ES2275528T3 - Metodos para detectar simultaneamente ambos miembros de un par de union. - Google Patents
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Abstract
Un método para medir simultáneamente ambos miembros A y B de un par de unión en una muestra biológica, cuyo método comprende: a) proporcionar un reactivo en fase sólida, comprendiendo dicho reactivo en fase sólida una partícula revestida con anticuerpos de captura que tienen actividades de unión específicas por dicho miembro A de dicho par de unión, b) poner en contacto dicha muestra biológica con dicho reactivo en fase sólida en condiciones en las que dicho miembro A, si está presente, resulta unido a dicha partícula, para formar una primera partícula reaccionda; c) poner en contacto dicha primera partícula reaccionada con primeros anticuerpos que tienen afinidades de unión específicas por dicho miembro A, en los que dichos primeros anticuerpos están marcados con una primera marca, y con segundos anticuerpos que tienen afinidades de unión específicas por dicho miembro B de dicho par de unión, en los que dichos segundos anticuerpos están marcados con una segunda marca, que es diferente de dicha primera marca, para formar una segunda partícula reaccionada, y d) medir dichas primera y segunda marcas en dicha segunda partícula reaccionada.
Description
Métodos para detectar simultáneamente ambos
miembros de un par de unión.
La invención se refiere a métodos para detectar
simultáneamente ambos miembros de un par de unión en una muestra
biológica.
Debe examinarse rutinariamente en productos
sanguíneos usados para transfusión y transferencia de componentes
de la sangre la presencia de agentes infecciosos tales como el virus
de la inmunodeficiencia humana (HIV), virus de hepatitis, virus
linfocitotrópico T humano y citomegalovirus. Tales agentes se
detectan típicamente por identificación de antígenos víricos o por
detección de una respuesta inmune al virus (es decir, anticuerpos
anti-víricos derivados del hospedante) usando
análisis de inmunoensayo de enzimas (EIA) o radioinmunoensayos
(RIA). Las técnicas de inmunoensayos se limitan en su capacidad a
detectar la presencia de contaminantes víricos en fases tempranas
de infección, variando el período de incertidumbre entre infección
con un virus y detección por técnicas de inmunoensayo de dos a
cuatro semanas para HIV y hasta aproximadamente 10 semanas para
virus de la hepatitis C (HCV). Técnicas tales como reacción de
cadena de transcriptasa inversa polimerasa (RT-PCR)
o análisis de ADN de cadena ramificada pueden acortar el período de
tiempo entre infección y detección, pero son de coste prohibitivo
para usarse en base a un donante individual y no eliminan el período
de incertidumbre.
El documento
EP-A-0 595 211 describe un método
para determinar simultáneamente un antígeno de un agente causante y
un anticuerpo dirigido contra este agente causante pero no dicho
antígeno. El método comprende la unión del antígeno y anticuerpo a
receptores R1 y R2, respectivamente, unidos ambos a una fase sólida
y la detección del antígeno y anticuerpo uniéndose a receptores R3
y R4, respectivamente, para ellos, estando marcados ambos con una
misma marca. La Patente de los EE.UU. Nº 5.627.026 describe un
método para detectar simultáneamente un antígeno y un anticuerpo en
una muestra biológica. El método incluye poner en contacto un
sustrato sólido que contiene una primera posición revestida de
anticuerpo y una segunda posición revestida de antígeno con una
muestra biológica y una mezcla de antígeno marcado y anticuerpo
marcado y determinar si está presente una marca en la posición
apropiada en el sustrato sólido.
La invención se basa en un método rápido y
sensible para detectar simultáneamente ambos miembros de un par de
unión, tales como un ligando y receptor o un antígeno y anticuerpo
de hospedante, de una muestra biológica. Los métodos de la
invención pueden, por ejemplo, aumentar la capacidad para detectar
infecciones en una fase temprana, conduciendo a un tratamiento más
temprano de la infección.
La invención presenta un método para medir
simultáneamente ambos miembros A y B de un par de unión en una
muestra biológica. La muestra biológica se selecciona del grupo
constituido por sangre, plasma, suero, orina, fluido
cerebroespinal, esputo, lágrimas, fluido amniótico, humor vítreo,
saliva y sobrenadantes de cultivo de tejidos. El método incluye
proporcionar un reactivo en fase sólida, que incluye una partícula
revestida con anticuerpos de captura que tienen afinidades de unión
específicas por el miembro A del par de unión, y poner en contacto
una muestra biológica con el reactivo en fase sólida en condiciones
en las que el miembro A, si está presente, resulta unido a la
partícula, para formar una primera partícula reaccionada. Los
anticuerpos de captura pueden ser monoclonales. La primera
partícula reaccionada se pone en contacto con primeros anticuerpos
que tienen afinidades de unión específicas por el miembro A, en los
que los primeros anticuerpos están marcados con una primera marca,
y con segundos anticuerpos que tienen afinidades de unión
específicas por el miembro B del par de unión, en los que los
segundos anticuerpos están marcados con una segunda marca, que es
diferente de dicha primera marca, para formar una segunda partícula
reaccionada. Los primeros y segundos anticuerpos pueden ser
monoclonales. Se miden la primera y segunda marcas (por ejemplo,
fluoróforos) en la segunda partícula reaccionada usando citometría
de
flujo.
flujo.
En ciertas realizaciones, sustancialmente todos
los anticuerpos de captura están orientados en la partícula de tal
modo que las regiones de unión de antígeno de los anticuerpos de
captura están disponibles para unirse al miembro A del par de
unión.
El miembro A del par de unión puede ser, por
ejemplo, un antígeno y el miembro B puede ser un anticuerpo del
hospedante. El antígeno puede ser un antígeno vírico tal como
antígeno de hepatitis C, un antígeno de hepatitis B o un antígeno
de virus de la inmunodeficiencia humana, o un autoantígeno tal como
descarboxilasa de ácido glutámico. El miembro A del par de unión
puede ser también un ligando, tal como una citoquina, y el miembro
B puede ser un receptor, tal como un receptor de citoquina. Además,
el miembro A puede ser una enzima y el miembro B puede ser un
sustrato. Por ejemplo, la enzima puede ser caspasa-3
o caspasa-1, y el sustrato puede ser polimerasa
poli(ADP-ribosa) o
proInterleuquina-1, respectivamente.
La invención presenta también un juego para
medir simultáneamente ambos miembros A y B de un par de unión en
una muestra biológica. El juego incluye un reactivo en fase sólida,
que incluye una partícula revestida con anticuerpos de captura que
tienen afinidades de unión específicas por el miembro A del par de
unión; primeros anticuerpos que tienen afinidades de unión
específicas por el miembro A del par de unión, en los que los
primeros anticuerpos están marcados con una primera marca; y
segundos anticuerpos que tienen afinidades de unión específicas por
el miembro B del par de unión, en los que los segundos anticuerpos
están marcados con una segunda marca, que es diferente de dicha
primera marca. Sustancialmente todos los anticuerpos de captura
están orientados en la partícula de tal modo que las regiones de
unión de antígeno de los anticuerpos de captura están disponibles
para unirse al miembro A del par de unión. El juego puede incluir
además una marca o inserto de paquete, que indica que el reactivo
en fase sólida, los primeros anticuerpos marcados y los segundos
anticuerpos marcados pueden usarse para medir simultáneamente ambos
miembros A y B de un par de unión en una muestra biológica por
citometría de flujo.
Salvo definición en contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo
significado que el que se entiende comúnmente por un experto
ordinario en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque
pueden usarse para practicar la invención métodos y materiales
similares o equivalentes a los descritos aquí, se describen después
métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto con
publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias
mencionadas aquí, mandará la presente memoria descriptiva,
incluyendo definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos
son sólo ilustrativos, y no pretenden ser limitativos.
Otros aspectos y ventajas de la invención se
evidenciarán a partir de la siguiente descripción y las
reivindicaciones.
La Figura 1 es una representación esquemática de
un ensayo para detectar el miembro A y un anticuerpo
anti-miembro A del hospedante (miembro B).
Las Figuras 2A-2H son
dispersogramas que indican la detección simultánea de antígeno
superficial de virus de la hepatitis B (HBV), anticuerpo
anti-HBV del hospedante, antígeno de núcleo de HCV,
y anticuerpo anti-HCV del hospedante por citometría
de flujo. La Figura 2A es antígeno y anticuerpo de HBV en una
muestra normal. La Figura 2B es antígeno y anticuerpo de HCV en una
muestra normal. La Figura 2C es es antígeno y anticuerpo de HBV en
una muestra positiva en HBV. La Figura 2D es antígeno y anticuerpo
de HCV en una muestra positiva en HBV. La Figura 2E es antígeno y
anticuerpo de HBV en una muestra positiva en HCV. La Figura 2F es
antígeno y anticuerpo de HCV en una muestra positiva en HCV. La
Figura 2G es antígeno y anticuerpo de HBV en una muestra positiva
en HBV/positiva en HCV. La Figura 2H es antígeno y anticuerpo de HCV
en una muestra positiva en HBV/positiva en HCV.
En general, la invención usa un método de
inmunoensayo sándwich para detectar simultáneamente ambos miembros
de un par de unión en una muestra biológica. Los pares de unión
incluyen cualquier combinación de moléculas que forma un complejo,
incluyendo pares compuestos por ácidos nucleicos, proteínas o una
molécula pequeña y una proteína. Los pares de ácidos nucleicos
pueden ser pares ADN:ARN o pares ADN:ADN. Por ejemplo, puede usarse
un par de unión ADN/ARN tal como un ADN de cadena sencilla (ss) y un
mARN como sistema de detección de producto de PCR. Puede usarse un
par de unión ADN/ADN tal como un ssADN y un ADN vírico en un ensayo
de competencia para cuantificar un virus por ADN multiplicado.
Los ejemplos no limitativos de pares de unión de
proteína, o una molécula pequeña y proteína, incluyen una hormona,
una citoquina, un péptido, un fármaco, una proteína vírica u otro
antígeno y un receptor cognado o anticuerpo del hospedante. Los
pares de unión proteína vírica/receptor pueden ser, por ejemplo,
gp120 de HIV y CD4 soluble. Los pares de unión fármaco y receptor
de fármaco pueden ser, por ejemplo, cocaína y un receptor de
dopamina. Los pares de unión péptido y receptor de péptido pueden
ser, por ejemplo, acetilcolina y un receptor muscarínico o dopamina
y un receptor de dopamina. Los pares de unión hormona y receptor de
hormona pueden ser, por ejemplo, insulina y receptor de insulina.
Los pares de unión citoquina y receptor de citoquina pueden ser,
por ejemplo, factor de necrosis de tumores (TNF) y un receptor de
TNF Tipo I o Tipo 2 o interleuquina 2 (IL-2) y
receptor de IL-2. Los pares antígeno y anticuerpo
pueden ser, por ejemplo, una proteína vírica y un anticuerpo
anti-proteína vírica o un autoantígeno y un
anticuerpo anti-autoantígeno del hospedante. p24 de
HIV/anticuerpo anti-HIV humano, gp120 de
HIV/anticuerpo anti-gp120 de HIV humano, antígeno
superficial de HBV/antígeno superficial anti-HBV
humano, y proteína de núcleo de HCV/anticuerpo
anti-núcleo de HCV humano son ejemplos de pares de
unión proteína vírica y anticuerpo del hospedante. Un par de unión
autoantígeno y anticuerpo anti-autoantígeno del
hospedante puede ser, por ejemplo, descarboxilasa de ácido glutámico
(GAD) y anticuerpo anti-GAD del hospedante.
Otros pares de unión de proteína que pueden
detectarse son pares de unión de enzima y sustrato de enzima. Por
ejemplo, el par enzima/sustrato puede ser
caspasa-3/polimerasa
poli(ADP-ribosa) o
caspasa-1/proInterleuquina-1.
El miembro A, que puede ser cualquier miembro
del par de unión, es capturado con un reactivo en fase sólida que
es una partícula revestida con anticuerpos de captura que tienen
afinidades de unión específicas por el miembro A. Por ejemplo, si
el par de unión a detectar simultáneamente es gp120 de
HIV/anticuerpo anti-gp120 de HIV del hospedante, la
partícula puede revestirse con anticuerpos que tienen afinidades de
unión específicas por gp120 de HIV o
anti-inmunoglobulina (Ig) del hospedante.
El miembro A se captura poniendo en contacto una
muestra biológica con la partícula revestida con anticuerpos de
captura. Según se usa aquí, las muestras biológicas adecuadas
contienen células o material celular, e incluyen, por ejemplo,
sangre, plasma, suero, orina, saliva, esputo, lágrimas, fluido
amniótico, humor vítreo y fluido cerebroespinal. Otras muestras
pueden incluir medio de cultivo de tejidos in
vitro/sobrenadantes. Las muestras biológicas pueden tratarse
con un detergente no iónico tal como 0,5% de
Triton-X 100 o Nonidet P40 (Sigma Chemical Company,
St. Louis, MO) para exponer antígenos de núcleo de patógenos.
El reactivo en fase sólida y la muestra
biológica se ponen en contacto en condiciones que facilitan la unión
del miembro A, si está presente, a la partícula, para formar una
primera partícula reaccionada. Tales condiciones pueden incluir el
uso de un tampón que contiene 1% de suero de bovino fetal (FBS) y
0,1% de azida sódica en solución salina tamponada con fosfato (PBS)
a temperatura ambiente, o el uso de cualquier fluido biológico, en
condiciones de pH fisiológico. La primera partícula reaccionada se
pone después en contacto con dos grupos de anticuerpos marcados (es
decir, anticuerpos informadores) para formar una segunda partícula
reaccionada. Los primeros anticuerpos tienen afinidades de unión
específicas por el miembro y se marcan con una primera marca. Los
primeros anticuerpos son capaces de unirse al miembro A mientras el
miembro A está unido a anticuerpos de captura. Así, los anticuerpos
de captura y los primeros anticuerpos deben trabajar como un par.
Los segundos anticuerpos tienen afinidades de unión específicas por
el miembro B del par de unión y se marcan con una segunda marca. Son
particularmente útiles en este método anticuerpos marcados
fluorescentemente.
La Figura 1 proporciona un esquema de un ensayo
para detectar el miembro A y el anticuerpo
anti-miembro A del hospedante. En esta realización,
anticuerpos de captura biotinados tienen afinidades de unión
específicas por el miembro A y están acoplados a perlas de captura
de antígeno mediante avidina. Los primeros anticuerpos tienen
afinidades de unión específicas por el miembro A y están marcados
con ficoeritrina (primera marca). Los segundos anticuerpos están
marcados con cianina-ficoeritrina (segunda marca) y
tienen afinidades de unión específicas por la Ig del hospedante
(miembro B). La primera partícula reaccionada incluye el miembro A,
los anticuerpos anti-miembro A del hospedante,
anticuerpos de captura y el reactivo en fase sólida (por ejemplo,
perlas de captura de antígeno), en la que la segunda partícula
reaccionada incluye la primera partícula reaccionada y los dos
anticuerpos marcados.
Puede usarse citometría de flujo para medir la
cantidad de marca en la segunda partícula reaccionada. Según se usa
aquí, el término "medir" se refiere a mediciones cualitativas y
cuantitativas. En otras palabras, el término "medir" incluye
informar de la presencia o ausencia de marca en la segunda partícula
reaccionada, así como determinar la cantidad de marca presente. Los
citómetros de flujo son capaces de medir al menos tres intervalos
de longitud de onda de emisión de fluorescencia discretos usando
filtros ópticos para dividir la emisión fluorescente y separar
tubos fotomultiplicadores para amplificar las señales de emisión
individuales. La intensidad de emisión fluorescente asociada con
las partículas es directamente proporcional a la concentración de
analito presente en la muestra biológica. Así, el uso de diferentes
colorantes con diferentes espectros de emisión, en los que cada
colorante está acoplado a un anticuerpo diferente, permite el
análisis de analitos múltiples por población de partículas. El
citómetro de flujo puede distinguir también partículas de diferentes
tamaños de tal modo que una partícula, de por ejemplo
aproximadamente 7 \mum de diámetro, puede diferenciarse de una
partícula de aproximadamente 10 \mum de diámetro. Por tanto,
pueden detectarse componentes adicionales usando una combinación de
colorantes fluorescentes múltiples y dos o tres poblaciones de
partículas de diferentes diámetros medios.
Pueden producirse mediante métodos estándares
anticuerpos que tienen afinidades de unión específicas por el
miembro A o el miembro B. Alternativamente, pueden estar disponibles
comercialmente anticuerpos, por ejemplo, de BiosPacific
(Emeryville, CA), Coulter (Hialeah, FL), Maine Biotechnology Service
(Portland, ME) o Biodesign International (Kennebunk, ME). Según se
usan aquí, los términos "anticuerpo" o "anticuerpos"
incluyen moléculas intactas así como fragmentos de ellas que sean
capaces de unirse a un determinante epitópico en el miembro A o el
miembro B. El término "epítope" se refiere a un determinante
antígeno o un antígeno al que se une al parátopo de un anticuerpo.
Los determinantes epitópicos consisten usualmente en agrupamientos
superficiales activos químicamente de moléculas tales como
aminoácidos o cadenas secundarias de azúcares, y tienen típicamente
tres características estructurales dimensionales específicas, así
como características de carga específicas. Los epítopes tienen
generalmente al menos cinco aminoácidos contiguos. Así, los términos
"anticuerpo" y "anticuerpos" incluyen anticuerpos
policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o
quiméricos, fragmentos de anticuerpos Fv de cadena sencilla,
fragmentos Fab y fragmentos F(ab)_{2}. Son
particularmente útiles anticuerpos monoclonales.
En general, una proteína de interés se produce
recombinantemente, por síntesis química o por purificación de la
proteína nativa, y se usa después para inmunizar animales. Pueden
inmunizarse por inyección de la proteína de interés diversos
animales hospedantes, incluyendo, por ejemplo, conejos, pollos,
ratones, cobayas y ratas. Pueden usarse coadyuvantes para aumentar
la respuesta inmunológica dependiendo de las especies hospedantes e
incluyen coadyuvante de Freund (completo e incompleto), geles
minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias
tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos,
polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa
ojo de cerradura (KLH) y dinitrofenol. Los anticuerpos policlonales
son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos que son
específicas para un antígeno particular, que están contenidas en
los sueros de los animales inmunizados. Los anticuerpos
monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un
epítope particular contenido dentro de un antígeno, pueden
prepararse usando tecnología de hibridomas estándar. En particular,
pueden obtenerse anticuerpos monoclonales por cualquier técnica que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por linajes
celulares continuos en cultivo tal como se describe por Kohler, G.
et al., Nature, 1975, 256:495, la técnica de
hibridomas de células B humanas (Kosbor et al., Immunology
Today, 1983, 4:72; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1983, 80:2026) y la técnica de hibridomas EBV (Cole et
al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R.
Liss, Inc., 1983, págs. 77-96). Tales anticuerpos
pueden ser cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM,
IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de ellas. El hibridoma que
produce los anticuerpos monoclonales de la invención puede
cultivarse in vitro o in vivo.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en la
que diferentes porciones se derivan de diferentes especies de
animales, tales como las que tienen una región variable derivada de
un anticuerpo monoclonal de ratón y una región constante de
inmunoglobulina humana. Pueden producirse anticuerpos quiméricos
mediante técnicas estándares.
Pueden generarse por técnicas conocidas
fragmentos de anticuerpos que tienen afinidad de unión específica
por los miembros A o B. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero
sin limitarse a ellos, fragmentos F(ab')_{2} que pueden
producirse por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, y
fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los puentes
disulfuro de fragmentos F(ab')_{2}. Alternativamente,
pueden construirse genotecas de expresión de Fab. Véase, por
ejemplo, Huse et al., 1989, Science, 246:1275. Se
forman fragmentos de anticuerpo Fv de cadena sencilla enlazando los
fragmentos de cadena pesada y ligera de la región de Fv mediante un
puente de aminoácidos (por ejemplo, 15 a 18 aminoácidos),
produciendo un polipéptido de cadena sencilla. Los fragmentos de
anticuerpo Fv de cadena sencilla pueden producirse mediante técnicas
estándares. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº
4.946.778.
Una vez producidos, se ensaya en los anticuerpos
o fragmentos de ellos el reconocimiento del miembro A o el miembro
B por métodos de inmunoensayo estándares que incluyen, por ejemplo,
técnicas ELISA o RIA. Véase Short Protocols in Molecular
Biology, Capítulo 11, Green Publishing Associates and John Wiley
& Sons, redactado por Ausubel, F.M. et al., 1992. Los
anticuerpos adecuados tienen preferiblemente iguales afinidades de
unión por proteínas recombinantes y nativas.
Alternativamente, pueden valorarse anticuerpos
por su capacidad para formar pares de unión en un ensayo sándwich
fluorescente de la siguiente manera. Pueden revestirse perlas con
anticuerpos biotinados, por ejemplo anticuerpos
anti-proteína vírica, e incubarse después durante
aproximadamente 30 minutos con 2 ng/ml de la proteína apropiada, por
ejemplo, proteína vírica recombinante, en un volumen de 100 \mul.
Después de lavar las perlas dos veces con 2 ml de tampón que
contiene 1% de FBS y 0,1% de azida sódica en PBS, se incuban las
perlas con aproximadamente
0,5 \mug de anticuerpo marcado con ficoeritrina. Son adecuados para uso en ensayos de la invención pares de anticuerpos que produzcan una señal fluorescente fuerte.
0,5 \mug de anticuerpo marcado con ficoeritrina. Son adecuados para uso en ensayos de la invención pares de anticuerpos que produzcan una señal fluorescente fuerte.
Las partículas adecuadas (por ejemplo, perlas)
tienen un diámetro medio de aproximadamente 2 \mum a 15 \mum y
pueden ser poliestireno, ferromagnéticas o paramagnéticas. Por
ejemplo, las partículas pueden tener un diámetro medio de alrededor
de 4 \mum a aproximadamente 11 \mum. Los diámetros de partículas
medios típicos son aproximadamente 4-5 \mum,
7-8 \mum y 10-11 \mum. Están
disponibles comercialmente partículas, por ejemplo, de Spherotech
Inc., Libertyville, IL. Las partículas pueden revestirse con
anticuerpos de captura por técnicas conocidas. Por ejemplo, perlas
paramagnéticas revestidas con avidina o estreptavidina pueden
revestirse con anticuerpos de captura biotinados. En general, se
resuspenden perlas revestidas con avidina o estreptavidina en una
solución salina, tal como PBS, mezclada con anticuerpos biotinados
en condiciones de saturación (aproximadamente 40 \mug de proteína
por 3,9 x 10^{7} perlas de
7 \mum), y se incuban a temperatura ambiente. Después de completarse la unión, se lavan las perlas y se bloquean con, por ejemplo, tampón que contiene 1% de FBS y 0,1% de azida sódica en PBS.
7 \mum), y se incuban a temperatura ambiente. Después de completarse la unión, se lavan las perlas y se bloquean con, por ejemplo, tampón que contiene 1% de FBS y 0,1% de azida sódica en PBS.
Pueden acoplarse perlas revestidas con avidina o
estreptavidina a ácidos nucleicos biotinados cuando se miden pares
de unión de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden estar
marcados con biotina por incorporación de
biotina-11-dUTP en unas reacciones
de traducción de corte estándar.
En realizaciones particulares, sustancialmente
todos los anticuerpos de captura están orientados en la partícula
de tal modo que están disponibles regiones de unión de antígeno para
unirse al miembro A, aumentando la sensibilidad total del ensayo.
La expresión "sustancialmente todos" indica que al menos el 80%
y preferiblemente al menos el 90% (por ejemplo, 95% a 99%) de los
anticuerpos están orientados de esta manera. Puede estimarse
cualitativamente la orientación porcentual midiendo la
fluorescencia asociada con la unión de anticuerpo
anti-ratón de cabra marcado con ficoeritrina, y
comparando con partículas fluorescentes estandarizadas. Están
disponibles regiones de unión de antígeno de anticuerpos para
unirse al miembro A cuando el anticuerpo está biotinado en residuos
de aminoácidos principalmente fuera de la región de unión de
antígeno. Así, durante la biotinación de anticuerpos, se usa una
relación molar de biotina:anticuerpo de alrededor de 5:1 a
aproximadamente 10:1 y otras condiciones de reacción estándares.
Por ejemplo, puede usarse éster de
N-hidroxisuccinimidilo de biotina o éster de
succinimidilo de biotina con un pH de aproximadamente 8,1.
Alternativamente, puede usarse hidrazida de biotina a un pH de
4,5-5,0.
También se aumenta la sensibilidad del ensayo
porque la captura del miembro A de una muestra biológica no está
limitada a volúmenes de reacción de 200 \mul o menos, como en
ensayos tradicionales. Son fáciles de recoger partículas de grandes
volúmenes de muestra biológica por separación magnética o
centrifugación. Además, cada partícula contiene, como media,
aproximadamente 180.000 a 240.000 lugares de unión de anticuerpo, y
aproximadamente 300.000 a 350.000 lugares de unión de antígeno
biotinado por partícula. Así, cada partícula tiene una gran
capacidad de unión y un gran intervalo eficaz de análisis para
concentración de antígeno.
Cada anticuerpo marcado puede visualizarse de
manera distinta marcando con un fluoróforo que emite luz de un
color que contrasta con otros fluoróforos. Por ejemplo, puede usarse
una combinación de los siguientes fluoróforos: ácido
7-amino-4-metilcumarin-3-acético
(AMCA), Texas Red® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), 5-(y
6-)-carboxi-X-rodamina,
lisamina rodamina B, 5-(y 6)-carboxifluoresceína,
5-isotiocianato de fluoresceína (FITC), ácido
7-dietilaminocumarin-3-carboxílico,
5-(y 6)-isotiocianato de tetrametilrodamina, 5-(y
6)-carboxitetrametilrodamina, ácido
7-hidroxicumarin-3-carboxílico,
ácido 6-[fluorescein-5(y
6)-carboxamido]hexanoico, ácido
N-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-3)-indacenopropiónico,
5-isotiocianato de eosina,
5-isotiocianato de eritrosina, ficoeritrina (B-, R-
o cianina-), aloficocianina, Oregon Green® y Cascade® azul
acetilazida (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR).
También pueden marcarse anticuerpos con
nanocristales semiconductores. Los nanocristales solubles en agua
están compuestos por diferentes tamaños de nanocristales de
núcleo-envoltura de
cadmio-selenio/cadmio-azufre
encerrados en una envoltura de sílice o nanocristales de
cadmio-selenio/zinc-azufre
solubilizados en ácido mercaptoacético. Tales nanocristales solubles
en agua tienen un espectro de emisión simétrico, estrecho y
sintonizable y son estables fotométricamente. Véase Bruchez Jr.
et al., Science, 1998, 281:2013-2016 y
Chan et al., Science, 1998,
281:2016-2018.
Puede usarse una combinación de marcas, tales
como Oregon Green® (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR),
ficoeritrina y cianina-ficoeritrina, para detectar,
entre otros, dos antígenos y un anticuerpo del hospedante. Por
ejemplo, pueden detectarse simultáneamente HCV, antígeno
superficial de HBV, anticuerpo anti-HCV del
hospedante y anticuerpo anti-antígeno superficial
de HBV del hospedante usando anticuerpos marcados con ficoeritrina
que tienen afinidades de unión específicas por HCV, anticuerpos
marcados con Oregon Green® que tienen afinidades de unión
específicas por antígeno superficial de HBV y anticuerpos
anti-Ig del hospedante marcados con
cianina-ficoeritrina. La utilización de tres marcas
diferentes y dos poblaciones de partículas que tengan tamaños
diferentes (por ejemplo, diámetros medios de 7-8
\mum y 10-11 \mum) permite detectar
simultáneamente hasta 6 antígenos víricos y anticuerpos del
hospedante diferentes. El uso de una tercera población de partículas
de un diámetro medio diferente permite detectar simultáneamente
hasta 9 antígenos víricos y anticuerpos del hospedante
diferentes.
Puede ser difícil detectar antígenos víricos en
muestras de plasma una vez que un individuo se ha seroconvertido (es
decir, ha desarrollado anticuerpos del hospedante) porque se han
bloqueado por el anticuerpo del hospedante los lugares de unión
para la captura o anticuerpos informadores en la partícula vírica.
La presente invención supera esta dificultad debido a la
sensibilidad mejorada del ensayo sobre formatos de inmunoensayo
tradicionales. Así, puede detectarse antígeno vírico usando los
presentes métodos en situaciones en las que no lo hacen formatos de
inmunoensayos tradicionales. Como se ha descrito aquí, pueden
capturarse antígenos víricos usando partículas revestidas con
anticuerpos monoclonales que tienen afinidades de unión específicas
por la proteína vírica, y detectarse su presencia con anticuerpos
monoclonales informadores dirigidos contra la proteína vírica en
individuos seropositivos. El anticuerpo del hospedante dirigido
contra la proteína vírica puede detectarse simultáneamente mediante
anti-Ig humana de cabra marcado. La detección de
proteína vírica sin anticuerpo del hospedante indica que el
hospedante se infectó recientemente y no se ha seroconvertido,
mientras que la detección de proteína vírica y anticuerpo del
hospedante indica la presencia de infección así como seroconversión.
En ciertas muestras, puede detectarse anticuerpo del hospedante
pero no hay proteína vírica cuando, por ejemplo, no están
disponibles lugares de unión para el primer anticuerpo. Aunque las
proteínas víricas no se miden directamente en este caso, hay aún
presentes proteínas víricas en la muestra, porque la perla de
captura revestida con anticuerpo dirigida contra la proteína vírica
captura el complejo inmune de antígeno vírico y anticuerpo del
hospedante.
La invención se describirá adicionalmente en los
siguientes Ejemplos, que no limitan el alcance de la invención
descrito en las reivindicaciones.
Se conjugaron anticuerpos con una concentración
de 5 mg/ml; se conjugaron antígenos víricos con una concentración
de 1 mg/ml. Para marcar con biotina anticuerpos
anti-proteína vírica y antígenos víricos, se
intercambiaron las proteínas en tampón de KH_{2}CO_{3} 100 mM
(pH 8,3) usando un filtro de tamaño apropiado Centricon
(Amicon).
Se preparó inmediatamente antes de usar éster de
N-hidroxisuccinimidilo de biotina (Molecular Probes,
Eugene, OR) en DMSO (10 mg/ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
Cat. D8779), y se añadió a la proteína a biotinar en una relación
molar 5:1 o 10:1. Se realizaron las reacciones sometiendo a
torbellino la solución de proteína ligeramente, y añadiendo la
biotina/DMSO a la solución de proteína y mezclando a fondo. La
proteína y el éster de biotina se hicieron reaccionar durante una
hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Se separó proteína
conjugada de biotina libre por separación en una columna de gel
Sephadex-25 de 10 ml o una columna de rotación
usando 1X PBS para eluir. Se recogieron fracciones individuales de 1
ml y se midió la absorbancia a A280 nm. Las fracciones que
representaban el pico inicial de A280 se recogieron y agruparon,
mientras que las fracciones restantes, incluyendo las que
representaban el segundo pico de A280, se desecharon.
Cuando se usaron columnas de rotación, la mezcla
de reacción se distribuyó igualmente entre cuatro columnas de
rotación y se hicieron girar usando una centrífuga Serofuge a alta
velocidad durante 2 min. Se recogió el material que pasaba a través
de la columna y se lavaron las columnas llenando la columna con 1X
PBS y haciendo girar a alta velocidad en una Serrofuge durante 2
min y repitiendo cinco veces. El material recogido se redistribuyó
igualmente entre cuatro columnas, y se hizo girar después usando la
centrífuga Serofuge a alta velocidad durante 2 min. Se recogió el
material que pasaba a través de la columna, se agrupó, se reanalizó
A280 y se determinó la concentración. La proteína conjugada se
guardó a 4ºC.
Se prepararon perlas de captura de analita
resuspendiendo completamente perlas paramagnéticas revestidas de
avidina (7 \mum, Spherotech,
VM-60-100) mezclando bien. Se
pusieron perlas (típicamente 3,8 x 10^{6} perlas) en un tubo de
centrífuga de 50 ml y se mezclaron con 30 ml de 1X PBS. Después de
retener perlas en el lado del tubo con imanes, se separó toda la
PBS. Las perlas se lavaron dos veces más con PBS.
Después del lavado final con PBS, se añadió a
las perlas el volumen requerido de anticuerpo biotinado (típicamente
40 \mug) y 2 ml de 1X PBS. Se resuspendieron las perlas sometiendo
a torbellino continuamente durante un mínimo de 3 horas, o
sometiendo a torbellino durante una hora y guardando después durante
la noche a 4ºC. Las perlas guardadas durante la noche se sometieron
a torbellino durante 2 horas más a la mañana siguiente. Se usaron
aproximadamente 30 ml de tampón que contenía 1% de FBS y 0,1% de
NaN_{3} en PBS para lavar las perlas conjugadas tres veces. Se
resuspendieron perlas en 19,25 ml del mismo tampón y se guardaron a
4ºC hasta usar.
Para marcar anticuerpos con el derivado de
fluoresceína Oregon Green® (Molecular Probes, Eugene, OR), se
intercambiaron anticuerpos en tampón de KH_{2}CO_{3} 100 mM (pH
9,0) con una concentración de 5 mg/ml. Se añadió Oregon Green® (10
mg/ml en dimetilformamida, DMF) al anticuerpo en una relación molar
25:1 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, en la
oscuridad. Se separó del anticuerpo Oregon Green® libre en una
columna Sephadex G-25. Se produjeron conjugados de
R-ficoeritrina (PE, Intergen BioDiagnostics,
Purchase, NY) y cianina-ficoeritrina (Cy5PE) usando
2-iminotiolano (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)
en una relación molar 1625:1 para modificar el fluorocromo y
sulfo-SMCC (Pierce) en una relación molar 20:1 para
modificar el anticuerpo. El fluorocromo y el anticuerpo modificados
se incubaron juntos durante 1 hora a temperatura ambiente en la
oscuridad. Se separaron fluorocromo y anticuerpo libres del
anticuerpo conjugado a fluorocromo en columnas Sephacryl
S-300-HR (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO). Se marcó con PE o Cy5-PE antisuero
anti-Ig humana F(ab')_{2} de cabra
(específico de cadena pesada y ligera) purificado por afinidad y
absorbido frente a anticuerpos de ratón, equino, bovino, de rata y
de conejo. Pueden hacerse alteraciones en la relación de fluorocromo
a proteína para optimizar la señal fluorescente para un anticuerpo o
antígeno vírico particular.
Se obtuvieron muestras de plasma de individuos
normales y de individuos positivos en HCV, HIV o HBV de New York
Biologicals (Southampton, NY), Scantibodies Laboratory (Santee, CA)
o Intergen BioDiagnostics (Purchase, NY). Se trataron las muestras
de plasma con detergente Triton-X 100 hasta una
concentración final de 0,5% para lisar membranas víricas y exponer
las partículas de núcleo antes de ensayar. Se obtuvieron antígenos
víricos recombinantes derivados de E. coli, incluyendo
antígenos superficiales y de núcleo, de BiosPacific (Emeryville, CA)
o Intergen BioDiagnostics. Se añadieron antígenos a muestras de
suero normal no patológico para desarrollar una curva patrón de
referencia y para su uso en análisis de punta y recuperación.
El análisis de citometría de flujo se realizó en
un citómetro de flujo Coulter EPICS Profile II, un Coulter XL, o un
Partec PAS, usando un dispersor de luz delantero frente a lateral
lineal para poner compuertas a la población de perlas. La señal de
fluorescencia se amplificó logarítmicamente. Se segregaron las
emisiones de fluorescencia en colores discretos mediante filtros
ópticos. Se usó un filtró de banda de 525 nm para recoger la
fluorescencia verde (Oregon Green y FITC), un filtro de banda de 565
nm para recoger la fluorescencia naranja (PE) y un filtro de paso
largo de 630 nm para recoger la fluorescencia roja (Cy5PE).
Se incubaron muestras con anticuerpo
anti-Ig humana (específica de cadena pesada y
ligera) F(ab')_{2} de cabra marcado con PE y Cy5PE. En
cada caso, se detectaron anticuerpos anti-víricos
del hospedante en perlas con antígeno capturado y no en perlas de
muestras normales o un virus incorrecto. Se detectaron antígeno
superficial de HBV y anticuerpo anti-HBV, así como
antígeno de núcleo de HCV y anticuerpo anti-HCV
usando un anticuerpo marcado con PE que tenía afinidad de unión
específica por antígeno de núcleo de HCV, un anticuerpo marcado con
Oregon Green que tenía actividad de unión específica por antígeno
superficial de HBV y un anticuerpo anti-Ig humana de
cabra marcado con Cy5PE. Como se indica en las Figuras
2A-2H, era posible la detección individual y
simultánea de HCV, HBV y anticuerpo del hospedante.
Claims (19)
1. Un método para medir simultáneamente
ambos miembros A y B de un par de unión en una muestra biológica,
cuyo método comprende:
a) proporcionar un reactivo en fase
sólida, comprendiendo dicho reactivo en fase sólida una partícula
revestida con anticuerpos de captura que tienen actividades de unión
específicas por dicho miembro A de dicho par de
unión,
unión,
b) poner en contacto dicha muestra
biológica con dicho reactivo en fase sólida en condiciones en las
que dicho miembro A, si está presente, resulta unido a dicha
partícula, para formar una primera partícula reaccionada;
c) poner en contacto dicha primera
partícula reaccionada con primeros anticuerpos que tienen afinidades
de unión específicas por dicho miembro A, en los que dichos
primeros anticuerpos están marcados con una primera marca, y con
segundos anticuerpos que tienen afinidades de unión específicas por
dicho miembro B de dicho par de unión, en los que dichos segundos
anticuerpos están marcados con una segunda marca, que es diferente
de dicha primera marca, para formar una segunda partícula
reaccionada, y
d) medir dichas primera y segunda marcas
en dicha segunda partícula reaccionada.
2. El método de la reivindicación 1, en
el que sustancialmente todos de dichos anticuerpos de captura están
orientado en dicha partícula de tal modo que las regiones de unión
de antígeno de dichos anticuerpos de captura están disponibles para
unirse a dicho miembro A de dicho par de unión.
3. El método de las reivindicaciones 1 ó
2, en el que dicho miembro A es un antígeno y dicho miembro B es un
anticuerpo del hospedante.
4. El método de la reivindicación 3, en
el que dicho antígeno es un antígeno vírico.
5. El método de la reivindicación 4, en
el que dicho antígeno vírico es un antígeno de hepatitis C, un
antígeno de hepatitis B o un antígeno de virus de la
inmunodeficiencia humana.
6. El método de la reivindicación 3, en
el que dicho antígeno es un autoantígeno.
7. El método de la reivindicación 6, en
el que dicho antígeno es descarboxilasa de ácido glutámico.
8. El método de las reivindicaciones 1 ó
2, en el que dicho miembro A es un ligando y dicho miembro B es un
receptor.
9. El método de la reivindicación 8, en
el que dicho ligando es una citoquina y dicho receptor es un
receptor de citoquina.
10. El método de las reivindicaciones 1 ó
2, en el que dicho miembro A es una enzima y dicho miembro B es un
sustrato.
11. El método de la reivindicación 10, en
el que dicha enzima es caspasa-3 y dicho sustrato es
polimerasa poli(ADP-ribosa) o en el que dicha
enzima es caspasa-1' y dicho sustrato es
prointerleuquina-1.
12. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dichas primera y segunda marcas
son fluoróforos.
13. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que dicha muestra biológica se
selecciona del grupo constituido por sangre, plasma, suero, orina,
fluido cerebroespinal, esputo, lágrimas, fluido amniótico, humor
vítreo, saliva y sobrenadantes de cultivo de tejidos.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que dichos anticuerpos de captura
son monoclonales.
15. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que dichos primeros anticuerpos son
monoclonales.
16. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dichos segundos anticuerpos son
monoclonales.
17. Un juego para medir simultáneamente
ambos miembros A y B de un par de unión en una muestra biológica,
cuyo juego comprende:
a) un reactivo en fase sólida,
comprendiendo dicho reactivo en fase sólida una partícula revestida
con anticuerpos de captura que tienen afinidades de unión
específicas por dicho miembro A de dicho par de unión, en el que
sustancialmente todos de dichos anticuerpos de captura están
orientados en dicha partícula de tal modo que las regiones de unión
de antígeno de dichos anticuerpos de captura están disponibles para
unirse a dicho miembro A de dicho par de unión,
b) primeros anticuerpos que tienen
afinidades de unión específicas por dicho miembro A de dicho par de
unión, en los que dichos primeros anticuerpos están marcados con una
primera marca; y
c) segundos anticuerpos que tienen
afinidades de unión específicas por dicho miembro B de dicho par de
unión, en los que dichos segundos anticuerpos están marcados con una
segunda marca que es diferente de dicha primera marca.
18. El juego de la reivindicación 17,
comprendiendo además dicho juego una marca o inserto de paquete, en
el que dicha marca o inserto de paquete indica que dicho reactivo en
fase sólida, dichos primeros anticuerpos y dichos segundos
anticuerpos pueden usarse para medir simultáneamente ambos miembros
A y B de un par de unión en una muestra biológica por citometría de
flujo.
19. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que dicha medida de dichas primera y
segunda marcas en dicha partícula reaccionada es por citometría de
flujo.
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