DE60108074T2 - Verfahren zur identifizierung von igg-produzierenden zellen - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von igg-produzierenden zellen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Identifizierung IgG produzierender Zellen unter nicht-IgG produzierenden Zellen, indem fluoreszenzmarkierte, eingekapselte IgG-produzierende Zellen und nicht-IgG produzierende Zellen durch Durchflusscytometrie unterschieden werden.
  • Immunglobulin G (IgG) wird zunehmend für diagnostische und therapeutische Zwecke in der Humanmedizin verwendet (Scheinberg, D.A. und Chapman, P.B., in Birch, J.R. und Lennox, E.S., Hrsg., 1995, Wiley, 45–105).
  • Identifizierungsmethoden, bei denen die Einkapselung von Zellen verwendet wird, um die Unterscheidung IgG produzierender Zellen von nicht-IgG produzierenden Zellen zu gestatten, sind allgemein bekannt (Gray, F. et al., 1995, J. Imm. Meth., 182, 155–163; Kenney, J.S. et al., 1995, Bio/Tech 13, 787–790) und sind ebenso kommerziell erhältlich, beispielsweise von One Cell Systems Inc. (Cambridge, MA). Die beschriebenen Methoden weisen jedoch einige Nachteile dahingehend auf, dass sie keine zur Identifizierung von Zelllinien mit hoher Produktion ausreichende Auflösung liefern.
  • Aus der WO89/10566 ist ein Verfahren zur Bildung und Verwendung von Gel-Mikrotröpfchen (gel microdroplets, GMD) bekannt, wobei Protein A als Markermolekül zugegeben werden kann.
  • In Meininger et al. (2000, Bd. 39, Nr. 1, Seiten 26–36) ist die Fähigkeit von Protein A und Protein G, an den Fc-Teil von Immunglobulin zu binden, beschrieben.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens, das eine größere Auflösung aufweist, durch die die Identifizierung hoher Niveaus an Zelllinien mit hoher Produktion gestattet ist.
  • Diese Aufgabe wurde mit einem neuartigen Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. IgG produzierende Zellen werden erfindungsgemäß unter nicht-IgG produzierenden Zellen identifiziert, wodurch
    • a) die IgG produzierenden Zellen und die nicht-IgG produzierenden Zellen in einer Matrix, die ein Rückhaltereagens für den produzierten Antikörper enthält, eingekapselt sind,
    • b) besagte Matrix für eine Zeitspanne, während der IgG produziert werden kann, inkubiert wird,
    • c) besagter produzierter IgG fluoreszenzmarkiert wird,
    • d) und fluoreszenzmarkierte, eingekapselte IgG produzierende Zellen und nicht-IgG produzierende Zellen durch Durchflusscytometrie unterschieden werden, wodurch das Rückhaltereagens Protein A und/oder Protein G ist.
  • In 1 ist ein Schema für die Rückhaltung von durch eine eingekapselte Zelle produziertem IgG dargestellt.
  • In 2 ist die Rückhaltung von IgG durch Verwendung von Protein A im Vergleich mit Antikörper als Rückhaltereagens dargestellt.
  • In 3 sind Arbeitskonzentrationen von Protein A dargestellt.
  • In 4 ist ein Vergleich zwischen dem prozentualen Anteil an GS-NSO-Nicht-Produzenten in einer Kultur mit dem mit Durchflusscytometrie geschätzten prozentualen Anteil dargestellt.
  • Zellen
  • Je nach Effizienz der Expression und Sekretion von IgG werden die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Zellen als IgG produzierende Zellen oder nicht-IgG produzierende Zellen definiert. Nicht-IgG produzierende Zellen könnten niedrige Mengen an IgG von bis zu etwa 0,1 bis 0,2 μg/ml oder gar kein IgG exprimieren und sezernieren. IgG produzierende Zellen könnten IgG auf Niveaus von oberhalb 0,2 μg/ml exprimieren und sezernieren. Bevorzugte Zellen, die sich in IgG produzierende Zellen und nicht-IgG produzierende Zellen unterscheiden lassen, sind Säugerzellen.
  • Für die vorliegende Erfindung lässt sich jede Säugerzelle verwenden. Beispiele für Säugerzellen, die verwendet werden können, sind Plastocytoma-, Myeloma-, Hybridoma-, CHO- (Chinese Hamster Ovary), Fibrosarcoma- oder Lymphoblastoidzellen, die entweder aus der Maus oder dem Menschen stammen. In der vorliegenden Verwendung bevorzugt verwendete Säugerzellen sind Maus-Myelomazellen. Beispiele für Maus-Myelomazellen sind NS0 sowie mit Glutamin-Synthetase transfizierte NS0 (GS-NSO). Besonders geeignet sind GS-NS0.
  • IgG
  • IgG, der von den in der vorliegenden Erfindung verwendeten Zellen produziert werden kann, könnte humaner, Schweine-, Meerschweinchen-, Rinder-, Ziegen-, Schaf-, Affen-, Pferde-, Maus-, Ratten- oder Hamster-IgG sein. Ebenso könnten humanisierter und chimärer IgG produziert werden. Vorzugsweise wird humaner IgG produziert. Weiterhin könnten die Zellen ebenso Fragmente von IgG, wie etwa Fc-, Fab-, (Fab)2-Fragmente, produzieren.
  • Einkapselung
  • Die Einkapselung der IgG produzierenden Zellen und der nicht-IgG produzierenden Zellen lässt sich durch Verwendung von beispielsweise Standardverfahren, wie in der WO 82/02561 beschrieben, oder gemäß den von One Cell Systems Inc. bereitgestellten Vorschriften durchführen.
  • Normalerweise werden die Zellen zu einem verflüssigten Gel gegeben, das die Einkapselungsmatrix, wie etwa die von One Cell Systems Inc. vertriebene Einkapselungsmatrix CelBioGelTM, enthält. Die Einkapselungsmatrix besteht üblicherweise aus Agarose. Die Matrix könnte biotinyliert sein. Besonders bevorzugt sind biotinylierte Agarose-Matrices.
  • Die bevorzugte Anzahl an Zellen, die zu dem verflüssigten Gel gegeben werden, liegt zwischen 105 und 108 Zellen/ml, insbesondere zwischen 5 × l05 und 107 Zellen/ml.
  • Die Zellen in der verflüssigten Einkapselungsmatrix lassen sich weiter bearbeiten, so dass Gel-Mikrotröpfchen (GMD) erzeugt werden, die wenigstens eine Zelle pro GMD enthalten, indem eine Emulsionsmatrix, die üblicherweise aus Öl, vorzugsweise Mineralöl, besteht, wie etwa die CelMixTM-Emulsionsmatrix, sowie ein Gerät zur Herstellung von Mikrotröpfchen, wie etwa das Gerät CellSys 101TM, verwendet werden. Die CelMixTM-Emulsionsmatrix und das CellSys 101TM-Gerät zur Herstellung von Mikrotröpfchen werden von One Cell Systems Inc. vertrieben.
  • Das Rückhaltereagens Protein A und/oder Protein G kann an die Matrix gebunden werden, bevor oder nachdem GMDs erzeugt worden sind. Vorzugsweise wird Protein A und/oder Protein G gebunden, nachdem GMDs erzeugt worden sind. Die Bindung erfolgt üblicherweise dadurch, dass zunächst die Matrix mit einem Verbindungsstück und danach mit Protein A und/oder Protein G inkubiert wird. Falls die Matrix biotinyliert ist, so ist ein bevorzugtes Verbindungsstück ein Avidin, wie Streptavidin. Streptavidin wird insbesondere verwendet. Protein A und/oder Protein G könnte biotinyliert werden, um eine Bindung an das Verbindungsstück zu ermöglichen, falls das Verbindungsstück Avidin ist. Vorzugsweise wird biotinyliertes Protein A und/oder Protein G verwendet, insbesondere wird biotinyliertes Protein A verwendet. Die Menge an Protein A und/oder Protein G, die üblicherweise zur Matrix oder zu den GMDs gegeben wird, liegt zwischen 0,001 und 5 mg/ml, vorzugsweise zwischen 0,01 und 0,1 mg/ml.
  • Inkubation zur IgG-Produktion
  • Der Inkubationszeitraum, während dessen der IgG produziert werden kann, hängt von der spezifischen IgG-Produktivität der Zelle ebenso wie von der Art der verwendeten Zelle ab. Falls eine Maus-Mylomazelle verwendet wird, liegt die Zeitspanne üblicherweise zwischen 1 und 15 Minuten, insbesondere zwischen 3 und 12 Minuten.
  • Die Inkubationstemperatur hängt ebenso von der spezifischen IgG-Produktivität der Zelle ebenso wie von der Art der verwendeten Zelle ab. Falls eine Maus-Mylomazelle verwendet wird, wird die Inkubation bei einer Temperatur zwischen 2°C und 15°C, vorzugsweise zwischen 2°C und 8°C, durchgeführt.
  • Üblicherweise wird während der Inkubation ein Kontroll-IgG zugegeben, um die Bindung des Rückhaltereagens zu bestätigen.
  • Markierung und Selektion mittels Durchflusscytometrie
  • Alle Substanzen, die das Produkt IgG erkennen und die mit einer Fluoreszenzverbindung konjugiert sind, können als Fluoreszenzmarkierung verwendet werden. Üblicherweise lassen sich Antikörper, die mit einer Fluoreszenzverbindung konjugiert sind und die spezifisch für das Produkt IgG sind, oder Antigene, die an eine Fluoreszenzverbindung konjugiert sind und die spezifisch für das Produkt IgG sind, verwenden. Vorzugsweise werden Antikörper, die an eine Fluoreszenzverbindung konjugiert sind und die spezifisch für das Produkt IgG sind, verwendet. Für das Produkt IgG spezifische Antikörper können Immunglobuline sein, die aus den Immunglobulinklassen A, D, E, G oder M ausgewählt sind und die aus einer Wirtszelle stammen sollten, die nicht mit der Zelle, die das Produkt IgG exprimiert und sezerniert, verwandt ist. Vorzugsweise ist der für den produzierten IgG spezifische Antikörper ebenso ein IgG. Falls die Zelle, die das Produkt IgG exprimiert und sezerniert, eine Mauszelle ist, so könnte der Markierungsantikörper beispielsweise ein aus der Ziege stammender IgG sein.
  • Beispiele für Fluoreszenzverbindungen sind Phycoerythrin, Fluoresceinisothiocyanat, Texas Red, Rhodamin oder Cyanin-Farbstoffe. Als bevorzugter Fluoreszenzmarker wird ein IgG verwendet, der an Phycoerythrin konjugiert ist und spezifisch für das Produkt IgG ist. IgGs, die eine Fluoreszenzverbindung enthalten und die spezifisch für das Produkt IgG sind, sind kommerziell erhältlich.
  • Falls für das Produkt IgG spezifische Antikörper als Marker verwendet werden, wird vorzugsweise den eingekapselten Zellen vor der Markierung ein Blockierungsmittel zugesetzt, um sowohl die Bindung von zusätzlich sezerniertem Produkt zu verhindern als auch um nichtspezifische Bindung zu reduzieren. Als ein bevorzugtes Blockierungsmittel wird Serum, insbesondere fötales Kälberserum, oder eine Lösung aus entrahmter Milch (z.B. Marvel) verwendet.
  • Die üblichen Durchflusscytometriebedingungen zur Unterscheidung IgG produzierender Zellen von nicht-IgG produzierenden Zellen werden gemäß der von One Cell Systems Inc. bereitgestellten Vorschrift gewählt. Üblicherweise werden leere GMDs und GMDs, die wenigstens eine Zelle enthalten, mittels Streuungseigenschaften nachgewiesen, die in einer graphischen Auftragung von linearer Vorwärtsstreuung (forward scatter, FSc) und logarithmischer Seitenstreuung (side scatter, SSc) dargestellt werden. Dabei lässt man zunächst eine Negativkontrolle (kein Rückhaltereagens) laufen und stellt die FSc und SSc so lange ein, bis die besetzte Population ungefähr im Zentrum des Fsc/SSc-Graphen erscheint. Der Schwellenwert-Diskriminator wird eingestellt, um das Auftreten der leeren GMDs zu reduzieren. Die einfach besetzte Subpopulation wird durchgelassen und unter Verwendung einer logarithmischen Einstellung am Detektor-PMT (photomultiplier tube), die dem Fluorochrom entspricht, auf Fluoreszenz analysiert. Das Fluoreszenzdetektions-PMT wird so eingestellt, dass die Population in der ersten logarithmischen Dekade des Fluoreszenzhistogramms liegt. Danach lässt man positive und Testproben laufen, wobei im Allgemeinen 10 000 Ereignisse pro Probe gesammelt werden. Die Unterscheidung mittels Durchflusscytometrie kann analytisch oder präparativ stattfinden. GMD kann gegebenenfalls vor der Durchflusscytometrie angefärbt werden, um auf lebensfähige Zellen zu selektionieren, indem die Zellen einer Färbeverbindung, wie etwa Propidiumiodid, ausgesetzt werden.
  • Die üblicherweise erhaltenen Nachweisgrenzen für IgG produzierende Zellen in einer Population aus IgG produzierenden Zellen und nicht-IgG produzierenden Zellen liegen zwischen 95 und 99,9%, vorzugsweise zwischen 99 und 99,5%, der Gesamtzahl der Zellen.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine biotinylierte Agarose-Matrix umfassend biotinyliertes Protein A und/oder Protein G als Rückhaltereagens für IgG, wobei das biotinylierte Protein A und/oder Protein G vermittels eines Avidin-Verbindungsstücks an die Matrix gebunden ist. Vorzugsweise umfasst die Matrix Protein A als Rückhaltereagens für IgG, und das Avidin-Verbindungsstück ist Streptavidin.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Herstellung von Zellen und Matrix
  • 15 ml CelMixTM-200cs-Emulsionsmatrix wurden in einem sterilen Glasszintillationsfläschchen auf 37°C temperiert. 106 lebensfähige GS-NS0-Zellen wurden durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 200 × g geerntet. Die Zellen wurden in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphate buffered saline, PBS) resuspendiert. Zu 400 μl verflüssigtem CelBioGelTM wurden 25 μl Pluronsäure (steril filtriert) gegeben und das Gel 3 min bei 37°C äquilibriert. Die resuspendierten Zellen wurden zu dem CelBioGelTM gegeben und leicht gemischt und danach 3 min bei 37°C inkubiert. Das CelBioGelTM-Zellen-Gemisch wurde spiralförmig (von unten nach oben) unter Verwendung einer 1-ml-Pipettenspitze zu dem erwärmten Emulsionsmatrixöl im Fläschchen zugetropft, wobei das Einführen von Luftblasen vermieden wurde. Dieses Gemisch wurde unter Verwendung des CellSys 101TM-Geräts zur Herstellung von Mikrotröpfchen, das 25-μm-Mikrotröpfchen produziert, emulgiert, indem 1 min bei RT und 2100 UpM, 1 min im Eisbad bei 2100 UpM und 10 min im Eisbad bei 1100 UpM zentrifugiert wurde. Das Einkapselungsgemisch wurde in zwei konische 15-ml-Röhrchen aufgeteilt, und die Emulsion wurde vorsichtig mit 5 ml PBS überschichtet. Die Lösung wurde 10 min bei 600 g zentrifugiert, so dass das GMD-Pellet sichtbar war. Die Ölphase wurde mit einer Pipette entfernt, der Überstand wurde abgesaugt, und die Pellets aus den beiden Röhrchen wurden vereinigt und mit 2 ml PBS versetzt. 10 ml PBS wurde als Aliquot in ein konisches 15-ml-Röhrchen eingeführt und mit den GMDs überschichtet. Das Gemisch wurde 5 min bei 400 × g zentrifugiert (falls notwendig, Schritt wiederholen). Der Überstand wurde entfernt, und die Zellen wurden in einer entsprechenden Lösung resuspendiert.
  • A. Streptavidin-Brücke
  • Das GMD-Pellet wurde in 2,3 ml kaltem DMEM-Medium resuspendiert, und ein 10-μl-Aliquot wurde hinsichtlich %-Besetzung beurteilt. 0,3 ml wurden für die "ungefärbte" Negativkontrolle aufbewahrt. 80 μl Streptavidin (1 mg/ml) wurden in 2 ml kaltem L15-Zellkulturmedium (Biowhittaker) verdünnt und zu den 2 ml GMDs gegeben und auf einem Rotator 15 min bei RT inkubiert. Das Gemisch wurde in 10 ml kaltem PBS gewaschen (zweimal 5 min bei 400 × g zentrifugiert).
  • B. Biotinylierter Rückhaltestoff-IgG-Bindung
  • Die GMDs wurden in 2,3 ml L 15 resuspendiert (0,3 ml wurde als negative "Nicht-Rückhalte"-Kontrollen aufbewahrt). 80 μl biotinyliertes Protein-A-Rückhaltereagens (Pierce) (1,0 mg/ml) wurden in 2 ml kaltem L15 verdünnt. Die 2 ml GMDs wurden mit verdünntem Rückhaltestoff versetzt, und die Lösung wurde 15 min bei RT auf einem Rotator inkubiert und in kaltem PBS gewaschen (zweimal 5 min bei 400 × g zentrifugiert) und in 3,3 ml kaltem L15 resuspendiert (0,3 ml wurden für Positivkontrollen aufbewahrt).
  • C. Sekretionsinkubation der eingekapselten Zellen
  • GMDs wurden zu 25 ml kaltem L15 gegeben und in einem T75-Kolben bei 4°C äquilibriert und 10 min bei 4°C inkubiert. 6 μl Kontroll-IgG (humaner IgG von Chromepure) wurden in 0,8 ml L15 verdünnt. Jede Kontrolle wurde mit jeweils 0,4 ml des verdünnten Kontroll-IgG versetzt, und diese Lösung wurde 15–30 min bei RT auf einem Rotator inkubiert. Am Ende dieser Inkubationen wurden alle Proben zweimal in kaltem PBS/2% fötalem Rinderserum (foetal bovine serum, FBS) gewaschen (5 min bei 400 × g zentrifugiert). Die Sekretionsprobe wurde in 2 ml resuspendiert, und die Kontrollen wurden in jeweils 1 ml kaltem L15 + 5% FBS resuspendiert.
  • D. Anfärbung mit Detektionsantikörper
  • 40 μl Ziege-Anti-Mensch-IgG-AntI-f(ab')2-R-Phycoerythrin (R-PE)-Detektionsantikörper (0,5 mg/ml) wurden für die Probe in 2 ml kaltem L15 + 5% FBS verdünnt, wobei für die Kontrollen 4 μl in 2 ml verdünnt wurden. Die 40-μl-Präparation wurde zu den GMDs gegeben, und jeweils 1 ml der 4-μl-Präparation wurde zu jeder Kontrolle gegeben. Das Gemisch wurde 15 min bei RT (im Dunkeln) rotiert. Es wurde 2 × in 10 ml kaltem PBS/2% FBS gewaschen (5 min bei 400 × g zentrifugiert), und jede Probe wurde zur Durchllusscytometrie in 2,0 ml PBS resuspendiert.
  • E. Durchflusscytometrie der eingekapselten Zellen
  • Das verwendete Gerät war ein Zellsortierungsgerät EPICS ELITE von Coulter, das mit einem 488nm-Argonionenlaser ausgestattet ist, der zuvor an Flowcheck-Fluorospheres [fluoreszierende Mikrokügelchen] ausgerichtet wurde. Leere und besetzte GMDs werden durch Streuungseigenschaften nachgewiesen, die auf einer graphischen Auftragung von linearer Vorwärtsstreuung (FSc) und logarithmischer Seitenstreuung (SSc) dargestellt werden. Dabei ließ man zunächst die Negativkontrolle (kein Rückhaltereagens) laufen und stellt die FSc und SSc so lange ein, bis die besetzte Population ungefähr im Zentrum des Fsc/SSc-Graphen erscheint. Der Schwellenwert-Diskriminator wurde eingestellt, um das Auftreten der leeren GMDs zu reduzieren. Die einfach besetzte Subpopulation wurde durchgelassen und unter Verwendung einer logarithmischen Einstellung am Detektor-PMT (photomultiplier tube), die dem Fluorochrom entspricht, auf Fluoreszenz analysiert. Das Fluoreszenzdetektions-PMT wurde so eingestellt, dass die Population in der ersten logarithmischen Dekade des Fluoreszenzhistogramms liegt. Danach ließ man positive und Testproben laufen, wobei im Allgemeinen 10 000 Ereignisse pro Probe gesammelt werden.
  • Beispiel 2
  • Vergleich der Rückhaltung des Produkts chimärer IgG durch Verwendung von Protein A bzw. Antikörper als Rückhaltereagens
  • Unterschiedliche Verdünnungen des Produkts chimärer IgG wurden leeren GMDs mit entweder biotinyliertem Protein-A-Rückhaltereagens oder biotinyliertem Ziege-Anti-Mensch-IgG-Fc-gamma-Fragment-spezifischem Antikörper-Rückhaltereagens ausgesetzt. GMDs, in die Protein A eingebaut war, zeigten eine wesentlich höhere Fluoreszenz verglichen mit dem Antikörper als Rückhaltereagens, und zwar bei allen Produktkonzentrationen (siehe 2).
  • Beispiel 3
  • Bestimmung der Arbeitskonzentrationen von Protein A
  • Eine GS-NSO-Zelllinie wurde als eingekapselte Testzellen, die IgG-Produkt produzieren, verwendet. Als Negativkontrolle wurden eingekapselte Zellen ohne biotinyliertes Protein A verwendet. Als eine Fc-Positivkontrolle wurden IgG produzierende eingekapselte Zellen mit humanem IgG versetzt. Es wurde eine Stammlösung von 1 mg Protein A pro ml PBS verwendet (siehe 3).

Claims (8)

  1. Verfahren zur Identifizierung IgG produzierender Zellen unter nicht-IgG produzierenden Zellen, wodurch a) die IgG produzierenden Zellen und die nicht-IgG produzierenden Zellen in einer Matrix, die ein Rückhaltereagens für den produzierten Antikörper enthält, eingekapselt sind, b) besagte Matrix für eine Zeitspanne, während der IgG produziert werden kann, inkubiert wird, c) besagter produzierter IgG fluoreszenzmarkiert wird, d) und fluoreszenzmarkierte, eingekapselte IgG-produzierende Zellen und nicht-IgG produzierende Zellen durch Durchflusscytometrie unterschieden werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Rückhaltereagens Protein A und/oder Protein G ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht IgG-produzierenden Zellen und die IgG produzierenden Zellen Säugerzellen sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Säugerzellen Maus-Myelomazellen sind.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der produzierte IgG ein humaner IgG ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein A und/oder Protein G biotinyliert ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitspanne während der IgG produziert werden kann, zwischen 1 und 15 Minuten beträgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einer Temperatur zwischen 2°C und 15°C ausgefühhrt wird.
  8. Eine biotinylierte Agarose-Matrix umfassend biotinyliertes Protein A und/oder Protein G als Rückhaltereagens für IgG wobei das biotinylierte Protein A und/oder Protein G vermittels eines Avidin-Verbindungsstückes an die Matrix gebunden ist.
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