KR20080025489A

KR20080025489A - 종양표시인자 검출용 바이오센서

Info

Publication number: KR20080025489A
Application number: KR1020060090024A
Authority: KR
Inventors: 이정오; 장현주; 공기정; 소혜미; 김병계; 박동원; 김범수
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-18
Filing date: 2006-09-18
Publication date: 2008-03-21
Also published as: KR100830811B1

Abstract

본 발명에서는, 종양표시인자를, 실시간으로 간편하게, 선택적으로 검출할 수 있는 종양표시인자 검출용 바이오센서를 제공한다. 본 발명에서는 또한, 종양표시인자 검출용 바이오 센서 제조 방법을 제공한다. 본 발명에서는 또한, 앞에서 설명한 본 발명의 바이오 센서를 이용한 종양표시인자 분석방법을 제공한다. 본 발명에서 제공하는 종양표시인자 검출용 바이오센서는, 기판; 상기 기판위에 부착된 제1전극; 상기 기판위에 부착된 제2전극; 상기 제1전극과 상기 제2전극을 전기적으로 연결하고 있는 반도체성 탄소나노튜브; 일 말단이 상기 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 결합되어 있는 링커분자(linker molecule); 및 상기 링커 분자의 다른 말단에 결합되어 있는 종양표시인자용 바이오-리셉터(bio-receptor);를 포함한다.

바이오센서, 종양표시인자, 탄소나노튜브, 전계효과

Description

종양표시인자 검출용 바이오센서 {Bio-sensor for detecting tumor marker}

도 1은, 본 발명의 바이오센서의 일 구현예를 도식적으로 나타내는 단면도이다.

도 2는, 본 제조예에서 제조된 트랜스듀서부 소자의 AFM(atomic force microscope) 사진이다.

도 3은, 실시예 1의 바이오센서의 탄소나노튜브 표면에 바이오리셉터가 고정화 되어있는 것을 AFM 사진으로 나타낸 것이다.

도 4는, 실시예 2에서 측정한 4 개의 CEA 시료에 대한 전류변화 그래프이다.

도 5는, 실시예 3에서 측정한 3 개의 CEA 시료에 대한 전류변화 그래프이다.

도 6은, 도 5에 나타난 결과를 이용하여, CEA 시료 용액을 적하하지 않은 상태에서의 초기전류(I₀)에 대한 전류감소치(ΔI)의 비율(%)과, CEA 농도 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 바이오센서(bio-sensor)에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 종양표 시인자 검출용 바이오센서 (bio-sensor for detecting tumor marker)에 관한 것이다.

바이오센서는, 예를 들면, 효소, 항원, 항체 등과 같은 특정 화학물질(표적 바이오-물질)을 인식할 수 있는 생체물질(바이오-리셉터)을 이용하여, 여러 가지 화학물질이 섞여 있는 시료에서 특정 화학물질을, 신속하고 간편하게, 선택적으로 측정하는 기기이다.

바이오센서는 일반적으로, 센서부(sensor part)와 트랜스듀서부(transducer part)로 이루어진다. 센서부는, 표적 바이오-물질(target bio-material)과 선택적으로 결합하는 바이오-리셉터(bio-receptor)로 이루어진다. 트랜스듀서부는 표적 바이오-물질과 바이오-리셉터의 결합에 의한 전기화학적 변화에 상응하는 전기신호를 출력한다. 대표적인 바이오센서의 종류로서는, 효소 센서 및 면역 센서가 있다.

효소 센서의 예로서는, 효소 전극 센서, 효소 트랜지스터 센서, 효소 서미스터 센서 등이 있다. 효소 전극 센서는, 효소의 촉매기능에 의하여 생성 또는 소비되는 물질이 이온 선택성 감응막에 생성시킨 막전위차를 측정(전위측정형)하거나, 이러한 물질과 전극과의 반응에 의한 전류값을 측정(전류측정형)하여, 효소반응에 관여하는 특정 물질의 농도를 측정한다. 효소 트랜지스터 센서는, 이온감응성 전계효과형 트랜지스터의 게이트 표면에 pH변화를 일으키는 효소를 고정시킨 것이다. 효소 서미스터 센서는, 고정화 효소와 화학반응열을 측정하는 서미스터를 결합한 것이다. 실용화된 효소 센서로서는, 혈당량을 측정하는 글루코오스 센서, 알코올 센서, 유기산 센서, 아미노산 센서, 요소 센서 등이 있다.

면역 센서는 항원과 항체 사이의 선택적 결합력을 이용하여, 예를 들면, 혈액과 같은 체액에 존재하는 단백질, 항원, 호르몬, 의약품 등의 측정에 이용된다. 면역 센서의 대표적인 예로서는 전극형 면역 센서가 있다. 전극형 면역 센서는 항원 또는 항체 고정화막과 전극으로 구성된다. 양전하로 대전되어 있는 항체 고정화막의 표면에, 음전하를 띠고 있는 단백질 등의 물질이 결합하면, 항체 고정화막의 양전하가 감소하게 된다. 이때, 전극으로 항체 고정화막의 전위 변화를 측정하므로써, 음전하를 띠고 있는 단백질 등의 물질의 농도를 결정할 수 있다. 면역 센서는, 예를 들면, 매독혈청의 진단, 혈액형의 판독 등에 이용될 수 있다. 전극형 면역 센서 외에도, 광계측(光計測) 장치, 수정진동자 등을 이용한 면역 센서가 있다.

한편, 종래의 암진단 방법에서는, 혈액으로부터, 다양한 암에서 특이적으로 발생하는 종양표시인자(tumor marker)를 검출한다. 종양표시인자의 검출 방법으로서는, 효소면역검사법(ELISA : enzyme-linked immunosorbent assay)이 주로 사용되고 있다. 그러나, 알려진 바와 같이, 이러한 면역학적 검사법은, 그 실행방법이 복잡하고, 결과를 얻는데 많은 시간이 소요된다.

따라서, 종양표시인자를, 신속하고 간편하게, 선택적으로 검출할 수 있는 바이오센서가 제공될 수 있다면, 암진단 방법은 획기적으로 개선될 수 있다.

본 발명에서는, 종양표시인자를, 실시간으로 간편하게, 선택적으로 검출할 수 있는 종양표시인자 검출용 바이오센서를 제공한다.

본 발명에서는 또한, 종양표시인자 검출용 바이오 센서 제조 방법을 제공한 다.

본 발명에서는 또한, 앞에서 설명한 본 발명의 바이오 센서를 이용한 종양표시인자 분석방법을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 종양표시인자 검출용 바이오센서는,

기판;

상기 기판위에 부착된 제1전극;

상기 기판위에 부착된 제2전극;

상기 제1전극과 상기 제2전극을 전기적으로 연결하고 있는 반도체성 탄소나노튜브;

일 말단이 상기 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 결합되어 있는 링커분자(linker molecule); 및

상기 링커 분자의 다른 말단에 결합되어 있는 종양표시인자용 바이오-리셉터(bio-receptor);를 포함한다.

본 발명에서 제공하는 바이오 센서 제조 방법은,

(a) 기판; 상기 기판위에 부착된 제1전극; 상기 기판위에 부착된 제2전극; 상기 제1전극과 상기 제2전극을 전기적으로 연결하고 있는 반도체성 탄소나노튜브;를 포함하는 트랜스듀서부에, 링커 분자를 결합시키는 단계; 및

(b) 상기 링커 분자에 종양표시인자용 바이오-리셉터를 결합시키는 단계;를 포함한다.

본 발명에서 제공하는 종양표시인자 분석방법은,

시료용액을, 앞에서 설명한 본 발명의 종양표시인자 검출용 바이오센서와 접촉시키는 단계; 및

상기 시료용액과 상기 바이오센서의 접촉을 유지하면서, 시간 경과에 따라, 상기 바이오센서의 탄소나노튜브의 전기전도도 변화를 측정하는 단계;를 포함한다.

이하에서는, 본 발명의 종양표시인자 검출용 바이오센서를 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 종양표시인자 검출용 바이오센서는 기판; 상기 기판위에 부착된 제1전극; 상기 기판위에 부착된 제2전극; 상기 제1전극과 상기 제2전극을 전기적으로 연결하고 있는 반도체성 탄소나노튜브; 일말단이 상기 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 결합되어 있는 링커분자(linker molecule); 및 상기 링커 분자의 다른 말단에 결합되어 있는 종양표시인자용 바이오-리셉터(bio-receptor);를 포함한다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 제1전극, 제2전극, 반도체성 탄소나노튜브는 트랜스듀서부를 구성하며, 바이오 리셉터는 센서부를 구성한다. 링커분자는 바이오 리셉터를 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 고정시키는 역할을 한다. 링커분자의 일말단은 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 결합되어 있고, 링커분자의 다른 말단은 바이오 리셉터와 결합되어 있다. 바이오 리셉터는, 링커분자에 의하여, 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 근접하여 견고하게 고정되어 있다. 본 발명의 바이오센서는 그 전체로서, FET(field effect transistor)를 구성한다. 링커분자는 게이 트 절연체의 역할을 하며, 바이오 리셉터는 게이트 전극의 역할을 한다.

기판은 전기절연성을 갖는 임의의 재료일 수 있다. 예를 들면, 기판은 실리콘, 석영, 사파이어, 유리, 또는 플라스틱일 수 있다. 반도체성 탄소나노튜브의 성장을 위하여, 열화학기상증착법을 이용하는 경우, 기판은 약 900 ℃ 이상의 고온에 견딜 수 있어야 한다. 따라서, 기판은 실리콘, 석영 또는 사파이어인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 제조공정이 간단하고 비교적 가격이 저렴한 실리콘이 기판으로서 사용될 수 있다.

제1전극 및 제2전극은 전기전도성을 갖는 임의의 재료일 수 있다. 예를 들면, 제1전극 및 제2전극은 금, 티타늄, 크롬, 백금, 팔라듐, 코발트, 또는 알루미늄일 수 있다.

금 또는 알루미늄의 경우, 실리콘 기판으로부터 잘 떨어지는 경향을 보인다. 이러한 현상을 방지하기 위해서는, 티타늄 또는 크롬을 기판위에 먼저 증착시킨 후, 그 위에 금 또는 알루미늄을 증착시킬 수 있다. 따라서, 제1전극 및 제2전극은, 예를 들면, 금/티타늄, 금/크롬, 알루미늄/티타늄, 또는 알루미늄/크롬과 같은 다층 전극일 수 있다.

제1전극은 소스 전극 또는 드레인 전극으로 사용될 수 있다. 제2전극 역시 소스 전극 또는 드레인 전극으로 사용될 수 있다. 다만, 제1전극이 소스 전극이면, 제2전극은 드레인 전극이며, 제1전극이 드레인 전극이면, 제2전극은 소스 전극이 다.

반도체성 탄소나노튜브는 제1전극과 제2전극을 전기적으로 연결하고 있다. 반도체성 탄소나노튜브는 전하 운반 채널의 역할을 한다.

반도체성 탄소나노튜브는 p-형 또는 n-형일 수 있다. 반도체 특성을 보이는 탄소나노튜브는 통상적으로, 전하운반자가 정공인 p-형 반도체이다. 전하운반자가 전자인 n-형 반도체 특성을 보이는 n-형 단일벽 탄소나노튜브는, 예를 들면, 탄소나노튜브에 K을 도핑하므로써, 또는, 탄소나노튜브를 진공 중에서 열처리하므로써 얻을 수 있다.

반도체성 탄소나노튜브는 단일벽, 이중벽 또는 다중벽 탄소나노튜브일 수 있다. 일반적으로, 이중벽 또는 다중벽 탄소나노튜브와 비교하여, 단일벽 탄소나노튜브가 반도체 특성을 가질 가능성이 훨씬 크다. 또한, 단일벽 탄소나노튜브는 열화학기상증착법을 이용하여 매우 용이하게, 기판위에 성장시킬 수 있다. 따라서, 반도체성 탄소나노튜브는 단일벽인 것이 바람직하다.

링커분자(linker molecule)는, 바이오 리셉터를 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 근접하도록 고정시키는 역할을 한다. 링커분자의 일말단은 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 결합되어 있고, 링커분자의 다른 말단은 바이오-리셉터와 결합되어 있다.

링커분자는, 물리적 흡착, 화학적 흡착, 공유결합, 비공유결합 및 이온결합 을 통하여 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 결합될 수 있는 제1 말단(또는, 결합부위)과, 물리적 흡착, 화학적 흡착, 공유결합, 비공유결합 및 이온결합을 통하여 바이오-리셉터와 결합할 수 있는 제2 말단(또는, 결합부위)을 갖는 임의의 비전도성 분자이다.

통상적으로 탄소나노튜브의 표면은 소수성을 갖는다. 따라서, 링커분자의 제1 말단은, 탄소나노튜브의 표면에, 물리적 또는 화학적 흡착 만으로도, 용이하게 결합될 수 있는, 소수성 모이어티인 것이 바람직하다. 구체적인 예를 들면, 제1 말단은, 치환기를 갖지 않는 탄소 사슬; 벤젠 고리; 피렌(pyrene); 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다.

링커분자의 제2 말단은, 구체적인 예를 들면, 바이오-리셉터로서 아민기를 갖는 항체를 사용하는 경우, 아민기와 용이하게 화학적 결합을 이룰 수 있는, 이미다졸기; 카르복실기; 또는 이들의 조합과 같은 작용기를 함유할 수 있다.

더욱 구체적인 예를 들면, 링커분자는, CDI-트윈20 (carbonyl diimidazol-tween20); 1-피렌부티릭 액시드 (1-pyrenebutyric acid); 또는 이들의 조합일 수 있다. CDI-트윈20은 CDI(carbonyl diimidazol)와 트윈20(polyoxyethylene-20 sorbitan monolaurate)을 반응시켜, CDI의 이미다졸기와 트윈20의 히드록시기를 결합시키므로써, 얻을 수 있다.

종양표시인자용 바이오-리셉터는, 종양표시인자와 특이적으로 결합할 수 있는 결합부위를 갖는 바이오-리셉터이다.

종양표시인자는 암 발병시 생체 내에서 특이적으로 증가하는 물질로서 암의 진단에 쓰일 수 있는 생체유래물질이다. 종양표시인자는, 예를 들면, 단백질, 당단백, 또는 탄수화물일 수 있다. 구체적인 종양표시인자의 예로서는, AFP(alpha fetoprotein), CEA(carcinoembryonic antigen), CA(cancer antigen)19-9, CA15-3, CA50, CA72-4, CA125, CA130, KMO-1, DuPAN-2, SPan-1, SLX, CA72-4, BFP, NCC-ST-439, SCC(sqamous cell carcinoma antigen), NSE(neuron specific enolase), CYFRA, γ-seminoprotein, 전립선 ACP, IAP, TPA(tissue polypeptide antigen), Ferritin, PIVKA ii, polyamine, β-microglobulin, PSβ1, POA, PAP(prostatic acid phosphatase), Galectin-3, PSA(prostatic specific Ag), β2-MG(β2-microglobulin), 등이 있다.

종양표시인자는 대부분 단백질을 기본 골격으로 하고 있으나, 단백질과 탄수화물의 결합으로 이루어진 당단백, 또는, 탄수화물일 수도 있다. 당단백인 종양표시인자로서는 예를 들면 CEA가 있다. 탄수화물인 종양표시인자로서는 예를 들면 CA19-9가 있다.

종양표시인자용 바이오-리셉터는, 예를 들면, 이러한 종양표시인자와 특이적으로 결합할 수 있는 결합부위를 갖는 항체, 효소, 단백질, 펩티드, 아미노산, 핵산, 압타머(aptamer), 지질, 코펙터 또는 탄수화물일 수 있다.

종양표시인자용 바이오-리셉터로 사용될 수 있는 항체로서는, 구체적인 예를 들면, 모노클로날 항체 (monoclonal antibody), 폴리클로날 항체 (polyclonal antibody), 항체 결합부위 프래그먼트 (antibody binding fragment), 등이 있다.

또한, 예를 들면, Galectin-3와 특이적으로 결합하는 마이콜릭 액시드(mycolic acid)와 같은 저해제도, 종양표시인자용 바이오-리셉터로서 사용될 수 있다.

이하에서는, 도 1을 참조하여, 본 발명의 바이오센서의 구조와 기능을 더욱 상세하게 설명한다. 도 1은, 본 발명의 바이오센서의 일 구현예를 도식적으로 나타내는 단면도이다.

기판(100) 위에, 제1전극(200) 및 제2전극(300)이 설치되어 있다. 제1전극(200)과 제2전극(300)은 반도체성 탄소나노튜브(400)에 의하여 전기적으로 연결되어 있다. 링커분자(500)의 일 말단부는 반도체성 탄소나노튜브(400)의 표면에 결합되어 있다. 링커분자(500)의 다른 말단부에는 종양표시인자용 바이오-리셉터(600)가 결합되어 있다.

예를 들어, 대장암의 대표적인 종양표시인자인 CEA(carcinoembryonic antigen)를 검출하는 경우, 바이오-리셉터(600)로서 모노클로날 항-CEA 항체가 사용될 수 있다. CEA 샘플은 pH 값이 약 6.5인 완충용액의 형태로 준비된다. pH 값이 약 6.5인 완충용액 중에서 CEA는 양전하를 띠게 된다. CEA 샘플을 도 1의 바이오센서와 접촉시키면, 모노클로날 항-CEA 항체인 바이오-리셉터(600)에, 양전하로 대전된 CEA가 특이적으로 결합된다. 그리하여, 바이오-리셉터(600)는, 결합된 CEA의 양에 비례하는 양의 전위를 갖게된다. 반도체성 탄소나노튜브(400)가 p-형 반도체의 특성을 갖고 있으면, 바이오-리셉터(600)에 형성된 양의 전위에 의한 전계효과에 의하여, 반도체성 탄소나노튜브(400)의 전기전도도가 감소한다. 그에 따라, 제1전극(200) 및 제2전극(300) 사이에 일정 전압이 인가되어 있는 상태에서, 반도체성 탄소나노튜브(400)를 따라 흐르는 전류가 감소하게 된다. 이러한 전류의 변화를 측정하므로써, CEA 샘플 중의 CEA의 존재여부 및/또는 그 농도를 검출할 수 있다.

바이오-리셉터(600)가, 분자레벨에서, 반도체성 탄소나노튜브(400)의 표면에 매우 근접하도록 고정되어 있기 때문에, 반도체성 탄소나노튜브(400)의 전기전도도는 바이오-리셉터(600)의 전위에 의하여 지배된다. 그리고, 바이오-리셉터(600)는 CEA 샘플 중의 다른 대전 성분과 결합하지 않고 CEA와 특이적으로 결합하기 때문에, 바이오-리셉터(600)의 전위는 CEA의 존재에 의해서만 의미있는 변화를 겪게 된다. 결국, 반도체성 탄소나노튜브(400)의 전기전도도는 CEA에 의해서만 변화될 수 있다. 따라서, 바이오-리셉터(600)로서 모노클로날 항-CEA 항체를 사용한 경우, 도 1의 바이오 센서는 CEA 만을 특이적으로 검출할 수 있다.

이와 같이, 각각의 종양표시인자와 특이적으로 결합하는 바이오-리셉터를 사용하므로써, 본 발명의 바이오 센서는 해당 종양표시인자를 특이적으로 검출할 수 있다. 게다가, 바이오-리셉터의 전위 변화가 샘플과의 접촉에 의하여 실시간으로 이루어지므로, 본 발명의 바이오 센서는 매우 신속하게 (예를 들어, 수 초 내지 수 분 내에) 샘플 중의 종양표시인자의 존재여부 및/또는 그 농도를 검출할 수 있다.

본 발명의 바이오센서의 다른 구현예에 있어서, 상기 제1전극 및 상기 제2전극 중의 적어도 하나의 표면에 절연층이 형성되어 있을 수 있다.

종양표시인자를 실시간으로 검출하는 과정에서, 종양표시인자가 함유된 시료용액을, 제1전극 및 제2전극 사이에 성장되어 있는 탄소나노튜브에 떨어뜨리게 된다. 이때, 정확한 분석을 위해서는 제1전극과 제2전극 사이의 탄소나노튜브를 통해서만 전류가 흘러야 한다. 그러나, 시료용액 자체가 전기전도성을 갖는 경우, 시료용액을 통하여 제1전극과 제2전극 사이에 전류가 흐를 수도 있다. 따라서, 상기 절연층은, 시료용액을 통하여 제1전극과 제2전극 사이에 전류가 흐르는 것을 방지하기 위하여 사용된다.

상기 절연층으로서는, 박막 트랜지스터 또는 집적 소자 분야에서 통상적으로 사용되는 절연성 재료가 사용될 수 있을 뿐만아니라, 예를 들면, SU-8과 같은 감광제 그 자체도 절연성 재료로 사용될 수 있다. 특히, SU-8은, 광에 노출된 후, 매우 강한 소수성을 발휘할 수 있으므로, 시료용액이 전극과 접촉하는 것을 매우 효과적으로 방지할 수 있다.

본 발명에서는 또한, 바이오 센서 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 바이오 센서 제조 방법은,

(a)단계에서 사용되는 트랜스듀서부는, 예를 들면, 탄소나노튜브 성장용 촉매의 존재하에서, 기판 위에 탄소나노튜브를 수평 성장시킨 후, 전극패턴을 형성시키므로써 얻을 수 있다. 트랜스듀서부 소자의 제작은, 공지된 탄소나노튜브 성장 방법 및 공지된 집적회로 소자 제작 방법을 이용하여 수행될 수 있으므로, 본 발명에서는 자세히 설명하지 않는다. 또한, 트랜듀서부는, 제1전극과 제2전극 중의 적어도 하나의 표면에 형성되어 있는 절연층을 더 포함할 수 있다.

(a)단계는, 트랜스듀서부 소자와 링커 분자를 접촉시켜서, 링커 분자의 일 말단을 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 결합시키는 단계이다. 예를 들면, 트랜스듀서부 소자를 링커 분자 함유 용액에 담그므로써, 링커 분자와 반도체성 탄소나노튜브를 결합시킬 수 있다.

(b)단계는, 링커 분자가 결합되어 있는 트랜스듀서부 소자와 종양표시인자용 바이오-리셉터를 접촉시켜서, 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 결합되어 있는 링커 분자의 다른 말단에 종양표시인자용 바이오-리셉터를 결합시키는 단계이다. 예를 들면, 링커 분자가 결합되어 있는 트랜스듀서부 소자를 종양표시인자용 바이오-리셉터 함유 용액에 담그므로써, 트랜스듀서부에 결합되어 있는 링커 분자의 다른 말단에, 종양표시인자용 바이오-리셉터를 결합시킬 수 있다.

(a) 및 (b) 단계를 거치므로써, 트랜스듀서부의 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 링커 분자와 바이오-리셉터의 결합체인 센서부가 형성된다.

링커 분자와 바이오-리셉터의 결합체는, 반도체성 탄소나노튜브의 표면 외의, 트랜스듀서부의 다른 영역에도 소량 결합될 수 있다. 그러나, 반도체성 탄소나 노튜브의 표면에 결합되는 링커 분자와 바이오-리셉터의 결합체가 반도체성 탄소나노튜브에 대한 전계 효과를 지배한다. 따라서, 트랜스듀서부의 다른 영역에 링커 분자와 바이오-리셉터의 결합체가 존재하더라도, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 바이오 센서의 기능에는 악영향이 미치지 않는다.

바이오 센서의 감도 향상 측면에서는, 링커 분자와 바이오-리셉터의 결합체가 반도체성 탄소나노튜브의 튜브에 집중적으로 결합되는 것이 바람직하다. 그리하여, 본 발명의 제조 방법의 다른 구현예에서는, 기판 및 전극의 표면 보다 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 더욱 잘 결합하는 링커 분자를 사용한다. 예를 들면, CDI-트윈20 (carbonyl diimidazol-tween20); 1-피렌부티릭 액시드 (1-pyrenebutyric acid)와 같은 링커 분자가, 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 대한 결합 선호도가 우수하다.

본 발명의 제조방법을 사용하므로써, 종양표시인자 검출용 바이오센서를 매우 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 종양표시인자 분석방법은,

시료용액은 pH 조절을 위한 버퍼용액을 함유할 수 있다. pH 조절을 위한 버퍼용액용 용질로서는, 예를 들면, TBS(tris buffered saline), PBS(phosphate buffered saline), 카보네이트-비카보네이트(carbonate-bicarbonate), 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. pH 조절을 위한 버퍼용액용 용매로서는, 예를 들면, 탈이온수가 사용될 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 종양표시인자 분석방법을 이용하면, 종래의 면역학적 기법과 비교할 때, 매우 적은 양의 혈액으로도 종양표시인자의 검출이 가능하다. 이는, 본 발명의 방법에 사용되는 바이오센서의 감도가 매우 우수하기 때문이다.

시료용액의 pH 값은, 바이오센서가 주로 항원-항체 반응에 기초하므로, 중성에 가까운 것이 바람직하다. 예를 들면, 시료용액의 pH는 약 6.4 내지 약 7.8 일 수 있다.

종양표시인자를 검출하기 위하여 사용되는 시료용액의 양은 특별히 제한되지 않으나, 통상적으로는, 약 3 내지 약 5 ㎕ 일 수 있다. 이러한 양은, 종래의 면역학적 분석방법인 ELISA법과 비교할 때, 매우 적은 양이다.

시간경과에 따라, 바이오센서의 탄소나노튜브의 전기전도도 변화를 측정하는 단계에 있어서, 시료용액과 바이오센서의 접촉을 유지하는 시간, 또는, 전기전도도 변화를 측정하는 시간이 너무 작으면 정확한 분석이 이루어질 수 없다. 또한, 분석이 신속하게 이루어지기 때문에, 전기전도도 변화를 측정하는 시간이 너무 클 필요도 없다. 이러한 점을 고려하여, 전기전도도 변화 측정 시간의 바람직한 예를 들 면, 약 100 내지 약 600 초 일 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 종양표시인자 분석방법을 이용하면, 종래의 면역학적 기법과 비교할 때, 매우 신속한 종양표시인자의 검출이 가능해진다.

본 발명의 분석방법으로부터 얻은 시간경과에 따른 전기전도도의 변화율, 및/또는, 시간경과에 따른 전기전도도의 변화 태양으로부터, 시료 중에 종양표시인자가 존재하는지의 여부 및 그 농도를, 매우 용이하고 매우 신속하게, 결정할 수 있다.

이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명의 바이오센서를 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

<제조예 1 --- 트랜스듀서부 소자의 제작>

반도체성 탄소나노튜브 성장을 위한 촉매용액 합성

질산철(Ⅲ)·9수화물 (iron(Ⅲ) nitrate nonahydrate) 20 mg, 알루미늄옥사이드 미분말 (aluminum oxide nanopowder) 15 mg 및 비스(아세틸아세토나토) 디옥소몰리브데늄(Ⅵ) (bis(acetylacetonato) dioxomolybdenum(Ⅵ)) 5 mg을, 15 ml의 메탄올에 넣은 후 상온에서 24시간 동안 교반하여, 촉매용액을 얻었다.

촉매패턴의 형성

스핀코팅법(spin coating)을 이용하여 실리콘 기판위에 PMMA(polymethyl methacrylate)를 도포한 후, 전자빔 리소그라피법으로 촉매 자리 패턴을 형성하였 다. 24시간 동안 교반한 촉매용액을 1시간 동안 초음파진탕(sonication) 한 후, 촉매 자리 패턴이 형성된 실리콘 기판 위에 20초 동안 떨어뜨린 다음, 에어건(air gun)을 이용하여 잉여 촉매용액을 제거하였다. 이 기판을 150 ℃ 오븐에서 3분 동안 건조시켰다. 50 ℃의 아세톤에 촉매 처리한 기판을 30초 동안 담그어, 기판 표면의 PMMA를 제거한 후, 기판을 아세톤과 이소프로필 알콜로 세척하였다.

반도체성 탄소나노튜브의 성장

촉매 패턴이 형성된 실리콘 기판을 퍼니스(furnace) 내의 석영튜브 안에 넣고, 1000 SCCM 의 Ar을 흘려주면서 900 ℃ 까지 가열하였다. 퍼니스의 온도가 900 ℃에 이르렀을 때 Ar 공급을 중단한 다음, 5000 SCCM의 메탄과 600 SCCM의 수소를 12분 동안 공급하였다. 그 다음, 메탄과 수소의 공급을 중단하고, 1000 SCCM의 Ar을 공급하면서 퍼니스를 상온까지 냉각 시켰다. 이러한 과정을 거쳐, 촉매 패턴 사이에 반도체성 단일벽 탄소나노튜브가 형성된 실리콘 기판을 얻었다.

전극의 형성

반도체성 탄소나노튜브가 성장되어 있는 실리콘 기판 위에 포토레지스트(photoresist, AZ7210)을 스핀코팅법으로 도포한 후, 포토리소그라피법으로 전극 패턴을 형성시킨 다음, 열증착기(thermal evaporator)를 사용하여, 5 nm 두께의 티타늄 층 및 20 nm 두께의 골드(gold) 층을 증착하였다. 이 소자를 아세톤(acetone)에 담그어 리프트-오프(lift-off)하였다.

SU -8 절연층의 형성

SU-8 네가티브 포토레지스트(negative photoresist)를 전극이 형성된 소자 위에 스핀코팅법으로 도포한 후, 포토리소그라피(photolithography)로 절연층 패턴을 형성하였다.

이러한 과정을 거쳐, 실리콘 기판, 제1전극, 제2전극 및 반도체성 탄소나노튜브를 포함하는 트랜스듀서부 소자를 제조하였다. 도 2는, 본 제조예에서 제조된 트랜스듀서부 소자의 AFM(atomic force microscope) 사진이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 수평 성장된 반도체성 단일벽 탄소나노튜브가 양 전극을 전기적으로 연결하고 있다.

<제조예 2 --- CDI-Tween20의 합성>

본 제조예에서는 링커 분자로 사용될 CDI-Tween20을 합성하였다. 10ml 유리용기에, 600 mg의 CDI, 5 ml의 디에틸에테르(diethyl ether) 및 1 ml의 Tween20을, 순차적으로 투입하였다. 유리용기의 입구를 개방시킨 상태에서, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 상분리되어 있는 반응용액 중 아래쪽 용액을 피펫을 이용하여 새로운 10 ml 유리용기에 옮겨 담았다. 이 유리용기에 디에틸에테르를 넣고 잘 섞은 후, 합성된 CDI-Tween20과 디에틸에테르가 상분되도록 한 후, 위쪽의 디에틸에테르를 피펫을 이용하여 제거하였다. 마지막 과정을 5회 반복하여 실시한 다음, 마지막으로 분리된 CDI-Tween20을 진공장치를 이용하여 상온에서 2시간 동안 건조하므로써, 남아있는 디에틸에테르를 제거하였다.

<실시예 1 --- 바이오 센서의 제조>

제조예 1에서 얻은 트랜스듀서부 소자를, 제조예 2에서 얻은 CDI-Tween20 용액(CDI-Tween20 : 탈이온수 = 5 : 1130 (v/v)) 속에 2시간 동안 교반하며 담그어 두므로써, 링커 분자인 CDI-Tween20을 트랜스듀서부 소자와 결합시켰다.

그 다음, 트랜스듀서부 소자를, 모노클로날 항-CEA 항체(시그마-알드리치)가 18 ng/ml IgG 농도로 함유된 10 mM PBS 용액에 담근 후, 온도를 20℃로 유지하면서 5시간 동안 반응시키므로써, CDI-Tween20과 모노클로날 항-CEA 항체를 결합시켰다.

그리하여, 실시예 1의 바이오센서를 제작하였다. 도 3은, 실시예 1의 바이오센서의 탄소나노튜브 표면에 바이오리셉터가 고정화 되어있는 것을 AFM 사진으로 나타낸 것이다. 도 3에서, 밝은 노란색 점들이 CDI-Tween20에 결합되어 있는 모노클로날 항-CEA 항체들이다. 이러한 밝은 노란색 점들이 탄소나노튜브의 표면을 따라 집중적으로 배치되어 있는 것을 확인할 수 있다 (실리콘 기판 위의 어두운 노란색 점은 모노클로날 항-CEA 항체가 아니며, 어떠한 처리도 하지 않은 실리콘 기판의 AFM 사진에서도 통상적으로 나타나는 점이다).

<실시예 2 --- 바이오센서의 성능>

본 실시예에서는, 실시예 1에서 얻은 바이오센서의 CEA 검출 능력을 확인하였다.

먼저, 시그마-알드리치의 CEA 용액(1.6 mg/ml) 17 ㎕에, 1683 ㎕의 1mM PBS 버퍼용액을 투입하여, 16 ㎍/㎖ 농도의 CEA 용액을 얻었다. 그 다음, 상기 CEA 용액을 1mM PBS 버퍼용액으로 다시 희석하여, 5.4 ㎍/㎖ 농도의 CEA 시료 용액, 5.4 ng/㎖ 농도의 CEA 시료 용액, 54 pg/㎖ 농도의 CEA 시료 용액 및 5.4 pg/㎖ 농도의 CEA 시료 용액을 얻었다.

그 다음, 실시예 1에서 얻은 바이오센서의 두 전극에 전압인가 및 전류측정 을 위한 회로를 연결하였다. 바이오센서의 두 전극 사이에 인가된 전압은 100 mV 이었다. 탄소나노튜브를 통과하는 전류를 측정하기 위한 장비로서는 "Probe Station"과 "LabVIEW^TM v6.1"을 사용하였다.

그 다음, 바이오센서의 표면에 4 개의 CEA 시료 용액을 순차적으로 각각 5 ㎕ 를 떨어 뜨린 후, 시간경과에 따라, 탄소나노튜브를 통과하는 전류의 변화를 측정하였다. 4 개의 CEA 시료에 대한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는, 실시예 2에서 측정한 4 개의 CEA 시료에 대한 전류변화 그래프이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 바이오센서에 4 개의 CEA 시료 용액을 적하할 때마다, 탄소나노튜브를 통과하는 전류가 감소하였다. 따라서, 실시예 1의 바이오센서가 p-형 FET의 성능을 보이고 있고, 탄소나노튜브의 표면에 고정된 바이오리셉터(모노클로날 항-CEA 항체)에 CEA가 결합함에 따라 양의 전계효과에 의하여 탄소나노튜브의 전기전도도가 감소하였으며, 또한, CEA 농도가 증가함에 따라 탄소나노튜브의 전기전도도가 단계적으로 감소하였다는 것을 알 수 있다. 또한, 도 4의 결과로부터, 실시예 1의 CEA-검출용 바이오센서가 수 pg 내지 수 ng/ml 범위의 매우 낮은 농도의 CEA 시료용액에 대해서도 민감도를 발휘한다는 사실을 알 수 있다.

<실시예 3 --- 바이오센서의 성능>

본 실시예에서는, 실시예 2와 마찬가지의 방법으로, 40 ng/㎖ 농도의 CEA 시료 용액, 0.4 ㎍/㎖ 농도의 CEA 시료 용액 및 40 ㎍/㎖ 농도의 CEA 시료 용액을 준비한 후, 이들 3 개의 CEA 시료 용액을 사용하여, 실시예 1에서 얻은 바이오센서의 CEA 검출 능력을 확인하였다. 3 개의 CEA 시료 용액에 대한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는, 실시예 3에서 측정한 3 개의 CEA 시료에 대한 전류변화 그래프이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 바이오센서에 3 개의 CEA 시료 용액을 적하할 때마다, 탄소나노튜브를 통과하는 전류가 단계적으로 감소하였다. 40 ng/㎖ 농도의 CEA 시료 용액을 적하하였을 때의 전류감소치는 ΔI₁ 이었고, 0.4 ㎍/㎖ 농도의 CEA 시료 용액을 적하하였을 때의 전류감소치는 ΔI₂ 이었으며, 40 ㎍/㎖ 농도의 CEA 시료 용액을 적하하였을 때의 전류감소치는 ΔI₃ 이었다.

도 6은, 도 5에 나타난 결과를 이용하여, CEA 시료 용액을 적하하지 않은 상태에서의 초기전류(I₀)에 대한 전류감소치(ΔI)의 비율(%)과, CEA 농도 간의 상관관계를 나타낸 그래프이다. 도 6에 나타난 바와 같이, CEA 농도의 증가에 따라 전류감소치도 증가하는 것을 알 수 있다. 이러한 상관관계를 이용하므로써, 본 발명의 바이오센서를 이용하여, 시료용액의 종양표시인자의 농도를 매우 용이하게 측정할 수 있다. 비록, 도 6의 상관관계는 직선으로 나타나 있지만, 구체적인 측정 조건에 따라, 다른 형태의 상관관계가 얻어질 수도 있다.

본 발명의 종양표시인자용 바이오센서는, 종양표시인자에 대한 매우 우수한 선택적 특이성; 및, 매우 낮은 농도의 종양표시인자를 검출할 수 있는 매우 우수한 감도;를 발휘할 수 있다.

본 발명의 제조방법을 사용하므로써, 종양표시인자 검출용 바이오센서를 매 우 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 종양표시인자 분석방법을 이용하면, 종래의 면역학적 기법과 비교할 때, 매우 적은 양의 혈액으로도 종양표시인자의 검출이 가능하다. 또한, 본 발명의 종양표시인자 분석방법을 이용하면, 종래의 면역학적 기법과 비교할 때, 매우 신속한 종양표시인자의 검출이 가능해진다.

Claims

기판;

상기 기판위에 부착된 제1전극;

상기 기판위에 부착된 제2전극;

상기 제1전극과 상기 제2전극을 전기적으로 연결하고 있는 반도체성 탄소나노튜브;

일 말단이 상기 반도체성 탄소나노튜브의 표면에 결합되어 있는 링커분자(linker molecule); 및

상기 링커 분자의 다른 말단에 결합되어 있는 종양표시인자용 바이오-리셉터(bio-receptor);를 포함하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
제 1 항에 있어서, 상기 반도체성 탄소나노튜브가 단일벽인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
제 1 항에 있어서, 상기 링커분자의 일 말단이 소수성 모이어티인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
제 1 항에 있어서, 상기 링커분자의 다른 말단이 이미다졸기; 카르복실기; 또는 이들의 조합을 함유하는 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센 서.
제 1 항에 있어서, 상기 링커분자가, CDI-트윈20; 1-피렌부티릭 액시드; 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
제 1 항에 있어서, 상기 종양표시인자용 바이오-리셉터가, AFP(alpha fetoprotein), CEA(carcinoembryonic antigen), CA(cancer antigen)19-9, CA15-3, CA50, CA72-4, CA125, CA130, KMO-1, DuPAN-2, SPan-1, SLX, CA72-4, BFP, NCC-ST-439, SCC(sqamous cell carcinoma antigen), NSE(neuron specific enolase), CYFRA, γ-seminoprotein, 전립선 ACP, IAP, TPA(tissue polypeptide antigen), Ferritin, PIVKA ii, polyamine, β-microglobulin, PSβ1, POA, PAP(prostatic acid phosphatase), Galectin-3, PSA(prostatic specific Ag) 또는 β2-MG(β2-microglobulin)와 특이적으로 결합할 수 있는 결합부위를 갖는 바이오-리셉터인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
제 6 항에 있어서, 상기 종양표시인자용 바이오-리셉터가, 항체, 효소, 단백질, 펩티드, 아미노산, 핵산, 압타머, 지질, 코펙터 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
제 6 항에 있어서, 상기 종양표시인자용 바이오-리셉터가, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 또는 항체 결합부위 프래그먼트인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
제 6 항에 있어서, 상기 종양표시인자용 바이오-리셉터가 저해제인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
제 1 항에 있어서, 상기 제1전극 및 상기 제2전극 중의 적어도 하나의 표면에 절연층이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
제 10 항에 있어서, 상기 절연층이 SU-8 인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 검출용 바이오센서.
(a) 기판; 상기 기판위에 부착된 제1전극; 상기 기판위에 부착된 제2전극; 상기 제1전극과 상기 제2전극을 전기적으로 연결하고 있는 반도체성 탄소나노튜브;를 포함하는 트랜스듀서부에, 링커 분자를 결합시키는 단계; 및

(b) 상기 링커 분자에 종양표시인자용 바이오-리셉터를 결합시키는 단계;를 포함하는 바이오 센서 제조 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 트랜스듀서부가, 상기 제1전극 및 상기 제2전극 중의 적어도 하나의 표면에 형성되어 있는 절연층을 더 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 바이오 센서 제조 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 링커 분자가, CDI-트윈20; 1-피렌부티릭 액시드; 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 바이오 센서 제조 방법.
시료용액을, 앞에서 설명한 본 발명의 종양표시인자 검출용 바이오센서와 접촉시키는 단계; 및

상기 시료용액과 상기 바이오센서의 접촉을 유지하면서, 시간 경과에 따라, 상기 바이오센서의 탄소나노튜브의 전기전도도 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 종양표시인자 분석방법.
제 15 항에 있어서, 상기 시료용액이 pH 조절을 위한 버퍼용액을 함유하는 것을 특징으로 하는 종양표시인자 분석방법.
제 15 항에 있어서, 상기 시료용액의 pH 값이 6.4 내지 7.8 인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 분석방법.
제 15 항에 있어서, 상기 시료용액과 상기 바이오센서의 접촉을 유지하는 시간이 100 내지 600 초인 것을 특징으로 하는 종양표시인자 분석방법.