CN105353121A - 一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼对双氧水有良好的电化学催化能力和电子转移能力，显著提高了生物传感器的灵敏度，对癌胚抗原的检测具有重要的意义。

Description

一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法及应用。具体是采用具有良好电化学催化性能的银-氨基化石墨烯-二硫化钼，制备一种检测癌胚抗原的传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
背景技术
癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物，目前电化学免疫传感器已经广泛用于肿瘤标志物的检测，因为电化学免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等一系列优点。其中，由于无标记电化学免疫传感器可以直接用于检测抗原抗体的识别过程并且避免了标记物带来的干扰，得到了更加广泛的关注。
本发明将银-氨基化石墨烯-二硫化钼修饰到玻碳电极表面，构建无标记电化学免疫传感器，首先，银-氨基化石墨烯-二硫化钼对双氧水具有良好的催化效果，其次，银-氨基化石墨烯-二硫化钼具有良好的电子转移能力和大的比表面积，最后，银-氨基化石墨烯-二硫化钼具有良好的生物相容性，能够有效固定大量的抗体。该方法在检测过程中产生了良好的电化学信号，可用于癌胚抗原的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测癌胚抗原提供了新途径。
发明内容
本发明的目的之一是基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建无标记型生物传感器。
本发明的目的之二是将该无标记型生物传感器应用于癌胚抗原的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案如下
1.一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6μL浓度为1~2mg/mL的银-氨基化石墨烯-二硫化钼水溶液，干燥；
（3）继续将6μL浓度为5~20μg/mL的癌胚抗原抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（4）用3μL浓度为5~20mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（5）将6μL浓度为0.0002~20ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
银-氨基化石墨烯-二硫化钼的制备
在10mL无水乙醇中分散0.1~0.3g氧化石墨烯，超声5h，加入0.2~0.4mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5h，加入0.1~0.3mL、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得氨基化石墨烯；
将8~12mg氨基化石墨烯加入到16~25mL银纳米粒子溶液中，震荡12h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得银-氨基化石墨烯；
将40mg硫磺粉和20~40mg银-氨基化石墨烯混合后，加入到含有15mL辛胺和15mL乙醇的溶液中，超声分散后，加入90mg钼酸铵，进一步超声后，将混合溶液转入反应釜中，在200℃下反应12h，离心洗涤后真空干燥，得到银-氨基化石墨烯-二硫化钼。
癌胚抗原的检测方法
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对癌胚抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4V，取样间隔设置为0.1s，运行时间设置为400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向磷酸盐缓冲溶液中注入10μL浓度为5mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替癌胚抗原标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
（1）本发明采用银-氨基化石墨烯-二硫化钼具有良好的生物相容性，通过形成银氮键化学键合至玻碳电极表面。
（2）本发明采用的银-氨基化石墨烯-二硫化钼具有大的比表面积，能够有效固定大量的抗体。
（3）本发明采用的银-氨基化石墨烯-二硫化钼对双氧水具有优越的电化学催化性能，提高了生物传感器的灵敏度。
（4）本发明采用的银-氨基化石墨烯-二硫化钼具有良好的电子的传递效率，进一步提高了生物传感器的灵敏度。
（5）本发明将制备的无标记型生物传感器用于癌胚抗原的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6μL浓度为1mg/mL的银-氨基化石墨烯-二硫化钼水溶液，干燥；
（3）继续将6μL浓度为5g/mL的癌胚抗原抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（4）用3μL浓度为5mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（5）将6μL浓度为0.0002~20ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
实施例2一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6μL浓度为1.5mg/mL的银-氨基化石墨烯-二硫化钼水溶液，干燥；
（3）继续将6μL浓度为10μg/mL的癌胚抗原抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（4）用3μL浓度为10mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（5）将6μL浓度为0.0002~20ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
实施例3一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6μL浓度为2mg/mL的银-氨基化石墨烯-二硫化钼水溶液，干燥；
（3）继续将6μL浓度为20μg/mL的癌胚抗原抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（4）用3μL浓度为20mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（5）将6μL浓度为0.0002~20ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
实施例4银-氨基化石墨烯-二硫化钼的制备
在10mL无水乙醇中分散0.1g氧化石墨烯，超声5h，加入0.2mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5h，加入0.1mL、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得氨基化石墨烯；
将8mg氨基化石墨烯加入到16mL银纳米粒子溶液中，震荡12h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得银-氨基化石墨烯；
将40mg硫磺粉和20mg银-氨基化石墨烯混合后，加入到含有15mL辛胺和15mL乙醇的溶液中，超声分散后，加入90mg钼酸铵，进一步超声后，将混合溶液转入反应釜中，在200℃下反应12h，离心洗涤后真空干燥，得到银-氨基化石墨烯-二硫化钼。
实施例5银-氨基化石墨烯-二硫化钼的制备
在10mL无水乙醇中分散0.2g氧化石墨烯，超声5h，加入0.3mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5h，加入0.2mL、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得氨基化石墨烯；
将10mg氨基化石墨烯加入到20mL银纳米粒子溶液中，震荡12h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得银-氨基化石墨烯；
将40mg硫磺粉和30mg银-氨基化石墨烯混合后，加入到含有15mL辛胺和15mL乙醇的溶液中，超声分散后，加入90mg钼酸铵，进一步超声后，将混合溶液转入反应釜中，在200℃下反应12h，离心洗涤后真空干燥，得到银-氨基化石墨烯-二硫化钼。
实施例6银-氨基化石墨烯-二硫化钼的制备
在10mL无水乙醇中分散0.3g氧化石墨烯，超声5h，加入0.4mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5h，加入0.3mL、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得氨基化石墨烯；
将12mg氨基化石墨烯加入到25mL银纳米粒子溶液中，震荡12h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得银-氨基化石墨烯；
将40mg硫磺粉和40mg银-氨基化石墨烯混合后，加入到含有15mL辛胺和15mL乙醇的溶液中，超声分散后，加入90mg钼酸铵，进一步超声后，将混合溶液转入反应釜中，在200℃下反应12h，离心洗涤后真空干燥，得到银-氨基化石墨烯-二硫化钼。
实施例7癌胚抗原的检测方法
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对癌胚抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4V，取样间隔设置为0.1s，运行时间设置为400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向磷酸盐缓冲溶液中注入10μL浓度为5mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替癌胚抗原标准溶液进行检测；
（5）该生物传感器对癌胚抗原检测线性范围为0.0002~20ng/mL，检测限0.05pg/mL。

Claims (3)

1.一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
（2）在电极表面滴加6μL浓度为1~2mg/mL的银-氨基化石墨烯-二硫化钼水溶液，干燥；
（3）继续将6μL浓度为5~20μg/mL的癌胚抗原抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（4）用3μL浓度为5~20mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1h，清洗干净；
（5）将6μL浓度为0.0002~20ng/mL的一系列不同浓度的癌胚抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。
2.如权利要求1所述的一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器的制备方法，所述银-氨基化石墨烯-二硫化钼的制备，其特征在于，步骤如下：
在10mL无水乙醇中分散0.1~0.3g氧化石墨烯，超声5h，加入0.2~0.4mL3-氨丙基三乙氧基硅烷，70℃回流1.5h，加入0.1~0.3mL、质量分数为80%的水合肼，95℃回流1.5h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得氨基化石墨烯；
将8~12mg氨基化石墨烯加入到16~25mL银纳米粒子溶液中，震荡12h，离心洗涤，35℃真空干燥，制得银-氨基化石墨烯；
将40mg硫磺粉和20~40mg银-氨基化石墨烯混合后，加入到含有15mL辛胺和15mL乙醇的溶液中，超声分散后，加入90mg钼酸铵，进一步超声后，将混合溶液转入反应釜中，在200℃下反应12h，离心洗涤后真空干燥，得到银-氨基化石墨烯-二硫化钼。
3.如权利要求1所述的制备方法制备的一种基于银-氨基化石墨烯-二硫化钼构建的生物传感器对癌胚抗原的检测方法，其特征在于，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）选择计时电流法对癌胚抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4V，取样间隔设置为0.1s，运行时间设置为400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向磷酸盐缓冲溶液中注入10μL浓度为5mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
（4）将待测样品溶液代替癌胚抗原标准溶液进行检测。
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