DE60031548T2

DE60031548T2 - Verfahren zum simultanen nachweis von beiden gliedern eines bindungspaares

Info

Publication number: DE60031548T2
Application number: DE60031548T
Authority: DE
Inventors: P. Daniel Lino Lakes COLLINS
Original assignee: Bioe LLC
Current assignee: Bioe LLC
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2020-07-29
Also published as: CA2380487C; WO2001009608A8; US7410802B2; RU2251111C2; EP1203236A1; US20020132231A1; US20090011443A1; WO2001009608A9; CA2380487A1; ZA200200809B; EP1203236B1; ATE343788T1; JP4111712B2; DE60031548D1; WO2001009608A1; IL147855A0; IL147855A; AU6392200A; US20020012907A1; JP2003506684A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von beiden Partnern eines Bindepaares in einer biologischen Probe.
Blutprodukte für den Gebrauch in der Transfusion oder dem Transfer von Blutkomponenten müssen routinemäßig auf die Anwesenheit von infektiösen Agentien wie menschliches Immunschwäche-Virus (HIV), Hepatitisviren, menschliches T-lymphocytotropes Virus und Cytomegalievirus abgesucht werden. Solche Agentien werden normalerweise entweder über die Identifizierung des Virus-Antigens oder über den Nachweis einer Immunantwort gegenüber dem Virus (z.B.: vom Wirt stammende antivirale Antikörper) mittels Enzymimmuntest (EIA) oder Radioimmuntest (RIA) nachgewiesen. Immuntestverfahren eignen sich nur begrenzt, das Vorhandensein von viralen infektiösen Agentien in den frühen Infektionsphasen nachzuweisen, wobei das zeitliche Fenster zwischen der Infektion mit einem Virus und dem Nachweis durch ein Immuntestverfahren von zwei bis vier Wochen für HIV und bis zu etwa 10 Wochen für Hepatitis C-Virus (HCV) reicht. Verfahren wie Umkehrtranskriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder verzweigtkettige DNA-Analyse kann den Zeitraum zwischen Infektion und Nachweis verkürzen, aber verbieten sich aufgrund der Kosten für die Verwendung bei einem Einzelspender und beheben nicht das zeitliche Fenster.
EP-A-0 595 211 beschreibt ein Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von einem Antigen eines verursachenden Agens und von einem Antikörper gegen dieses verursachende Agens, nicht aber das Antigen. Das Verfahren umfasst das Binden des Antigens und des Antikörpers an die Rezeptoren R1 beziehungsweise R2, beide an eine feste Phase gebunden, und den Nachweis des Antigens und Antikörpers durch Binden der Rezeptoren R3 beziehungsweise R4, dazu sind beide mit dem gleichen Marker markiert. Das US-Patent Nr. 5,627,026 beschreibt ein Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis eines Antigens und eines Antikörpers in einer biologischen Probe. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen eines festen Substrats, das eine Antikörper-beschichtete erste Stelle und eine Antigen-beschichtete zweite Stelle aufweist, mit der biologischen Probe und einem Gemisch eines markierten Antigens und eines markierten Antikörpers und die Bestimmung, ob ein Marker an der entsprechenden Stelle auf dem festen Substrat vorkommt.
Die Erfindung beruht auf einem schnellen und sensitiven Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis beider Partner eines Bindepaares wie zum Beispiel einem Liganden und einem Rezeptor oder einem Antigen und einem Wirts-Antikörper aus einer biologischen Probe. Die erfindungsgemäßen Verfahren können zum Beispiel die Fähigkeit, Infektionen in einer frühen Phase nachzuweisen steigern, was zu einer früheren Behandlung der Infektion führt.
Die Erfindung bietet ein Verfahren zur gleichzeitigen Messung von beiden Partner A und B eines Bindepaares in einer biologischen Probe. Die biologische Probe wird aus einer Gruppe bestehend aus Blut, Plasma Serum Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, Sputum, Tränen, amniotischer Flüssigkeit, Glaskörper-Humor, Speichel und Gewebekultur-Überstände ausgewählt. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen eines Festphasenreagenzes, welches ein Teilchen einschließt, das mit Einfang-Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A des Bindepaares beschichtet ist, und das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit dem Festphasenreagenz unter Bedingungen, unter denen der Partner A, wenn er vorhanden ist, an das Teilchen gebunden wird, um ein erstes reagiertes Teilchen auszubilden. Die Einfang-Antikörper können monoclonal sein. Das erste reagierte Teilchen wird mit ersten Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A in Kontakt gebracht, wobei die ersten Antikörper mit einer ersten Markierung markiert sind, und mit zweiten Antikörpern mit spezifischer Bindeaffinität für den Partner B des Bindepaares, wobei die zweiten Antikörper mit einer zweiten Markierung markiert sind, die unterschiedlich zu der ersten Markierung ist, um ein zweites reagiertes Teilchen auszubilden. Die ersten und zweiten Antikörper können monoclonal sein. Die erste und zweite Markierung (z.B. Fluorophore) werden auf dem zweiten reagierten Teilchen mittels Durchflusscytometrie gemessen.
Bei bestimmten Ausführungsformen sind im Wesentlichen alle Einfang-Antikörper so auf dem Teilchen angeordnet, dass die Antigen-bindenden Regionen der Einfang-Antikörper für das Binden des Partners A des Bindepaares zugänglich sind.
Partner A des Bindepaares kann zum Beispiel ein Antigen und Partner B ein Wirts-Antikörper sein. Das Antigen kann ein Virus-Antigen wie zum Beispiel ein Hepatitis C-Antigen, ein Hepatitis B-Antigen oder ein menschliches Immunschwäche-Virus-Antigen sein oder ein Autoantigen wie zum Beispiel Glutaminsäure-Decarboxylase. Partner A des Bindepaares kann auch ein Ligand sein, wie zum Beispiel ein Cytokin, und Partner B ein Rezeptor, wie zum Beispiel ein Cytokin-Rezeptor. Außerdem kann Partner A ein Enzym und Partner B ein Substrat sein. Zum Beispiel kann das Enzym Caspase-3 oder Caspase-1 und das Substrat Poly(ADP-Ribose)-Polymerase beziehungsweise Pro-Interleukin-1 sein.
Die Erfindung bietet auch ein Kit zur gleichzeitigen Messung beider Partner A und B des Bindepaares in einer biologischen Probe. Der Kit umfasst ein Festphasereagenz, welches ein Teilchen einschließt, das mit Einfang-Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A des Bindepaares beschichtet ist, erste Antikörper mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A des Bindepaares, wobei die ersten Antikörper mit einer ersten Markierung markiert sind, und mit zweiten Antikörpern mit spezifischer Bindeaffinität für den Partner B des Bindepaares, wobei die zweiten Antikörper mit einer zweiten Markierung markiert sind, die unterschiedlich zu der ersten Markierung ist. Im Wesentlichen sind alle Einfang-Antikörper so auf dem Teilchen angeordnet sind, dass die Antigen-bindenden Regionen der Einfang-Antikörper für das Binden des Partners A des Bindepaares zugänglich sind. Der Kit enthält des weiteren ein Etikett oder Beipackzettel, welche anzeigen, dass das Festphasenreagenz, die markierten erste Antikörper und die markierten zweiten Antikörper für das gleichzeitige Messen beider Partner A und B des Bindepaares in einer biologischen Probe mittels Durchflusscytometrie verwendet werden können. Sofern nicht anders ausgewiesen haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung wie gemeinhin von einer gewöhnlichen Fachkraft auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird. Wenngleich Verfahren und Materialien, die ähnlich oder entsprechend den hier Beschriebenen verwendet werden können, um die Erfindung auszuführen, werden geeignete Verfahren und Materialien nachstehend beschrieben. Im Falle eines Widerspruchs mit Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patenten und andere hierin aufgeführte Druckschriften ist die vorliegende Ausführung einschließlich der Definitionen entscheidend. Des weiteren sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung vorgesehen.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch die nachstehende ausführliche Beschreibung und durch die Ansprüche ersichtlich.
Bei 1 handelt es sich um eine schematische Darstellung eines Tests zum Nachweis eines Partners A und eines Wirt-anti-Partner A-Antikörpers (Partner B).
Die 2A–2H sind Streudiagramme, welche den gleichzeitigen Nachweis von Hepatitis B-Virus (HBV)-Oberflächenantigen, Wirt-anti-HBV-Antikörper, HCV-Kapsidantigen und Wirt-anti-HCV-Antikörper mittels Durchflusscytometrie zeigen. 2A zeigt HBV-Antigen und -Antikörper in einer normalen Probe. 2B zeigt HCV-Antigen und -Antikörper in einer normalen Probe. 2C zeigt HBV-Antigen und -Antikörper in einer HBV-positiven Probe. 2D zeigt HCV-Antigen und -Antikörper in einer HBV-positiven Probe. 2E zeigt HBV-Antigen und -Antikörper in einer HCV-positiven Probe. 2F zeigt HCV-Antigen und -Antikörper in einer HCV-positiven Probe. 2G zeigt HBV-Antigen und -Antikörper in einer HBV-positiven/HCV-positiven Probe. 2H zeigt HCV-Antigen und -Antikörper in einer HBV-positiven/HCV-positiven Probe.
IMMUNTEST AUSFÜHRUNG
Im allgemeinen wird bei der Erfindung ein Sandwich-Immuntestverfahren zum gleichzeitigen Nachweis beider Partner eines Bindepaares in einer biologischen Probe verwendet. Bindepaare umfassen jede Kombination von Molekülen, die einen Komplex bilden, einschließlich Paaren, die aus Nucleinsäuren, Proteinen oder einem kleinen Molekül und einem Protein zusammengesetzt sind. Nucleinsäurepaare können DNA:RNA-Paare oder DNA:DNA-Paare sein. Zum Beispiel ein DNA/RNA-Bindepaar wie eine einzelsträngige (ss) DNA und eine mRNA kann als PCR-Produkt-Nachweissystem verwendet werden. Ein DNA/DNA-Bindepaar wie zum Beispiel eine ssDNA und eine virale DNA können in einem Verdrängungstest zur Quantifizierung des Viruses je amplifizierter DNA verwendet werden.
Nicht einschränkende Beispiele eines Proteins oder eines kleinen Moleküls und Proteins sowie Bindepaare umfassen ein Hormon, ein Cytokin, ein Peptid, ein Arzneistoff, ein Virusprotein oder anderes Antigen und ein dazugehörender Rezeptor oder Wirts-Antikörper. Virusprotein/Rezeptor-Bindepaare könne zum Beispiel HIV gp120 und lösliches CD4 sein. Arzneistoff- und Arzneistoff-Rezeptor-Bindepaare können zum Beispiel Kokain und ein Dopamin-Rezeptor sein. Peptid- und Peptid-Rezeptor-Bindepaare können zum Beispiel Acetylcholin und ein Muskarin-Rezeptor oder Dopamin und ein Dopamin-Rezeptor sein. Hormon- und Hormon-Rezeptor-Bindepaare können zum Beispiel Insulin und Insulin-Rezeptor sein. Cytokin- und Cytokin-Rezeptor-Bindepaare können zum Beispiel Tumornekrosefaktor (TNF) und ein TNF-Typ 1- oder Typ 2-Rezeptor oder Interleukin 2 (IL-2) und IL-2-Rezeptor sein. Antigen- und Antikörperpaare können zum Beispiel ein Virusprotein und ein Wirt-anti-Virusprotein-Antikörper oder ein Autoantigen und ein Wirt-anti-Autoantigen-Antikörper sein. HIV p24/Mensch-anti-HIV-Antikörper, HIV gp120/Mensch-anti-HIV-gp120-Antikörper, HBV-Oberflächenantigen/Mensch-anti-HBV-Oberflächenantigen-Antikörper und HCV-Kapsidprotein/Mensch-anti-HCV-Kapsidprotein-Antikörper sind Beispiele für Virusprotein- und Wirts-Antikörper-Bindepaare. Ein Autoantigen- und Wirt-anti-Autoantigen-Antikörper-Bindepaar kann zum Beispiel Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) und Wirt-anti-GAD-Antikörper sein.
Andere Protein-Bindepaare, die nachgewiesen werden können, sind Enzym- und Substrat-Bindepaare. Zum Beispiel kann das Enzym/Substrat-Bindepaar Caspase-3/Poly(ADP-Ribose)-Polymerase oder Caspase-1/Pro-Interleukin-1 sein.
Partner A, der jeder Partner des Bindepaares sein kann, wird eingefangen mit einem Festphasereagenz, das aus einem Teilchen besteht, welches mit Einfang-Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A beschichtet ist. Zum Beispiel, wenn das gleichzeitig nachzuweisende Bindepaar HIV gp120/Wirt-anti-HIV gp120-Antikörper ist, kann das Teilchen mit Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für HIV gp120 oder Anti-Wirts-Immunglobulin (Ig) beschichtet sein.
Partner A wird eingefangen durch das Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit dem Teilchen, das mit den Einfang-Antikörpern beschichtet ist. Wie hierin verwendet, enthalten geeignete biologische Proben Zellen oder zelluläres Material und umfassen zum Beispiel Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Sputum, Tränen, amniotische Flüssigkeit, Glaskörper-Humor, und Cerebrospinalflüssigkeit. Andere Proben können in vitro Gewebekultur-Medium/-Überstand beinhalten. Biologische Proben können mit einem nichtionischen Detergenz wie 0,5% Triton-X 100 oder Nonidet P40 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) behandelt werden, um Kapsidantigene von Pathogenen freizulegen.
Das Festphasenreagenz und die biologische Probe werden unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die das Binden von Partner A, wenn er vorhanden ist, an das Teilchen vereinfachen, um das erste reagierte Teilchen auszubilden. Solche Bedingungen können die Verwendung eines Puffers, der 1 % fötales Kälberserum (FBS) und 0,1% Natriumazid in phospatgepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur oder die Verwendung einer biologischen Flüssigkeit unter physiologischen pH-Bedingungen einschließen. Das erste reagierte Teilchen wird dann mit zwei Sätzen markierter Antikörper (d.h. Rezeptor-Antikörper) in Kontakt gebracht, um ein zweites reagiertes Teilchen auszubilden. Die ersten Antikörper haben spezifische Bindeaffinitäten für den Partner A und sind mit einer ersten Markierung markiert. Die ersten Antikörper sind in der Lage, Partner A zu binden, während Partner A an den Einfang-Antikörper gebunden ist. Somit müssen die Einfang-Antikörper und die ersten Antikörper als Paar arbeiten. Die zweiten Antikörper haben spezifische Bindeaffinitäten für den Partner B des Bindepaares und sind mit einer zweiten Markierung markiert. Fluoreszenz-markierte Antikörper sind besonders nützlich bei diesem Verfahren.
1 liefert ein Schema für einen Test zum Nachweis von Partner A und Wirt-anti-Partner A-Antikörper. In dieser Ausführungsform haben die biotinylierten Einfang-Antikörper spezifische Bindeaffinitäten für Partner A und sind über Avidin an die Antigen-Infangkügelchen gekoppelt. Die ersten Antikörper besitzen spezifische Bindeaffinitäten für den Partner A und sind markiert mit Phycoerythrin (erste Markierung). Die zweiten Antikörper sind markiert mit Cyanin-Phycoerythrin (zweite Markierung) und weisen eine spezifische Bindeaffinitäten für das Wirts-Ig (Partner B) auf. Das erste reagierte Teilchen umfasst: Partner A, Wirt-anti-Partner A-Antikörper, Einfang-Antikörper und das Festphasenreagenz (z.B. Antigen-Einfang-Kügelchen); wobei das zweite reagierte Teilchen das erste reagierte Teilchen und die zwei markierten Antikörper umfasst.
Durchflusscytometrie kann verwendet werden, um die Menge der Markierung auf dem zweiten reagierten Teilchen zu messen. Der Begriff „messen" wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf qualitative und quantitative Messungen. In anderen Worten umfasst der Begriff „messen", die Anzeige des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Markierung auf dem zweiten reagierten Teilchen, sowie die Bestimmung der Menge der vorhandenen Markierung. Durchflusscytometer sind in der Lage, mindestens drei getrennte Fluoreszenzemissionswellenlängenbereiche zu messen. Dies gelingt durch die Verwendung von optischen Filtern, um die Fluoreszenzemission zu teilen, und getrennten Photovervielfacher-Röhrchen, um die einzelnen Emissionssignale zu verstärken. Die Intensität der mit dem Teilchen assoziierten Fluoreszenzemission ist direkt proportional zu der Konzentration des Anylats in der biologischen Probe. Daher erlaubt die Verwendung von verschiedenen Farbstoffen mit unterschiedlichen Emissionsspektren, wobei jeder Farbstoff an einen anderen Antikörper gekoppelt ist, die Analyse von mehreren Analyten je Teilchenpopulation. Das Durchflusscytometer kann auch Teilchen von verschiedener Größe unterscheiden, so dass ein Teilchen, das zum Beispiel einen Durchmesser von etwa 7 μm besitzt, von einem Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 10 μm unterschieden werden kann. Daher können zusätzliche Komponenten durch die Verwendung einer Kombination von mehreren Fluoreszenzfarbstoffen und zwei oder drei Teilchenpopulationen mit unterschiedlichen durchschnittlichen Durchmessern nachgewiesen werden.
HERSTELLUNG DER ANTIKÖRPER
Antikörper mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A oder den Partner B können mittels Standardverfahren hergestellt werden. Wahlweise können die Antikörper auch im Handel erworben werden, zum Beispiel von BiosPacific (Emeryville, CA), Coulter (Hialeah, FL), Maine Biotechnology Service (Portland, ME) oder Biodesign International (Kennnebunk, ME). Die Begriffe „der Antikörper" oder „die Antikörper" wie hier verwendet, umfassen intakte Moleküle genauso wie Fragmente davon, die in der Lage sind, an eine Epitopdeterminante des Partners A oder des Partners B zu binden. Der Begriff „Epitop" bezieht sich auf eine Antigendeterminante auf einem Antigen, an welches das Paratop des Antikörpers bindet. Epitopdeterminanten bestehen in der Regel aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie zum Beispiel Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, und haben üblicherweise spezifische dreidimensionale Struktureigenschaften sowie spezifische Ladungseigenschaften. Epitope besitzen gewöhnlich mindestens fünf aneinander grenzende Aminosäuren.
Daher schließt der Begriff „der Antikörper" und „die Antikörper" polyclonale Antikörper, monoclonale Antikörper, humanisierte oder chimäre Antikörper, einkettige Fv-Antikörperfragmente, Fab-Fragment und F(ab)₂-Fragment mit ein. Monoclonale Antikörper sind besonders nützlich.
Für gewöhnlich wird ein Protein von Interesse rekombinant hergestellt, durch chemische Synthese oder durch Aufreinigung des nativen Proteins und dann zur Immunisierung der Tiere verwendet. Verschiedene Wirtstiere, einschließlich zum Beispiel Kaninchen, Hühner, Mäuse, Meerschweinchen und Ratten können durch Injektion des Proteins von Interesse immunisiert werden. Adjuvantien können verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken, abhängig von der Wirtsart, und umfassen Freundsches Adjuvans (komplett und inkomplett), Mineralgele wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie zum Beispiel Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüssellochschnecke-Hämocyanin (KLH) und Dinitrophenol. Polyclonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die spezifisch für ein bestimmtes Antigen und in den Seren von immunisierten Tieren enthalten sind. Monoclonale Antikörper sind homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Epitop, das innerhalb eines Antigens enthalten ist, und können unter Verwendung von Standard-Hybridomverfahren hergestellt werden. Im Besonderen können monoclonale Antikörper mit jedem Verfahren gewonnen werden, das die Herstellung der Antikörpermoleküle durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur vorsieht wie von Köhler, G. et al., Nature, 1975, 256:495 beschrieben; das menschliche B-Zell-Hybridomverfahren (Kosbor et al., Immunology Today 1983, 4:72; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80:2026) und das EBV-Hybridomverfahren (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., 1983, Seiten 77-96). Solche Antikörper können von jeder Immunglobulin-Klasse einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und jede Subklasse davon sein. Das Hybridom, das die erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper produziert kann in vitro oder in vivo gezüchtet werden.
Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül in dem verschieden Teile von unterschiedlichen Tierarten stammen wie solche, die eine variable Region von einem Maus-monoclonalen Antikörper und eine menschliche konstante Immunglobulin-Region haben. Chimäre Antikörper können durch jedes Standardverfahren hergestellt werden.
Antikörperfragmente, die spezifische Bindeaffinitäten für den Partner A oder B haben, können mittels bekannter Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel umfassen solche Fragmente, ohne darauf beschränkt zu sein, F(ab')₂-Fragmente, die durch Pepsin-Verdau des Antikörpermoleküls hergestellt werden können, und Fab-Fragmente, die durch die Reduktion der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können. Wahlweise können Fab-Expressionsbanken hergestellt werden. Siehe dazu zum Beispiel Huse et al., 1989, Science, 246:1275: Einkettige Fv-Antikörperfragmente werden erzeugt durch Verbinden der schweren und leichten Kettenfragmente der Fv-Region über eine Aminosäurebrücke (z.B. 15 bis 18 Aminosäuren), was ein einzelkettiges Polypeptid ergibt. Einzelkettige Fv-Antikörperfragmente können durch Standardverfahren hergestellt werden. Siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 4,946,778.
Wenn die Antikörper hergestellt sind, werden sie auf die Erkennung des Partners A oder des Partners B mittels Standardimmuntestverfahren, einschließlich zum Beispiel ELISA-Verfahren oder RIA, getestet. Siehe, „Short Protocols in Molecular Biology, Kapitel 11, Green Publishing Associates und John Wiley & Sons, herausgegeben von Ausubel, F.M. et al., 1992. Geeignete Antikörper haben vorzugsweise die gleichen Bindeaffinitäten für rekombinante und native Proteine.
In einer anderen Ausführungsform können die Antikörper hinsichtlich ihrer Fähigkeit Bindepaare auszubilden in einem Sandwich-Test der folgenden Art getestet werden. Kügelchen können mit biotinylierten Antikörpern beschichtet werden, zum Beispiel Anti-Virusprotein-Antikörper, dann für die Dauer von etwa 30 Minuten mit 2 ng/ml eines geeigneten Proteins, z.B. dem rekombinanten Virusprotein, in einem Volumen von 100 μl inkubiert werden. Nach dem zweimaligen Waschen der Kügelchen mit 2 ml Puffer, der 1 % FCS und 0,1 % Natriumazid in PBS enthält, werden die Kügelchen mit etwa 0,5 μg Phycoerythrin-markiertem Antikörper inkubiert. Paare von Antikörpern, die ein starkes Fluoreszenzsignal erzeugen, sind für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Tests geeignet.
FESTPHASENREAGENZIEN
Geeignete Teilchen (z.B. Kügelchen) weisen einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 2 μm bis 15 μm auf und können aus Polystyrol und ferromagnetisch oder paramagnetisch sein. Zum Beispiel können die Teilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 4 μm bis etwa 11 μm haben. Für gewöhnlich liegen die durchschnittlichen Teilchendurchmesser bei etwa 4-5 μm, 7-8 μm und 10-11 μm. Die Teilchen sind im Handel erhältlich, zum Beispiel bei Spherotech Inc., Libertyville, IL. Die Teilchen können mit den Einfang-Antikörpern mittels bekannter Verfahren beschichtet werden. Zum Beispiel können Avidin- oder Streptavidin-beschichtete paramagnetische Kügelchen mit biotinylierten Einfang-Antikörpern beschichtet werden. Im Allgemeinen werden die Avidin- oder Streptavidin-beschichteten Kügelchen in einer Salzlösung, wie zum Beispiel PBS, resuspendiert, mit biotinylierten Antikörpern unter sättigenden Bedingungen (etwa 40 μg Protein je 3,9 × 10⁷ 7 μm Kügelchen) gemischt und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Vervollständigung der Bindung werden die Kügelchen mit zum Beispiel einem Puffer, der 1 % FCS und 0,1 % Natriumazid in PBS enthält, gewaschen und blockiert.
Avidin- oder Streptavidin-beschichtete Kügelchen können an biotinylierte Nucleinsäuren gekoppelt werden, wenn Nucleinsäure-Bindepaare gemessen werden. Nucleinsäuren können mit Biotin durch den Einbau von Biotin-11-dUTP mit einer Standard-Nick-Translationsreaktion markiert werden.
Bei besonderen Ausführungsformen sind im Wesentlichen alle der Einfang-Antikörper auf dem Teilchen so orientiert, dass die Antigen-bindenden Regionen für die Bindung des Partners A zugänglich sind, was insgesamt die Sensitivität des Tests erhöht. Der Begriff „im Wesentlichen alle" weist darauf hin, dass mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% (z.B. 95% oder 99%) der Antikörper in dieser Art und Weise orientiert sind. Die prozentuale Orientierung kann qualitativ abgeschätzt werden durch Messen der Fluoreszenz, die mit dem Binden von Phycoerythrin-markiertem Ziege-anti-Maus-Antikörper assoziiert ist, und dem Vergleich mit standardisierten fluoreszierenden Teilchen. Die Antigen-bindenden Regionen der Antikörper stehen für das Binden des Partners A zur Verfügung, wenn der Antikörper an einem Aminosäurerest vornehmlich außerhalb der Antigen-bindenden Region biotinyliert ist. Daher werden während der Biotinylierung der Antikörper ein Molverhältnis von Biotin:Antikörper von etwa 5:1 bis etwa 10:1 und andere Standard-Reaktionsbedingungen verwendet. Zum Beispiel können Biotin-N-Hydroxysuccinimidylester oder Biotin-Succinimidylester bei einem pH-Wert von etwa 8,1 verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann Biotin-Hydrazin bei einem pH-Wert von 4,5-5,0 verwendet werden.
Die Testsensitivität kann auch erhöht werden, da das Einfangen des Partners A aus einer biologischen Probe nicht beschränkt ist auf Reaktionsvolumina von 200 μl oder weniger, wie in herkömmlichen Tests. Die Teilchen sind leicht aus einem großen Volumen einer biologischen Probe durch entweder magnetische Trennung oder Zentrifugation zu gewinnen. Des weiteren enthält jedes Teilchen im Durchschnitt etwa 180 000 bis 240 000 Antikörperbindungstellen und etwa 300 000 bis 350 000 biotinylierte Antigenbindungsstellen je Teilchen. Daher hat jedes Teilchen eine große Bindekapazität und einen großen wirksamen Bereich zur Analyse der Antigenkonzentration.
NACHWEISBARE MARKIERUNGEN
Jeder markierte Antikörper kann unterschiedlich dargestellt werden, indem er mit einem Fluorophor, das Licht einer mit anderen Fluorophoren kontrastierenden Farbe emittiert, markiert wird. Zum Beispiel kann eine Kombination der folgenden Fluorophore verwendet werden: 7-Amino-4-methylcumarin-3-essigsäure (AMCA), Texas Red^TM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), 5-(und-6)-Carboxy-X-rhodamin, Lissamin-Rhodamin B, 5-(und-6)-Carboxyfluorescein, Fluorescein-5-isothiocyanat (FITC), 7-Diethylaminocumarin-3-carbonsäure, Tetramethylrhodamin-5-(und-6)-isothiocyanat, 5-(und-6)-Carboxytetramethylrhodamin, 7-Hydroxycumarin-3-carbonsäure, 6-[Fluorescein 5-(und-6)-carboxyamido]hexansäure, N-(4,4-Difluor-5,7-dimethyh4-bora-3a,4a-diaza-3-indacenproprionsäure, Eosin-5-isothiocyanat, Erythrosin-5-isothiocyanat, Phycoerythrin (B-, R- oder Cyanin-), Allophycocyanin, Oregon Green^TM und Cascade^TM Blau-Acetylazid (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
Die Antikörper können auch mit Halbleiter-Nanokristallen markiert werden. Wasserlösliche Nanokristalle sind zusammengesetzt aus unterschiedlichen Größen von Cadmiumselenid/Cadmiumsulfid-Kern-Hülle-Nanokristallen, eingeschlossen in eine Silika-Hülle, oder Cadmiumselenid/Zinksulfid-Nanokristalle, gelöst in Mercaptoessigsäure. Solche wasserlöslichen Nanokristalle haben ein enges, abstimmbares, symmetrisches Emissionsspektrum und sind photometrisch stabil. Siehe, Bruchez Jr. et al., Science, 1998, 281:2013-2016 und Chan et al., Science, 1998, 281:2016-2018.
NACHWEIS VON MEHREREN ANTIGENEN UND WIRTS-ANTIKÖRPER
Eine Kombination von Markierungen wie Oregon Green^TM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), Phycoerythrin und Cyanin-Phycoerythrin können für den Nachweis von unter anderem zwei Antigenen und einem Wirts-Antikörper verwendet werden. Zum Beispiel können HCV, HBV-Oberflächenantigen, Wirt-anti-HCV-Antikörper und Wirt-anti-HBV-Oberflächenantigen-Antikörper gleichzeitig nachgewiesen werden durch die Verwendung der Phycoerythrin-markierten Antikörper mit spezifischen Bindeaffinitäten für HCV, der Oregon Green^TM-markierten Antikörper mit spezifischen Bindeaffinitäten für das HBV-Oberflächenantigen und der Cyanin-Phycoerythrin-markierten anti-Wirts-Ig-Antikörper. Die Verwendung von drei unterschiedlichen Markierungen und zwei Teilchenpopulationen mit unterschiedlichen Größen (z.B. durchschnittlicher Durchmesser von 7-8 μm und 10-11 μm) erlaubt den gleichzeitigen Nachweis von bis zu 6 verschiedenen Virus-Antigenen und Wirts-Antikörpern. Die Verwendung einer dritten Teilchenpopulation mit einem unterschiedlichen durchschnittlichen Durchmesser erlaubt den Nachweis von bis zu 9 verschiedenen Virus-Antigenen und Wirts-Antikörpern.
Sobald ein Individuum serokonvertiert ist (es hat z.B. Wirts-Antikörper entwickelt) können Virus-Antigene in Plasmaproben schwer nachgewiesen werden, da die Bindungsstellen für die Einfang- oder Reporter-Antikörper auf dem Viruspartikel durch den Wirts-Antikörper blockiert sind. Die vorliegende Erfindung bewältigt diese Schwierigkeiten durch die verbesserte Sensitivität des Tests gegenüber herkömmlichen Immuntestausführungen. Daher kann mit den vorliegenden Verfahren ein Virus-Antigen in Situationen nachgewiesen werden, in denen herkömmliche Immuntestausführungen dies nicht können. Wie hierin beschrieben, können Virus-Antigene durch Teilchen eingefangen werden, die mit monoclonalen Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für das Virusprotein beschichtet sind, und ihr Vorkommen kann mit monoclonalen Reporter-Antikörpern, die gegen das Virus-Antigen gerichtet sind, in seropositiven Individuen nachgewiesen werden. Der Wirts-Antikörper gegen das Virusprotein kann gleichzeitig unter Verwendung eines markierten Ziege-anti-menschliches-Ig nachgewiesen werden. Der Nachweis des Virusproteins ohne Wirts-Antikörper weist darauf hin, dass sich der Wirt erst kürzlich infiziert hat und noch nicht serokonvertiert ist, wohingegen der Nachweis des Virusproteins und des Wirts-Antikörpers auf die Anwesenheit der Infektion sowie die Serokonversion hinweist. In bestimmten Proben kann vielleicht der Wirts-Antikörper, aber nicht das Virusprotein nachgewiesen werden, wenn zum Beispiel die Bindungsstellen für den ersten Antikörper nicht zugänglich sind. Obwohl in diesem Fall die Virusproteine nicht direkt gemessen werden, sind die Virusproteine dennoch in der Probe vorhanden, da das Antikörper-beschichtete Einfang-Kügelchen, welches gegen das Virus-Antigen gerichtet ist, den Immunkomplex aus Virus-Antigen und Wirts-Antikörper einfängt.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben, die den in den Ansprüchen beschriebenen Schutzbereich der Erfindung nicht einschränken.
BEISPIEL 1 – BIOTINYLIERUNG VON PROTEINEN
Die Antikörper wurden in einer Konzentration von 5 mg/ml konjugiert; die Virus-Antigene wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml konjugiert. Um die Anti-Virusprotein-Antikörper und die Virus-Antigene mit Biotin zu markieren, wurden die Proteine unter Verwendung eines Centricon (Amicon)-Filters der entsprechenden Größe in 100 mM KH₂CO₃-Puffer (pH 8,3) umgepuffert.
Biotin-N-Hydroxysuccinimidylester (Molecular Probes, Eugene, OR) in DMSO (10 mg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Cat. #D8779) wurde kurz vor Gebrauch hergestellt und zu dem zu biotinylierenden Protein in einem Molverhältnis von 5:1 oder 10:1 gegeben. Die Reaktionen wurden ausgeführt durch leichtes Verwirbeln der Proteinlösung, Hinzufügen des Biotin/DMSO zur Proteinlösung und gründliches Mischen. Protein und Biotinester wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln umgesetzt. Das konjugierte Protein wurde von freiem Biotin getrennt, indem es mittels einer 10 ml Sephadex-25-Gelsäule oder einer Spinsäule aufgetrennt wurde, dabei wurde für die Elution 1 × PBS verwendet. Einzelne 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt und die Extinktion bei A280 nm gemessen. Fraktionen, die den Anfangs-Peak von A280 ausmachten, wurden gesammelt und vereinigt, während die verbleibenden Fraktionen einschließlich jene, die den zweiten A280-Peak ausmachten, verworfen wurden.
Bei der Verwendung von Spinsäulen wurde das Reaktionsgemisch gleichmäßig auf vier Spinsäulen verteilt und mittels einer Serofuge-Zentrifuge auf höchster Geschwindigkeit für die Dauer von 2 Minuten zentrifugiert. Das Material, welches durch die Säule hindurchgelaufen war, wurde gesammelt. Dann wurden die Säulen gewaschen, indem die Säulen mit 1 × PBS befüllt und in einer Serofuge für die Dauer von 2 Minuten bei der höchsten Geschwindigkeit zentrifugiert wurden. Dies wurde fünfmal wiederholt. Das gesammelte Material wurde wieder auf die vier Säulen verteilt und dann unter Verwendung der Serofuge-Zentrifuge für die Dauer von 2 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert. Das Material, welches durch die Säule hindurchgelaufen war, wurde gesammelt, vereinigt und wieder hinsichtlich A280 analysiert und die Konzentration bestimmt. Das konjugierte Protein wurde bei 4°C aufbewahrt.
BEISPIEL 2 – HERSTELLUNG VON ANALYT-EINFANG-KÜGELCHEN
Analyt-Einfang-Kügelchen wurden hergestellt durch vollständiges Resuspendieren von Avidin-beschichteten paramagnetischen Kügelchen (7 μm, Spherotech, VM-60-100) und gutem Durchmischen. Die Kügelchen (normalerweise 3,8 × 10⁶ Kügelchen) wurden in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen gegeben und mit 30 ml 1 × PBS gemischt. Während die Kügelchen mit Magneten auf der Seite des Röhrchens zurückgehalten wurden, wurde das gesamte PBS entfernt. Die Kügelchen wurden zwei weitere Male mit PBS gewaschen.
Nach dem letzten PBS-Waschgang, wurde das erforderliche Volumen des biotinylierten Antikörpers (normalerweise 40 μg) und 2 ml 1 × PBS zu den Kügelchen gegeben. Die Kügelchen wurden durch fortlaufendes Verwirbeln für die Dauer von mindestens 3 Stunden resuspendiert oder durch Verwirbeln für die Dauer von einer Stunde gefolgt von der Aufbewahrung über Nacht bei 4°C. Die Kügelchen, die über Nacht aufbewahrt worden waren, wurden am nächsten Morgen für weitere 2 Stunden verwirbelt. Ungefähr 30 ml eines Puffers, der 1 % FCS und 0,1 % NaN₃ in PBS enthält, wurden verwendet, um die konjugierten Kügelchen dreimal zu waschen. Die Kügelchen wurden in 19,25 ml des gleichen Puffers resuspendiert und bei 4°C bis zu ihrer Verwendung aufbewahrt.
Um die Antikörper mit dem Fluorescein-Abkömmling Oregon Green^TM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) zu markieren, wurden die Antikörper in 100 mM KH₂CO₃-Puffer (pH 9,0) in einer Konzentration von 5 mg/ml umgepuffert. Oregon Green^TM (10 mg/ml in Dimethylformamid, DMF) wurde zu dem Antikörper in einem Molverhältnis von 25:1 gegeben und für die Dauer von einer Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Freies Oregon Green^TM wurde auf einer G-25-Sephadex-Säule vom Antikörper getrennt. R-Phycoerythrin (PE, Intergen BioDiagnostics, Purchase, NY) und Cyanin-Phycoerythrin (Cy5PE)-Konjugate wurden unter Verwendung von 2-Iminothiolan (Pierce Chemicals Co., Rockford, IL) in einem Molverhältnis von 1625:1 hergestellt, um die Fluorochrome zu modifizieren, und Sulfo-SMCC (Pierce) in einem Molverhältnis von 20:1, um den Antikörper zu modifizieren. Die modifizierten Fluorochrome und der Antikörper wurden zusammen für die Dauer von einer Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Freie Fluorochrome und Antikörper wurden vom Fluorochrom-konjugierten Antikörper auf einer Sephacryl S-300-HR Säule (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) getrennt. Ziege-F(ab')₂-anti-menschliches Ig-Antiserum (schwere und leichte Kette spezifisch), affinitätsgereinigt und gegen Maus-, Pferd-, Rind-, Ratte- und Kaninchen-Antikörper absorbiert, wurde mit PE oder Cy5-PE markiert. Abänderungen im Verhältnis von Fluorochrom zu Protein können gemacht werden, um das Fluoreszenzsignal für einen bestimmten Antikörper oder ein bestimmtes Virus-Antigen zu optimieren.
BEISPIEL 3 – NACHWEIS VON VIRUS-ANTIGENENEN UND WIRTS-ANTIKÖRPER
Plasmaproben von normalen Individuen und von HCV-, HIV- oder HBV-positiven Individuen wurden bezogen von New York Biologicals (Southampton, NY), Scantibodies Laboratory (Santee, CA) oder Intergen BioDiagnostics (Purchase, NY). Die Plasmaproben wurden mit dem Detergens Triton-X 100, mit einer Endkonzentration von 0,5%, behandelt, um die Virusmembranen zu lysieren und die Kapsidpartikel vor dem Testen freizulegen. Von E. coli stammende, rekombinante Virus-Antigene, einschließlich Oberflächen- und Kapsidantigene, wurden von BiosPacific (Emeryville, CA) oder Intergen BioDiagnostics bezogen. Die Antigene wurden zu normalen, nicht-pathologischen Serumproben gegeben, um eine Vergleichsstandardkurve zu entwickeln und für den Gebrauch bei Einsatz/Wiedergewinnungs-Analysen.
Eine durchflusscytometrische Analyse wurde mit einem Coulter EPICS Profile II, einem COULTER XL oder einem Partec PAS-Durchflusscytometer durchgeführt, dabei wurde eine Vorwärts- vs. Seitenlichtstreuung verwendet, um die Kügelchenpopulation zu steuern. Die Fluoreszenzsignale wurden logarithmisch verstärkt. Die Fluoreszenzemissionen wurden durch optische Filter in die einzelnen Farben aufgespalten. Ein 525 nm-Bandpassfilter wurde verwendet, um die grüne Fluoreszenz (Oregon Green und FITC), ein 565 nm Bandpassfilter, um die orangene Fluoreszenz (PE) und ein 630 nm langer Passfilter, um die rote Fluoreszenz (Cy5PE) zu bündeln.
Die Proben wurden mit PE- und Cy5PE-markiertem F(ab')-Ziege-anti-menschliches Ig (schwere und leichte Kette spezifischem) Antikörper inkubiert. In jedem Fall wurden mit dem eingefangenen Antigen Wirt-anti-Virus-Antikörper auf den Kügelchen nachgewiesen, nur nicht auf den Kügelchen von normalen Proben oder einem fehlerhaften Virus. HBV-Oberflächenantigen und Anti-HBV-Antikörper sowie HCV-Kapsidantigen und Anti-HCV-Antikörper wurden unter Verwendung eines PE-markierten Antikörpers mit spezifischer Bindeaffinität für das HCV-Kapsidantigen, eines Oregon Green-markierter Antikörpers mit einer spezifischen Bindeaffinität für das HBV-Oberflächenantigen und eines Cy5PE-markierter Ziege-anti-menschliches Ig-Antikörpers nachgewiesen. Wie in den 2A–2H gezeigt, war der einzelne und der gleichzeitige Nachweis von HCV, HBV und Wirts-Antikörper möglich.

Claims

Verfahren zum gleichzeitigen Messen beider Partner A und B eines Bindepaares in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Bereitstellen eines Festphasenreagenzes, wobei das Festphasenreagenz ein Teilchen umfasst, das mit Einfang-Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A des Bindepaares beschichtet ist; (b) das Inkontaktbringen der biologischen Probe mit dem Festphasenreagenz unter Bedingungen, unter denen der Partner A, wenn er vorhanden ist, an das Teilchen gebunden wird, um ein erstes reagiertes Teilchen auszubilden; (c) das Inkontaktbringen des ersten reagierten Teilchens mit ersten Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A, wobei die ersten Antikörper mit einer ersten Markierung markiert sind, und mit zweiten Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner B des Bindepaares, wobei die zweiten Antikörper mit einer zweiten Markierung markiert sind, die unterschiedlich zu der ersten Markierung ist, um ein zweites reagiertes Teilchen auszubilden, und (d) das Messen der ersten und zweiten Markierung auf dem zweiten reagierten Teilchen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei im Wesentlichen alle Einfang-Antikörper so auf dem Teilchen angeordnet sind, dass die Antigen-bindenden Regionen der Einfang-Antikörper für das Binden des Partners A des Bindepaares zugänglich sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Partner A ein Antigen und der Partner B ein Wirts-Antikörper ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Antigen ein virales Antigen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei das virale Antigen ein Hepatitis C-Antigen, ein Hepatitis B-Antigen oder ein menschliches Immunschwäche-Virus-Antigen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Antigen ein Autoantigen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Autoantigen Glutaminsäure-Decarboxylase ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Partner A ein Ligand und der Partner B ein Rezeptor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Ligand ein Cytokin und der Rezeptor ein Cytokin-Rezeptor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Partner A ein Enzym und der Partner B ein Substrat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Enzym Caspase-3 und das Substrat Poly(ADP-Ribose)-Polymerase ist oder wobei das Enzym Caspase-1 und das Substrat Pro-Interleukin-1 ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die ersten und zweiten Markierungen Fluorophore sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Blut, Plasma, Serum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, Sputum, Tränen, amniotischer Flüssigkeit, Glaskörper-Humor, Speichel und Gewebekultur-Überstände.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Einfang-Antikörper monoclonal sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die ersten Antikörper monoclonal sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die zweiten Antikörper monoclonal sind.
Kit zum gleichzeitigen Messen von beiden Partnern A und B eines Bindepaars in einer biologischen Probe, wobei der Kit umfasst: (a) ein Festphasenreagenz, wobei das Festphasenreagenz ein Teilchen umfasst, das mit Einfang-Antikörpern mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A des Bindepaares beschichtet ist, wobei im Wesentlichen alle Einfang-Antikörper so auf dem Teilchen angeordnet sind, dass die Antigen-bindenden Regionen der Einfang-Antikörper für das Binden des Partners A des Bindepaares zugänglich sind; (b) erste Antikörper mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner A des Bindepaares, wobei die ersten Antikörper mit einer ersten Markierung markiert sind; und (c) zweite Antikörper mit spezifischen Bindeaffinitäten für den Partner B des Bindepaares, wobei die zweiten Antikörper mit einer zweiten Markierung markiert sind, die unterschiedlich ist zu der ersten Markierung.
Kit gemäß Anspruch 17, wobei der Kit ferner ein Etikett oder einen Beipackzettel umfasst, wobei das Etikett oder der Beipackzettel anzeigt, dass das Festphasenreagenz, die ersten Antikörper und die zweiten Antikörper für das gleichzeitige Messen beider Partner A und B eines Bindepaares in einer biologischen Probe mittels Durchflusscytometrie verwendet werden können.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Messen der ersten und zweiten Markierungen auf dem reagierten Teilchen mittels Durchflusscytometrie geschieht.