CN110366677A - 为数字测定使用横向照明的光学成像系统 - Google Patents

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Abstract

紧凑的光学成像系统，其包括单个过滤器和光源，该光源为数字测定中的珠粒检测提供横向照明。该光源被配置成朝向检测器皿发射光。该单个过滤器被定位成接收从检测器皿中的样本反射的、源自光源的光，并且接收来自检测器皿中的样本的输出。检测器被配置成接收反射光的一部分和传过单个过滤器的输出的一部分。

Description

为数字测定使用横向照明的光学成像系统
相关申请的交叉引用
本申请是2016年12月21日提交的美国临时专利申请No.62/437,534的非临时申请并且要求其权益，该临时专利申请的全部内容通过引用结合于本文。
技术领域
本公开涉及一种光学成像系统，其包括单个过滤器和光源，该光源为数字测定中的分析物分析提供横向照明。
背景技术
可以准确分析样本中的（一个或多个）关注分析物的设备和方法对于诊断是必不可少的，诸如例如诊断疾病、病症或病状、预后、环境评估、食品安全、化学或生物战剂的检测等等。用于量化样本中的低水平分析物分子的大多数当前技术使用扩增程序来增加报告分子的数量从而提供可测量的信号。当前技术的示例包括：用于在基于抗体的测定中扩增信号的酶联免疫吸附测定（ELISA）、以及用于在基于DNA的测定中扩增靶DNA链的聚合酶链式反应（PCR）。大多数检测方案要求在整体中存在大量分子，以用于使聚合信号高于检测阈值。该要求限制了大多数检测技术的灵敏度以及动态范围（即，可以检测到的浓度的范围）。许多已知方法和技术进一步受到非特异性结合问题的困扰，这导致背景信号中的增加并且限制了可以准确地或可再现地检测到的最低浓度。
数字ELISA是针对下一代免疫测定的候选者，因为它可以使用偶联物（conjugate）来检测一个酶的分子。参见图1和图2。在数字ELISA中，在捕获抗体与检测抗体之间的珠粒（bead）上捕获靶分子，其中检测抗体与酶结合。然后将珠粒与酶的基质一起俘获在液滴腔中，并且用重油来替代水相，从而允许在分析之前去除水相。
在基于珠粒的数字ELISA中，将单个珠粒封装在阵列的微腔中。其中珠粒已经捕获了免疫复合型种类的一些腔在荧光成像时提供明亮点（即，明亮的腔）。有珠粒存在的腔的百分比与抗原浓度相关。因此，有必要在阵列微腔中标识珠粒和酶的方位。
光学成像是一种用以在测定中确定珠粒位置的方法。光学成像还可以使用珠粒/酶双通道成像来一次检测大量（超过10000）微腔的数据。然而，由于用于荧光/荧光类型的珠粒/酶双通道成像的复杂光学器件，用于双通道成像的常规光学系统对于要安装在现有产品上而言是大型且昂贵的。常规光学系统要求用于相应通道的多个光学过滤器，以及用于交换模式的外部致动器。
发明内容
因此，提供一种用于数字免疫测定的简化光学成像系统是合期望的，该系统提供了紧凑且低成本的数字免疫测定设备。本发明的实施例提供了一种使用光散射光学器件以用于数字免疫测定的成像系统，其中与常规光学成像系统相比，其大幅度降低了大小和成本。
本发明的实施例通过采用将光散射应用于用以珠粒检测的测定的光源来简化光学成像系统。光学成像系统利用光散射/荧光类型，并且已经通过去除用于在常规系统中所使用的模式交换的光学组件和对应的致动器结构而被简化。为了演示根据该系统的实施例的光学成像系统的能力，设计并测试了用于数字ELISA的紧凑设备。光学成像系统的实施例演示了良好的性能，并且与常规光学成像系统相当或优于常规光学成像系统。（值得注意的规格总结在图1中）检测器的体积和成本分别是近似几十分之一和100分之一。
在一个实施例中，本发明提供了一种紧凑的数字测定装置，其包括：检测器皿；光源，其被配置成朝向检测器皿发射光；单个过滤器；以及检测器。单个过滤器被定位成接收从检测器皿中的样本反射的、源自光源的光，并且接收来自检测器皿中的样本的输出。检测器被配置成接收反射光的一部分和传过单个过滤器的输出的一部分。
在另一实施例中，本发明提供了一种紧凑的数字测定装置，其包括：检测器皿；第一光源，其被配置成朝向检测器皿并且相对于样本阵列以一角度来发射光；第二光源，其被配置成朝向检测器皿发射光；单个过滤器；以及检测器。单个过滤器被定位成接收从检测器皿中的样本反射的、源自第一光源的光，以及接收来自检测器皿中的样本的荧光输出。检测器被配置成接收反射光的一部分和传过单个过滤器的荧光的一部分。
在另外的实施例中，本发明提供了一种紧凑的数字测定装置，其包括：样本阵列，其具有多个孔（well）；第一光源，其被配置成相对于样本阵列以一角度、朝向样本阵列发射光，以照射样本阵列中的样本；第二光源，其被配置成在不使用反射镜或其他反射物体的情况下朝向样本阵列发射光，第二光源进一步被配置成激活样本阵列中的样本以发射输出；过滤器；以及检测器。过滤器被定位成接收从样本阵列反射的、源自第一光源的光，以及接收来自样本阵列中的样本的输出。检测器被配置成接收反射光和传过该过滤器的来自样本的输出，并且生成光学数据，该光学数据标识了哪些孔包含珠粒以及哪些孔包含标记。
在又另一实施例中，本发明提供了一种紧凑的数字测定装置，其包括：样本阵列，其包括被定位在多个纳米孔中的多个样本；光源，其被配置成相对于样本阵列、以一角度朝向样本阵列发射光，以照射样本阵列中的样本，该光源具有在450 nm与550 nm之间的波长；以及检测器，其被配置成接收从样本反射的光的一部分。
通过考虑具体实施方式和附图，本发明的其它方面将变得显而易见。
通过研究附图，本文中阐述的主题的细节（关于其结构和操作两者）可以是显而易见的，在附图中相似的附图标记指代相似的部分。附图中的组件不一定是按比例的，而是将重点置于说明主题的原理上。此外，全部说明意图传达概念，其中相对大小、形状及其它详细属性可能被示意性地而非字面上地或精确地图示。
附图说明
图1是根据本发明实施例的简化光学成像系统与常规光学成像系统的比较。
图2是根据本发明实施例的光学成像系统的透视图。
图3示出了图2中图示的光学成像系统的若干视图。
图4是根据本发明实施例的光学成像系统的示意图。
图5是用于数字免疫测定的微腔阵列以及通过酶促反应进行的荧光信号放大机制（顶部图像）的示意图；常规系统的光学成像系统与图2中图示的光学成像系统之间的差异的比较。
图6图示了由图5中图示的光学成像系统获取的图像。
图7图示了由图5中图示的光学成像系统获取的图像。
图8图示了由图5中图示的光学成像系统获取的图像。
图9图示了由图5中图示的光学成像系统获取的图像。
图10图示了由图5中图示的光学成像系统获取的图像。
图11图示了由图5中图示的光学成像系统获取的图像。
图12图示了由图5中图示的光学成像系统获取的图像。
具体实施方式
1定义
在描述本公开的实施例之前，要理解的是，本发明不限于所描述的特定实施例，由此当然可以变化。还要理解的是，本文中使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不意图是限制性的。
如本文中使用的“包括”、“包含、“具有（have）”、“具有（has）”、“可以”、“含有”及其变体意图是开放式过渡短语、术语或词语，它们不排除附加的行动或结构的可能性。单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另行清楚地规定。本公开还考虑了“包括”本文中呈现的实施例或元件、“由本文中呈现的实施例或元件组成”以及“基本上由本文中呈现的实施例或元件组成”的其他实施例，无论是否明确地阐述。
对于本文中的数字范围的记载，明确地考虑了其之间具有相同程度精度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外还考虑数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确地考虑数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文中可互换使用的“亲和性”和“结合亲和性”指代结合成员与分析物的结合倾向或强度。例如，结合亲和性可以由平衡解离常数（KD）、解离速率（kd）或结合速率（ka）来表示。
如本文中使用的“类似物”指代具有与关注分子的结构类似的结构的分子（例如，核苷类似物、核苷酸类似物、糖磷酸类似物、分析物类似物等）。分析物类似物是在结构上与分析物类似但是其结合成员具有不同亲和性的分子。
如本文中可互换使用的“分析物”、“靶分析物”、“关注分析物”指代在本文中公开的方法和设备中测量的分析物。本文中进一步描述了关注分析物。
如本文中使用的一个或多个“抗体”指代单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体（完全或部分人源化的）、动物抗体（该动物诸如但不限于鸟（例如，鸭或鹅）、鲨鱼、鲸鱼以及哺乳动物，该哺乳动物包括非灵长类动物（例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、老鼠等）或非人类灵长类动物（例如，猴子、黑猩猩等））、重组抗体、嵌合抗体、单链Fvs（“scFv“）、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F（ab'）片段、F（ab'）2片段、二硫键链接的Fvs（“sdFv”）和抗独特型（“anti-Id”）抗体、双域抗体、双可变域（DVD）或三重可变域（TVD）抗体（双可变域免疫球蛋白及其制备方法在Wu,C.等人的NatureBiotechnology，25（11）：1290-1297（2007）和PCT国际专利申请WO 2001/058956中有所描述，其中的每一个的内容通过引用结合于本文）、以及上述任一项的功能活性的表位结合片段。特别地，抗体包括：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即，包含分析物结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以属于任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或子类。为了简单起见，针对分析物的抗体在本文中通常被称为“抗分析物抗体”或仅仅被称为“分析物抗体”。
如本文中使用的“抗体片段”指代包括抗原结合位点或可变区域的完整抗体的一部分。该部分不包括完整抗体的Fc区域的恒定重链域（即，CH2、CH3或CH4，这取决于抗体同种型）。抗体片段的示例包括但不限于：Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F（ab'）2片段、Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv（scFv）分子、仅包含一个轻链可变域的单链多肽、包含轻链可变域的三个CDR的单链多肽、仅包含一个重链可变区域的单链多肽，以及包含重链可变区域的三个CDR的单链多肽。
“珠粒”和“粒子”在本文中可互换使用，并且指代基本上球形的固体支持物。
“结合蛋白”在本文中被用来指代利用结合搭档与复合物结合并形成复合物的单体或多聚体蛋白质，诸如例如多肽、抗原、化学化合物或其他分子，或任何种类的基质。结合蛋白与结合搭档特异性地结合。结合蛋白包括抗体，以及其抗原结合片段和本领域已知和下面在本文中描述的其他各种形式及其衍生物，以及包括结合至抗原分子或抗原分子上的特定位点（表位）的一个或多个抗原结合域的其他分子。因此，结合蛋白包括但不限于：抗体、四聚体免疫球蛋白、IgG分子、IgG1分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体、亲和性成熟的抗体，以及保留了结合至抗原的能力的任何这样的抗体的片段。
如本文中使用的“捕获分子”指代被用来捕获或固定生物样本中的关注分析物的特异性结合搭档或特异性结合成员。除了关注的分析物之外，捕获分子通常是复合物的一种组分，并且还可以包含一个或多个检测分子。复合物可以可选地与固体支持物结合。
一种或多种“组分”或者“至少一种组分”一般指代捕获抗体、检测试剂或偶联物、校准器、对照、灵敏度板、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅助因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、基质（例如，作为溶液）、终止溶液等等，根据本文中描述的方法和本领域已知的其他方法，它们可以被包括在用于测试样品（诸如，患者尿液、血清、全血、组织抽吸物或血浆样本）的测定的试剂盒（kit）中。一些组分可以在溶液中，或者被冻干以用于重构而在测定中使用。
如本文中使用的“接触”及其语法等同物指代任何类型的组合动作，其使结合成员与样本中关注分析物充分地紧密接近，使得如果样本中存在特异于结合成员的关注分析物，则将发生结合相互作用。接触可以以各种各样不同的方式实现，包括将样本与结合成员进行组合、通过将结合成员引入到分析物附近而将靶分析物暴露于结合成员等等。
如本文中使用的“对照”指代针对分析物的参考标准，诸如本领域已知或接受的那样，或使用可接受的手段（诸如，通常采用的手段）在经验上确定的那样。“参考标准”是标准物质，其被用作类似物质的测量基础。例如，存在美国药典公约（USP-NF）、食品化学法典和膳食补充剂纲要（全部这些都可在http://www.usp.org上获得）中公布的备有证明文件的参考标准以及其他已知来源。在文献中描述了用于使参考文献标准化的方法。还公知的是，用于通过使用分析物的校准曲线或者通过与替代参考标准进行比较来量化存在的分析物的量的手段。可以使用已知浓度的分析物的连续稀释液或溶液、通过质谱法、重量分析方法以及通过本领域已知的其他技术来生成标准曲线。已在文献中描述的替代参考标准包括标准添加（也被称为标准添加方法）或数字聚合酶链式反应。
如本文中使用的“检测分子”指代下述特异性结合搭档或特异性结合成员：其被用来检测生物样本中存在关注分析物和/或量化或测量关注分析物的量。检测分子通常是复合物的一种组分，该复合物可以包含一个或多个捕获分子和关注分析物。复合物可以可选地与固体支持物结合。
如本文中使用的“检测”或“反应”器皿指代可能包含反应混合物的容器或其他装置，该反应混合物可能包含或可能不包含关注分析物。合适的“检测”或“反应”器皿的示例包括比色皿、管、管板的个体（一个或多个）管、微量滴定板中的（一个或多个）洞或（一个或多个）孔、（一个或多个）个体反应孔（诸如孔阵列，诸如微孔阵列或纳米孔阵列）或测试滑动板或测定阵列板中的（一个或多个）凹坑。
如本文中使用的“固定化”指代第一特异性结合成员与固体支持物的表面的稳定缔合。“稳定缔合”指代两个实体之间的物理缔合，其中缔合的平均半衰期例如在生理条件下为一天或更长。在某些方面，两个实体之间的物理缔合具有2天或更长、1周或更长、1个月或更长、包括6个月或更长（例如，在4℃下的PBS中为1年或更长）的平均半衰期。根据某些实施例，稳定缔合起因于两个实体之间的共价键、两个实体之间的非共价键（例如，离子键或金属键），或其他形式的化学吸引（诸如，氢结合、范德华力等等）。
如本文中使用的“标记”和“可检测标记”指代附着到抗体或分析物的基元（moiety），以使抗体与分析物之间的反应可检测，并且如此标记的抗体或分析物被称为“被可检测地标记的”。标记可以产生可通过视觉或仪器手段检测的信号。各种标记包括产生信号的物质，诸如色原、荧光化合物、化学发光化合物、放射性化合物等等。本文中描述了其他标记。在这方面，基元本身可能是不可检测的，但是在与又另一基元发生反应时可能变成可检测的。使用术语“被可检测地标记的”意图涵盖这样的加标记。
如本文中使用的“单克隆抗体”指代从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，即，除了可能以少量而存在的可能天然发生的突变之外，包括该群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其被引导针对单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体被引导针对抗原上的单个决定簇。本文中的单克隆抗体特别包括：“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定种类或属于特定抗体类或子类的抗体中的对应序列相同或同源，而该（一个或多个）链的剩余部分与衍生自另一个种类或属于另一抗体类或子类的抗体中的对应序列相同或同源；以及这样的抗体的片段，只要它们表现出期望的生物性。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”指代核碱基聚合物或寡聚体，其中核碱基通过糖磷酸联接（糖-磷酸骨架）而连接。示例性多核苷酸和寡核苷酸包括2'-脱氧核糖核苷酸（DNA）的聚合物和核糖核苷酸（RNA）的聚合物。多核苷酸可以完全由核糖核苷酸组成，完全由2'-脱氧核糖核苷酸或其组合组成。“核酸”涵盖“多核苷酸”和“寡核苷酸”，并且包括核苷酸单体的单股和双股聚合物。
如本文中使用的“预定截止”和“预定水平”指代被用来通过将测定结果针对预定截止/水平进行比较来评估诊断、预后或治疗功效结果的测定截止值，其中预定截止/水平已经与各种临床参数（例如，疾病的存在、疾病的阶段、疾病的严重性、进展、非进展或疾病的改善等）链接或相关联。本公开提供了示例性预定水平。然而，公知的是，截止值可以取决于免疫测定的性质（例如，采用的抗体、反应条件、样本纯度等）而有所不同。基于由本公开提供的描述来使本文中的公开内容适用于其他免疫测定以获得用于那些其他免疫测定的免疫测定特异性截止值完全处于本领域普通技术人员的范围内。尽管预定截止/水平的精确值可以在测定之间有所不同，但是如本文中描述的关联应当是普遍适用的。
如在如本文中描述的诊断测定中使用的“预处理试剂”（例如，裂解、沉淀和/或溶解试剂）是裂解任何细胞和/或溶解测试样本中存在的任何分析物的试剂。如本文中进一步描述的，不是对于全部样本都需要预处理。除了其他以外，将分析物溶解需要从样本中存在的任何内源结合蛋白释放分析物。预处理试剂可以是同质的（不要求分离步骤）或异质的（要求分离步骤）。在使用异质预处理试剂的情况下，在进行到测定的下一个步骤之前，从测试样本中去除任何沉淀的分析物结合蛋白。预处理试剂可选地可以包括：（a）一种或多种溶剂和盐，（b）一种或多种溶剂、盐和去污剂，（c）去污剂，（d）去污剂和盐，或（e）适合于细胞裂解和/或分析物的溶解的任何试剂或试剂组合。
在本文中描述的免疫测定和试剂盒的情境中，“质量对照试剂”包括但不限于校准器、对照和灵敏度板。通常使用“校准器”或“标准”（例如，一个或多个，诸如多个），以便建立用于分析物（诸如，抗体或分析物）浓度的内插的校准（标准）曲线。替换地，可以使用接近预定正/负截止的单个校准器。多个校准器（即，多于一个校准器或变化量的（一个或多个）校准器）可以结合地使用以包括“灵敏度板”。
如本文中使用的“受体”指代识别并响应于内源性-化学信号的蛋白质分子。当这样的内源性-化学信号与受体结合时，它们会引起某种形式的细胞/组织响应。受体的示例包括但不限于神经受体、激素受体、营养受体和细胞表面受体。
“重组抗体”和“重组抗体”指代通过一个或多个步骤制备的抗体，该步骤包括通过重组技术来克隆将一个或多个单克隆抗体的全部或一部分编码成适当的表达载体的核酸序列，并且随后在适当的宿主细胞中表达该抗体。该术语包括但不限于：重组产生的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体（完全或部分人源化的）、由抗体片段形成的多特异性或多价结构、双功能抗体、异源偶联物Abs
[数学1]
，
以及如在本文中的（i）中描述的其他抗体。（双可变域免疫球蛋白及其制备方法在Wu,C.等人的Nature Biotechnology，25（11）：1290-1297（2007）中有所描述）。如本文中使用的术语“双功能抗体”指代下述抗体：其包括具有针对一个抗原位点的特异性的第一臂和具有针对不同抗原位点的特异性的第二臂，即，双功能抗体具有双重特异性。
如本文中使用的“样本”、“测试样本”、“生物样本”、“来自主体的样本”、“流体生物样本”和“患者样本”可以可互换地使用，并且指代包含或被怀疑包含关注分析物的流体样本。
如本文中使用的“样本阵列”指代一个或多个（或多个）检测或反应器皿的集合。
如本文中使用的，“信号生成化合物”指代在暴露于合适或适当的转化剂（诸如，信号生成基质）时可以被转化成可检测产物或可检测标记的任何分子、化合物、蛋白质等等。“可检测产物”或“可检测标记”是通过充当所检测的实体、使用本领域已知的所选技术来便于检测的任何分子、粒子等等。信号生成化合物的示例是酶，诸如淀粉酶、多核苷酸酶、精氨酸酶、腺嘌呤酶、氨基多肽酶、胃蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶、酪氨酸酶、醇脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、心肌黄酶、乙二醛酶、醛缩酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶（诸如，β-半乳糖苷酶）、磷酸酶、磷酸化酶以及己糖激酶或其组合。
如本文中使用的“信号生成基质”指代在暴露于合适或适当的转化剂（诸如，信号生成化合物）时可以被转化成或导致被转化成可检测产物或可检测标记的信号生成化合物的任何分子、化合物、蛋白质、物质、粒子等等。“可检测化合物”或“可检测标记”是通过充当所检测的实体、使用本领域已知的所选技术来便于检测的任何分子、粒子等等。信号生成基质可以是比色的、化学发光的或化学荧光的。信号生成基质的示例是酶基质，诸如：化学发光基质，诸如
[数学2]
（4-氯-3-（甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-（5'-氯）三环[3.3.1.1.sup.3,7]癸烷}-4-基）磷酸苯基二钠）
[数学3]
或（3-（4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2-（5'-氯）三环[3.3.1.1.sup.3,7]癸烷}-4-基）磷酸苯基二钠）；发光基质，诸如对硝基苯基磷酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）、4-硝基蓝四唑氯化物（NBT）或碘硝基四唑（INT）；荧光基质，诸如4-甲基伞形酮磷酸酯（4-MUP）；以及显色基质，诸如5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸二钠，或对硝基苯基磷酸酯。
如本文中可互换使用的“特异性结合搭档”或“特异性结合成员”指代两个或更多个不同分子中的一个，其特异性地识别另一个分子，与此相比，显著较少地识别其他分子。两个不同分子中的一个在表面上或在腔室中具有一区，该区与另一个分子的特定空间和极性组织特异性地结合，并且因此被定义为与该特定空间和极性组织互补。分子可以是特异性结合对的成员。例如，特异性结合成员可以包括但不限于蛋白质，诸如受体、酶和抗体。
除了常见免疫测定的抗原和抗体特异性结合对之外，其他特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白（或链霉抗生物素蛋白）、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应子和受体分子、辅因子和酶、酶和酶抑制剂等等。此外，特异性结合对可以包括作为原始特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，该抗体包括单克隆和多克隆抗体以及其复合物和片段，无论是隔离的还是重组产生的。
“固体支持物”指代不可溶的、或者可以通过随后的反应使其不可溶的任何物质。可以针对固体支持物的吸引捕获剂并且使捕获剂固定化的固有能力来挑选固体支持物。替换地，固体支持物可以具有附着到其上的联接剂，该联接剂具有吸引捕获剂并且使捕获剂固定化的能力。例如，联接剂可以包括相对于捕获剂本身或与捕获剂缀合的带电物质带相反电荷的带电物质。一般而言，联接剂可以是被固定化在（附着到）固体支持物上并且具有通过结合反应使捕获剂固定化的能力的任何结合搭档（优选地是特异性的）。在实行测定之前或在实行测定期间，联接剂使得捕获剂能够间接结合到固体支持物材料。例如，固体支持物可以是塑料、衍生的塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，包括例如试管、微量滴定孔、片、珠粒、微粒子、芯片以及本领域普通技术人员已知的其他配置。
如本文中使用的“主体”和“患者”可互换地指代任何脊椎动物，包括但不限于：哺乳动物（例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠和老鼠，非人类灵长类动物（例如，诸如食蟹猴或恒河猴之类的猴子、黑猩猩等）以及人类）。在一些实施例中，主体可以是人类或非人类。主体或患者可能正在经受其他形式的治疗。
如本文中使用的“阈值”指代在经验上确定的主观截止水平，高于该水平，所获取的数据被认为是“信号”，而低于该水平，所获取的数据被认为是“噪声”。基于CUSUM（累积和算法）的计算机程序被采用来处理所获取的数据，并且基于来自用户的阈值输入来检测事件。通过检测尽可能多的事件、接着然后出于特定目的对数据进行过滤来避免用户之间的变化。在“宽松”阈值的情况下，较少数量的事件将被计为信号。在“严格”阈值的情况下，较大数量的事件将被计为信号。将阈值设置为宽松或严格是基于针对测定的期望灵敏度或特异性、以及在给定的评估中是否将优选假阳性（false positive）或假阴性（falsenegative）的主观选择。
“治疗（treat）”、“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”在本文中均可互换地用来描述逆转、减轻或抑制疾病或者这样的术语所适用于的这样的疾病的一个或多个症状的进展。取决于主体的病状，该术语还指代预防疾病，并且包括预防疾病的发作，或者预防与疾病相关联的症状。治疗可以用急性或慢性方式来实行。该术语还指代在疾病的折磨之前降低疾病或与这样的疾病相关联的症状的严重性。在折磨之前这样预防或降低疾病的严重性指代将本发明的抗体或药物组合物施用于下述主体：该主体在施用时没有受到该疾病的折磨。“预防”还指代预防疾病或与这样的疾病相关联的一个或多个症状的复发。由于上面定义了“治疗”，因此“治疗”和“治疗地”指代正在治疗的行动。
除非以其他方式定义，本文中使用的全部技术和科学术语具有与本领域普通技术人员一般理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文档（包括定义）为准。下面描述了优选的方法和材料，尽管与本文中描述的那些类似或等同的方法和材料可以被用在本发明的实践或测试中。本文中提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考通过引用整体地被并入，以便结合出版物所记载的内容来公开和描述该方法和/或材料。本文中公开的材料、方法以及示例仅仅是说明性的而不意图是限制性的。
1光学成像系统
本发明提供了一种用于进行数字测定（诸如，数字免疫测定）的紧凑且相对低成本的装置，用以检测和/或量化样本中的关注分析物。该装置可以是手持的、或被定位在支持物表面上、或连接到相邻的处理装备并由相邻的处理装备支持。本文中描述的装置提供了优于本领域已知的常规光学成像系统的许多益处。例如，本公开的装置是紧凑的，提供更大的成像区，并且包括简化的结构等。如图1中说明的，将本发明的实施例与常规系统（例如，光学显微镜系统）进行比较。本发明的装置的大小显著地小于常规系统。例如，该装置的一种构造尺寸为12 cm×10 cm×10 cm，而常规系统尺寸为70 cm×50 cm×50 cm。在该构造中，该装置是常规系统的约五分之一。附加地，与用于常规系统的尺寸为约9 mm2的30,000个样本腔相比，本发明的装置的成像区是100,000个样本腔，其尺寸为约30 mm2。对于本发明的实施例，图像获取可以在环境条件下发生，而常规系统需要暗室。图1中示出了本发明的实施例与常规系统之间的附加比较。
本发明的装置的构造与常规系统的构造相比也不那么复杂。利用荧光成像技术来检测样本中的一个或多个关注分析物的常规系统需要用于两个通道中的每一个的多个光学过滤器、连同用于交换过滤器的致动器。本装置利用光散射成像技术以进行分析物检测，并且利用相对于样本阵列以一角度而定向的光源（包括一个或多个检测或反应器皿），因此允许使用单个过滤器并且消除在常规系统中使用的多个过滤器和致动器。附加地，可以基于被用于分析物检测的发射过滤器来选择光源的颜色，从而允许使用单个过滤器以进行分析物检测。
根据实施例，该装置包括多个组件，这些组件包括：一个或多个检测或反应器皿；光源，其被配置成朝向检测器皿发射光；单个过滤器，其被定位成接收从一个或多个检测器皿中的样本反射的、源自光源的光，并且接收来自检测器皿中的样本的输出；以及检测器，其被配置成接收反射光的一部分和传过单个过滤器的输出的一部分。
图2-5图示了根据本发明实施例的光学成像系统100。参考图4，光学成像系统100被配置成检测可以在检测器皿104（诸如，包括多个微孔或纳米孔的样本阵列）中包含关注分析物的固体支持物（例如珠粒），并且在激活样本时检测（诸如，通过使用可检测标记）来自检测器皿104中的样本的输出。
光学成像系统100可以包括用于接收检测器皿104的支持物108。系统100还包括第一光源112，并且可以包括第二光源116。第一光源112可以由单个光源或多个光源组成。第一光源112被定位在检测器皿104的上方或下方，并且相对于大体上垂直于检测器皿104延伸的轴线120以角度θ而定向。例如，大体上垂直包括：相对于检测器皿104的90度+/-约2度（即，88度至92度）。角度θ在约0度与约90度之间。在其他实施例中，角度θ在约45度与约90度之间。在另一实施例中，角度θ是80度。
第一光源112朝向检测容器104发射散射光124。第一光源112可以包括以特定波长发射光的发光二极管（LED）。例如，第一光源112可以包括以约520 nm发射光的绿色LED。散射光124从检测器皿104中的样本反射出来作为反射光128，其由过滤器132接收。过滤器132允许反射光128的一部分通过至检测器或相机136。相机136生成图像，该图像呈现明亮像素，该明亮像素在图像中可视化或者确定包含关注分析物的任何固体支持物（例如，珠粒）的方位。（一个或多个）图像有助于确定检测器皿的数量，该检测器皿包含了含有关注分析物的固体支持物和/或提供关于位置的方位的空间信息。例如，参见图6，其图示了利用如上所描述的第一光源112而生成的图像（A）和（D）。在其他构造中，可以基于该装置中使用的过滤器132来选择第一光源112的LED的颜色。
继续参考图4和图5，第二光源116被定位于检测器皿104的上方或下方，并且相对于检测器皿104大体上垂直地定向。例如，大体上垂直包括90度和+或-约2度（即，相对于检测器皿104为88度至92度）。在一些实施例中，第二光源116沿轴线120定位，而在其他实施例中，第二光源116与轴线120相邻地定位。例如，如图4中图示的（类型A），第二光源116从轴线120横向偏移，以便不干扰从样本反射的散射光和从样本发射的荧光（下面讨论的）。
第二光源116朝向检测器皿104发射激发光140。第二光源116可以包括以特定波长发射激发光的LED。例如，第二光源116可以包括以约450 nm发射光的蓝色LED。激发光140激发或激活检测器皿104中的样本。例如，如果（一个或多个）样本中存在特定分析物，则（一个或多个）样本发射输出144，诸如荧光。如果（一个或多个）样本中不存在特定分析物，则不产生输出144。过滤器132（与接收反射光128的过滤器相同）接收输出144并且允许输出144通过至相机136。相机136生成图像，该图像呈现明亮像素，该明亮像素可视化或确定哪些检测器皿包含特定的关注分析物。例如，参见图6，其图示了利用如上所述的第二光源116而生成的图像（B）和（E）。可以基于被采用以用于在样本中进行分析物检测的过滤器132来具体地选择（例如，LED颜色）第二光源116。
相机136可以是被用来捕获图像的CCD相机。相机的其他示例包括：电荷注入设备（CID）、互补金属氧化物半导体（CMOS）设备、科学CMOS（sCMOS）设备以及时间延迟集成（TDI）设备。
相机136可以电子地或通信地耦合到计算机148。计算机148包括：电子处理器（例如，微处理器、专用集成电路（ASIC）或其他合适的电子设备）、存储设备（例如，非暂时性计算机可读存储介质），以及用于通过通信网络（例如，无线）以及可选地一个或多个附加通信网络或连接进行通信的通信接口（诸如收发器）。电子处理器、存储设备和通信接口通过一个或多个通信线路或总线进行通信。应当理解的是，计算机可以包括除了上面在各种配置中描述的那些组件之外的附加组件，并且可以实行除了本申请中描述的功能之外的附加功能。例如，在一些实施例中，本文中描述的如由计算机实行的功能可以在多个设备（诸如，多个计算机和服务器）当中分发。
电子处理器执行被存储在存储设备中的指令。特别地，存储设备存储了图像分析器。图像分析器是可由电子处理器执行的软件应用。如下面所述，图像分析器在由电子处理器执行时，通过通信网络（通过通信接口）与相机136进行通信，以管理本地存储在相机136上的数据至一个或多个远程存储位置（例如，计算机中的存储设备）的迁移。
图像分析器接收由相机136生成的图像的输入。图像分析器可以处理图像以将它们组合成合并图像，该合并图像图示了检测器皿104中的样本的珠粒和酶位置。例如，参见图6，其利用经分析和经合并的图像图示了图像（C）和（F）。具体地，图像（C）是图6中的图像（A）和（B）的经分析和经合并的图像。类似地，图像（F）是图6中的图像（D）和（E）的经分析和经合并的图像。
2. 用于分析物分析的方法
本文中还提供了用于分析物分析的方法。该方法可以涉及单分子计数。在某些实施例中，用于分析物分析的方法可以涉及评估样本中存在的关注分析物。在某些实施例中，评估可以被用于确定样本中的关注分析物的存在和/或浓度。在某些实施例中，该方法还可以被用于确定样本中的多个不同的关注分析物的存在和/或浓度。
本文中提供了用于检测液体液滴中的关注分析物的方法（其中关注分析物来自测试或生物样本）。该方法包括：提供包含关注分析物的第一液体液滴；提供包含至少一个固体支持物（诸如例如，磁性固体支持物（诸如珠粒））的第二液体液滴，该固体支持物包含与关注分析物结合的特异性结合成员；使用能量来施加力以操控第一液体液滴（其包含关注分析物）与第二液体（包含至少一个固体支持物）以产生混合物（在本文中也被称为“反应混合物”）；将全部混合物或至少一部分混合物移动到孔阵列（其中阵列的一个或多个孔具有足够的大小来容纳至少一个固体支持物）；在将混合物的一部分移动到孔阵列之前、之后或者在其之前或之后两者，将至少一个可检测标记添加至混合物；以及检测孔中的关注分析物。孔阵列在本文中也被被称为“检测器皿”。
在一些实施例中，孔可以是微孔阵列或纳米孔阵列。在一些实施例中，微孔阵列或纳米孔阵列具有至少约4 mm、至少约5 mm、至少约6 mm、至少约7 mm、至少约8 mm、至少约9mm或者至少约10 mm的直径。在一些实施例中，微孔阵列具有6 mm的直径。在一些实施例中，微孔阵列或纳米孔阵列包含近似100,000至近似1,000,000个孔、近似200,000至近似750,000个孔，或者近似300,000至近似500,000个孔。在一些实施例中，微孔阵列包含约100,000、约200,000、约300,000、约350,000、约375,000、约400,000、约425,000、约450,000、约475,000、约500,000、约600,000、约700,000、约800,000、约900,000或者约1,000,000个孔。在一些实施例中，微孔阵列包含400,000个孔。在一些实施例中，孔可以在孔的底部处具有至少约1μM的直径、至少约2μM的直径、至少约3μM的直径、至少约4μM的直径、至少约5μM的直径、至少约6μM的直径、至少约7μM的直径、至少约8μM的直径、至少约9μM的直径或者至少约10μM的直径。在一些实施例中，多个反应器皿可以是微孔阵列或纳米孔阵列，其具有6 mm的直径并且包含在孔的底部处具有5μm的直径的近似400,000个孔。
在某些实施例中，“使用能量来施加力以操控第一液体液滴与第二液体液滴”指代使用非机械力（即，例如，在不使用泵和/或阀的情况下产生的能量）以提供或施加将至少第一和第二液体液滴（以及可选地，附加液滴）操控（诸如，合并或组合）成混合物的力。可以被用在本文中描述的方法中的非机械力的示例包括：电致动力（诸如，液滴致动、电泳、电润湿、介电电泳、静电致动、电场介导、电极介导、毛细管力、色谱、离心或抽吸）和/或声学力（诸如表面声波（或“SAW”））。在某些实施例中，所生成的电致动力是交流电。例如，交流电可以具有10 V、15 V、20 V、25 V、30 V、35 V或更高的均方根（rms）电压。例如，这样的交流电可以具有10 V或更高、15 V或更高、20 V或更高、25 V或更高、30 V或更高或者35 V或更高的rms电压。替换地，交流电可以具有射频范围内的频率。
在某些实施例中，如果使用磁性固体支持物，则可以应用电致动力和磁场，以及相对于混合物的至少一部分从相反方向应用电致动力和磁场。在某些其它实施例中，混合物是通过下述方式来混合的：将其以圆形图案来回移动，或者通过将其拆分成两个或更多个子混合物并且然后将子混合物合并。在某些其他实施例中，可以使用一系列或多个电极（即，至少两个或更多个、至少三个或更多个、至少四个或更多个、至少五个或更多个、至少六个或更多个、至少七个或更多、至少八个或更多个、至少九个或更多个、至少十个或更多个、至少十一个或更多个、至少十二个或更多个、至少十三个或更多个、至少十四个或更多个、至少十五个或更多个等）来生成电致动力，以将混合物移动到孔阵列以便密封这些孔（其装载有至少一个固体支持物）。
在某些实施例中，将全部混合物或至少一部分混合物移动到孔阵列导致了将至少一个固体支持物装载（填充和/或放置）到孔阵列中。在某些实施例中，磁场被用来便于移动混合物，并且因此便于将至少一个固体支持物移动到阵列的一个或多个孔中。在某些实施例中，在将至少一个固体支持物装载到孔中之后，可以使用本领域已知的惯常技术来去除未装载到孔中的任何固体支持物。例如，这样的去除可以涉及利用一系列或多个电极来生成电致动力（诸如，本文中先前描述的电致动力）以将流体液滴（诸如，可极化的流体液滴）移动到孔阵列，从而将混合物的至少一部分从孔阵列移动一定距离（其长度不是关键性的）。在某些实施例中，含水洗涤液体可以被用来去除未与任何关注分析物结合的固体支持物。在这样的实施例中，该去除涉及利用一系列或多个电极来生成电致动力，从而使含水洗涤（或洗涤）液滴（第三液滴）跨孔阵列而移动。用于所述洗涤的含水液体的量和类型不是关键性的。
在某些实施例中，该方法中的混合物是含水液体。在其他实施例中，混合物是不可混合的液体。在其他实施例中，液体液滴是疏水性液体液滴。在其他实施例中，液体液滴是亲水性液体液滴。在某些实施例中，该方法中使用的孔阵列具有疏水性表面。在其他实施例中，孔阵列具有亲水性表面。
在某些实施例中，该方法中使用的第一液体液滴是可极化液体。在某些实施例中，该方法中使用的第二液体液滴是可极化液体。在某些实施例中，该方法中使用的第一和第二液体液滴是可极化液体。在某些实施例中，混合物是可极化液体。在某些实施例中，第一液滴、第二液滴和混合物中的一个或多个是可极化液体。
在某些实施例中，至少一个固体支持物包含与关注分析物特异性地结合的至少一个特异性结合成员。在某些实施例中，在将混合物的至少一部分移动到孔阵列之前，将可检测标记添加到混合物。在某些其他实施例中，在移动关注分析物的至少一部分之后，将可检测标记添加到混合物。在某些实施例中，可检测标记包括与关注分析物特异性地结合的至少一个特异性结合成员。在某些实施例中，可检测标记包括：发色团、荧光化合物、酶、化学发光化合物或放射性化合物。在某些实施例中，特异性结合成员是受体、适体或抗体。在某些实施例中，该方法进一步包括：使用毛细管元件将混合物的至少一部分定位在孔阵列上，该毛细管元件被配置成便于将混合物移动到孔阵列。
在某些实施例中，当混合物是液体并且在将混合物移动到孔阵列之后，在孔内产生水相。在某些实施例中，可以通过添加一个或多个溶剂来密封孔（“溶剂孔密封”）。可以使用亲水性或疏水性溶剂。可以使用的亲水性溶剂包括亲水醇、亲水醚、酮、腈溶剂、二甲基亚砜，以及N，N-二甲基甲酰胺或者其混合物。亲水醇的示例包括乙醇、甲醇、丙醇和甘油。亲水醚的示例包括四氢呋喃、聚环氧乙烷和1,4-二恶烷。酮的示例包括丙酮和甲基乙基酮。腈溶剂的示例包括乙腈。可以使用的疏水性溶剂包括烃、不饱和烃、芳烃、硅油、全氟化碳、卤素溶剂、疏水性离子液体及其混合物。饱和烃的示例包括：烷烃，诸如癸烷和十六烷。不饱和烃的示例包括角鲨烯。芳烃的示例包括苯和甲苯。全氟化碳的示例涵盖
[数学4]
FC-40、FC-72、FC-84、FC-77、FC-3255、FC-3283、FC-43、FC-70）、3M Novec 4200、3MNovec 4300、3M FC-4432、3M FC-4430或3M FC-4434。卤素溶剂的示例涵盖氯仿、二氯甲烷和氯苯。疏水性离子液体表示至少在水中不解离的离子液体。离子液体的示例包括1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐。
由于亲水性或疏水性溶剂的密度比水相更重，因此在添加了溶剂之后，它会朝向孔的底部移动并且替代水相，从而迫使其至表面，并且在上部水相与下部溶剂相之间产生清楚的分离。可以使用本领域已知的惯常技术来去除上部水相。
在某些实施例中，使用第1部分中描述的光学成像系统来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用微流体设备来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用数字微流体设备（DMF）来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用基于表面声波的微流体设备（SAW）来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用集成式DMF和分析物检测设备来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用集成式基于表面声波的微流体设备和分析物检测设备来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用基于机器人的测定处理单元来实行本文中描述的方法。
本文中提供了用于检测液体液滴中的关注分析物的方法（其中关注分析物来自测试或生物样本）。该方法包括：提供包含关注分析物的第一液体液滴；提供包含至少一个可检测标记的第二液体液滴，该可检测标记包含与关注分析物结合的特异性结合成员；使用能量来施加力以操控第一液体液滴（其包含关注分析物）与第二液体（包含至少一个固体支持物）以产生混合物（即，包含分析物/可检测标记特异性结合成员复合物的反应混合物）；将全部混合物或至少一部分混合物移动到孔阵列（其中阵列的一个或多个孔具有足够的大小以容纳至少一个固体支持物）；可选地使用一种或多种溶剂来密封孔；以及检测孔中的关注分析物。在某些实施例中，“使用能量来施加力以操控第一液体液滴与第二液体液滴”指代使用非机械力（即，例如，在不使用泵和/或阀的情况下产生的能量）以提供或施加将至少第一和第二液体液滴（以及可选地，附加液滴）操控（诸如，合并或组合）成混合物的力。可以被用在本文中描述的方法中的非机械力的示例包括：电致动力（诸如液滴致动、电泳、电润湿、介电电泳、静电致动、电场介导、电极介导、毛细管力、色谱、离心或抽吸）和/或声学力（诸如表面声波（或“SAW”））。在某些实施例中，所生成的电致动力是交流电。例如，交流电可以具有10 V、15 V、20 V、25 V、30 V、35 V或更高的均方根（rms）电压。例如，这样的交流电可以具有10 V或更高、15 V或更高、20 V或更高、25 V或更高、30 V或更高或者35 V或更高的rms电压。替换地，交流电可以具有射频范围内的频率。
在某些实施例中，混合物是通过下述方式来混合的：将其以圆形图案来回移动，或者通过将其拆分成两个或更多个子混合物并且然后将子混合物合并。在某些其他实施例中，可以使用一系列或多个电极（即，至少两个或更多个、至少三个或更多个、至少四个或更多个、至少五个或更多个、至少六个或更多个、至少七个或更多、至少八个或更多个、至少九个或更多个、至少十个或更多个、至少十一个或更多个、至少十二个或更多个、至少十三个或更多个、至少十四个或更多个、至少十五个或更多个等）来生成电致动力，以将混合物移动到孔阵列以便密封这些孔（其装载有至少一个固体支持物）。
在某些实施例中，将全部混合物或至少一部分混合物移动到孔阵列导致了将分析物/可检测标记特异性结合成员复合物装载（填充和/或放置）到孔阵列中。在某些实施例中，磁场被用来便于移动混合物，并且因此便于将至少一个分析物/可检测的标记物特异性结合成员复合物移动到阵列的一个或多个孔中。例如，这样的去除可以涉及利用一系列或多个电极来生成电致动力（诸如，本文中先前描述的电致动力）以将流体液滴（诸如，可极化的流体液滴）移动到孔阵列，从而将混合物的至少一部分从孔阵列移动一定距离（其长度不是关键性的）。在某些实施例中，含水洗涤液体可以被用来去除未与任何分析物结合的任何可检测的标记特异性结合成员。在这样的实施例中，该去除涉及利用一系列或多个电极来生成电致动力，从而使含水洗涤（或洗涤）液滴（第三液滴）跨孔阵列而移动。用于所述洗涤的含水液体的量和类型不是关键性的。
在某些实施例中，该方法中的混合物是含水液体。在其他实施例中，混合物是不可混合的液体。在其他实施例中，液体液滴是疏水性液体液滴。在其他实施例中，液体液滴是亲水性液体液滴。在某些实施例中，该方法中使用的孔阵列具有疏水性表面。在其他实施例中，孔阵列具有亲水性表面。
在某些实施例中，该方法中使用的第一液体液滴是可极化液体。在某些实施例中，该方法中使用的第二液体液滴是可极化液体。在某些实施例中，该方法中使用的第一和第二液体液滴是可极化液体。在某些实施例中，混合物是可极化液体。在某些实施例中，第一液滴、第二液滴和混合物中的一个或多个是可极化液体。
在某些实施例中，可检测标记与至少一个固体支持物结合。在某些实施例中，可检测标记包括：发色团、荧光化合物、酶、化学发光化合物或放射性化合物。在某些实施例中，特异性结合成员是受体、适体或抗体。在某些实施例中，该方法进一步包括：使用毛细管元件将混合物的至少一部分定位在孔阵列上，该毛细管元件被配置成便于将混合物移动到孔阵列。
在某些实施例中，当混合物是液体并且在将混合物移动到孔阵列之后，在孔内产生水相。在某些实施例中，可以通过添加一个或多个溶剂来密封孔，如本文中先前讨论的。
在某些实施例中，使用本文中描述的紧凑的数字免疫测定装置来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用微流体设备来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用数字微流体设备（DMF）来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用基于表面声波的微流体设备（SAW）来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用集成式DMF和分析物检测设备来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用集成式基于表面声波的微流体设备和分析物检测设备来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用基于机器人的测定处理单元来实行本文中描述的方法。
本文中提供了用于测量液滴中的关注分析物的方法（其中关注分析物来自测试或生物样本）。该方法包括：提供包含关注分析物的第一液体液滴；提供包含至少一个固体支持物（诸如例如，磁性固体支持物（诸如珠粒））的第二液体液滴，该固体支持物包含与关注分析物结合的特异性结合成员；使用能量来施加力以操控第一液体液滴（其包含关注分析物）与第二液体（包含至少一个固体支持物）以产生混合物（在本文中也被称为“反应混合物”）；将全部混合物或至少一部分混合物移动到孔阵列（其中阵列的一个或多个孔具有足够的大小来容纳至少一个固体支持物）；在将混合物的一部分移动到孔阵列之前、之后或者在其之前或之后两者，将至少一个可检测标记添加至混合物；可选地使用一种或多种溶剂来密封孔阵列；以及测量孔中的关注分析物。在某些实施例中，“使用能量来施加力以操控第一液体液滴与第二液体液滴”指代使用非机械力（即，例如，在不使用泵和/或阀的情况下产生的能量）以提供或施加将至少第一和第二液体液滴（以及可选地，附加液滴）操控（诸如，合并或组合）成混合物的力。可以用在本文中描述的方法中的非机械力的示例包括：电致动力（诸如，液滴致动、电泳、电润湿、介电电泳、静电致动、电场介导、电极介导、毛细管力、色谱、离心或抽吸）和/或声学力（诸如，表面声波（或“SAW”））。在某些实施例中，所生成的电致动力是交流电。例如，交流电可以具有10 V、15 V、20 V、25 V、30 V、35 V或更高的均方根（rms）电压。例如，这样的交流电可以具有10 V或更高、15 V或更高、20 V或更高、25 V或更高、30 V或更高或者35 V或更高的rms电压。替换地，交流电可以具有射频范围内的频率。
在某些实施例中，如果使用磁性固体支持物，则可以应用电致动力和磁场，以及相对于混合物的至少一部分从相反方向应用电致动力和磁场。在某些其它实施例中，混合物是通过下述方式来混合的：将其以圆形图案来回移动，或者通过将其拆分成两个或更多个子混合物并且然后将子混合物合并。在某些其他实施例中，可以使用一系列或多个电极（即，至少两个或更多个、至少三个或更多个、至少四个或更多个、至少五个或更多个、至少六个或更多个、至少七个或更多、至少八个或更多个、至少九个或更多个、至少十个或更多个、至少十一个或更多个、至少十二个或更多个、至少十三个或更多个、至少十四个或更多个、至少十五个或更多个等）来生成电致动力，以将混合物移动到孔阵列中以便密封这些孔（其装载有至少一个固体支持物）。
在某些实施例中，将全部混合物或至少一部分混合物移动到孔阵列中导致了将至少一个固体支持物装载（填充和/或放置）到孔阵列中。在某些实施例中，磁场被用来便于移动混合物，并且因此便于将至少一个固体支持物移动到阵列的一个或多个孔中。在某些实施例中，在将至少一个固体支持物装载到孔中之后，可以使用本领域已知的惯常技术来去除未装载到孔中的任何固体支持物。例如，这样的去除可以涉及利用一系列或多个电极来生成电致动力（诸如，本文中先前描述的电致动力）以将流体液滴（诸如，可极化的流体液滴）移动到孔阵列，从而将混合物的至少一部分从孔阵列移动一定距离（其长度不是关键性的）。在某些实施例中，含水洗涤液体可以被用来去除未与任何关注分析物结合的固体支持物。在这样的实施例中，该去除涉及利用一系列或多个电极来生成电致动力，从而使含水洗涤（或洗涤）液滴（第三液滴）跨孔阵列而移动。用于所述洗涤的含水液体的量和类型不是关键性的。
在某些实施例中，该方法中的混合物是含水液体。在其他实施例中，混合物是不可混合的液体。在其他实施例中，液体液滴是疏水性液体液滴。在其他实施例中，液体液滴是亲水性液体液滴。在某些实施例中，该方法中使用的孔阵列具有疏水性表面。在其他实施例中，孔阵列具有亲水性表面。
在某些实施例中，该方法中使用的第一液体液滴是可极化液体。在某些实施例中，该方法中使用的第二液体液滴是可极化液体。在某些实施例中，该方法中使用的第一和第二液体液滴是可极化液体。在某些实施例中，混合物是可极化液体。在某些实施例中，第一液滴、第二液滴和混合物中的一个或多个是可极化液体。
在某些实施例中，至少一个固体支持物包含与关注分析物特异性地结合的至少一个特异性结合成员。在某些实施例中，在将混合物的至少一部分移动到孔阵列之前，将可检测标记添加到混合物。在某些其他实施例中，在将关注分析物的至少一部分移动到孔阵列之后，将可检测标记添加到混合物。在某些实施例中，可检测标记包括与关注分析物特异性地结合的至少一个特异性结合成员。在某些实施例中，可检测标记包括：发色团、荧光化合物、酶、化学发光化合物或放射性化合物。在某些实施例中，特异性结合成员是受体、适体或抗体。在某些实施例中，该方法进一步包括：使用毛细管元件将混合物的至少一部分定位在孔阵列上，该毛细管元件被配置成便于将混合物移动到孔阵列。
在某些实施例中，当混合物是液体并且在将混合物移动到孔阵列之后，在孔内产生水相。在某些实施例中，可以通过添加一个或多个溶剂来密封孔，如本文中先前讨论的。
在某些实施例中，使用第1节中描述的光学成像系统来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用微流体设备来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用数字微流体设备（DMF）来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用基于表面声波的微流体设备（SAW）来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用集成式DMF和分析物检测设备来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用集成式基于表面声波的微流体设备和分析物检测设备来实行本文中描述的方法。在某些实施例中，使用基于机器人的测定处理单元来实行本文中描述的方法。
在某些实施例中，测量首先涉及确定阵列孔中的固体支持物的总数（“总计固体支持物数量”）。接下来，确定包含可检测标记的阵列孔中的固体支持物的数量，诸如例如确定由可检测标记产生的信号的强度（“阳性”）。从总体固体支持物数量中减去阳性，以提供不包含可检测标记或未被检测到的（“阴性”）孔阵列中的固体支持物的数量。然后，可以确定孔阵列中的阳性与阴性的比率，并且然后将其与校准曲线进行比较。替换地，使用泊松方程P（x；μ）进行数字量化，如下所示：
其中：
e：A是等于近似2.71828的常数，
μ：是在指定区域中出现的平均成功次数，以及
x：是在指定区域中出现的实际成功次数。
被用在本文中描述的方法中的样本可以是包含或被怀疑包含关注分析物的任何测试样本。如本文中使用的，“分析物”、“靶分析物”、“关注分析物”可互换地使用，并且指代在本文中公开的方法和设备中测量的分析物。下面进一步描述了关注分析物。
如本文中使用的，“接触”及其语法等同物指代任何类型的组合动作，其使特异性结合成员与样本中的关注分析物充分地紧密接近，使得如果样本中存在特异于特异性结合成员的关注分析物，则将发生结合相互作用。接触可以用各种各样不同的方式来实现，包括将样本与特异性结合成员进行组合、通过将结合成员引入至分析物附近而将靶分析物暴露于特异性结合成员等等。
在某些情况下，第一特异性结合成员可以被固定化在固体支持物上。如本文中使用的，术语“固定化”指代第一特异性结合成员与固体支持物的表面的稳定缔合。通过说“稳定缔合”，其意指两个实体之间的物理缔合，其中缔合的平均半衰期例如在生理条件下为一天或更长。在某些方面，两个实体之间的物理缔合具有两天或更长、一周或更长、一个月或更长、包括六个月或更长（例如，在4℃下的PBS中为1年或更长）的平均半衰期。根据某些实施例，稳定缔合起因于两个实体之间的共价键、两个实体之间的非共价键（例如，离子键或金属键），或其他形式的化学吸引（诸如，氢结合、范德华力等等）。
具有在其上将特异性结合成员固定化的表面的固体支持物可以是平面或非平面构象中的任何方便的表面，诸如微流体芯片的表面、腔的内表面、珠粒的外表面（如本文中定义的）或多孔珠粒的内表面和/或外表面。例如，第一特异性结合成员可以共价或非共价地附着到珠粒，例如乳胶、琼脂糖、琼脂糖凝胶、链霉抗生物素蛋白、甲苯磺酸化、环氧树脂、聚苯乙烯、氨基珠粒、胺珠粒、羧基珠粒等等。在某些实施例中，珠粒可以是粒子，例如，微粒子。在一些实施例中，微粒子可以在约0.1 nm至约10微米之间、约50 nm至约5微米之间、约100 nm至约1微米之间、约0.1 nm至约700 nm之间、约500 nm至约10微米之间、约500 nm至约5微米之间、约500 nm至约3微米之间、约100 nm至700 nm之间、或者约500 nm至700 nm之间。例如，微粒子可以是约4-6微米、约2-3微米、或约0.5-1.5微米。小于约500 nm的粒子有时被认为是纳米粒子。因此，微粒子可选地可以是在约0.1 nm至约500 nm之间、约10 nm至约500 nm之间、约50 nm至约500 nm之间、约100 nm至约500 nm之间、约100 nm、约150 nm、约200 nm、约250 nm、约300 nm、约350 nm、约400 nm、约450 nm或约500 nm的纳米粒子。
在某些实施例中，珠粒可以是磁性珠粒或磁性粒子。在某些实施例中，珠粒可以是磁性纳米珠粒、纳米粒子、微珠粒或微粒子。磁性珠粒/粒子可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。示例性的铁磁性材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO和NiO/Fe。亚铁磁性材料的示例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4（或FeO·Fe2O3）。珠粒可以具有磁性的固体核心部分并且被一个或多个非磁性层包围。替换地，磁性部分可以是非磁芯周围的层。在其上将第一特异性结合成员固定化的固体支持物可以以干燥形式或以液体形式存储。磁性珠粒可以在利用在其上将第一特异性结合成员固定化的磁性珠粒来与样本接触之前或之后受磁场的影响。
在接触步骤之后，可以将样本和第一特异性结合成员培养达足够的时间段，以允许特异性结合成员与分析物之间发生结合相互作用。附加地，该培养可以处于便于特异性结合相互作用的结合缓冲液中。通过变化结合缓冲液，可以在测定中操控或更改第一特异性结合成员和/或第二特异性结合成员的结合亲和性和/或特异性。在一些实施例中，可以通过改变结合缓冲液来增加结合亲和性和/或特异性。在一些实施例中，可以通过改变结合缓冲液来降低结合亲和性和/或特异性。
可以使用下面描述的所公开的方法和设备来测量第一特异性结合成员和/或第二特异性结合成员的结合亲和性和/或特异性。在一些实施例中，使用一组条件来对一份样本进行测定，并且将其与使用不同组条件来测定的另一份样本进行比较，从而确定该条件对结合亲和性和/或特异性的影响。例如，改变或更改条件可以是下述各项中的一个或多个：从样本中去除靶分析物、添加针对结合而与靶分析物或配体竞争的分子，以及改变pH、盐浓度或温度。附加地或替换地，持续时间可以是变量，并且改变条件可以包括在再次实行检测方法之前等待长达持续时间。
结合缓冲液可以包括对于抗原-抗体结合缓冲液是标准的分子，诸如白蛋白（例如BSA）、非离子型去污剂（Tween-20，Triton X-100）和/或蛋白酶抑制剂（例如PMSF）。在某些情况下，可以在添加样本之前或之后将结合缓冲液添加到微流体芯片、腔等中。在某些情况下，第一特异性结合成员可以在与样本接触之前存在于结合缓冲液中。结合成员与分析物之间发生结合相互作用的时间长度可以在经验上确定，并且可以取决于结合成员与分析物之间的结合亲和性和结合亲合力。在某些实施例中，接触或培养可以是长达5秒至1小时的时段，诸如10秒至30分钟、或1分钟至15分钟、或5分钟至10分钟，例如10秒、15秒、30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时或2小时。针对结合相互作用的其他条件（诸如温度、盐浓度）也可以在经验上确定，或者可以基于制造商的用法说明。例如，接触可以在室温（21℃-28℃，例如23℃-25℃）、37℃或4℃下实施。在某些实施例中，可以在接触步骤期间实施样本与第一特异性结合成员的可选混合。
在固定化的第一特异性结合成员与分析物之间的复合物形成之后，可以将任何未结合的分析物连同样本一起从第一特异性结合成员的附近去除，同时由于该复合物与固体支持物的缔合，可以保留第一特异性结合成员与分析物的复合物。可选地，可以使固体支持物与洗涤缓冲液接触以去除与固体支持物非特异性地结合的任何分子。
在第一接触步骤以及可选的样本去除和/或可选的洗涤步骤之后，第一特异性结合成员与分析物的复合物可以与第二特异性结合成员接触，从而导致形成三明治式复合物，其中该分析物通过两个特异性结合成员来结合。可以在第二接触步骤期间实施第二成员与第一特异性结合成员-分析物复合物的可选混合。在一些实施例中，分析物分子相对于表面的固定化可以有助于从溶液中去除任何过量的第二特异性结合成员，而无需担心从该表面中除去分析物分子。在一些实施例中，第二特异性结合成员可以包括可检测标记，该可检测标记包括一个或多个信号产生物质，诸如发色团、荧光化合物、化学发光化合物、酶、放射性化合物等等。
如上面指出的，可以在足以在分析物与第二特异性结合成员之间进行结合相互作用的条件下实施第二接触步骤。在第二接触步骤之后，可以去除任何未结合的第二特异性结合成员，接着是可选的洗涤步骤。任何未结合的第二特异性结合成员可以通过合适的手段与第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员的复合物分离，该手段诸如液滴致动、电泳、电润湿、介电电泳、静电致动、电场介导、电极介导、毛细管力、色谱、离心、抽吸或SAW。在从第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员的复合物附近去除任何未结合的第二特异性结合成员时，附着到存在于第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员的复合物中的第二特异性结合成员的可检测标记可以通过合适的手段来分离，或者可以使用本领域已知的技术来检测。在一些实施例中，可检测标记包括下述可检测标记：其包括一个或多个信号产生物质，诸如发色团、荧光化合物、酶、化学发光化合物、放射性化合物等等。替换地，在一些实施例中，如果可检测标记包括标签，则该标签可以从去除了未结合的试剂之后剩余的复合物中切割或解离。例如，标签可以经由可切割联接器（如本文中描述的“可切割联接器”）而附着到第二特异性结合成员。第一特异性结合成员-分析物-第二特异性结合成员的复合物可以暴露于切割剂，该切割剂对可切割联接器的切割进行介导。
如本文中指出的，标签可以包括核酸。在某些实施例中，分析物的量化不包括通过确定标签中存在的核酸序列的至少一部分的身份（identity）来确定标签的身份。例如，计数步骤可以不包括确定标签的序列。在其他实施例中，可以不对标签进行排序，然而，可以在基于与标签相关联的可区分信号（由于标签的大小、构象、电荷、电荷量等等）而将一个标签与另一标签区分开的程度上来确定标签的身份。标签的标识可能在涉及同时分析样本中的多个不同分析物（例如，样本中的两个、三个、四个或更多个不同分析物）的方法中是有用的。
在某些实施例中，可以通过使用多个不同的第一和第二特异性结合成员来实行对单个样本中的多个分析物的同时分析，其中一对第一和第二特异性结合成员特异于样本中的单个分析物。在这些实施例中，与特异于单个分析物的第一对第一和第二特异性结合成员的第二特异性结合成员相关联的可检测标记可以与下述可检测标记区分开：该可检测标记与特异于不同分析物的第二对第一和第二特异性结合成员的第二特异性结合成员相关联。如上面指出的，基于信号产生物质等方面的差异，第一可检测标记可以是可与第二可检测标记区分开的。
在一些实施例中，可以基本上准确确定的流体样本中的分析物的浓度小于约5000fM（飞摩尔）、小于约3000 fM、小于约2000 fM、小于约1000 fM、小于约500 fM、小于约300fM、小于约200 fM、小于约100 fM、小于约50 fM、小于约25 fM、小于约10 fM、小于约5 fM、小于约2 fM 、小于约1 fM、小于约500 aM（阿托摩尔）、小于约100 aM、小于约10 aM、小于约5 aM、小于约1 aM、小于约0.1 aM、小于约500 zM（仄普托摩尔）、小于约100 zM、小于约10zM、小于约5 zM、小于约1 zM、小于约0.1 zM或更小。
在一些情况下，检测的限制（例如，可以在溶液中确定的分析物的最低浓度）为约100 fM、约50 fM、约25 fM、约10 fM、约5 fM、约2 fM、约1 fM、约500 aM（阿托摩尔）、约100aM、约50 aM、约10 aM、约5 aM、约1 aM、约0.1 aM、约500 zM（仄普托摩尔）、约100 zM、约50zM、约10 zM、约5 zM、约1 zM、约0.1 zM或更小。在一些实施例中，可基本上准确确定的流体样本中的分析物的浓度在约5000 fM至约0.1 fM之间、约3000 fM至约0.1 fM之间、约1000fM至约0.1 fM之间、约1000 fM至约0.1 zM之间、约100 fM至约1 zM之间、约100 aM至约0.1zM之间或更小。
检测的上限（例如，可以在溶液中确定的分析物的上限浓度）为至少约100 fM、至少约1000 fM、至少约10 pM（微微摩尔）、至少约100 pM、至少约100 pM、至少约10 nM（纳摩尔）、至少约100 nM、至少约1000 nM、至少约10μM、至少约100μM、至少约1000μM、至少约10mM、至少约100 mM、至少约1000 mM或更高。
在一些情况下，可以通常在少于约1小时（例如45分钟、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟、1分钟或30秒）内快速地检测样本中的分析物的存在和/或浓度。
在某些实施例中，可以使用第1部分中描述的光学成像系统来实行本文中描述的至少一些方法。在某些实施例中，本文中描述的方法中的至少一些步骤可以在数字集成式微流体和分析物检测设备上实施，该设备诸如本文中描述的设备。在某些实施例中，使用数字集成式微流体设备结合分析物检测设备来执行本公开的方法。例如，数字微流体设备和分析物检测设备可以是单独的设备，并且可以在微流体设备中生成包含可检测标记的液滴，并且将其输送至分析物检测设备。
在某些实施例中，使用其中数字微流体模块与分析物检测设备（诸如，下面描述的设备）集成的设备来实施本公开的方法。在某些实施例中，数字集成式微流体模块和分析物检测设备可以可逆地集成。例如，两个模块可以物理地组合以形成集成设备，并且然后可以将该设备分离成个体模块。在某些实施例中，使用一次性套筒（cartridge）来实施本公开的方法，该一次性套筒包括具有内置分析物检测设备的微流体模块。被用于实行本文中提供的方法的设备的示例性实施例将在下一部分中进一步描述。
本方法的示例性实施例包括：将包含关注分析物的样本液滴与包含第一特异性结合成员的液滴合并，该第一特异性结合成员与关注分析物结合并且可以被固定化在固体支持物（例如，磁性粒子或珠粒）上。可以将单个合并的液滴培养达足够的时间段，以允许第一特异性结合成员与关注分析物结合。可选地，可以搅动该单个液滴以促进样本与第一特异性结合成员的混合。混合可以通过来回移动单个液滴、在多个电极上四处移动单个液滴、拆分液滴并且然后将液滴合并，或者使用SAW等等来实现。接下来，单个液滴可以受到磁力的影响以将珠粒保留在该设备中的位置处，同时可以将该液滴移开并且利用包含第二特异性结合成员的液滴来替换，该第二特异性结合成员可以可选地包含可检测标记。在添加了第二特异性结合成员之前，可以通过使用磁力将洗涤缓冲液的液体移动到保留了珠粒的位置来实行可选的洗涤步骤。在足以使第二特异性结合成员来结合与第一特异性结合成员相结合的分析物达一时间段之后，可以去除掉包含第二特异性结合成员的液滴，同时将珠粒保留在第一位置处。可以使用洗涤缓冲液的液滴来洗涤珠粒。在洗涤步骤之后，可以去除磁力，并且将包含经标记的珠粒（包含第一特异性结合成员/分析物/第二特异性结合成员-可选的可检测标记）的液滴移动到检测模块，诸如本文中描述的检测模块。允许经标记的珠粒沉降到检测模块中的孔阵列中。可以经由重力或通过应用电力或磁力使珠粒沉降。在洗涤步骤去除了没有位于孔内部的任何珠粒之后，可以使用溶剂（诸如疏水性液体，诸如油）来密封孔。在上面的实施例中，可选地，在组合之后，可以操控液滴（例如，来回移动、在圆形方向上移动、振荡、拆分/合并、暴露于SAW等）来便于样本与测定试剂（诸如，第一特异性结合成员、第二特异性结合成员等）的混合。在其中可检测标记是酶的实施例中，可以在将复合物移动至孔阵列之前或之后添加基质。
移动集成式微流体和分析物检测设备中的液滴可以使用电力（例如，电润湿、介电电泳、电极介导、光电润湿、电场介导和静电致动）压力、表面声波等等来实施。被用于移动液滴的力可以基于该设备的细节（这些细节在下面的部分中描述）来确定，并且针对本文中描述的特定设备来确定。
在一些实施例中，一个或多个检测到的信号对应于特异性结合成员与分析物的结合事件。在一些实施例中，一个检测到的信号对应于特异性结合成员与分析物的结合事件。在一些实施例中，两个或更多个检测到的信号对应于特异性结合成员与分析物的结合事件。
在一些实施例中，将包括第一特异性结合成员和第二特异性结合成员的固体支持物按顺序或同时添加至样本。
分析物的检测通过可检测产物或可检测标记（即，由至少一个信号生成化合物和至少一个信号生成基质所生成的信号）而相关。在一些实施例中，该至少一个信号生成化合物是酶，并且该至少一个信号生成基质是用于酶的基质。在一些实施例中，用于酶的基质是比色、荧光（非荧光）基质或发色基质。在一些实施例中，可检测信号是荧光信号。例如，酶可以是多核苷酸酶、精氨酸酶、腺嘌呤酶、氨基多肽酶、胃蛋白酶、脂肪酶、过氧化氢酶、酪氨酸酶、醇脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、心肌黄酶、乙二醛酶、醛缩酶、葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶（诸如，β-半乳糖苷酶）、磷酸酶、磷酸化酶以及己糖激酶或其组合。可以使用的酶基质的示例包括化学发光基质，诸如
[数学5]
（4-氯-3-（甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-（5'-氯）三环[3.3.1.1.sup.3,7]癸烷}-4-基）磷酸苯基二钠），
[数学6]
或（3-（4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2-（5'-氯）三环[3.3.1.1.sup.3,7]癸烷}-4-基）磷酸苯基二钠）；发光基质，诸如对硝基苯基磷酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）、4-硝基蓝四唑氯化物（NBT）或碘硝基四唑（INT）；荧光基质，诸如4-甲基伞形酮磷酸酯（4-MUP）；以及显色基质，诸如5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸二钠，或对硝基苯基磷酸酯。
在一些方面，可以使用的酶包括下述这些酶：它们包含与酶的活性结合位点以外的位点结合的抑制剂分子（诸如蛋白质、肽等）。这样的抑制剂分子改变酶的活性结合位点的构象并且防止其与基质结合。抑制剂分子的示例包括蛋白酶抑制剂。可以使用本领域已知的惯常技术从酶中去除抑制剂，以允许酶与基质结合，从而允许发生信号生成反应。
在一些实施例中，酶可以将非荧光基质转化为荧光基质。在一些实施例中，酶可以使用发色基质来生成颜色。
3. 特异性结合成员
如本领域技术人员领会的，特异性结合成员将通过待分析的分析物确定。针对多种多样的靶分子的特异性结合成员是已知的，或者可以使用已知技术而被容易地发现或开发。例如，当靶分析物是蛋白质时，特异性结合成员可以包括蛋白质、特别是抗体或其片段（例如，抗原结合片段（Fab）、Fab'片段、F（ab'）2片段、重组抗体、嵌合抗体、单链Fvs（“scFv”）、单链抗体、单域抗体（诸如源自骆驼科动物的可变重链域（“VHH”；也被称为“VHH片段”）（VHH及其制备方法在Gottlin等人的Journal of Biomolecular Screening，14：77-85（2009）中有所描述））、重组VHH单域抗体，以及VNAR片段、二硫键链接的Fvs（“sdFv”）和抗独特型（“anti-Id”）抗体，以及上述任一项的功能活性的表位结合片段、全长多克隆或单克隆抗体、抗体状片段等）、其他蛋白质（诸如受体蛋白质、蛋白质A、蛋白质C）等等。在其中分析物是小分子（诸如类固醇、后胆色素、类视黄醇和脂质）的情况下，第一和/或第二特异性结合成员可以是支架蛋白（例如，脂质运载蛋白）或受体。在一些情况下，针对蛋白质分析物的特异性结合成员可以是肽。例如，当靶分析物是酶时，合适的特异性结合成员可以包括酶基质和/或酶抑制剂，它们可以是肽、小分子等等。在一些情况下，当靶分析物是磷酸化种类时，特异性结合成员可以包括磷酸盐结合剂。例如，磷酸盐结合剂可以包括金属离子亲和介质，诸如美国专利No.7,070,921和美国专利申请No.2006/0121544中描述的那些。
当靶分子是碳水化合物时，潜在合适的捕获组分（如本文中定义的）包括例如抗体、凝集素和选择蛋白。如本领域普通技术人员将领会的是，可以与关注靶分子特异性关联的任何分子都可以潜在地被用作特异性结合成员。
对于某些实施例，合适的靶分析物/特异性结合成员复合物可以包括但不限于：抗体/抗原、抗原/抗体、受体/配体、配体/受体、蛋白质/核酸、酶/基质和/或抑制剂、碳水化合物（包括糖蛋白和糖脂）/凝集素和/或选择素、蛋白质/蛋白质、蛋白质/小分子等。
在特定实施例中，第一特异性结合成员和/或第二特异性结合成员可以经由联接而附着到固体支持物，该联接可以包括支持物和/或特异性结合成员的任何部分、功能化或修饰，这便于特异性结合成员附着到支持物。特异性结合成员与支持物之间的联接可以包括一个或多个化学或物理（例如，经由范德华力的非特异性附着、氢键、静电相互作用、疏水性/亲水性相互作用；等）键，和/或提供（一个或多个）这样的键的化学间隔物。
在某些实施例中，固体支持物还可以包括保护性、阻断或钝化层，该层可以在测定期间消除或最小化非捕获组分（例如，分析物分子、特异性结合成员）与结合表面的非特异性附着，该非特异性附着可能导致检测期间的假阳性信号或导致信号丢失。在某些实施例中可以被利用以形成钝化层的材料的示例包括但不限于：聚合物，诸如聚（乙二醇），其排斥蛋白质的非特异性结合；天然存在的具有该特性的蛋白质，诸如血清白蛋白和酪蛋白；表面活性剂，例如，两性离子表面活性剂，诸如磺基甜菜碱；天然存在的长链脂质；聚合物刷，以及核酸，诸如鲑鱼精子DNA。
某些实施例利用作为蛋白质或多肽的特异性结合成员。如本领域已知的，可以使用任何数量的技术将多肽附着到多种多样的固体支持物上。已知多种多样的技术将反应性部分添加到蛋白质，例如，美国专利No. 5,620,850中概述的方法。进一步地，用于将蛋白质附着到表面的方法是已知的，例如参见Heller, Acc. Chem. Res. 23:128 (1990)。
如本文中解释的，特异性结合成员与分析物之间的结合是特异性的，例如，如当特异性结合成员与分析物是结合对的互补部分时。在某些实施例中，特异性结合成员与分析物特异性地结合。通过说“特异性地结合”或“结合特异性”，其指代特异性结合成员在具有足以在分析物分子与测试样本的其他组分或污染物之间进行区分的特异性的情况下而与分析物分子结合。例如，根据一个实施例，特异性结合成员可以是与分析物上的表位特异性地结合的抗体。根据一个实施例，抗体可以是能够与关注分析物特异性地结合的任何抗体。例如，适当的抗体包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、域抗体（dAb）（例如，诸如在Holt等人的(2014) Trends in Biotechnology 21:484-490中描述的），并且包括天然存在的单域抗体sdAb，例如，如软骨鱼和骆驼科动物中的单域抗体，或者是合成的抗体，例如纳米抗体、VHH或其他域结构）、合成抗体（有时被称为抗体模拟物）、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物（有时被称为“抗体偶联物”）以及分别各自的片段。作为另一个示例，分析物分子可以是抗体，并且第一特异性结合成员可以是抗原，而第二特异性结合成员可以是与靶抗体特异性地结合的第二抗体，或者第一特异性结合成员可以是与靶抗体特异性地结合的第二抗体，而第二特异性结合成员可以是抗原。
在一些实施例中，特异性结合成员可以是化学编程的抗体（cpAbs）（在Rader（2014）Trends in Biotechnology 32：186-197中描述的）、双特异性cpAb、抗体募集分子（ARM）（在McEnaney等人的(2012) ACS Chem. Biol. 7:1139-1151中描述的）、支链捕获剂（诸如三配位体捕获剂（在Millward等人的（2011）J.Am.Chem.Soc.133：18280-18288中描述的））、源自非抗体支架的工程化结合蛋白（诸如单体（源自人类纤连蛋白的第10个纤连蛋白III型域））、亲和体（源自免疫球蛋白结合蛋白A）、DARPins（基于锚蛋白重复模块）、抗运载蛋白（源自脂质运载蛋白后胆色素结合蛋白和人类脂质运载蛋白2），以及半胱氨酸结肽（打结素）（在Gilbreth和Koide的（2012）Current Opinion in Structural Biology 22：1-8；Banta等人的（2013）Annu.Rev.Biomed.Eng.15：93-113中描述的）、WW域（在Patel等人的（2013）Protein Engineering，Design＆Selection 26（4）：307-314中描述的）、重新定位的受体配体、亲和素（在Behar等人的（2013）26：267-275中描述的）和/或Adhirons（在Tiede等人的（2014）Protein Engineering，Design＆Selection 27：145-155中描述的）。
根据其中分析物是生物细胞（例如，哺乳动物、禽类、爬行动物、其他脊椎动物、昆虫、酵母、细菌、细胞等）的一个实施例，特异性结合成员可以是针对细胞表面抗原（例如，细胞表面受体）具有特异性亲和性的配体。在一个实施例中，特异性结合成员可以是粘附分子受体或其部分，其针对靶细胞类型的表面上所表达的细胞粘附分子具有结合特异性。在使用中，粘附分子受体与靶细胞的细胞外表面上的粘附分子相结合，从而固定化或捕获该细胞，然后可以通过使用可能与第一特异性结合成员相同、或者可能与在该细胞的表面上表达的不同分子相结合的第二特异性结合成员，来检测所结合的细胞。
在一些实施例中，分析物分子与特异性结合成员之间的结合亲和性应当足以在测定条件下保持结合，该测定包括洗涤步骤以去除非特异性地结合的分子或粒子。在一些情况下，例如在检测某些生物大分子时，分析物分子与其互补的特异性结合成员的结合常数可以在至少约104至约106M-1之间、至少约105至约109M-1之间、至少约107至约109M-1之间、大于约109M-1或更大。
4. 示例性靶分析物
如本领域技术人员将领会的，可以使用本公开的方法和设备来检测并且可选地量化可以被第一特异性结合成员和第二特异性结合成员特异性地结合的任何分析物。
在一些实施例中，分析物可以是生物大分子或生物分子。生物大分子和生物分子的非限制性示例包括：巨分子，诸如蛋白质、脂质和碳水化合物。在某些实例中，分析物可以是激素、抗体、生长因子、细胞因子、酶、受体（例如，神经、激素、营养物和细胞表面受体）或其配体、癌症标志物（例如，PSA、TNF-α）、心肌梗死的标志物（例如，肌钙蛋白、肌酸激酶、BNP、pro-BNP、NT-ProBNP、CK-MB、Galectin-3等等）、甲状腺标志物（例如，抗Tg、抗TPO、游离T3、游离T4、T-摄取、总T3、总T4、TSH）、毒素、药物（例如，成瘾药物）、代谢剂（例如，包括维生素）等等。蛋白质分析物的非限制性实施例包括肽、多肽、蛋白质片段、蛋白质复合物、融合蛋白、重组蛋白、磷蛋白、糖蛋白、脂蛋白等等。在一些实施例中，分析物可以是生物标志物，诸如针对创伤性脑损伤、败血症或凝血的生物标志物、涉及一般化学的分析物（例如，氨、AST、胆固醇等）、蛋白质（例如，转铁蛋白、CRP等）、用于治疗药物监测的分析物（例如，甲氨蝶呤）、用于移植的分析物（例如，他克莫司）、滥用的药物或针对遗传性疾病的生物标志物。
在某些实施例中，分析物可以是转译后修饰的蛋白质（例如，磷酸化的、甲基化的、糖基化的蛋白质），并且第一或第二特异性结合成员可以是特异于转译后修饰的抗体。经修饰的蛋白质可以与固定化在固体支持物上的第一特异性结合成员结合，其中第一特异性结合成员与经修饰的蛋白质结合而不是与未修饰的蛋白质结合。在其他实施例中，第一特异性结合成员可以与未修饰的蛋白质和经修饰的蛋白质两者结合，而第二特异性结合成员可以特异于转译后修饰的蛋白质。
在一些实施例中，分析物可以是细胞，诸如循环肿瘤细胞、病原细菌、病毒（包括逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、慢病毒、丝状病毒（例如，西尼罗病毒、埃博拉和寨卡病毒）、肝炎病毒（例如，A、B、C、D和E）；HPV、细小病毒等；孢子等。
可以通过本文中呈现的方法进行分析的分析物的非限制性列表包括：Aβ42淀粉样蛋白β蛋白、胎球蛋白-A、牛磺酸（tau）、分泌粒蛋白II、朊病毒蛋白、α-突触核蛋白、牛磺酸蛋白、神经丝轻链、巴金蛋白（parkin）、PTEN诱导的推定的激酶1、DJ-1、富含亮氨酸的重复激酶2、突变的ATP13A2、Apo H、铜蓝蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α）、运甲状腺素蛋白、维生素D结合的蛋白质、活性-B12、B12、皮质醇、叶酸、果糖胺、同型半胱氨酸、完整PTH、胃蛋白酶原I和II、DHEA-S、雌二醇，hCG、孕酮、催乳素、SHBG、睾酮、促凋亡激酶R（PKR）及其磷酸化PKR（pPKR）、IL-12p40、CXCL13、IL-8、Dkk-3（精液）、p14内分泌片段、血清、ACE2、对CD25的自身抗体、hTERT、CAI25（MUC16）、VEGF、sIL-2、骨桥蛋白、人附睾蛋白4（HE4）、甲胎蛋白、白蛋白、蛋白尿、微量蛋白尿、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、胱抑素C、白细胞介素18（IL-18）、肾损伤分子-1（KIM-1）、肝脂肪酸结合蛋白（L-FABP）、LMP1、BARF1、IL-8、BRAF、CCNI、EGRF、FGF19、FRS2、GREB1，以及LZTS1、α-淀粉酶、癌胚抗原（CEA）、CA 125、硫氧还蛋白、β-2微球蛋白水平-监测病毒活性、肿瘤坏死因子-α受体-监测病毒活性、甲胎蛋白（AFP）、CA15-3、CA19-9、CYFRA21-1、HE-4、PIVKA-11、ProGRP、SCC、卵泡刺激素（FSH）、促黄体激素（LH）、T细胞淋巴瘤侵袭和转移1（TIAM1）、N-cadherin、EC39、双调蛋白、dUTPase、分泌凝溶胶蛋白（pGSN）、PSA（前列腺特异性抗原）、胸腺素β15、胰岛素、血浆C肽、糖基化血红蛋白（HBA1c）、C反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）、ARHGDIB（RhoGDP-解离抑制剂2）、CFL1（丝切蛋白-1）、PFN1（抑制蛋白-1）、GSTP1（谷胱甘肽S-转移酶P）、S100A11（蛋白质S100-A11）、PRDX6 （过氧化物酶-6）、HSPE1（10kDa热休克蛋白、线粒体）、LYZ（溶菌酶C前体）、GPI（葡萄糖-6-磷酸异质酶）、HIST2H2AA（组蛋白H2A 2-A型）、GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、HSPG2（基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白前体）、LGALS3BP（半乳糖凝集素-3结合蛋白前体）、CTSD（组织蛋白酶D前体）、APOE（载脂蛋白E前体）、IQGAP1（Ras GTP酶活化样蛋白IQGAP1）、CP（血浆铜蓝蛋白前体）和IGLC2（IGLC1蛋白）、PCDGF/GP88、EGFR、HER2、MUC4、IGF-IR、p27（kip1）、Akt、HER3、HER4、PTEN、PIK3CA、SHIP、Grb2、Gab2、PDK-1（3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1）、TSC1、TSC2、mTOR、MIG-6（ERBB受体反馈抑制剂1）、S6K、src、KRAS、MEK丝裂原活化蛋白激酶1、cMYC、TOPO II拓扑异构酶（DNA）II α170 kDa、FRAP1、NRG1、ESR1、ESR2、PGR、CDKN1B、MAP2K1、NEDD4-1、FOXO3A、PPP1R1B、PXN、ELA2、CTNNB1、AR、EPHB2、KLF6、ANXA7、NKX3-1、PITX2、MKI67、PHLPP、脂联素（ADIPOQ）、纤维蛋白原α链（FGA）、瘦蛋白（LEP）、高级糖基化终产物特异性受体（AGER aka RAGE）、α-2-HS-糖蛋白（AHSG）、血管生成素（ANG）、CD14分子（CD14）、铁蛋白（FTH1）、胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP1）、白细胞介素2受体、α（IL2RA）、血管细胞粘附分子1（VCAM1）和血管性血友病因子（VWF）、髓过氧化物酶（MPO）、IL1α、TNFα、核周抗中性粒细胞胞浆抗体（p-ANCA）、乳铁蛋白、钙卫蛋白、肾母细胞瘤-1蛋白、水通道蛋白-1、MLL3、AMBP、VDAC1、大肠杆菌肠毒素（热不稳定外毒素、热稳定肠毒素）、流感HA抗原、破伤风毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、志贺样毒素I、志贺样毒素II、艰难梭菌毒素A和B等。
可以在样本中测量示例性靶标，该样本诸如环境样本，使用本方法从患者或需要的主体获得的生物样本包括：滥用的药物（例如，可卡因）、蛋白质生物标记物（包括但不限于核仁素、核因子-kB必需调节剂（NEMO）、CD-30、蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）、血管内皮生长因子（VEGF）、MUC1糖型、免疫球蛋白μ重链（IGHM）、免疫球蛋白E、αvβ3整合素、α-凝血酶、HIVgp120、NF-κB、E2F转录因子、HER3、纤溶酶原激活物抑制剂、肌腱蛋白C、CXCL12/SDF-1、前列腺特异性膜抗原（PSMA）、胃癌细胞、HGC-27；细胞（包括但不限于非小细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌细胞、（DLD-1）、H23肺腺癌细胞、Ramos细胞、T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）细胞、CCRF-CEM、急性髓细胞白血病（AML）细胞（HL60）、小细胞肺癌（SCLC）细胞、NCIH69、人类成胶质细胞、U118-MG、PC-3细胞、HER-2过表达人类乳腺癌细胞、SK-BR-3、胰腺癌细胞系（Mia-PaCa-2）和传染因子（包括但不限于结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏痢疾杆菌、大肠杆菌O157：H7、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌O8，以及肠炎沙门氏菌）。
可以在使用本方法从患者或需要的主体获得的样本中测量的示例性靶标包括但不限于：HBV核心衣壳蛋白、CDK2、E2F转录因子、胸苷酸合成酶、Ras、EB1和晚期糖基化终产物受体（RAGE）。
5. 样本
如本文中使用的，“样本”、“测试样本”、“生物样本”指代包含或被怀疑包含关注分析物的流体样本。样本可以源自任何合适的来源。在一些情况下，样本可以包括液体、流动的粒子固体或固体粒子的流体悬浮液。在一些情况下，可以在本文中描述的分析之前对样本进行处理。例如，可以在分析之前将样本与其来源分离或纯化；然而，在某些实施例中，可以直接对包含分析物的未经处理的样本进行测定。分析物分子的来源可以是合成物（例如，在实验室中产生的）、环境（例如，空气、土壤、流体样本，例如水供给等）、动物（例如，哺乳动物）、植物、或其任何组合。在特定示例中，分析物的来源是人体物质（例如，体液、血液、血清、血浆、尿液、唾液、汗液、痰液、精液、粘液、泪液、淋巴液、羊膜液、间质液、肺灌洗、脑脊液、粪便、组织、器官等等）。组织可以包括但不限于：骨骼肌组织、肝组织、肺组织、肾组织、心肌组织、脑组织、骨髓、子宫颈组织、皮肤等。样本可以是液体样本或固体样本的液体提取物。在某些情况下，样本的来源可以是器官或组织，诸如活组织检查样本，其可以通过组织崩解/细胞裂解而溶解。
可以分析宽范围体积的流体样本。在几个示例性实施例中，样本体积可以为约0.5nL、约1 nL、约3 nL、约0.01μL、约0.1μL、约1μL、约5μL、约10μL、约100μL、约1 mL、约5 mL、约10mL等等。在一些情况下，流体样本的体积为约0.01μL至约10 mL之间、约0.01μL至约1 mL之间、约0.01μL至约100μL之间、或约0.1μL至约10μL之间。
在一些情况下，可以在测定中使用之前稀释流体样本。例如，在其中分析物分子的来源是人体体液（例如，血液、血清）的实施例中，可以利用适当的溶剂（例如，缓冲液，诸如PBS缓冲液）来稀释流体。在使用之前，流体样本可以被稀释约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更大。
在某些情况下，样本可能经历预分析处理。预分析处理可以提供附加的功能，诸如非特异性蛋白质去除和/或有效而又廉价可实现的混合功能。预分析处理的一般方法可以包括使用电动捕获、AC电动力学、表面声波、等速电泳、介电电泳、电泳或本领域已知的其他预浓缩技术。在一些情况下，可以在测定中使用之前浓缩流体样本。例如，在其中分析物分子的来源是人体体液（例如，血液、血清）的实施例中，可以通过沉淀、蒸发、过滤、离心或其组合来浓缩流体。在使用之前，流体样本可以被浓缩约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更大。
在某些实施例中，在测量分析物之前，不对分析物进行扩增（即，不增加分析物的拷贝数量）。例如，在其中分析物是DNA或RNA的情况下，不对分析物进行复制来增加分析物的拷贝数量。在某些情况下，分析物是蛋白质或小分子。
6. 关于方法的变型
用于确定样本中的关注分析物的存在或量的所公开的方法可以如上所述。鉴于用于对分析物进行分析的其他方法，还可以改编这些方法。公知变型的示例包括但不限于：免疫测定，诸如三明治式免疫测定（例如，单克隆-多克隆三明治式免疫测定，其包括酶检测（酶免疫测定（EIA）或酶联免疫吸附测定（ELISA））；竞争性抑制免疫测定（例如，正向和反向）；酶增殖免疫测定技术（EMIT）；竞争性结合测定；生物发光共振能量转移（BRET）；一步抗体检测测定；同质测定；异质测定；即时捕获测定等。在一些情况下，以下描述可以与上面描述的方法重叠；在其他情况下，以下描述可以提供替代方案。
（a）免疫测定
可以使用免疫测定来分析关注分析物和/或其肽或其片段。可以通过使用本文中描述的抗体并检测与关注分析物的特异性结合，来确定关注分析物的存在或量。可以利用任何免疫测定。免疫测定可以是例如酶联免疫测定（ELISA）、竞争性抑制测定（诸如，正向或反向竞争性抑制测定）或竞争性结合测定。在一些实施例中，将一个信号生成化合物或信号生成基质附着到捕获抗体和检测抗体。替换地，被采用于捕获的微粒子也可以起作用以供检测。
可以使用同质的格式。例如，在从主体获得测试样本之后，制备混合物。该混合物包含：针对分析物而被评估的测试样本、第一特异性结合搭档和第二特异性结合搭档。添加测试样本、第一特异性结合搭档和第二特异性结合搭档以形成混合物的次序不是关键性的。同时使测试样本与第一特异性结合搭档和第二特异性结合搭档相接触。在一些实施例中，测试样本中包含的第一特异性结合搭档和任何关注分析物可以形成第一特异性结合搭档-关注分析物-抗原复合物，并且第二特异性结合搭档可以形成第一特异性结合搭档-关注分析物-第二特异性结合搭档复合物。在一些实施例中，测试样本中包含的第二特异性结合搭档和任何关注分析物可以形成第二特异性结合搭档-关注分析物-抗原复合物，并且第一特异性结合搭档可以形成第一特异性结合搭档-关注分析物-第二特异性结合搭档复合物。此外，利用如本文中描述的可检测标记来标记第二特异性结合搭档，或者第二特异性结合搭档包含该可检测标记。
可以使用异质的格式。例如，在从主体获得测试样本之后，制备第一混合物。该混合物包含针对关注分析物而被评估的测试样本和第一特异性结合搭档，其中第一特异性结合搭档和测试样本中包含的任何关注分析物形成了第一特异性结合搭档-关注分析物复合物。优选地，第一特异性结合搭档是抗关注分析物抗体或其片段。添加测试样本和第一特异性结合搭档以形成混合物的次序不是关键性的。优选地，第一特异性结合搭档被固定化在固体支持物上。免疫测定（针对第一特异性结合搭档，以及可选地第二特异性结合搭档）中使用的固体支持物可以是本领域已知的任何固体支持物，诸如但不限于磁性粒子、珠粒、纳米珠粒、微珠粒、纳米粒子、微粒子、隔膜、支架分子、膜、滤纸、盘或芯片（例如，微流体芯片）。在其中固体支持物是珠粒的那些实施例中，珠粒可以是磁性珠粒或磁性粒子。磁性珠粒/粒子可以是铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁性的或铁磁流体的。示例性的铁磁性材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO和NiO/Fe。亚铁磁性材料的示例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4（或FeO·Fe2O3）。珠粒可以具有磁性的固体核心部分并且被一个或多个非磁性层包围。替换地，磁性部分可以是非磁芯周围的层。在其上将第一特异性结合成员固定化的固体支持物可以以干燥形式或以液体形式存储。磁性珠粒可以在利用在其上将第一特异性结合成员固定化的磁性珠粒来与样本接触之前或之后经受磁场的影响。
在形成了包含第一特异性结合搭档-关注分析物复合物的混合物后，使用本领域已知的任何技术从复合物中去除任何未结合的关注分析物。例如，可以通过洗涤来去除未结合的关注分析物。然而，期望地，第一特异性结合搭档以超过测试样本中存在的任何关注分析物的量而存在，使得存在于测试样本中的全部关注分析物被第一特异性结合搭档所结合。
在去除了任何未结合的关注分析物之后，将第二特异性结合搭档添加到混合物以形成第一特异性结合搭档-关注分析物-第二特异性结合搭档复合物。第二特异性结合搭档优选地是抗关注分析物抗体，其与关注分析物上的表位结合，该表位不同于由第一特异性结合搭档结合的关注分析物上的表位。此外，还优选地的是，利用如上所述的信号生成化合物或信号生成基质来对标记第二特异性结合搭档，或者第二特异性结合搭档包含信号生成化合物或信号生成基质。
使用固定化的抗体或其片段可以并入到免疫测定中。抗体可以被固定化到各种各样的支持物上，该支持物诸如磁性或色谱基体粒子、乳胶粒子或修饰表面乳胶粒子、聚合物或聚合物膜、塑料或塑料膜、平面基质、微流体表面、固体基质材料片等等。
（b）三明治式免疫测定
三明治式免疫测定测量两层抗体（即，捕获抗体（即，至少一个捕获抗体））与检测抗体（即，至少一个检测抗体）之间的抗原量。捕获抗体和检测抗体与抗原（例如，关注分析物）上的不同表位结合。期望地，捕获抗体与表位的结合不会干扰检测抗体与表位的结合。单克隆或多克隆抗体可以被用作三明治式免疫测定中的捕获和检测抗体。
通常，采用至少两种抗体来分离和量化测试样本中的关注分析物。更具体地，该至少两种抗体与关注分析物的某些表位结合，或与形成免疫复合物的关注分析物片段结合，这被称为“三明治”。一个或多个抗体可以被用来捕获测试样本中的关注分析物（这些抗体通常被称为一个或多个“捕获”抗体），并且具有信号生成化合物或信号生成基质的也与关注分析物结合的一个或多个抗体（这些抗体通常被称为一个或多个“检测”抗体）可以被用来完成该三明治。在三明治式测定中，抗体与其表位的结合期望地不会由于测定中的任何其他抗体与其相应表位的结合而减弱。换言之，对抗体进行选择，使得与被怀疑包含关注分析物的测试样本相接触的一个或多个第一抗体并不与由第二或后续抗体所识别的表位的全部或部分相结合，从而干扰了一个或多个第二检测抗体与关注分析物相结合的能力。上面描述的捕获抗体是捕获分子的示例。上面描述的检测抗体是检测分子的示例。
在一个实施例中，被怀疑包含关注分析物的测试样本可以与至少一种捕获抗体（或多种抗体）和至少一种检测抗体同时或顺序地接触。在三明治式测定形式中，被怀疑包含关注分析物的测试样本（隔膜相关联的关注分析物、可溶的关注分析物、隔膜相关联的关注分析物的片段、可溶的关注分析物的片段、关注分析物的变体（隔膜相关联的或可溶的关注分析物）或其任何组合）首先与至少一种捕获抗体接触，该捕获抗体在允许形成抗体-关注分析物复合物的条件下与特定表位特异性地结合。如果使用多于一种捕获抗体，则形成多种捕获抗体-关注分析物复合物。在三明治式测定中，以测试样本中预期的关注分析物或关注分析物片段的最大量的摩尔过量来使用抗体、优选地至少一种捕获抗体。
可选地，在使测试样本与至少一个第一捕获抗体接触之前，可以使至少一个捕获抗体与固体支持物结合，这便于从测试样本中分离抗体-关注分析物复合物。可以使用本领域已知的任何固体支持物，包括但不限于由以平面基质或珠粒等等形式的聚合物材料制成的固体支持物。抗体（或多个抗体）可以通过吸附、通过使用化学偶联剂的共价结合或者通过本领域已知的其他手段与固体支持物结合，只要这样的结合不会干扰抗体与关注分析物或关注分析物片段结合的能力。此外，如果需要，可以将固体支持物衍生化以允许与抗体上的各种官能团进行反应。这样的衍生化需要使用某些偶联剂，诸如但不限于：马来酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、叠氮基、炔基和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺。
在使被怀疑包含关注分析物的测试样本与至少一个捕获抗体接触之后，培养该测试样本以便允许形成捕获抗体（或多个捕获抗体）-关注分析物复合物。该培养可以在约4.5至约10.0的pH下、约2℃至约45℃的温度下实施，并且持续从至少约一（1）分钟至约十八（18）小时、从约2-6分钟、或从约3-4分钟的时段。
在形成捕获抗体（多个抗体）-关注分析物复合物之后，然后使复合物与至少一个检测抗体接触（在允许形成捕获抗体（多个抗体）关注分析物-检测抗体（多个抗体）复合物的条件下）。如果捕获抗体-关注分析物复合物与多于一个检测抗体接触，则形成了抗体（多个抗体）-关注分析物-检测抗体（多个抗体）检测复合物。与捕获抗体一样，当至少一个检测（和随后的）抗体与捕获抗体-关注分析物复合物接触时，需要在与上述条件类似的条件下进行培养的时段，以用于形成捕获抗体（多个抗体）-关注分析物-检测抗体（多个抗体）复合物。优选地，至少一个检测抗体包含信号生成化合物或信号生成基质。信号生成化合物或信号生成基质可以在形成捕获抗体（多个抗体）-关注分析物-检测抗体（多个抗体）复合物之前、同时或之后与至少一个检测抗体结合。
添加测试样本和（一个或多个）特异性结合搭档以形成用于测定的混合物的次序不是关键性的。如果第一特异性结合搭档附着到信号生成化合物或信号生成基质，则信号生成化合物或信号生成基质附着的第一特异性结合搭档-关注分析物复合物形成了。替换地，如果使用了第二特异性结合搭档，并且第二特异性结合搭档附着到信号生成化合物或信号生成基质，则信号生成化合物或信号生成基质附着的第一特异性结合搭档-关注分析物-第二特异性结合搭档的复合物形成了。可以使用本领域已知的任何技术（诸如洗涤）从混合物中去除任何未结合的特异性结合搭档，无论是经标记的还是未标记的。
接下来，生成了指示关注分析物或其片段的存在的信号。基于所生成的信号的参数，可以量化样本中的关注分析物的量。可选地，可以使用已知浓度的关注分析物的连续稀释液或溶液、通过质谱法、重量分析方法以及本领域已知的其他技术来生成标准曲线。
（c）正向竞争抑制
在正向竞争形式中，已知浓度的一份经标记的关注分析物被用来针对与关注分析物抗体的结合来与与测试样本中的关注分析物竞争。
在正向竞争测定中，固定化的特异性结合搭档（诸如抗体）可以顺序或同时地与测试样本和经标记的关注分析物、关注分析物片段，或其关注分析物变体相接触。关注分析物肽，关注分析物片段或关注分析物变体可以与信号生成化合物或信号生成基质附着。在该测定中，可以将抗体固定化到固体支持物上。替换地，可以将抗体与已经固定化在固体支持物（诸如，微粒子或平面基质）上的抗体（诸如，反种抗体）偶联。
经标记的关注分析物、测试样本和抗体在与上面结合三明治式测定形式所描述的条件类似的条件下培养。然后，可以生成两个不同种类的抗体-关注分析物复合物。具体地，所生成的抗体-关注分析物复合物之一包含信号生成化合物或信号生成基质，而其他抗体-关注分析物复合物不包含信号生成化合物或信号生成基质。在量化可检测产物或可检测标记之前，抗体-关注分析物复合物可以但不用必须与测试样本的剩余部分分离。无论抗体-关注分析物复合物是否与测试样本的剩余部分分离，然后都对抗体-关注分析物复合物中的可检测产物或可检测标记（例如，可检测信号）的量进行量化。然后可以确定测试样本中的关注分析物（诸如，隔膜相关联的关注分析物、可溶的关注分析物、可溶的关注分析物片段、关注分析物的变体（隔膜相关联的或可溶的关注分析物）或其任何组合）的浓度，例如，如上所述。如果有帮助，可以通过将抗体-关注分析物复合物中的可检测产物或可检测标记（例如，可检测信号）的量与标准曲线进行比较来进行确定。可以使用已知浓度的关注分析物（诸如，隔膜相关联的关注分析物、可溶的关注分析物、可溶的关注分析物片段、关注分析物的变体（隔膜相关联的或可溶的关注分析物）或其任何组合）的连续稀释液来生成标准曲线，其中浓度是通过质谱法、重量分析法以及通过本领域已知的其他技术来确定的。
可选地，可以通过将抗体与固体支持物（诸如，上面结合三明治式测定形式讨论的固体支持物）结合、然后去除测试样品的剩余部分以免与固体支持物接触，来将抗体-关注分析物复合物与测试样本分离。
（d）反向竞争测定
在反向竞争测定中，固定化的关注分析物可以与测试样本和至少一个经标记的抗体顺序地或同时地接触。关注分析物可以与固体支持物结合，该固体支持物诸如上面结合三明治式测定形式所讨论的固体支持物。
固定化的关注分析物、测试样本和至少一个经标记的抗体在与上面结合三明治式测定形式所描述的条件类似的条件下培养。然后生成两个不同种类的关注分析物-抗体复合物。具体地，所生成的关注分析物-抗体复合物之一被固定化并且包含信号生成化合物或信号生成基质，而其他关注分析物-抗体复合物没有被固定化并且不包含信号生成化合物或信号生成基质。通过本领域已知的技术（诸如，洗涤）从固定化的关注分析物-抗体复合物的存在中去除未固定化的关注分析物-抗体复合物和测试样本的剩余部分。一旦去除了未固定化的关注分析物抗体复合物，就可以量化固定化的关注分析物-抗体复合物中的信号生成化合物或信号生成基质的量。然后，可以通过比较如上所描述的可检测信号的量来确定测试样本中的关注分析物的浓度。如果有帮助，这可以在使用标准曲线的情况下完成。可以使用已知浓度的关注分析物或关注分析物片段的连续稀释液来生成标准曲线，其中浓度是通过质谱法、重量分析法以及通过本领域已知的其他技术来确定的。
（e）一步免疫测定或即时捕获测定
在一步免疫测定或即时捕获测定中，固体基质被预先涂覆有固定化剂。将捕获剂、分析物和检测剂一起添加至固体基质，接着是检测之前的洗涤步骤。捕获剂可以结合分析物并且包括针对固定化剂的配体。捕获剂和检测剂可以是抗体，或者是能够如本文中描述的那样或本领域已知的那样进行捕获或检测的任何其他部分。配体可以包括肽标签，并且固定化剂可以包括抗肽标签抗体。替换地，配体和固定化剂可以是能够结合在一起的任何试剂对，以便被采用于即时捕获测定（例如，特异性结合对，以及诸如本领域已知的其他那些）。可以测量多于一个分析物。在一些实施例中，固体基质可以被涂覆有抗原，并且待分析的分析物是抗体。
在一些实施例中，使用了预先涂覆有固定化剂（诸如，生物素、链霉抗生物素蛋白等）的固体支持物（诸如，微粒子）以及至少第一特异性结合成员和第二特异性结合成员（其分别充当捕获和检测剂）。第一特异性结合成员包括：针对固定化剂的配体（例如，如果固体支持物上的固定化剂是链霉抗生物素蛋白，则第一特异性结合成员上的配体可以是生物素），并且还与关注分析物结合。第二特异性结合成员包括：信号生成化合物或信号生成基质，并且与关注分析物结合。可以将固体支持物以及第一和第二特异性结合成员添加至测试样本（顺序地或同时地）。第一特异性结合成员上的配体与固体支持物上的固定化剂结合，以形成固体支持物/第一特异性结合成员复合物。样本中存在的任何关注分析物与固体支持物/第一特异性结合成员复合物结合，以形成固体支持物/第一特异性结合成员/分析物复合物。第二特异性结合成员与固体支持物/第一特异性结合成员/分析物复合物以及检测到的信号生成化合物或信号生成基质相结合。在检测之前，可以采用可选的洗涤步骤。在某些实施例中，在一步测定中，可以测量多于一个分析物。在某些其他实施例中，可以采用多于两个的特异性结合成员。在某些其他实施例中，可以添加多个信号生成化合物或信号生成基质。在某些其他实施例中，可以检测多个关注分析物。
使用一步免疫测定或即时捕获测定可以用如本文中描述以及本领域已知的各种各样的形式来进行。例如，形式可以是如上所述的三明治式测定，但是替换地可以是竞争测定，可以采用单个特异性结合成员，或者使用诸如已知的其他变型。
（f）组合测定（利用Ag/Ab对微粒子的共同涂覆）
在组合测定中，固体基质（诸如，微粒子）被共同涂覆有抗原和抗体，以分别从样本中捕获抗体和抗原。固体支持物可以被共同涂覆有两个或更多个不同的抗原，以从样本中捕获两个或更多个不同的抗体。固体支持物可以被共同涂覆有两个或更多个不同的抗体，以从样本中捕获两个或更多个不同的抗原。
附加地，本文中描述的方法可以使用阻断剂来防止测定化合物当中的特异性或非特异性结合反应（例如，HAMA关心的反应）。一旦该剂（以及可选地，任何对照）被固定化在支持物上，该剂的剩余结合位点可以在支持物上被阻断。可以使用本领域普通技术人员已知的任何合适的阻断试剂。例如，可以采用牛血清白蛋白（“BSA”）、酪蛋白在PBS中的磷酸盐缓冲盐水（“PBS”）溶液、Tween 20TM（密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司）、或其他合适的表面活性剂，以及其他阻断试剂。
如从本公开中显而易见的，本文中公开的方法（包括变化）可以被用于诊断被怀疑患有疾病、病症或病状的主体中的疾病、病症或病状。例如，样本分析可以有助于检测疾病标记物，诸如癌症标记物、心脏病状标记物、毒素、病原体（诸如，病毒、细菌）或其部分。该方法还可以被用于测量生物样本中存在的分析物。该方法还可以被用在血液筛选测定中以检测靶分析物。血液筛选测定可以被用来筛选血液供应。
7. 多重测定
该方法可以包括一个或多个（或替换地，两个或更多个）特异性结合成员，以在多重测定中检测样本中的一个或多个（或替换地，两个或更多个）靶分析物。一个或多个（或替换地，两个或更多个）特异性结合成员中的每一个与不同的靶分析物结合，并且每个特异性结合成员与不同的信号生成化合物或信号生成基质缀合。例如，第一特异性结合成员与第一靶分析物结合，第二特异性结合成员与第二靶分析物结合，第三特异性结合成员与第三靶分析物结合等，并且第一特异性结合成员被利用第一信号生成化合物或第一信号生成基质来加标记，第二特异性结合成员被利用第二信号生成化合物或第二信号生成基质来加标记，第三特异性结合成员被利用第三信号生成化合物或第三信号生成基质来加标记。在一些实施例中，可以在测定期间的各种时间处改变样本的条件，从而允许检测第一信号生成化合物或第一信号生成基质、第二信号生成化合物或第二信号生成基质、第三信号生成化合物或第三信号生成基质等，由此检测一个或多个（或替换地，两个或更多个）靶分析物。在一些实施例中，同时地检测一个或多个（或替换地，两个或更多个）信号生成化合物或信号生成基质。在一些实施例中，连续地检测一个或多个（或替换地，两个或更多个）信号生成化合物或信号生成基质。在一些实施例中，一个或多个（或替换地，两个或更多个）信号生成化合物或信号生成基质生成不同的可检测信号，诸如不同波长的荧光信号。
替换地，一个或多个（或替换地，两个或更多个）特异性结合成员中的每一个与不同的靶分析物结合，并且每个特异性结合成员与不同的固体支持物（诸如，不同的荧光团珠粒）缀合。例如，第一特异性结合成员与第一靶分析物结合，第二特异性结合成员与第二靶分析物结合，第三特异性结合成员与第三靶分析物结合等，第一特异性结合成员被利用第一信号生成化合物或第一信号生成基质来加标记，第二特异性结合成员被利用第二信号生成化合物或第二信号生成基质来加标记，第三特异性结合成员被利用第三信号生成化合物或第三信号生成基质来加标记等，并且第一特异性结合成员被固定化在第一固体支持物上，第二特异性结合成员被固定化在第二固体支持物上，第三特异性结合成员被固定化在第三固体支持物上等。在一些实施例中，一个或多个（或替换地，两个或更多个）信号生成化合物或信号生成基质生成了不同的可检测信号（诸如，不同波长的荧光信号），并且同时地或连续地检测不同的固体支持物。
在一些实施例中，第一特异性结合成员与第一靶分析物结合，第二特异性结合成员与第二靶分析物结合，第三特异性结合成员与第三靶分析物结合等，第一特异性结合成员、第二特异性结合成员、第三特异性结合成员等被利用信号生成化合物或信号生成基质来加标记，并且第一特异性结合成员被固定化在第一固体支持物上，第二特异性结合成员被固定化在第二固体支持物上，第三特异性结合成员被固定化在第三固体支持物上等。在一些实施例中，信号生成化合物或信号生成基质生成可检测信号（诸如，不同波长的荧光信号），并且同时地或连续地检测不同的固体支持物。
8. 试剂盒
本文中还提供了用于在实行上述方法时使用的试剂盒。该试剂盒可以包括针对利用所公开的方法来对分析物进行分析的用法说明。试剂盒中包括的用法说明可以贴于包装材料，或者可以作为包装说明书而被包括在内。用法说明可以是书面材料或印刷材料，但是不限于此。本公开考虑了能够存储这样的用法说明并将它们传送给最终用户的任何介质。这样的介质包括但不限于电子存储介质（例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片）、光学介质（例如，CD ROM）等等。如本文中使用的，“用法说明”可以包括提供该用法说明的互联网站点的地址。
替换地或附加地，试剂盒可以包括：校准器或对照（例如，纯化的）以及可选地冻干的关注分析物或者以液体、凝胶或其他形式存在；和/或用于与上述方法一起使用的至少一个容器（例如，管、微量滴定板或条带）；和/或缓冲液，诸如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中的任一个可以被提供为浓缩溶液。在一些实施例中，试剂盒包括：实行该测定所必需的全部组分，即，试剂、标准品、缓冲液、稀释剂等。用法说明还可以包括用于生成标准曲线的用法说明。
试剂盒可以进一步包括用于量化关注分析物的参考标准。可以采用参考标准来建立用于内插和/或外推关注分析物浓度的标准曲线。该试剂盒可以包括在浓度水平方面有所不同的参考标准。例如，试剂盒可以包括具有高浓度水平、中浓度水平或低浓度水平的一个或多个参考标准。就参考标准的浓度范围而言，这可以根据测定而被优化。参考标准的示例性浓度范围包括但不限于，例如：约10 fg/mL、约20 fg/mL、约50 fg/mL、约75 fg/mL、约100 fg/mL、约150 fg/mL、约200 fg/mL、约250 fg/mL、约500 fg/mL、约750 fg/mL、约1000fg/mL、约10 pg/mL、约20 pg/mL、约50 pg/mL、约75 pg/mL、约100 pg/mL、约150 pg/mL、约200 pg/mL、约250 pg/mL、约500 pg/mL、约750 pg/mL、约1 ng/mL、约5 ng/mL、约10 ng/mL、约12.5 ng/mL、约15 ng/mL、约20 ng/mL、约25 ng/mL、约40 ng/mL、约45 ng/mL、约50 ng/mL、约55 ng/mL、约60 ng/mL、约75 ng/mL、约80 ng/mL、约85 ng/mL、约90 ng/mL、约95 ng/mL、约100 ng/mL、约125 ng/mL、约150 ng/mL、约165 ng/mL、约175 ng/mL、约200 ng/mL、约225 ng/mL、约250 ng/mL、约275 ng/mL、约300 ng/mL、约400 ng/mL、约425 ng/mL、约450ng/mL、约465 ng/mL、约475 ng/mL、约500 ng/mL、约525 ng/mL、约550 ng/mL、约575 ng/mL、约600 ng/mL、约700 ng/mL、约725 ng/mL、约750 ng/mL、约765 ng/mL、约775 ng/mL、约800 ng/mL、约825 ng/mL、约850 ng/mL、约875 ng/mL、约900 ng/mL、约925 ng/mL、约950ng/mL、约975 ng/mL、约1000 ng/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/mL、约10μg/mL、约20μg/mL、约30μg/mL、约40μg/mL、约50μg/mL、约60μg/mL、约70μg/mL、约80μg/mL、约90μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约300μg/mL、约400μg/mL、约500μg/mL、约600μg/mL、约700μg/mL、约800μg/mL、约900μg/mL、约1000μg/mL、约2000μg/mL、约3000μg/mL、约4000μg/mL、约5000μg/mL、约6000μg/mL、约7000μg/mL、约8000μg/mL、约9000μg/mL、或约10000μg/mL。
试剂盒中提供的任何特异性结合成员可以并入至少一个信号生成化合物、一个或多个信号生成基质等等，或者试剂盒可以包括用于标记特异性结合成员的试剂，或用于检测特异性结合成员和/或用于标记分析物的试剂，或用于检测分析物的试剂。如果期望，试剂盒可以包含一个或多个不同的信号生成化合物和/或信号生成物或基质。特异性结合成员、校准器和/或对照可以在单独的容器中提供，或预先分配成适当的测定形式。
试剂盒可以包括一个或多个特异性结合成员，例如以在多重测定中检测样本中的一个或多个靶分析物。试剂盒中的不同类型的特异性结合成员的数量的范围可以广泛地取决于试剂盒的预期使用。试剂盒中的特异性结合成员的数量的范围可以从1至约10个或更高。例如，试剂盒可以包括：1至10个特异性结合成员、1至9个特异性结合成员、1至8个特异性结合成员、1至7个特异性结合成员、1至6个特异性结合成员、1至5个特异性结合成员、1至4个特异性结合成员、1至3个特异性结合成员、1至2个特异性结合成员、2至10个特异性结合成员、2至9个特异性结合成员、2至8个特异性结合成员、2至7个特异性结合成员、2至6个特异性结合成员、2至5个特异性结合成员、2至4个特异性结合成员、3至10个特异性结合成员、3至9个特异性结合成员、3至8个特异性结合成员、3至7个特异性结合成员、3至6个特异性结合成员、3至5个特异性结合成员、3至4个特异性结合成员、4至10个特异性结合成员、4至9个特异性结合成员、4至8个特异性结合成员、4至7个特异性结合成员、4至6个特异性结合成员结合成员、5至10个特异性结合成员、5至9个特异性结合成员、5至8个特异性结合成员、5至7个特异性结合成员、5至6个特异性结合成员、6至10个特异性结合成员、6至9个特异性结合成员、6至8个特异性结合成员、6至7个特异性结合成员、7至10个特异性结合成员、7至9个特异性结合成员、7至8个特异性结合成员、8至10个特异性结合成员、8至9个特异性结合成员、或9至10个特异性结合成员。一个或多个特异性结合成员中的每一个可以与不同的靶分析物结合，并且每个特异性结合成员可以与不同的信号生成化合物和/或信号生成基质结合。例如、试剂盒可以包括：与第一靶分析物结合的第一特异性结合成员、与第二靶分析物结合的第二特异性结合成员、与第三靶分析物结合的第三特异性结合成员等，并且第一特异性结合成员与第一信号生成化合物和/或第一信号生成基质相关联，第二特异性结合成员与第二信号生成化合物和/或第二信号生成基质相关联，第三特异性结合成员与第三信号生成化合物和/或第三信号生成基质相关联等。除了一个或多个特异性结合成员之外，试剂盒可以进一步包括：一个或多个附加的测定组分，诸如合适的缓冲介质等等。试剂盒还可以包括：用于检测和测量信号生成化合物和/或信号生成基质的设备，诸如上文描述的那些。最后，试剂盒可以包括用于在根据本发明的分析物检测方法中使用特异性结合成员的用法说明，其中用于使用的这些用法说明可以存在于试剂盒包装上和/或包装说明书上。
可选地，该试剂盒包括质量对照组件（例如，灵敏度板、校准器和阳性对照）。质量对照试剂的制备在本领域中是公知的，并且在用于各种免疫诊断产品的说明书页上有所描述。灵敏度板成员可选地被用来建立测定性能特性，并且进一步可选地是试剂盒试剂的完整性和测定的标准化的有用指示符。
试剂盒还可以可选地包括进行诊断测定或便于质量对照评估所需的其他试剂，诸如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、基质、检测试剂等等。其他组分（诸如，用于测试样本（例如，预处理试剂）的隔离和/或处理的缓冲液和溶液）也可以被包括在试剂盒中。该试剂盒可以附加地包括一个或多个其他对照。可以将试剂盒的一个或多个组分冻干，在这种情况下，试剂盒可以进一步包括适合于重构冻干组分的试剂。一个或多个组分可以以液体形式存在。
如果需要，可选地在合适的容器中提供试剂盒的各种组分。该试剂盒进一步可以包括用于保持或存储样本的容器（例如，用于尿液、唾液、血浆、脑脊髓液或血清样本的容器，或者用于存储、运输或处理组织以便产生组织抽吸物的适当容器）。在适当的时候，试剂盒还可以可选地包含反应器皿、混合器皿和其他便于制备试剂或测试样本的组分。该试剂盒还可以包括用于辅助获得测试样本的一个或多个样本收集/获取仪器，诸如，各种血液收集/转移设备，这些设备诸如微量采样设备、微针或其他微创无痛血液收集方法；（一个或多个）血液收集管；刺血针；毛细血管血液收集管；其他单个指尖刺破血液收集方法；口腔拭子、鼻/咽拭子；16号或其他大小的针、用于穿孔活组织检查的圆形刀片（例如，1-8 mm，或其他适当的大小）、手术刀或激光（例如，特别是手持式的）、注射器、无菌容器或者套管以用于获得、存储或抽吸组织样本；等等。该试剂盒可以包括下述一个或多个仪器：其用于辅助关节抽吸、锥形活组织检查、穿孔活组织检查、细针抽吸活组织检查、图像引导的经皮穿刺活组织检查、支气管肺泡灌洗、内窥镜活组织检查以及腹腔镜活组织检查。
如果需要，试剂盒可以包含固体支持物，诸如磁性粒子、珠粒、隔膜、支架分子、膜、滤纸、圆盘或芯片。
如果需要，试剂盒可以进一步包括单独的或与用法说明进一步组合的一个或多个组分，以用于针对另一分析物来测定测试样本，该另一分析物可以是生物标志物，诸如疾病状态或病症的生物标志物，该疾病或病症诸如传染病、心脏病、代谢疾病、甲状腺疾病等。
9. 示例
示例1
图4图示了用于数字免疫测定的微腔阵列以及通过酶促反应进行荧光信号放大的机制。在该示例中，珠粒直径为~2.7 um，孔直径/深度为~4 um/~4 um，酶是碱性磷酸酶，荧光基质是荧光素二磷酸，并且信号放大为在RT下长达90 min。
为了评估数字ELISA免疫测定的有用性，开发了基于本发明实施例的手持式（~10×10×12，以厘米为单位）光学成像系统。在该演示中，应用了零和10毫微微M的抗原溶液（重组HBsAg）。第一光源被应用于检测器皿，分别产生了图6中所示的图像（A）和（D）。第二光源被应用于检测器皿，分别产生了图6中所示的图像（B）和（E）。图像分析器将图像（A）与（B）组合，这产生了图像（C），并且图像分析器将图像（D）与（E）组合，这产生了图像（F），如图6中所示。图像（C）和（F）分别图示了由灰色和白色点绘制的“仅珠粒”和“珠粒和酶”的检测到的方位；白色点被标识为免疫复合物信号。手持式检测器的性能示出了关于数字测定的良好性能——在图像中捕获了100,000腔区。
示例2
HBsAg（乙型肝炎病毒表面抗原）的数字免疫测定光学检测
利用EDC（1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基）将抗HBsAg的老鼠单克隆抗体（内部制备的）涂覆到3μm直径的顺磁性微粒子（安捷伦科技公司）表面上以制备捕获抗体。在洗涤之后，将涂覆的顺磁性微粒子添加到包含蛋白质的缓冲溶液中。
使用本领域已知的标准化学反应将抗HBsAg的山羊多克隆抗体（内部制备的）与碱性磷酸酶（雅培公司）缀合以制备检测抗体。使用本领域已知的惯常凝胶过滤方法来纯化缀合的抗体。将纯化的缀合抗体稀释到包含蛋白质的缓冲溶液中。
将50μL的抗HBsAg抗体微粒子溶液和50μL的碱性磷酸酶缀合的抗HBsAg抗体溶液与75μL的人类血清（具有或不具有HBsAg）一起培养。在37℃下培养达18分钟之后，利用缓冲溶液来洗涤珠粒，并且将珠粒与MUP或FDP溶液混合，然后加载到在底部处具有微孔阵列（近似400,000个5微米直径的孔（飞升腔，femtoliter chamber））的孔（直径为6 mm）中。在孔的顶部上添加重质氟化油（诸如例如，FC-40），并且改变水相和油相。去除水相（顶部相），并且利用本文中描述的手持式光学成像系统来设置孔。
利用光学系统拍摄的图像（照片）如图7-11中所示。通过散射图像检测来检测微粒子。通过荧光图像检测来检测具有抗体涂覆的微粒子-HBsAg-碱性磷酸盐缀合的抗体复合物（HBsAg免疫复合物）的飞升腔。使用Image J软件来分析检测到的信号，以计数具有HBsAg免疫复合物的飞升腔的数量和微粒子的数量。
示例3
图4图示了用于数字免疫测定的微腔阵列以及通过酶促反应进行荧光信号放大的机制。在该示例中，珠粒直径为~2.7um，并且珠粒包括Qdot625（Ex/Em：蓝色/红色）涂覆的和未涂覆的混合物（比例为近似10％），孔直径/深度为~4um/~4um。通过光散射和荧光成像来分别使全部珠粒以及Qdot涂覆的珠粒的红色荧光可视化。
为了评估荧光成像对于数字ELISA免疫测定的有用性，利用了基于本发明实施例的手持式（~10×10×10，以厘米为单位）光学成像系统。在该示例中，单发射过滤器是515nm长通类型的过滤器（例如，Semrok515LP）。在该演示中，应用了10％的红色荧光和非荧光珠粒的二元混合物。
所利用的成像方案演示了不需要改变发射过滤器。该成像方案利用了使用包括绿色LED（525 nm）的第一光源的第一自动聚焦步骤，并且然后将第一光源应用于检测器皿以供散射和珠粒成像。这产生了图12中所示的图像（A）。在下一个步骤中，将包括蓝色LED（450nm）的第二光源应用于检测器皿以激发检测器皿中的样本。这产生了图12中所示的荧光图像（B）。接下来，刷新色差以包括红色LED（625 nm）作为第一光源。利用该刷新的第一光源来实行自动聚焦，并且然后将其应用于检测器皿以用于散射。这产生了图12中所示的图像（C）。将第二光源（蓝色LED）应用于检测器皿以激发样本，这产生了图12中所示的图像（D）。
图像分析器将图像（A）与（D）进行组合，这产生了如图12中所示的图像（E）。ImageJ软件被用来合并图像（A）和（D）。图像（E）图示了由绿色和红色点绘制的“珠粒和荧光种类”的检测方位。
在所附权利要求中阐述了本发明的各种特征和优点。

Claims (53)

1.一种紧凑的数字测定装置，其包括：
检测器皿；
光源，其被配置成朝向所述检测器皿发射光；
单个过滤器，其被定位成接收从所述检测器皿中的样本反射的、源自所述光源的光，以及
接收来自所述检测器皿中的样本的输出；以及
检测器，其被配置成接收反射光的一部分和传过所述单个过滤器的输出的一部分。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述光源是发光二极管。
3.根据权利要求2所述的装置，其中所述光源包括多个发光二极管。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述光源由多于一个光源组成。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述光源被配置成改变颜色。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述光源被配置成在蓝色与绿色之间改变。
7.根据权利要求6所述的装置，其中所述绿色光源从所述检测器皿中的样本反射出来，以供所述检测器生成标识了所述样本中是否存在珠粒的光学数据。
8.根据权利要求6所述的装置，其中所述蓝色光源激发所述检测器皿中的样本，以供所述检测器生成标识了所述样本中是否存在酶的光学数据。
9.根据权利要求1所述的装置，其中所述输出是在由所述光源激发所述检测器皿中的样本之后所生成的荧光。
10.根据权利要求1所述的装置，其中所述输出是通过所述检测器皿中的样本的化学反应而生成的。
11.一种紧凑的数字测定装置，其包括：
检测器皿；
第一光源，其被配置成朝向所述检测器皿并且相对于所述检测器皿以一角度来发射光；
第二光源，其被配置成朝向所述检测器皿发射光；
单个过滤器，其被定位成接收从所述检测器皿中的样本反射的、源自所述第一光源的光，以及
接收来自所述检测器皿中的样本的荧光输出；以及
检测器，其被配置成接收反射光的一部分和传过所述单个过滤器的荧光输出的一部分。
12.根据权利要求11所述的装置，其中所述检测器皿包括以大体上90度延伸穿过其中的轴线。
13.根据权利要求12所述的装置，其中相对于所述轴线以一角度来定位所述第一光源。
14.根据权利要求13所述的装置，其中所述角度在0度与90度之间。
15.根据权利要求13所述的装置，其中所述角度在45度与90度之间。
16.根据权利要求13所述的装置，其中所述角度为80度。
17.根据权利要求12所述的装置，其中所述第二光源被配置成发射沿着所述轴线行进的光束。
18.根据权利要求12所述的装置，其中所述第二光源相对于所述轴线横向偏移，并且其中所述第二光源配置成发射平行于所述轴线行进的光束。
19.根据权利要求11所述的装置，其中所述第二光源包括多于一个光源。
20.根据权利要求11所述的装置，其中所述第一光源是发光二极管。
21.根据权利要求20所述的装置，其中所述第一光源包括多个发光二极管。
22.根据权利要求11所述的装置，其中所述第一光源由多于一个光源组成。
23.根据权利要求11所述的装置，其中所述第一光源是绿色发光二极管。
24.根据权利要求11所述的装置，其中所述第二光源是蓝色发光二极管。
25.根据权利要求11所述的装置，其中所述检测器被配置成基于源自所述第一光源的光来生成第一图像，所述第一图像标识了所述检测器皿中的样本中的珠粒的位置。
26.根据权利要求25所述的装置，其中所述检测器被配置成基于来自在由所述第二光源进行激活之后的样本的荧光输出来生成第二图像，所述第二图像检测所述检测器皿中的样本中存在标记。
27.根据权利要求11所述的装置，其中所述第一光源包括颜色，并且进一步地，其中所述颜色基于所述单个过滤器。
28.一种紧凑的数字测定装置，其包括：
样本阵列，其具有多个检测器皿；
第一光源，其被配置成相对于所述检测器皿以一定角度、朝向所述检测器皿发射光，以照射所述检测器皿中的样本；
第二光源，其被配置成在不使用反射镜或其他反射物体的情况下朝向所述检测器皿发射光，所述第二光源进一步被配置成激活所述检测器皿中的样本以发射输出；
过滤器，其被定位成接收从所述检测器皿反射的、源自所述第一光源的光，以及
接收来自所述检测器皿中的样本的输出；以及
检测器，其被配置成接收反射光和传过所述过滤器的来自样本的输出，并且生成光学数据，所述光学数据标识了哪些孔包含珠粒以及哪些孔包含标记。
29.根据权利要求28所述的装置，其中所述样本阵列包括以大体上90度延伸穿过其中的轴线。
30.根据权利要求29所述的装置，其中相对于所述轴线以一角度来定位所述第一光源。
31.根据权利要求30所述的装置，其中所述角度在0度与90度之间。
32.根据权利要求30所述的装置，其中所述角度在45度与90度之间。
33.根据权利要求30所述的装置，其中所述角度为80度。
34.根据权利要求29所述的装置，其中所述第二光源被配置成发射沿着所述轴线行进的光束。
35.根据权利要求29所述的装置，其中所述第二光源相对于所述轴线横向偏移，并且其中所述第二光源配置成发射平行于所述轴线行进的光束。
36.根据权利要求28所述的装置，其中所述第二光源包括多于一个光源。
37.根据权利要求28所述的装置，其中所述第一光源是发光二极管。
38.根据权利要求37所述的装置，其中所述第一光源包括多个发光二极管。
39.根据权利要求28所述的装置，其中所述第一光源由多于一个光源组成。
40.根据权利要求28所述的装置，其中所述第一光源是绿色发光二极管。
41.根据权利要求28所述的装置，其中所述第二光源是蓝色发光二极管。
42.根据权利要求28所述的装置，其中所述光学数据是下述图像：所述图像标识了所述珠粒——如果存在的话——在所述检测器皿中的位置、以及所述标记——如果存在的话——在所述检测器皿中的位置。
43.根据权利要求28所述的装置，其中所述第一光源包括颜色，并且进一步地，其中所述颜色基于所述过滤器。
44.一种紧凑的数字测定装置，其包括：
样本阵列，其包括被定位在多个纳米孔中的多个样本；
光源，其被配置成相对于所述样本阵列、以一角度朝向所述样本阵列发射光，以照射所述样本阵列中的样本，所述光源具有在450 nm与550 nm之间的波长；以及
检测器，其被配置成接收从所述样本反射的光的一部分。
45.根据权利要求44所述的装置，其中所述光源是发光二极管。
46.根据权利要求45所述的装置，其中所述光源包括多个发光二极管。
47.根据权利要求44所述的装置，其中所述光源包括多于一个光源。
48.根据权利要求44所述的装置，其中所述光源被配置成改变颜色。
49.根据权利要求48所述的装置，其中所述光源被配置成在蓝色与绿色之间改变。
50.根据权利要求49所述的装置，其中所述绿色光源从所述样本阵列中的样本反射出来，以供所述检测器生成标识了所述样本中是否存在珠粒的光学数据。
51.根据权利要求44所述的装置，其中相对于垂直于所述样本阵列而定向的轴线，所述角度在0度与90度之间。
52.根据权利要求44所述的装置，其中相对于垂直于所述样本阵列而定向的轴线，所述角度在45度与90度之间。
53.根据权利要求44所述的装置，其中相对于垂直于所述样本阵列而定向的轴线，所述角度为80度。
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