CN111273025A - 一种检测肿瘤标志物的生物传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测肿瘤标志物的生物传感器，本生物传感器基于葡萄糖氧化酶（GOD）介导的比色pH传感的敏感分析技术，用于癌症生物标志物蛋白检测，将以下三个方面有效地整合到了本发明中：磁分离，信号放大和信号转换。磁分离和信号放大过程可以有效地排除复杂成分的干扰并克服检测低丰度目标的挑战。产酸酶GOD介导的信号转化可导致pH值急剧下降，为pH比色法提供了前提条件。基于pH比色检测技术的发展对于促进pH传感在POCT中的实际应用具有重要价值，并且可以为其他高性能传感器的开发提供指导。

Description

一种检测肿瘤标志物的生物传感器
技术领域
本发明属于生物电化学传感器技术领域，具体涉及一种检测肿瘤标志物的生物传感器及其应用。
技术背景
癌症生物标志物(例如蛋白质，核酸，小分子，外泌体和环状肿瘤细胞)是早期癌症筛查和诊断的重要检测指标。在过去的几十年中，研究人员已经开发出多种技术来快速，灵敏地检测生物标志物。然而，在实际应用中，公认的检测技术仍然是传统技术。例如，在检测癌症生物标记蛋白中，当今的主要检测技术仍然是基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的实验室检测技术。因此，检测技术的优化和创新在癌症诊断中仍然具有重要的价值，特别是低成本和便捷检测平台的开发可以为即时检测(POCT)提供基础。近年来，已经为POCT开发了一些检测技术，包括基于比色法的裸眼检测，基于便携式仪器的光谱分析和通过监视微电机运动来进行的手机诊断等。
在这些POCT技术中，比色分析是最直观的技术之一，它得到了广泛的关注，因为它无需任何设备即可用于肉眼检测。pH，在化学和生物学分析中是一种关键参数，这在比色技术的开发中是众所周知的。此外，其它的研究还发现了适用于不同pH范围的pH指示剂，pH敏感材料以及精确的pH指示条和便携式pH的发展仪表，这为基于pH的POCT技术的开发提供了低成本，便捷的平台。因此，基于pH比色法的癌症生物标志物检测方法的开发对于POCT具有重要意义，同时具有广阔的应用前景。
但是，低目标丰度以及复杂成分和分析过程的干扰限制了比色pH传感的实际应用。
发明内容
针对上述情况，本发明公开了一种检测肿瘤标志物的生物传感器，基于葡萄糖氧化酶(GOD)介导的比色pH传感的敏感分析技术，用于癌症生物标志物蛋白检测，可以有效地排除复杂成分的干扰并检测低丰度目标。
为了实现上述发明的目的，一种检测肿瘤标志物的生物传感器，由以下步骤制成：
I.使用免疫磁珠来选择性分离靶标；
II.将适体-触发器结合在靶标上，形成免疫磁珠/靶标/适体-触发器三明治结构；
III.固定在免疫磁珠表面上的适体-触发器在存在圆模板1和DNA聚合酶的情况下启动线性滚环扩增，生成线性滚环扩增的产物；
IV.GOD标记的辅助引物2和圆形模板2与步骤III中的线性滚环扩增的产物结合，形成三元复合物，辅助引物2启动分支滚环扩增,生成分支产物；
V.GOD标记的辅助引物1和圆形模板1与步骤IV中的分支产物结合，形成另一个三元复合物并启动二级分支滚环扩增，获得所述生物传感器。所述圆模板1和圆模板2均为环状DNA。适体是一段由人工筛选的能够像抗体一样和靶标分子结合的单链DNA序列。适体与靶标的结合主要依赖于适体DNA通过自身的弯曲折叠形成的高级结构，适体的高级结构能够与靶标蛋白表面位点契合并通过非共价作用稳定下来。在适体-触发器结构中，适体部分参考自前人报道的已经验证过的序列，起到与靶标蛋白稳定结合的作用，而触发器部分则是圆形模板1的引物，它可以与圆形模板1互补并触发后续的多重支链滚环扩增。
进一步的，上述一种检测肿瘤标志物的生物传感器，所述靶标为肿瘤标志物；所述DNA聚合酶为phi29-DNA聚合酶；所述GOD标记采用的交联剂为磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸。
进一步的，上述一种检测肿瘤标志物的生物传感器，所述圆模板1的核酸序列为SEQ ID NO.1、所述圆模板2的核酸序列为SEQ ID NO.2、所述适体的核酸序列为SEQ IDNO.3、所述触发器的核酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5；所述辅助引物1的核酸序列为SEQ ID NO.6；所述辅助引物2的核酸序列为SEQ ID NO.7。
进一步的，上述一种检测肿瘤标志物的生物传感器，所述辅助引物1和辅助引物2的5’端均经过巯基修饰。
进一步的，上述一种检测肿瘤标志物的生物传感器，所述靶标为血小板衍生生长因子-BB。当靶标为人血小板衍生生长因子-BB时，适体-触发器结构中的适体为人PDGF-BB适体，而触发器部分则是圆形模板1的引物，它可以与圆形模板1互补并触发后续的多重支链滚环扩增。
进一步的，上述一种检测肿瘤标志物的生物传感器的的检测方法，包括以下步骤：
A：将所述生物传感器置于含有PH指示剂和甲醇的葡萄糖溶液中孵育；
B：将孵育后的上清进行光谱扫描。
进一步的，上述一种检测肿瘤标志物的生物传感器的的检测方法，所述步骤A中，所述PH指示剂为溴甲酚紫；所述葡萄糖溶液的浓度为250mM-1000mM；所述甲醇的浓度为0-25‰；所述孵育的温度为25-45℃。
进一步的，上述一种检测肿瘤标志物的生物传感器的的检测方法，所述步骤A中所述葡萄糖溶液的浓度为500mM；所述甲醇的浓度为5‰；所述孵育的温度为37℃。
进一步的，上述一种检测肿瘤标志物的生物传感器的的检测方法，所述步骤B中，所述光谱扫描的参数为：光谱范围在350nm至700nm之间，以2nm的间隔进行光谱扫描，并测量在590nm和430nm处的相应吸光度。
进一步的，上述一种检测肿瘤标志物的生物传感器的的检测方法，所述PH指示剂为溴甲酚紫。
进一步的，上述检测肿瘤标志物的生物传感器及其检测方法在用于检测肿瘤的试剂盒中的用途。
本发明具有如下的有益效果：本发明公开了一种检测肿瘤标志物的生物传感器及其使用方法和应用，特别适用于癌症生物标志物蛋白检测。为了提高检测灵敏度，简化检测方法，本发明将以下三个方面有效地整合到了技术方案中：磁分离，信号放大和信号转换。磁分离和信号放大过程可以有效地排除复杂成分的干扰并克服检测低丰度目标的挑战。产酸酶GOD介导的信号转化可导致pH值急剧下降，为pH比色法提供了前提条件。基于pH比色检测技术的发展对于促进pH传感在POCT中的实际应用具有重要价值，并且可以为其他高性能传感器的开发提供指导。
附图说明
图1为本发明所述的一种检测肿瘤标志物的生物传感器的制备及其应用的示意图：(A)基于免疫磁珠的靶标分离示意图；(B)多支滚环扩增(mb-RCA)和葡萄糖氧化酶(GOD)富集的示意图；(C)基于GOD的信号转换和基于pH指示剂溴甲酚紫(BCP)的比色pH传感的示意图；(D)目标蛋白的紫外/可见光谱；
图2为比色pH传感的可行性验证和优化比较图：pH指示剂BCP在不同pH值下的颜色(A)和A590 nm/A430 nm值(B)的变化；不同浓度GOD催化葡萄糖情况下的照片(C)和催化动力学对比(D)；甲醇浓度(E)，葡萄糖浓度(F)和催化温度(G)对GOD催化活性的影响；这些pH值变化是用附图2B中的公式计算得到的；
图3为不同pH情况下紫外光谱比较图：在1x PBS溶液中，随着pH酸碱指示剂BCP的浓度改变时，pH为5.43(A)，6.35(B)和7.36(C)的UV-Vis光谱；
图4为mb-RCA的扩增效率比较图：phi29-DNA聚合酶参与下的两个LRCA系统的可行性验证(A)；DNA聚合酶的优化(B)；LRCA，b-RCA和mb-RCA的扩增效率比较(C，D)；所有的荧光图像均在Image Lab软件的Gel Doc XR+(Bio-Rad)下采集并经过虚拟彩色处理，荧光强度通过ImageJ计算；
图5为mb-RCA的扩增特异性分析图：该图像在Image Doc XR+(Bio-Rad)下使用Image Lab软件成像；
图6为RCA，b-RCA和mb-RCA样品的琼脂糖凝胶电泳图：该图像使用Image Lab软件在Gel Doc XR+(Bio-Rad)下成像；
图7为mb-RCA产品的表征图：(A)LRCA，b-RCA和mb-RCA的示意图。(B)阴性对照和LRCA，b-RCA，mb-RCA产品的形态表征；不带触发器的mb-RCA用作阴性对照；
图8为固定有不同浓度人体样本PDGF-BB的mb-RCA产品的免疫磁珠图像：该图像使用Image Lab软件在Gel Doc XR+(Bio-Rad)下成像；
图9为基于pH传感的人体样本PDGF-BB检测的可行性验证实验图；(A)制备了带有GOD标记的辅助引物偶联体的示意图。(B)验证磺基-SMCC介导的GOD和SH-DNA之间的交联效率。(C)基于比色pH传感的人体样本PDGF-BB检测的可行性验证。虚线上方的数据已超出pH指示剂BCP的线性范围；
图10为基于比色pH传感的目标人体样本PDGF-BB的检测图：(A)pH值变化对靶标浓度的依赖性。内插图显示了pH值变化与目标浓度之间的对数线性关系。虚线上方的数据已超出pH指示剂BCP的线性范围。(B)比色pH传感的检测特异性。选择血管内皮生长因子(VEGF)，血红蛋白(HB)，凝血酶(TB)，溶菌酶(Lys)，人血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG)作为阴性对照。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；本发明所涉及的抗体的氨基酸和核酸序见序列表。本发明中RCA为滚环扩增的缩写，b-RCA为分支滚环扩增的缩写，mb-RCA为多支滚环扩增的缩写，LRCA为线性滚环扩增的缩写，GOD为葡萄糖氧化酶的缩写，PDGF-BB为人血小板衍生生长因子BB的缩写。HO-DNA-FAM为5’羟基修饰，3’FAM修饰的辅助引物1；SH-DNA-FAM为5’巯基修饰，3’FAM修饰的辅助引物1；FAM为荧光素。
实施例1
制备流程和试验方法
一种检测肿瘤标志物的生物传感器，由以下步骤制成：
I.使用免疫磁珠来选择性分离靶标；
II.将适体-触发器结合在靶标上，形成免疫磁珠/靶标/适体-触发器三明治结构；
III.固定在免疫磁珠表面上的适体-触发器在存在圆模板1的情况下启动线性滚环扩增，生成线性滚环扩增的产物；
IV.GOD标记的辅助引物2和圆模板2与步骤III中的线性滚环扩增的产物结合，形成三元复合物，辅助引物2启动分支滚环扩增,生成分支产物；
V.GOD标记的辅助引物1和圆模板1与步骤IV中的分支产物结合，形成另一个三元复合物并启动二级分支滚环扩增，获得所述生物传感器。
(1)核酸序列。其中，所述圆模板1的核酸序列为SEQ ID NO.1、所述圆模板2的核酸序列为SEQ ID NO.2、所述适体的核酸序列为SEQ ID NO.3、所述触发器的核酸序列为SEQID NO.4(触发器1)或SEQ ID NO.5(触发器2)；所述辅助引物1的核酸序列为SEQ ID NO.6；所述辅助引物2的核酸序列为SEQ ID NO.7。具体序列见下表1。
表1序列表
Figure BDA0002387810060000091
(2)滚环扩增的具体步骤如下：在包含一定浓度引物和400μM dNTP混合物，500nM圆模板1，圆模板2，GOD标记的辅助引物1、GOD标记的辅助引物2、0.2UμL-1DNA聚合酶和1x相应缓冲液的1x PBS(pH 7.4)的混合溶液中进行多分支滚环扩增(mb-RCA)。在上述溶液中不使用辅助引物1进行分支滚环扩增(b-RCA)。在含有一定浓度引物和400μM dNTP混合物，500nM环形模板1、0.2UμL-1DNA聚合酶和1x相应缓冲液的1×PBS(pH 7.4)混合溶液中进行线性滚环扩增(LRCA)。为了进行荧光成像分析，添加了最终浓度为1×SYBR Green I(KeyGenBiotech)。所有的荧光图像均在Image Lab软件的Gel Doc XR+(Bio-Rad)下采集并经过伪彩色处理。
(3)免疫磁珠的具体制备方法如下：将10μL 10mg mL-1羧基磁珠用水冲洗3次，然后用500μL EDC/NHS溶液(在1mL水中溶解77.5mg EDC和11.6mg NHS)再造。将该溶液在37℃摇动下温育15分钟以活化磁珠的羧基。再次用水冲洗后，加入10μL 1mg mL-1人体样本PDGF-BB抗体和1mL 1×PBS缓冲液(pH 7.4)，在37℃振荡下再孵育3h，形成免疫磁珠。最后，将免疫磁珠漂洗3次，并用1mL含1％BSA(pH 7.4)的1x PBS复溶，并保存在4℃以便进一步实验。
(4)GOD-DNA偶联物的制备方法如下：通过双功能交联剂磺基-SMCC使GOD和引物DNA交联。详细的步骤如下，将GOD溶解在反应缓冲液(55mM磷酸钠，150mM氯化钠，20mMEDTA，pH 7.2)中，并与磺基-SMCC(溶解在二甲亚砜DMSO中)以1:50(100μM：5mM)在室温(25℃)下放置2h，以激活GOD的氨基。同时，DNA(SH-DNA-FAM，HO-DNA-FAM，辅助引物1和辅助引物2)被100×过量的TCEP预先激活。用30kD超滤离心管纯化活性GOD，并用反应缓冲液再造。随后，将活性GOD与先前的活性DNA以1：2(10μM：20μM)的摩尔比混合。使混合物在4℃下反应过夜。最后，通过30kD超滤离心管纯化GOD-DNA偶联物。以SH-DNA-FAM为模型，通过荧光光谱法计算共轭效率。荧光光谱在Hitachi FL-7000荧光光谱仪上进行，所有样品均稀释100倍(终浓度为200nM SH-DNA-FAM)，然后进行测量。
(5)原子力显微镜的表征步骤：使用原子力显微镜(AFM)，表征LRCA，b-RCA，mb-RCA和阴性对照(mb-RCA，无触发)的产物。首先，将10μL样品(1：1用20mM氯化镁稀释)添加到新鲜裂解的云母上，然后在室温下吸附5分钟。然后将云母用水冲洗30秒钟，并立即用氮气干燥以进行AFM成像。所有AFM图像均使用Agilent5500AFM(安捷伦技术公司)以敲击模式采集。使用名义弹簧常数为40N m-1且共振频率约为325kHz的NSC-15/Al BS吸头。
(6)比色分析方法。比色分析之前，所有样品均进行了预处理。首先，将100μL样品与100μL 0.1mg mL-1免疫磁珠在37℃下混合30分钟以捕获靶标。之后，将免疫磁珠用1x PBS冲洗3次，然后用含有200nM适配体-触发器的50μL 1x PBS在37℃下再孵育1小时后，再次用1x PBS冲洗免疫磁珠。最后，用50μL混合溶液(同(2)中混合溶液组成)再造免疫磁珠，用于mb-RCA扩增。mb-RCA在37℃下进行1.5h，再次漂洗以除去游离的GOD。然后，加入150μL含一定浓度BCP的500mM葡萄糖(经氮气预处理)并密封在37℃孵育30分钟。最后，将100μL上清液转移至底部透明96孔ELISA板中，用于比色pH传感。比色分析在SpectraMax M2多模式酶标仪上进行。光谱范围在350nm至700nm之间，以2nm的间隔进行光谱扫描，并测量在590nm和430nm处的相应吸光度。
(7)琼脂糖凝胶电泳操作方法：进行2％琼脂糖凝胶电泳以表征RCA，b-RCA和mb-RCA的产物。将所有样品与6x凝胶加样缓冲液按5：1(v：v)的比例混合，然后将6μL混合物装载至2％琼脂糖凝胶。然后，在1x TAE缓冲液中于120V电泳40分钟。电泳后，将凝胶用2xSYBR Green I染色15分钟，并用Image Lab软件在Gen Doc XR+(Bio-Rad)下成像。
如附图1所示，为本生物传感器的制备流程示意图，有效地整合了以下三个方面：(i)由于样品和分析过程中存在大量干扰成分，因此引入了免疫磁珠来选择性分离靶标(附图1A)并丰富葡萄糖氧化酶(GOD)。一方面，免疫磁珠充当分散界面。它可以有效捕获靶标，形成免疫磁珠/靶标/适体-触发器三明治结构。另一方面，免疫磁珠易于收集和富集，有利于排除复杂成分和分析过程中的干扰。(ii)由于样品中靶标的丰度低，因此需要信号放大。在这里，如附图1B所示，提出了一种新颖的扩增技术，称为多分支滚动环扩增(mb-RCA)。固定在免疫磁珠表面上的适体-触发器在存在圆模板1的情况下启动了线性滚环扩增(LRCA)。然后，GOD标记的辅助引物2和圆形模板2与LRCA的产物结合，形成三元复合物，辅助引物2启动分支滚环扩增(b-RCA)。随后，GOD标记的辅助引物1和圆形模板1将依次与分支产物结合，形成另一个三元复合物并启动第二分支扩增。特别是，二级支链产物与LRCA相同，因此，可以一次又一次地进行三级和高级支链扩增。由于连续分支扩增的特性，该策略称为mb-RCA。(iii)在将DNA扩增信号转化为pH时，由mb-RCA富集的GOD充当介体。如附图1C中所示，GOD催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸，然后将溶液的pH从碱性改变为酸性，这为比色pH传感提供了先决条件。
进一步的，在这项工作中，选择了溴甲酚紫(BCP)作为指示剂。用肉眼可以观察到碱性溶液中的紫色外观和酸性溶液中的黄色外观，并且在UV-Vis光谱中可以观察到430nm的减少与590nm的增加的对比图谱(附图1D)。
实施例2
实验例：比色pH传感的可行性验证和优化比较。
本发明选用的GOD在中性pH值(5.2～6.8)下效果很好，与BCP的变色范围一致(见附图2A，B和附图3)。
进一步的，选择中性pH 7.0作为初始pH进行进一步的实验，因为肉眼从中性pH到酸性pH的颜色变化很明显。附图2C显示即使在低GOD浓度(2nM)下，也可以在短时间内(30分钟)用肉眼观察到从紫色到黄色的变化，表明GOD在pH传感中表现良好。
附图2D提供了更准确的比色结果。可以看出，所有阳性样品(具有GOD)的A590 nm/A430 nm都有明显变化，而阴性样品(不含GOD)的A590 nm/A430 nm几乎没有变化。以上结果表明，GOD可用于比色pH传感技术的开发，并且30分钟的催化作用足以导致pH的显着变化。我们优化了可能影响pH感应的三个关键条件。并且，为了更好地显示pH的变化，通过附图2B中的公式计算pH。首先评估甲醇浓度对pH传感的影响，因为pH指示剂BCP溶解在甲醇中，并且甲醇的浓度可能会影响GOD的催化活性。如附图2E所示，即使甲醇浓度达到25‰，pH值的变化也不会受到影响。因此，实时监测pH的变化是可行的。但是，认为5‰甲醇(v：v)是最佳的，分析后添加了BCP。之后，优化底物葡萄糖的浓度。如附图2F所示，pH的变化随着葡萄糖浓度的增加而显着增加，并在250μM时达到最大值，表明250μM葡萄糖可以基本满足需求。当葡萄糖浓度增加到1M时，可以看到略有下降。这是合理的，因为过量的葡萄糖会抑制GOD的催化活性。在此，选择0.5M葡萄糖的浓度。最后，对反应温度进行了优化(附图2G)。这种比色pH传感技术可以在较宽的温度范围(25℃～45℃)中执行，最佳温度约为37℃。
实施例3
实验例：mb-RCA的扩增效率比较
如附图4所示，pH的变化与GOD的浓度成正相关。因此，通过信号放大技术富集更多的GOD是提高低丰度目标检测效果的有效途径。在本发明中，我们提出了一种新的等温DNA信号扩增技术，称为mb-RCA。由于mb-RCA可以分为两个紧密相关的LRCA系统，因此，首先对这两个LRCA系统验证。如附图4A所示，仅当存在触发器，模板和聚合酶时，才能启动LRCA。随后，对DNA聚合酶进行优化(附图4B)。在这两种可在37℃下正常工作的常用DNA聚合酶中，phi29-DNA聚合酶的扩增效率比克列诺碎片酶Klenow Fragment(3'-5'exo-)的扩增效率高得多。此外，还观察到了良好的扩增特异性(如附图5)。仅当同时存在触发器1和圆模板1时才能启动放大。之后，我们还比较了LRCA，b-RCA和mb-RCA的放大效率。如附图4C，附图4D和附图6所示，放大效率存在一个梯度：mb-RCA>b-RCA>LRCA。
实施例4
实验例：mb-RCA产物的结构验证
除扩增效率外，产物的结构是丰富GOD和随后进行pH传感的另一个重要因素。如附图7A所示，mb-RCA产物的结构被预测为连续分支的树枝状产物。因此，通过原子力显微镜(AFM)对LRCA，b-RCA和mb-RCA产品进行了形态表征(附图7B)。没有触发器1的mb-RCA用作阴性对照，并首先进行了验证。显然，阴性对照中没有结构化产品。对于LRCA和b-RCA的产物，可以看到LRCA产物的长链线性外观和b-RCA的长链支链外观，这与以前的研究是一致的。对于mb-RCA的产物，可以看到连续分支的树枝状产物，这与LRCA和b-RCA的产物完全不同。除形态上的差异外，mb-RCA的产物大小也比LRCA和b-RCA的产物大得多。mb-RCA产品的特性有利于丰富大量的GOD，有利于后续的比色pH传感。
实施例5
测试例：检测人血小板衍生生长因子(PDGF-BB)中的可行性验证。
在验证了溶液中的mb-RCA之后，在免疫磁珠的界面上进行了mb-RCA在检测人血小板衍生生长因子(PDGF-BB)中的可行性验证(附图8)。显然，mb-RCA产物随目标样本PDGF-BB浓度的增加而增加。因此，认为磁分离系统和扩增技术mb-RCA是兼容的。为了将GOD富集到mb-RCA的树突状产物中，将GOD与辅助引物1或2偶联(附图9A)。通过检测滤液中的荧光强度和回收率，验证了双功能交联剂，磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-甲酸(sulfo-SMCC)介导的交联效率，并选择了荧光团FAM标记的DNA作为模型。由于GOD-DNA-FAM偶联物的分子量
Figure BDA0002387810060000161
比DNA-FAM的分子量
Figure BDA0002387810060000162
大得多，因此，GOD-DNA-FAM存在于回收物中。同时DNA-FAM也存在于回收物中，通过30kD超滤离心管分离滤液。如附图9B所示，巯基修饰的DNA(SH-DNA-FAM)已成功偶联到GOD，而羟基修饰的DNA(HO-DNA-FAM)没有。经计算，GOD与硫醇修饰的DNA之间的交联比约为1：1.6。随后，在免疫磁珠的界面上进行了基于比色pH传感的人体样本PDGF-BB检测的可行性验证。如附图9C所示，观察到阳性样品(带有目标人体样本PDGF-BB)的pH值有明显变化，而阴性对照(没有目标人体样本PDGF-BB)的低背景信号被观察到，表明大量的GOD富集到了产品中mb-RCA并保留其催化活性。因此，认为该比色pH传感技术可用于检测人体样本PDGF-BB。
实施例6
测试例：人体样本PDGF-BB的定量检测
如附图10A所示，pH的变化随目标人体样本PDGF-BB浓度的增加而增加。并且，观察到人体样本PDGF-BB的浓度与pH的变化之间呈正对数线性关系(校正的线性相关系数平方Adj.R-Square＝0.995)。线性范围为1pM至25pM，计算出的检出限为0.94pM(3SD)。此外，我们获得了良好的检测特异性。如附图10B所示，只有当目标人体样本PDGF-BB存在时，才能观察到显着的pH变化。最后，在加标血清中检测人体样本PDGF-BB时(如表2所示)，在血清样品中获得了104％至109％的良好回收率，表明该技术具有潜在的实际应用前景。
表2使用比色pH传感器检测加标血清中的人体样本PDGF-BB。
Figure BDA0002387810060000171
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州健雄职业技术学院
<120> 一种检测肿瘤标志物的生物传感器
<130> 2020
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工
<400> 1
gaagaaaagt ccccaaaaag gaccttgacg ttcaccatag tagagaagct gttgtaaatt 60
gttgtcgaa 69
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工
<400> 2
taccgaagca gaatcagtga taattgttgt cgaagaagaa aaaaaaatcc caaccctacc 60
caccc 65
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工
<400> 3
caggctacgg cacgtagagc atcaccatga tcctgttt
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<400> 4
cttttcttct tcgacaacaat 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<400> 5
tctgcttcgg tagggtgggt 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<400> 6
aaaaataccg aagcagaatc tacta 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<400> 7
aaaaagaagc tgttgtaata tcact 25

Claims (10)

1.一种检测肿瘤标志物的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器由以下步骤制成：
I. 使用免疫磁珠来选择性分离靶标；
II.将适体-触发器结合在靶标上，形成免疫磁珠/靶标/适体-触发器三明治结构；
III.固定在免疫磁珠表面上的适体-触发器在存在圆模板1和DNA聚合酶的情况下启动线性滚环扩增，生成线性滚环扩增的产物；
IV.GOD标记的辅助引物2和圆模板2与步骤III中的线性滚环扩增的产物结合，形成三元复合物，辅助引物2启动分支滚环扩增,生成分支产物；
V.GOD标记的辅助引物1和圆模板1与步骤IV中的分支产物结合，形成另一个三元复合物并启动二级分支滚环扩增，获得所述生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤标志物的生物传感器，其特征在于，所述靶标为肿瘤标志物；所述DNA聚合酶为phi29-DNA聚合酶；所述GOD标记采用的交联剂为磺基琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-甲酸。
3.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤标志物的生物传感器，其特征在于，所述圆模板1的核酸序列为SEQ ID NO.1、所述圆模板2的核酸序列为SEQ ID NO.2、所述适体的核酸序列为SEQ ID NO.3、所述触发器的核酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5；所述辅助引物1的核酸序列为SEQ ID NO.6；所述辅助引物2的核酸序列为SEQ ID NO.7。
4.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤标志物的生物传感器，其特征在于，所述辅助引物1和辅助引物2的5’端均经过巯基修饰。
5.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤标志物的生物传感器，其特征在于，所述靶标为血小板衍生生长因子-BB。
6.如权利要求1-5任一项所述的检测肿瘤标志物的生物传感器的检测方法，包括以下步骤：
A：将所述生物传感器置于含有pH指示剂和甲醇的葡萄糖溶液中孵育；
B：将孵育后的上清进行光谱扫描。
7.根据权利要6所述的检测肿瘤标志物的生物传感器的检测方法，其特征在于，所述步骤A中，所述PH指示剂为溴甲酚紫；所述葡萄糖溶液的浓度为250mM-1000 mM；所述甲醇的浓度为0-25‰；所述孵育的温度为25-45℃。
8.根据权利要7所述的检测肿瘤标志物的生物传感器的检测方法，其特征在于，所述葡萄糖溶液的浓度为500 mM；所述甲醇的浓度为5‰；所述孵育的温度为37℃。
9.根据权利要6所述的检测肿瘤标志物的生物传感器的检测方法，其特征在于，所述步骤B中，所述光谱扫描的参数为：光谱范围在350nm至700nm之间，以2nm的间隔进行光谱扫描，并测量在590nm和430nm处的相应吸光度。
10.如权利要1-5任一项所述的检测肿瘤标志物的生物传感器在制备检测肿瘤的试剂盒中的应用。
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