーゼからなる群より選ばれる酵素である。

【００３９】シグナル発生手段は、少なくとも１種の触
媒、通常は酵素と、少なくとも１種の基質を包含し、２
種または３種以上の触媒および複数種の基質を含有させ
ることもできる。この場合、１つの酵素の基質は他の酵
素の生成物とする。シグナル発生手段の操作により、サ
ンプル中の免疫グロブリンの量に関連した検出可能シグ
ナルを与える生成物が生成する。

【００４０】シグナル発生系に使用できる多数の酵素お
よび補酵素が米国特許第４，２７５，１４９号１９〜２
３欄、米国特許第４，３１８，９８０号１０〜１４欄お
よび米国特許第４，８６８，１０４号７欄に指示されて
いる。多数の酵素の組み合わせが米国特許第４，２７
５，１４９号２３〜２８欄に掲げられている。これらの
組み合わせは、本発明に使用できる。

【００４１】とくに興味があるのは、過酸化水素を生成
させる酵素であり、染料前駆体の染料への酸化のための
過酸化水素の使用である。特定の組み合わせとしては、
サッカライドオキシダーゼたとえばグルコースおよびガ
ラクトースオキシダーゼ、または異項環オキシダーゼた
とえばウレアーゼおよびキサンチンオキシダーゼと、染
料前駆体の酸化に過酸化水素を使用する酵素、すなわ
ち、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダ
ーゼ、またはミクロペルオキシダーゼとの組み合わせが
包含される。その他の酵素の組み合わせは上述の引用特
許に記載されている。単一の酵素を標識として使用する
場合には、他の酵素、たとえば、アルカリホスファター
ゼおよびβ−ガラクトシダーゼのようなヒドロラーゼも
使用できる。また、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ル
シフェラーゼのようなルシフェラーゼも使用できる。

【００４２】使用できる補酵素の例にはＮＡＤ［Ｈ］：
ＮＡＤＰ［Ｈ］；ピリドキサールリン酸、ＦＡＤ
［Ｈ］：ＦＭＮ［Ｈ］等、通常サイクル反応に関与する
補酵素が包含される。とくに、米国特許第４，３１８，
９８０号の記載が参考になる。

【００４３】酵素反応の生成物は通常、染料または蛍光
体である。蛍光体の例は多数、米国特許第４，２７５，
１４９号３０〜３１欄に指示されている。

【００４４】シグナル発生系には、少なくとも約５０ｎ
ｍで約５０ミクロン未満、通常少なくとも約１００ｎｍ
で約２５ミクロン未満、好ましくは約０．２〜５ミクロ
ンの直径の不溶性粒子である１種または２種以上の粒子
を包含させることができる。粒子は、有機または無機
の、多孔性または非多孔性の、好ましくは比重が約０．
７〜１．５ｇ／mlと水とほぼ同じで、透明、半透明、ま
たは不透明の物質とすることができる。

【００４５】有機粒子は通常、アッセイメジウム中に容
易に分散される、ポリマー、付加または縮合ポリマーと
する。粒子の表面は、直接または間接的に、オリゴヌク
レオチドまたはｓｂｐ構成要素を結合できるように、吸
着性であるかまたは多官能性化可能である。粒子の性質
については上述の通りである。

【００４６】興味ある蛍光体は、一般的に３５０ｎｍ以
上、通常は４００ｎｍ以上、好ましくは４５０ｎｍ以上
の波長で発光するものである。蛍光体は、高い量子収
量、長いストークスシフトを有し、それらの接合および
使用条件で化学的に安定であることが望ましい。蛍光体
の語は、電磁放射線による活性化または化学的活性化に
際して発光する物質を包含して使用され、蛍光性および
リン光性物質、シンチレーター、ならびに化学発光物質
を包含する。

【００４７】興味ある蛍光体は、主要な官能性により多
様な種類に分類できる。これらの主要な官能性化合物に
は、１−および２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ−ジアミ
ノスチルベン、ピレン、四級フェナンスルジン塩、９−
アミノアクリジン、ｐ，ｐ´−ジアミノスチルベンイミ
ン、アントラセン、オキサカルボキシアニン、メロシア
ニン、３−アミノエクイレニン、ペリレン、ビス−ベン
ゾキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，
２−ベンゾフェナジン、レチナール、ビス−３−アミノ
ピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、
ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミ
ン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンテ
ン、７−ヒドロキシクマリン、４，５−ベンズイミダゾ
ール、フェノキサジン、サリチレート、ストロファンチ
ジン、ポルフィリン、トリアリールメタン、フラピンお
よび希土類キレート酸化物および塩が包含される。蛍光
体の例は米国特許第４，３１８，７０７号７〜８欄に列
挙されている。

【００４８】さらに、直径が少なくとも約５０ｎｍの不
溶性固体粒子で、プローブとポリヌクレオチド被検物質
のハイブリダイゼーションまたは特異的結合対の構成要
素間の特異的結合から生じた距離内の場合、蛍光粒子の
蛍光を消光できるエネルギー吸収粒子もしくは消光粒子
を使用することもできる。消光粒子は蛍光粒子と同種で
も異種でもよいが、通常は異種のものが用いられる。通
常、消光粒子は、距離を粒子の表面から測定して、約５
０Ａ以上、好ましくは約５００Ａ以上、さらに好ましく
は約２０００Ａ以上の距離で実質的な消光を与えるもの
である。

【００４９】光の放射を修飾するためには、多くの様々
種類の粒子が使用できる。とくに興味があるのは、炭素
粒子、たとえば、炭末、煤煙、グラファイト、コロイド
状炭素等である。炭素粒子以外に、金属ゾル、とくに貴
金属の金、銀、および白金のゾルも使用できる。金属由
来の他の粒子としては、硫化鉛、硫化銀もしくは硫化銅
のような金属硫化物、または酸化鉄もしくは酸化銅のよ
うな金属酸化物がある。

【００５０】検出可能なシグナルとしての他の光源に化
学発光体がある。化学発光原には、化学反応によって電
子的に励起され、ついで検出可能なシグナルとして役立
つかまたは蛍光アクセプターにエネルギーを付与する光
を放射する化合物が包含される。

【００５１】多様な条件下に化学発光を与えるいくつか
の化合物群が知られている。一つの化合物群に、２，３
−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンがある。もっと
も普遍的な化合物、ルミノールは、上記化合物の５−ア
ミノ類縁体である。この群の他の化合物には、５−アミ
ノ−６，７，８−トリメトキシ−およびジメチルアミン
−［ｃａ］ベンズ類縁体が包含される。これらの化合物
は、アルカリ性過酸化水素または次亜塩素酸カルシウム
と塩基でルミネッセンスにすることができる。他の化合
物群には、母体化合物の一般名がロフィンの、２，４，
５−トリフェニルイミダゾールがある。化学発光類縁体
にはｐ−ジメチルアミノ−およびｐ−メトキシ置換体が
包含される。化学発光はまた、オキシレート、通常はオ
キサリル活性エステルたとえばｐ−ニトロフェニルと過
酸化物たとえば過酸化水素で、塩基性条件下に得られ
る。また、ルシフェリンをルシフェラーゼまたはルシゲ
ニンと組み合わせて使用することもできる。

【００５２】「補助材料」は、本発明によるアッセイに
用いられる様々な付加的材料を意味する。たとえば、ア
ッセイメジウム中には通常、緩衝剤、ならびにアッセイ
メジウムおよびアッセイ成分のための安定剤が添加され
る。これらの添加物に加えて、付加的蛋白質たとえばア
ルブミン、また界面活性剤とくに非イオン界面活性剤、
結合増強剤たとえばポリアルキルグリコール等が多くの
場合、包含される。

【００５３】「全体的または部分的に順次」とは、本発
明において用いられるサンプルおよび様々な試薬を、一
緒に（同時に）以外の方法で混合する場合を意味し、１
種または２種以上の成分を残りの試薬の１種または２種
以上と混合して部分混合物を形成させる。各部分混合物
をついで混合して、本発明の方法に付す。

【００５４】上述のように、本発明の一態様は、以下の
成分、すなわち、免疫グロブリンの含有が疑われるサン
プル、その免疫グロブリンに対する受容体に結合した小
分子、その免疫グロブリンに結合できる抗原、その免疫
グロブリンの結合部位とは異なる抗原上の部位でその抗
原に結合できるその抗原に対する受容体に結合したシグ
ナル発生手段、および上記小分子に対する受容体が結合
する支持体を水性メジウム中に混合することによる、特
定の免疫グロブリンのイムノアッセイを実施する方法に
関する。ついで、メジウムを支持体から分離する。サン
プル中の免疫グロブリンの存在または量に関連するシグ
ナル発生手段の存在または量を、メジウムまたは支持体
について観察する。本発明の好ましい実施態様において
は、固体支持体はビーズのマトリックスである。

【００５５】本発明のイムノアッセイに用いられる試薬
は、本発明の設計にとくに重要である。設計されたよう
に、その方法論は、大部分の被検物質に一般的なある種
の試薬類からなり、イムノアッセイ系における自動化と
試薬の安定性の制御を容易にしたものである。典型的に
は、本発明は、興味のある免疫グロブリンのアッセイに
あたり、以下の試薬、すなわち、（１）その免疫グロブ
リンに対する受容体に結合した小分子、（２）その免疫
グロブリンに結合できる抗原、（３）その免疫グロブリ
ンの結合部位とは異なる抗原上の部位で上記抗原に結合
できる上記抗原に対する受容体に結合したシグナル発生
手段、および（４）上記小分子に対する受容体が結合す
る支持体を使用する。すべてのアッセイで同一の小分子
を使用すれば、受容体に結合した支持体は、被検物質が
何であるかには無関係に使用できる一般試薬となる。シ
グナル発生手段は、抗原に対する受容体に結合した第二
の小分子と第二の小分子に対する標識された受容体から
構成することができる。この場合も、すべてのアッセイ
で同一の第二の小分子を使用すれば、第二の小分子に対
する標識受容体は一般試薬となる。

【００５６】本発明の一実施態様におけるサンプル中の
免疫グロブリンの検出のための方法を詳細に説明する。
このアッセイの方法においては、以下の試薬、すなわ
ち、興味のある免疫グロブリンの含有が疑われるサンプ
ル；その免疫グロブリン（Ｉｇ）に対する受容体に結合
した小分子、たとえば抗−Ｉｇに結合したビオチン；Ｉ
ｇに結合できる抗原；Ｉｇの結合部位とは異なる抗原上
の部位で上記抗原に結合できる上記抗原に対する受容体
に結合したシグナル発生手段、たとえば抗−抗原に結合
した標識；および上記小分子に対する受容体が結合する
支持体、たとえばアビジン、が使用される。他の実施態
様においては、シグナル発生手段は、抗−抗原に結合す
る小分子に対する受容体に結合した標識、たとえば酵素
標識抗−フルオレセインとフルオレセイン標識抗−抗原
とすることができる。

【００５７】本発明において試薬として使用される抗体
はモノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれで
あってもよいが、モノクローナルであるこよが好まし
い。このようなアッセイ系においては、固体支持体に結
合するシグナル発生手段の量は、サンプル中に存在する
免疫グロブリンの量に直接関連することになる。とく
に、免疫グロブリンの存在下には、抗原はその一部位で
免疫グロブリンに結合される。シグナル発生手段を結合
する抗体は、第二の異なる部位で抗原に結合する。一
方、小分子が結合する抗−Ｉｇは免疫グロブリンに結合
し、小分子は支持体に結合する小分子に対する受容体に
結合する。これで、支持体へ結合する興味のある複合体
を生じる。

【００５８】試薬とサンプルは互いにまた支持体と、同
時にまたは全体的もしくは部分的に順次、混合される。
一つのアプローチでは、すべての試薬、サンプルおよび
固体支持体は一緒に混合される。これについで、１回の
インキュベーションを行い、続いて未結合試薬を洗浄に
よって除去する。ＩｇＭ−型免疫グロブリンの検出に適
用された本発明のイムノアッセイで形成される複合体を
模式的に示せば次の通りである。標識−Ａｂ_Ag：Ａｇ：ＩｇＭ：Ａｂ_IgM−Ｘ：Ｙ−支持
体式中、標識−Ａｂ_Agは標識に結合した抗原（Ａｇ）に対
する抗体であり、ＡｇはＩｇに結合できる抗原であり、
Ａｂ_IgM−ＸはＩｇに対する抗体に結合した小分子
（Ｘ）であり、Ｙ−支持体は支持体に結合した小分子に
対する受容体である。好ましい実施態様においては、抗
原はＢ型肝炎コア抗原またはＡ型肝炎ウイルス抗原であ
る。Ｘはビオチン、Ｙはアビジンとすることができる。

【００５９】本発明の一実施態様においては、標識たと
えば酵素は、抗−抗原抗体に直接結合させることができ
る。酵素活性の程度はついで、サンプル中のＩｇＭの濃
度に相関する。このようなアッセイの変法においては、
フルオレセインのような小分子を抗−抗原抗体に結合さ
せる。ついで標識は、抗−フルオレセイン抗体に結合さ
せる。

【００６０】アッセイ系の設計により、一般的なすなわ
ち興味のある被検物質が何であるかには無関係にアッセ
イ系に使用できる試薬の使用を可能にする。上述の例か
ら明らかなように、各アッセイは小分子に結合した受容
体からなる接合体を使用する。

【００６１】アッセイの実施に際しては、より便利な工
程順序があり、また採用される特定の順序の選択はアッ
セイを実施する者のニーズによって決定される。一般的
に、サンプル、すべての試薬および支持体は通常、添加
順序は考慮しないで、水性メジウム中に混合される。典
型的には、サンプル、試薬および支持体はほぼ同時に混
合される。サンプル、試薬および支持体を含有する水性
メジウムをついで、１時間までまたはそれ以上の期間イ
ンキュベートする。支持体に結合したまたはメジウム中
に残ったシグナル発生手段の量をついで、直接、ただし
通常は支持体からメジウムを分離したのちに、測定す
る。

【００６２】本発明のアッセイにおいては、任意の便利
な標識が使用できる。標識は通常、抗原に対する受容
体、通常は抗体に共有結合で結合される。しかしなが
ら、本発明はまた、小分子を抗原に対する受容体に結合
させ、標識を小分子に対する受容体、通常は抗体に共有
結合させることも意図している。結合は、標識の水素原
子の受容体への結合での置換を生じる化学反応によって
達成できる。また、標識と受容体の間に連結基を包含さ
せることもできる。連結基は任意の長さとすることがで
きるが、標識に結合した化合物に相補性の化合物の自由
な結合および標識によるシグナルの生成が可能なよう
に、必要以上に長くしないことが好ましい。一般に、連
結基は、１〜１００個の原子、通常は１〜１５個の原子
からなる結合または基とする。連結基は、結合用に、標
識または受容体に導入することができる。結合のための
官能性たとえばカルボン酸、ヒドロキシル、チオ、アミ
ノ、アルデヒド、アミド、活性化エチレンたとえばマレ
イミド、スルホン酸等は、標識または受容体に元来存在
しない場合には、標識または受容体に導入できる。接合
の方法は本技術分野においてよく知られている。たとえ
ば、米国特許第３，８１７，８３７号が参考になる。

【００６３】受容体に結合した小分子を含有する本発明
の接合体は、天然の受容体が存在するかまたは調製でき
る小分子を含有する。小分子は通常、極端に親水性でも
疎水性でもなく、サンプル中に存在が考えられる物質と
構造的に類似しないことが好ましい。小分子を受容体の
接合体は、通常共用結合で結合した接合体中に、すなわ
ち１個、多くは２〜２０個の小分子をもっている。標識
−受容体結合について上述したように、受容体に対する
小分子の結合は、小分子の水素原子の受容体への結合に
よる置換を生じる化学反応によって達成できる。また、
標識と受容体の間に連結基を包含させることもできる。
連結基は任意の長さとすることができるが、小分子に対
する受容体および接合体中の受容体に相補性の化合物を
両者の接合に対する結合が可能なように、必要以上に長
くしないことが好ましい。

【００６４】本発明の支持体は通常、ビーズ、リポソー
ム、セル、ゾル等のような粒子、多孔膜、セルロースペ
ーパー、ガラスペーパーおよびニトロセルロース膜のよ
うな吸水性物質、ガラス、プラスチック、金属、セラミ
ック等のような非多孔性物質である。受容体は直接、共
有結合でまたは非共有結合で、受容体に相補性の小分子
を含む接合体の容易な結合が可能なように、支持体の表
面に結合される。受容体の表面への結合は通常、表面を
受容体とインキュベートすることによって行われる。こ
の場合、表面は予め結合を増強する試薬たとえばポリリ
ジンのようなポリカチオン；カルボジイミド；シリル化
剤；二官能性架橋試薬をたとえばカルボニルジイミダゾ
ール、過ヨー素酸塩；および類似の活性化剤で処理する
ことができる。また、受容体は、最初に受容体に対して
相補性の化合物たとえば受容体に対するリガンドもしく
は受容体に対する抗体が既に表面に結合している支持体
を調製することによって、支持体に間接的に結合させる
ことができる。ついでこのような表面と受容体をインキ
ュベートすると、受容体の非共有結合的な結合が生じ
る。受容体に対するリガンドが最初に表面上に存在する
場合にこの結合方法を採用すれば、受容体は通常、リガ
ンドに対して少なくとも２個の結合部位をもつことにな
る。

【００６５】本発明においては、固体支持体がビーズの
マトリックスである場合、ビーズは通常非多孔性であ
り、通常ガラスまたはマトリックスであり、通常、直径
は平均０．２〜２．５mmである。とくに好ましくは、ビ
ーズの直径は平均０．５〜２mmである。ビーズは通常ほ
ぼ球状で、粗なまたは平滑な表面を有する。

【００６６】ビーズの表面積は大きいので、バックグラ
ンド非特異的結合が低く抑えられるように表面の性質に
注意を払う必要がある。アビジンがビーズに結合した受
容体として用いられる場合には、ビーズにアビジンを結
合させたのち、スクロースの存在下にガラス粒子を乾燥
することにより非特異的結合を低下させることができ
る。有用なことが明らかにされているコーティングの例
には、糖にほかにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリ
（ビニルアルコール）、カゼインおよび脱脂ミルクがあ
る。

【００６７】どの種類の固体支持体を使用しても、小分
子に特異的に結合する受容体がその表面に結合するよう
に処理しなければならない。本発明の好ましい実施態様
においては、支持体には、異なる様々なアッセイに使用
できるように、それにリガンドまたは受容体が結合され
ている。たとえば、アビジンは、０．５〜１．５mmの球
状ガラスビーズに共有結合させることができる。これら
のビーズのマトリックスを、水性メジウム中、免疫グロ
ブリンに対するビオチン標識抗体、免疫グロブリン含有
サンプル、抗原、および免疫グロブリンの結合部位とは
異なる部位で抗原に結合する標識抗体と混合する。ビー
ズはビオチンに結合し、ビオチンは抗体に結合できるの
で、大部分の抗体−抗原対に対して同一のビーズを使用
できる。標識抗体のビオチン化抗体への結合、ならびに
後者のビーズへの結合に十分なインキュベーションを行
ったのちに、溶液をビーズからたとえば吸引によって分
離する。ついで洗浄溶液を加え、液体を再び除去する。
洗浄サイクルを反復したのち、標識を検出し、標識の量
をサンプル中のＩｇの量と関連づける。たとえば、標識
が酵素の場合には、基質を加え、適当なインキュベーシ
ョン時間後に、酵素産生物の量を測光法によって測定
し、既知濃度のＩｇを含むサンプルについて得られた生
成物の量と比較する。

【００６８】本発明の実施に際しては、液体、通常は水
性のメジウムが使用される。他の極性溶媒、通常は１〜
６個、さらに通常では１〜４個の炭素原子を有する酸素
化有機溶媒、たとえばアルコール、エーテル等も使用で
きる。通常これらの共溶媒は約４０％未満、さらに通常
では約２０％未満存在させる。一般的には５〜１０、さ
らに通常では６〜９のpH範囲が使用される。アッセイの
pHに関しては、一つには有意な結合レベルの維持が、ま
た他方ではシグナル産生の向上が考慮される。場合によ
っては、これらの考慮の間に矛盾を生じることがある。
所望のpHの達成および定量中のpHの維持には、様々な緩
衝液が使用できる。緩衝液の例としては、ホウ酸塩、リ
ン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等を挙げること
ができる。本発明には、使用される特定のpHによる制限
はない。しかしながら、個々の分離、個々のアッセイに
おいては、ある緩衝液が他の緩衝液より好ましいという
ことはある。

【００６９】中等度の、通常の一定の温度が、アッセイ
の実施に通常使用される。アッセイのための温度、とく
にイムノアッセイの温度は、一般的に約０〜５０℃、さ
らに通常には約１５〜４０℃の範囲である。

【００７０】各種試薬の濃度は、一般的に、液体メジウ
ム中の受容体またはアッセイ中の免疫グロブリンの濃度
範囲によって決定されるが、各試薬の最終濃度は通常、
興味ある範囲における感度および分離またはアッセイの
特異性を至適化するように経験的に決定される。

【００７１】本発明のイムノアッセイにおいては、水性
メジウムにシグナル発生手段の１または２以上の構成要
素も含有させることができる。シグナル発生手段の各構
成要素の濃度は、免疫グロブリンの興味ある濃度範囲、
ならびに関連する測定またはアッセイの種類によって変
動し、決定される。一般的には、シグナル発生手段の各
構成要素の濃度は、免疫グロブリンの興味ある濃度範囲
内におけるアッセイの感度を至適化するように選択され
る。

【００７２】アッセイの結果を測定するためには、標識
された固相反応生成物、たとえば、標識−Ａｂ_Ag：Ａｇ：ＩｇＭ：Ａｂ_IgM−Ｘ：Ｙ−支持
体を、過剰量存在ししたがって未反応の遊離試薬を含有す
る水性メジウムから、好ましくは分離する。反応生成物
は支持体によって不溶化された固相であるから、沈降も
しくは遠心分離のような方法、または本技術分野で確立
されている他の方法によって容易に分離できる。

【００７３】便利なように、アッセイの実施のための試
薬は、免疫グロブリン（Ｉｇ）のアッセイに使用するた
めの既定量を組み合わせパッケージにしたキットとして
提供することもできる。キットは、（ａ）小分子とＩｇ
に対する受容体の接合体、（ｂ）Ｉｇに結合できる抗
原、（ｃ）標識と上記抗原に対する受容体の接合体、お
よび（ｄ）上記小分子に対する受容体が表面に結合した
支持体から構成される。キットには、サンプル中のＩｇ
の量に関連するシグナルを生成させるための他の試薬た
とえば標識に対する基質を包含させることもできる。必
要に応じて補助剤も包含させることができる。

【００７４】本発明の方法の使用は、免疫グロブリンの
任意の不均一系結合アッセイに適用することができる。
特異的アッセイには、たとえば、Ｂ型肝炎コア抗原に対
するＩｇＭ抗体およびＡ型肝炎ウイルス抗原、に対する
ＩｇＭ抗体が包含される。いずれの系においても、免疫
グロブリンに相補性のビオチン化抗体が用いられる。ア
ビジン（ストレプトアビジンを含む）以外の受容体、た
とえば抗体、プロテインＡ、内因子、プロテインＧ、Ｃ
ｌｑ、レクチン、アボ酵素等をビーズに結合させ、つい
で、免疫グロブリンに相補性の抗体に接合させた各相補
性小分子を使用することができる。

【００７５】本発明の好ましい態様においては、標準的
ＥＬＩＳＡ化学に対して以下の利点が得られる。すなわ
ち、１）受容体結合支持体はすべてのアッセイに共通で
ある。２）溶液相における抗体への被検物質の結合は、
固体表面上に固定化された抗体によって達成される場合
に比較して極めて急速な反応速度を生じる。３）分離イ
ンキュベーションおよび分離洗浄の必要性の排除によ
り、最少数の手操作工程で効率的なアッセイが提供され
る。ビオチンやフルオレセインのような小分子を抗体ま
たはハプテンに連結させる化学は単純で効率的である
（たとえば、Ｄ．Ｍ．Ｂｏｏｒｓｍａ，Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２：１５５，１９８３）。
小分子接合体の安定性は、接合体中に用いられる抗体と
同様に良好である。

【００７６】例以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明
を限定するものではない。とくに指示のない限り、試薬
を市販品を入手し、適用可能の場合は製造業者の指示に
従って使用した。

【００７７】実施例を通じて以下の略号を使用する。抗−ＨＡＶ抗−Ａ型肝炎ウイルス抗体抗−ｈＩｇＭ抗−免疫グロブリン抗体抗−ＨＢｃＡｇ抗−Ｂ型肝炎コア抗原抗体ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳスクシニミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエートＢＳＡウシ血清アルブミンＤＭＦＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドＥＤＡＣ１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＧＢガラスビーズＨＡＶＡ型肝炎ウイルスＨＢｃＡｇＢ型肝炎コア抗原ｈＩｇＭヒト免疫グロブリンＭＨＲＰ西洋ワサビペルオキシダーゼＩｇＧヒト免疫グロブリンＧＬＣ３，３´−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミンＭＥＳ２−［Ｎ−モリホリノ］エタンスルホン酸ＮＨＳＮ−ヒドロキシスクシンイミドＰＢＳリン酸緩衝食塩溶液ＴＭＢ３，３´５，５´−テトラメチルベンジジン

【００７８】例１Ｂ型肝炎コア抗原に対する免疫グロブリンＭ検出のため
の不均一酵素ベースイムノアッセイ材料の調製ヤギ抗−ｈＩｇＭ（アフィニティー精製、ｍ−鎖特異
的）は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍ
Ｄ）から入手した。ビオチン−抗−ｈＩｇＭは、ビオチ
ン−ＬＣ−ＮＨＳと抗体の反応によって製造した。組換
えＨＢｃＡｇは、Ｍｅｒｃｋ，ＳｈａｒｐａｎｄＤｏ
ｈｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｄｓ（ＷｅｓｔＰｏ
ｉｎｔ，ＰＡ）から入手した。ヒトＩｇＧ抗−ＨＢｃＡ
ｇ−ＨＲＰ接合体は、ＳｏｒｂｉｎＢｉｏｍｅｄｉｃ
ａ（Ｉｔａｌｙ）からのＥＴＩ−ＣＯＲＥ−ＩＧＭＫキ
ット中に包含される試薬である。アッセイ緩衝液は、Ｐ
ＢＳと０．１％ＢＳＡ，pH７．４から構成された。洗浄
緩衝液は、１０ｍＭリン酸ナトリウムpH７．２とした。
ＴＭＢ／尿素ペルオキシダーゼ基質は標準操作を用いて
製造した。

【００７９】ＧＢ−アビジンの製造直径約１mmのガラスビーズ（ＧｌｅｎＭｉｌｌｓ，Ｉ
ｎｃ，Ｍａｙｗｏｏｄ，ＮＪ）をまず、５％硝酸中で１
時間煮沸して清浄化し、ついで洗液のpHが中性になるま
で脱イオン水で洗浄した。ビーズを室温で真空下に乾燥
した。

【００８０】酸−洗浄ビーズ１kgに、３００mlの酢酸エ
チル中１mlのアミノプロピルトリエトキシシランを加え
た。ついで混合物をロータリーアスピレーター上に置
き、溶媒を除去したのち、ビーズをアミノシラン試薬の
薄い膜で被覆した。次に、ビーズをステンレス反応器に
移し、窒素／アルゴン気相下にオーブン中で１３０℃に
一夜加熱した。冷却後、ビーズはそのまま次の工程に使
用した。

【００８１】アミノ化ビーズ５００ｇに、傾斜組織培養
フラスコ中、０．１Ｍホウ酸ナトリウム（pH９．０）１
７０mlを加えた。１０分後、無水コハク酸の溶液（２０
mlＤＭＦ中２．０ｇ）をピペットで加えた。フラスコに
栓をして手で振盪した。無水コハク酸の溶液の最後の添
加後、すべての液体を除去し、ビーズを脱イオン水２０
０ml×４で洗浄した。

【００８２】１５０mlの０．１ＭＭＥＳ，pH５．２で
１回洗い流したのち、ビーズが丁度覆われる液量のＭＥ
Ｓに再懸濁した。２mlのＭＥＳ中１００mgのＥＤＣＡを
一度に加えて、５分間手で振盪して混合した。アスピレ
ーターを用いて液体を除去したのち、アビジン（２０m
g）およびＢＳＡ（４０mg）のＭＥＳ２０ml溶液を一度
に加えた。培養フラスコを内容物ごとに、４℃で一夜、
軌道シェーカー上に置いた。

【００８３】ビーズの調製にはさらに、１ＮＮａＣｌ
（２００ml×４）ついで脱イオン水（２００ml×４）に
よるビーズの洗浄が包含される。各洗浄の前後に、液体
は完全に除去される。ビーズをついで、０．１％ＢＳＡ
および２．５％スクロースを含有するリン酸緩衝食塩溶
液（２０ｍＭリン酸塩、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．０
２％ＮａＮ₃、pH７．４）１５０ml×３で処理した。過
剰の液体を除去し、湿ったビーズを真空乾燥器中の容器
に移す。

【００８４】ＵＳＡ標準試験シーブ１６または２０号を
通過させたのち、最後に、ビーズにカゼイン粉末を振り
かけて保存時に互いに付着するのを防止する。

【００８５】³Ｈ−ビオチンとの結合試験では、このよ
うにして調製されたビーズには、各ガラスビーズあたり
２〜１１mgの活性アビジンが導入されたことを示した。

【００８６】アッセイプロトコールアッセイプロトコールは次の通りである。まず、１：１
０００希釈ＩｇＭ抗−ＨＢｃＡｇ陽性および陰性サンプ
ル１００mlを、試験管中のＧＢ−アビジン０．６５ｇに
加え、ついでビオチン−抗−ｈＩｇＭ（２３７ｎｇ／ア
ッセイ）１００mlを加えた。ついでＨＢｃＡｇと抗−Ｈ
ＢｃＡｇ−ＨＲＰの混合物（１００ｎｇのＨＢｃＡｇ／
テスト含有）２００mlを各試験管に加えた。すべてのサ
ンプルおよび試薬はアッセイ緩衝液中に希釈した。３７
℃で４０分インキュベートしたのち、洗浄緩衝液で４回
洗浄して未反応成分を除去した。結合ＨＲＰを測定し、
７５０mlの１Ｎ硫酸で停止させた。吸収は４５０ｎｍで
読み取った。

【表１】結果サンプルＡ₄₅₀ 陰性０．０７３陽性１．０６２これらの結果は陽性サンプルの明らかな変化を示した。

【００８７】例２Ａ型肝炎ウイルス抗原に対する免疫グロブリンＭ検出の
ための不均一酵素ベースイムノアッセイ材料の調製以下の材料を調製した。アフィニティー精製ビオチン標
識ヤギ抗−ｈＩｇＭ（ｍ−鎖特異的）は、Ｓｉｇｍａ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）か
ら入手した。ホルマリン固定抗−ＨＡＶは、Ｍｅｄｌａ
ｇｎｏｓｔ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
から提供された。ＧＢ−アビジンは例１の記載と同様に
して調製した。サンプル希釈緩衝液および接合体希釈剤
は、ＳｏｒｂｉｎＢｉｏｍｅｄｉｃａ（Ｉｔａｌｙ）
からのＥＴＩ−ＣＯＲＥ−ＩＧＭＫキットから得られ
た。洗浄緩衝液は、１０ｍＭリン酸ナトリウムpH７．２
とした。ＴＭＢ／尿素ペルオキシダーゼ基質は標準操作
を用いて製造した。

【００８８】予備実験予備実験は、ＨＡＶ抗原とペルオキシダーゼ標識抗−Ｈ
ＡＶの適当な比を決定するために行われた。ＨＡＶと
１：１５００希釈接合体の等量が、捕捉ヒト抗−ＨＡＶ
に結合する抗原の十分な過剰量を与えた。

【００８９】提案されたアッセイプロトコール提案されたアッセイホーマットは次の通りである。ま
ず、１：１５００希釈接合体とＨＡＶ抗原の混合物２０
０mlを、試験管中のＧＢ−アビジン０．６５ｇに加え
た。次に、１：１５００希釈抗−ＨＡＶＩｇＭ陽性お
よび陰性患者血清１００mlを各試験管に加え、ついでビ
オチン−抗−ｈＩｇＭ（８００ｎｇ／アッセイ）１００
mlを加えた。４０分インキュベートしたのち、洗浄緩衝
液で４回洗浄して未反応成分を除去した。結合ＨＲＰを
ＴＢＭ／尿素ペルオキシダーゼ基質２５０mlを加えて測
定した。５分間、３７℃でインキュベートしたのち、７
５０mlの１Ｎ硫酸で反応を停止させた。結合ＨＲＰ活性
の４５０ｎｍ吸収を測定した。

【００９０】以上の説明には、本発明に関連する機構に
関してある種の理論を包含する。本発明は記載された結
果を達成することを明らかにしたものであって、これら
の理論がいかなる意味においても本発明を限定すること
はない。

【００９１】本発明を以上、上述の実施態様をとくに参
照しながら詳細に説明した。しかしながら、本発明の精
神および範囲内において変化および修飾が可能であるこ
とを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者リタイウエングアメリカ合衆国カリフオルニア州パロアルト，エヌ．カリフオルニアアベニユー 995 (72)発明者ルドルフバーロアメリカ合衆国カリフオルニア州マウントビユー，ウツドストツクレーン 3402

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特定の免疫グロブリンのイムノアッセイ
を実施する方法において、（ａ）（ｉ）免疫グロブリンの含有が疑われるサンプ
ル、（ii）当該免疫グロブリンに対する受容体に結合し
た小分子、（iii ）当該免疫グロブリンに結合できる抗
原、（iv）当該免疫グロブリンの結合部位とは異なる抗
原上の部位で上記抗原に結合できる上記抗原に対する受
容体に結合したシグナル発生手段、および（ｖ）上記小
分子に対する受容体が結合する支持体を水性メジウム中
に混合し、（ｂ）この混合物をインキュベートし、（ｃ）上記メジウムと上記支持体を分離し、ついで（ｄ）サンプル中の当該免疫グロブリンの存在または量
に関連するシグナルの存在または量を、上記メジウムま
たは上記支持体について観察する、各工程からなる方法
【請求項２】免疫グロブリンは疾患状態の病原体に対
して産生される抗体である請求項１に記載の方法
【請求項３】免疫グロブリンはＩｇＭ抗体である請求
項１に記載の方法
【請求項４】抗原はＢ型肝炎コア抗原、またはＡ型肝
炎ウイルス抗原である請求項１に記載の方法
【請求項５】シグナル発生手段は、酵素、蛍光体、化
学発光体および金属粒子からなる群より選ばれる標識で
あり、好ましくは、標識はペルオキシダーゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼお
よびＱ−β−レプリカーゼからなる群より選ばれる酵素
である請求項１に記載の方法
【請求項６】シグナル発生手段は、抗原に対する受容
体に結合した第二の小分子と、酵素、蛍光体、化学発光
体および金属粒子からなる群より選ばれる標識に結合し
た上記第二の小分子に対する受容体からなり、好ましく
は、上記第二の小分子はフルオレセイン誘導体であり、
第二の小分子に対する上記受容体は抗体であり、上記標
識はペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレア
ーゼおよびアルカリホスファターゼからなる群より選ば
れる酵素である請求項１に記載の方法
【請求項７】免疫グロブリンに対する受容体は抗体で
ある請求項１に記載の方法
【請求項８】抗原に対する受容体は抗体である請求項
１に記載の方法
【請求項９】小分子がビオチンであり、小分子に対す
る受容体はアビジンおよびストレプトアビジンからなる
群より選ばれる請求項１に記載の方法
【請求項１０】支持体はガラスビーズである請求項１
に記載の方法
【請求項１１】ＩｇＭ型免疫グロブリンのイムノアッ
セイを実施する方法において、（ａ）（ｉ）ＩｇＭの含有が疑われるサンプル、（ii）
ＩｇＭに結合できるビオチン化抗体、（iii ）ＩｇＭに
結合できる抗原とシグナル発生手段に結合する抗体との
抗原：抗体複合体、および（iv）支持体に結合したビオ
チンに対する受容体をアッセイメジウム中に加え、（ｂ）このメジウムをインキュベートし、（ｃ）上記メジウムと上記支持体を分離し、ついで（ｄ）サンプル中の１ｇＭの存在または量に関連するシ
グナルの存在または量を、上記メジウムまたは上記支持
体について観察する、各工程からなる方法
【請求項１２】サンプル中の存在が疑われるＩｇＭ型
免疫グロブリンを検出するためのアッセイにおいて、上
記サンプル中の上記ＩｇＭの量に直接関連して、複合体標識−Ａｂ_Ag：Ａｇ：ＩｇＭ：Ａｂ_IgM−Ｘ：Ｙ−支持
体［式中、標識−Ａｂ_Agは標識に結合した抗原（Ａｇ）に
対する抗体であり、ＡｇはＩｇＭに結合できる抗原であ
って、Ａ型肝炎ウイルス抗原およびＢ型肝炎コア抗原か
らなる群より選ばれ、Ａｂ_IgM−Ｘは上記ＩｇＭに対す
る抗体に結合した小分子（Ｘ）であり、Ｙ−支持体は支
持体に結合した小分子に対する受容体である］を生成さ
せる工程からなる方法
【請求項１３】免疫グロブリンに結合したビオチン化
抗体の接合体、上記免疫グロブリンに結合した抗原、お
よび上記抗原に結合した標識抗体からなる組成物
【請求項１４】ビオチン化抗体はビオチンに対する受
容体を有する支持体にさらに結合し、上記受容体はアビ
ジンおよびストレプトアビジンからなる群より選ばれる
請求項１３に記載の組成物
【請求項１５】式標識−Ａｂ_Ag：Ａｇ：ＩｇＭ：Ａｂ_IgM−Ｘ：Ｙ−支持
体［式中、標識−Ａｂ_Agは標識に結合した抗原（Ａｇ）に
対する抗体であり、１ｇＭはＩｇＭ型免疫グロブリンで
あり、ＡｇはＩｇＭに結合できる抗原であって、Ａ型肝
炎ウイルス抗原およびＢ型肝炎コア抗原からなる群より
選ばれ、Ａｂ_1gM−Ｘは上記ＩｇＭに対する抗体に結合
した小分子（Ｘ）であり、Ｙ−支持体は支持体に結合し
た小分子に対する受容体である］を表される組成物
【請求項１６】免疫グロブリンのイムノアッセイを実
施するためのキットにおいて、（ａ）小分子と上記免疫
グロブリンに対する受容体の接合体、（ｂ）上記免疫グ
ロブリンに結合できる抗原、（ｃ）標識と上記抗原に対
する受容体の接合体、および（ｄ）上記小分子に対する
受容体が表面に結合した支持体をパッケージとしたキッ
ト