JPS60125564A - 同時複合反応式抗体・ビ−ルス測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 病原体ないし病原体由来の物質を反応原として抗体を測
定する血甫反応検査には各種の術式が確立しているが、
近年に至り、病気感染によって産生される抗体は、イグ
ノ・グロブリンＭ、同人、四Ｇ（以下、ＩｇＭ、ＩｇＡ
、　ＩｇＧとよぷ。）など病期に応じて大きさの異るも
のが産生され、１ｇＭは感染初期に産生されて治ゆとと
もに消滅するが、ＩｇＧは治ゆ後に産生されること、病
原体由来の物質にはどの抗体に対する反応基も含まれて
いるから、それら（とくにＩｇＭ）を選別して測定する
ことはできず、その結果、病気の治ゆ判定ないし治療後
の経過観祭が不可能であること、などが指摘されるよう
になった。

そこで、１９７０年代以降、主として梅毒につわせ、す
なわち２段階の作業によって梅毒Ｉ　ｇＭを測定する術
式であること、１　ｇＭと非Ｉ　ｇＭの極刑（分＃）ヲ
ゲル瀘ｉｆ行う方法（Ｆ、Ｍ旧１ｅｒ　、　Ｗ（０／Ｖ
ｌｙｒ／ＭＳ　、７９３６１（１９７９））では高価な
装置と長時間の作業を必要とし、またＩｇＭと非ｉｇＭ
の極刑（分離）にも血清反応を用いるその他の方法（Ｂ
ｒｕｎｏ　８ｃｈｍｉｔ　、　Ｓｅｘ　Ｔｒａｎｓ　Ｄ
ｉｓ　。

７．５３−５８　（’１９８０）など。）は、いったん
血清反応で拾い上けた抗体にさらに新たな反応をさせる
という無理がｓｂ、その無理を回避するについて第１段
階の積別反応を弱くする方法をとると洗浄（遠心分離）
の微妙な加減によってかなりの梅毒１ｇＭを逸失するこ
とになるなど、それぞれ臨床検査法に供されるには致命
的な障害をかかえている。

血清反応が当面する第２の問題はビールスの測定である
。早期診断の理想からは病原体そのものを測定目標にす
ることが望ましいのであるが、ビールスの場合は他の物
体との結合は直ちに血清反応を意味しないこともあって
、その測定のための血清反応の術式は開発されていない
。

第３の問題は測定作業の機械化であるが、従来の術式で
は、間接血球凝集反応を除いては機械測定に不通な術式
であり、また間接血球凝集反応においても、判定指標の
読み携り作業を行う機械はかなり精密なものでなければ
ならない。

本発明の測定法では上澄中における中剤（光学的標線を
施したもの）の浮遊の侑無、程度が測定指標であり、乙
剤の反応原感作粒子は抗体・病原体が存在しない条件下
においては単独に、存在する条件下においては抗体・ビ
ールスおよびそれに中剤と乙剤とが共同して行っている
ことに重大な意味がある。すなわち、本発明法において
適格性が認められるのは中剤にも乙剤にも反応する（二
重の反応をする）抗体・病原体たけであってその一方に
反応するだけの抗体・病原体は指標にその存在を＠現し
得ない。従来の血清反応術式では常識外におかれていた
同時複合反応（ダブル・チェック）である。

この同時複合反応がもたらす利益の第１は、特定病棟に
おける特種抗体（たとえはＩｇＭ　）の選別測定を、抗
体の物理的分離（遠心・洗浄１）という非血清学的作業
が不可欠な二段階の反応によらずに一回の反応で行うこ
とができるということである。

その第２は、反応の特異性である。一般の非特異凝集で
このダブル・チェックをノくスするもσ）は来物質（抗
ｉ）、他方を抗クロプリンとする場合において然りであ
る。この反応の特異性は、測定目的がビールスである場
合にｌ狭である。抗体測定の場合は抗原剤ないしメディ
ウムの材料（血球など）に対応する抗体を吸収すれは、
従来法でもかなりの特異性は得られるが、ビールスが血
球などの粒子Ｋ（いわは非特異的に）吸着する原因はビ
ールスの性質そのものにあると潟えられるから他種ビー
ルスの吸収は困難である。したがって、従来法の術式で
考えられる方法としては、血球だせた乙管のパターンと
の差異の廟無、程度を指標として測定する方法ぐらいし
かないと思われる。

本発明法（中剤には担体粒子を用いない）に・、よれは
、他種ビールスは乙剤の神体わｔ子にＩＪ＆着し同粒子
とともに沈降するが、指標となる中剤に反応して中剤を
みち連れにすることはでき動い。

さらに、本発明法では判足指Ｉｖ（中剤の浮遊量）が一
元的、１董的であり、その数量は反射光量に転換し得る
から、機械による読、み取りが極めて容易である。睨み
取りの機械化は単に省力ないし誤読１ｊ止の面たけでな
く、微實測定の限界を拡ける面でも廟益である。たとえ
は間接凝集法では典型的非凝集パターンを下す希釈倍数
をもって抗体価を表すが、抗体は希釈に比例して減少す
るだけで無くなるわけではないから、非凝集ノくターン
は当該術式独自に設定された６（１１定限界、いいかえ
ればそれ以上の微量を表すパターンがないことを意味す
るに過き゛ず、この測定限界は判定指標が多元的・形状
的であること、しかもその形成エリヤが狭小であること
により決定されている。これに対し本発明法の判定指標
は一元的・数量的であるから、原則的に測定限界はない
。測定目的が微量である場合は９剤・６剤を少知″用い
て測定し、その使用量比で反射光量（抗体１曲）を修正
すれはよ為したがって、本兄明法では多数希釈の必要は
なくある基準希釈において測定光量が１００およびＯで
なければ測定光量を抗体価（逆数で表す方がよい）とし
、１００の場合は低希釈で９剤・色剤受検使用の微量測
定をし、０の場合にはそのまま９剤および６剤を加えて
攪拌し、再測定すれはよいから、１または２管で十分に
測定目的を達しうる。

さらＫ、本発明法では６剤は凝集の任務を与えられてい
ないから、凝集を必要とする術式に比べて早い時間で沈
降させることができ、目的の抗体・ビールスと反応する
機会が十分与えられるかぎり、遠心によって沈下させ、
直ちに測定することも可能である。

以上の作用効果は、梅毒、風疹、インフルエンザ、ハシ
力、リウマチ、狸紅熱、結核、日本脳炎、水痘、オタフ
ク風、Ｂ型肝炎、ヘルペスなど血清反応検査のほぼ全対
象について本発明法定試みた結果、希釈倍数と測定光量
との間に正確な比例関係か認められたこと、特殊抗体の
選別ｉ＋１１１定についてはゲル濾過分画によって特異
性が認められたことＫよって確認された。

実施例１　インフルエンザ抗体測駕 反応１京とするビールスに螢光物置フルオレセイン　イ
ソチアネートを吸漬させ（用村明郷外″Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　
ａｎｄ　ｔｈｅｉｒものを９剤とし、同棹ビールスをホ
ルマリン１司定したヒツジ赤血球に感作させ、反応用液
に懸濁したものを６剤とし、反応原基音において等址使
用する。３ｒｎｍ内径、５０　ｍｍ深のガラス試験管（
測定面を除きｉｆｔ！ｌ向は黒色塗付）中で反応用液に
より破検崩１＃を８量倍に希釈し、これに９剤・６剤の
基準量を同時に混入して攪拌し、３時間静置後またＩＩ
′ｉ２．０００　ｐＩｎ　（６００Ｘｇ　）で５分間遠
心後に上部から光をあて上澄の反射光量を光度測定機に
より測定する。抗体価は全中剤浮遊の光ｉｔ　（１００
）マイナス測定光量で表わすが、抗体価０の場合は５倍
希釈、９剤・色剤１０分の１量で再測定して抗体価を修
正計算し、同じ＜１００の場合は９剤および６剤の基準
量４倍を加えて再攪拌し、前回同様に再測定して抗体価
を修正計算する。

実施例２　風疹ビールス測定 風疹ビールスを免疫したマウスの牌臓から特異的グロブ
リンを産生ずるリンパ球を選別しくハイプリドーマ法）
、その培養によって反応原グロブリンを精製、（１１の
方法でこれに螢光標識を施して９剤とし、同グロブリン
を（１１同様に固定ヒツジ赤血球に感作させたものを６
剤とし、患者咽喉から採取した唾液を反応用液で５倍に
希釈して（ＩＨ＊ｊ様に測定する。（ただし、測定（ｉ
１ｉ＋：　０の場合はそのまま０とし、１００の場合の
み＋１１同様に再測定するが現実にはけとんとその必要
は生じない。）実施例３　梅毒１ｇＭの測定 （２）のようｋ１ｗ＊ＪｇＭの免疫によって精製された
市販のウサギ抗ヒ）　ＩｇＭ　（または（２）のように
梅毒ＩｇＭの免役によ！７特異的に精製した抗梅毒１ｇ
Ｍ）に（１）同様にして螢光標識を施したものを９剤と
し病原性トレホネーマ・バリーダムの超音波破壊物物を
（１１同様にして固定ヒツジ赤廂琢に感作させたものを
６剤とし、反応用液で４０倍に希釈した被検血精につい
て（１）同様に押１定する。

（３５００円）手続補正書 昭和５２年３月２２日 特許庁長官　若杉和夫殿 １、事件の表示　昭和！ざ年特許願第、２３．２７タ７
号２、発明の名称 同時複合反応式抗体・ビールス測定法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 サカイ 東京都武蔵野市境４丁目２番２号 ４、代理人 東京都新宿区西新宿１丁目９番１２号 ７、補正の対象　願書発明の名称欄おにび樹細書全文８
、補正の内容 （１、発明の名称をっぎのとおりとする。

（２）明細書全文を別紙のとおりとする。

明　細　書 １、発明の名称 同時複合反応測定法 ２、特許請求の範囲 の抗体−であり、Ａ剤およびＢ剤にお　る測定対象に対
して免疫的結合反応　を　る　のい言“　の範囲１の測
定　法。

３、発明の詳細な説明 抗原抗体反応を用いて抗体を測定する血清検査には数多
くの術式が確立されているが、特定感染原因によって産
生される抗体には治ゆ後もなお多量に存在するものがあ
るから、単に病原体力いしその部分を反応原として病棟
特異の抗体を測定するだけでは、治ゆ判定ないし治療後
の経過観察が困難である。そこで、実際的には感染後景
も早く産生され、はぼ治ゆとともに消失すると考えられ
るＩｇＭを標的として、納期特異性も備えた測定方法の
開発が試みられ、すでにいくつかの試験例が報信されて
いる。

しかしながら、それらの方法のなかでは分画した納期特
異抗体に従来の病棟特異反応を行うものが特異性、鋭敏
性とも優れているが、分画作業そのものに特別の装置と
煩雑な・手技を心壁とし、その他の方法では、いったん
病棟または納期特異の血清反応で得た抗原抗体複合物（
第１次）に対しさらに納期または病棟特異の血清反応を
行うものであるため、その中間において第１液抜合物を
溶媒から分離（洗浄）する作業が不可欠であり、就中、
標識法（酵素、放射性物質標識も含む。）で向ないしば
らつきが見られるのは、それらの洗浄作業に原因がある
ものと考えられるのであるが、いずれにしても、反応産
物の分離（洗浄）作業なくして病棟・納期特異の抗体を
測定する術式は、従前において全く存在していない。本
発明は測定示標である反応結合物の離合が多分に手技的
なこの分離・洗浄作業の加減によって左右されるという
不合理を承認せず、その作業なくして簡易かつ迅速に病
棟・納期特異抗体の測定を行い得る血清検査術式を希求
する知見での研究から主１れたものであり、その術式（
以下、本発明法という。）の原理はつぎのとおりである
。

すなわち、試験管中の検体希釈液に、単独では容易に沈
降しない標識反応ＩＱＡ剤と、測定対象を介してＡ剤と
結合した状態においてその結合物を容易に沈降せしめる
条件を備えた沈錘反応原Ｂ剤を混合、攪拌すると、測定
対象が存在しない条件下でのＡ剤は、Ｂ剤の浮遊、沈降
に関わりなく容易に沈降しないが、測定対象が存在すれ
ば、その存在する限度においてＡ剤・対象・Ｂ剤の結合
が生じ、その結合物は余剰Ａ剤よりも早く沈降する。

そして、このサンドインチ結合すなわち同結合によって
早く沈降することとなるＡ剤の量は測定対象の存在量に
比例するから、Ａ剤の定量使用を前提として基準時（攪
拌後一定時。ただしサンドイッチ結合物沈澱後。）の基
準上澄または沈澱部位におけるＡ剤の存在（密度）を検
測すれば測定対象を測定することができる。そこで、標
識Ａ剤および沈錘Ｂ剤のいずれか一方に病棟特異の抗原
を、他方に納期特異の抗免疫グロブリン抗体を用いれば
、病棟・納期特異の抗体を分離（洗浄）作業なくして測
定することができる。

もとより、反応原の組合せないし測定対象は上記の抗原
〈抗体〉抗抗体に限られず、抗体く抗原〉抗体、抗原〈
抗体〉抗１京および抗抗体〈抗体〉抗抗体の組合せが可
能であり、さらに抗１京に９いては病棟特【抗原と非特
異抗原、抗体については納期特異と非特異、抗抗体につ
いては病棟特異と非特異女どの選択が可能であるが、特
別な目的がないかぎり抗原・抗原、抗抗体・抗抗体は避
けて抗原・抗抗体とし、非特異的反応除去のため、培養
ないし産生動物種を異にする組合せが合目的的である。

なお、抗体については当然に病棟特異性が必要であるが
、抗抗体における病棟特異性は反応に表現されにくく、
すくなくとも測定対象がＩｇＭである場合は病棟非特異
の結合が常態的に行われるので、Ａ開側を病棟特異抗原
としてＢ開側に用いる々らば、とくに病棟特異のものだ
けを用いる８厳６なく、患者血清を免疫した血清を分画
するだけでも十分である。もとより、病棟特異のものだ
けを調製（ハイプリドーマ法）して用いるならばより合
理的であるが、異種反応原の混入は、従来の一面反応で
は直ちに非特異的反応の可能性を意味したのに対し、本
発明法の二面反応では、一方に混入しただけでは非特異
的サンドインチ結合は生じない。すなわち、従来の一面
反応では不可欠かつ鍛型要事であった非特異反応素の吸
収は、Ａ剤、Ｂ剤の双方にその反応原の存在が疑われる
場合でないかぎり、本発明法では不要である。

標識Ａ剤の代表的な標識法を例示すれば、反応物質に螢
光染料を吸着させる方法、反応物質を不活性化した細菌
、ラテックスなどの軽粒子に吸着させる方法、さらにこ
れをヘマトキシリン、ツクシン、クリスタルバイオレッ
トなどで染色する方法などがある。

一方、沈錘Ｂ剤に用いる粒子は、その−浮遊によってＡ
剤の検測が妨げられるおそれがあるかぎり、単独でもＡ
剤より十分に早く沈降する粒子が用いられなければなら
ないが、そのおそれがなければその必要はない。ただし
、Ａ剤、Ｂ開缶粒子の大きさは、それぞれに用いられる
反応物質と測定対象との反応態様、反応（結合）力差等
との相関において決定されることが望ましい。

試験管については、標識法ないし検測装置いかんにもよ
るが、概して内径３ないし／θミリで、深さが５θミリ
深以上のものが合目的的である。

標識Ａ剤の密度を検測する装置は標識法に応じて螢光光
度計等の光学的測定機を用いればよいが、本発明法の測
定数値に対する信頼性は原則的に定時検測に依拠してい
るものであるから、自動装置がセットされたものが望ま
しい。

本発明法はその本来の目的である通常的力価の簡易測定
にこれを用いる場合は上澄の一定部位（沈降時間、検測
時との相関で選定する。）におけるＡ剤浮遊密度を示標
とするが、従来法のように分離・洗浄を行えば、沈澱中
におけるＡ剤を微量検出の示標とすることができる。も
とよりその微量測定法それ自体は公知の標識サンドイン
チ法であり、本発明法の特徴であるＡ剤と三重合物との
沈降時間差がそれに寄与しているわけではないが、たと
えばある種のホルモンのようにはじめから微量を前提に
した検査の場合はともかく、いわばマクロ的抗原・抗体
の測定から（陰性価の場合に）そのまま連続的に微量測
定に移行できる術式であるということは、本発明法の重
要な特徴の７つである。

なお、測定値の精度については、各種感染症等の抗原お
よび抗体測定において、陽性血清希釈率と測定価の比例
関係をもって確認されているが、本発明法がその特異的
効用を発揮するのは病棟９病期特異抗体の測定において
である。

実施例１　梅毒ＩｇＭの測定（螢光標識法）（Ａ剤の調
製）家兎畢丸に接種、培養した病原性トレボネー−ｑ　
（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ　以下、ＴＰ
トいう。）のホモジナイザー破壊物に螢光染料ＦＩＴＣ
（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａ
ｔｅ）を吸着させ、リン酸緩衝食塩液（ＰＨ７ｔ２以下
、ＰＨ１という。）に０，２５％に懸濁してＡ剤液とす
る。

（Ｂ剤の調製）アフイニテイクロマトグラフイーとゲル
濾過によりヒト梅毒早期血清から６＆’ｒｒ’のＩｇＭ
を分離、マウスに免疫して、ノ・イブリドーマにより抗
ヒト梅毒ＩｇＭ抗体を特異的に精製し、これをホルマリ
ン固定、タンニン酸処理したヒツジ赤血球に吸着させ、
２．５％ＰＢ８懸濁液とする。

（検査）　８ｍｍ　Ｘ　７５ｍｍ　のガラス試験管に被
検血清のＰＨ１５倍希釈および１６０倍希釈各０．２５
ｍ１　を用意し、これにＡ剤およびＢ剤液各種０２５ｍ
１　を混合して分光光度計の試料室（３７°Ｃ）に静置
し、タイマー作動により３時間後の液面下２０ｍ１７１
中心部位における光度を測定、記録する。抗体価は、希
釈毎の対照（Ｂ剤の代りに非感作血球を同量使用する−
１かは同条件）１００との光度差（１０〇−感光度）が
９８〜３の範囲内にある方の数値から、換算表により換
算値が〈３と力る直前の希釈倍数をめて抗体価とする。

なお、−２管とも９８〜３の範囲内にある場合は５倍管
の数値をとり、２管とも同範囲外にあるときは１６０倍
管を３とする。５倍管が〈３の場合は抗体価はく５倍と
し、１６０倍管が〉９８の場合は５１２０倍希釈で前同
様に再検査する。

（微量検出）測定抗体価かく５倍の場合で微量検出の必
要があるときは、そのまま上澄を吸引、除去し、生理食
塩液を加えて２．０００　’９４Ｎ　（６００ｘｇ）の
５分間遠心φ上澄除去（洗浄）を２回行った後、沈澱中
のＡ剤を螢光顕微鏡により検認す実施例２　風疹ＩｇＭ
の測定（染色細菌標識法）（Ａ剤の調製）ホルマリン固
定したウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ
　）をメチレン・ブルーで染色し、これに上記のように
ハイプリドーマにより特異的に精製した抗ヒト風疹１ｇ
Ｍ抗体（マウス）をグルタルアルデヒドにより吸着させ
、０．５％牛血清アルブミン加ＰＢＳに２．５％の割合
に懸濁してＡ剤液とする。

（Ｂ剤の調製）ホモジナイザー処ｉｌｌ！　した培養風
疹ウィルスをグルタルアルデヒドによりホルマリン固定
したニワトリ赤血球に吸着させ、上記ＰＢＳで２．５％
の割合に懸濁してＢ剤液とする。

（検査１−浮遊示標法）先ずＢ剤を混合し、３７°Ｃで
２０〜３０分静皺後にＡ剤を混合して攪拌するほかは実
施例１同様にして混合２時間後のＡ剤浮遊密度を分光比
色計により自動検測し、抗体価を算定する。

（検査２−沈澱示標法）各穴が内径１６ｍｍ×最深２０
ｍｍで底部が頂部を丸く整形した円錐状突起で成型され
ているトレイを使用し、被検血清を上記ＰＢＳにより２
０〜５１２０倍間４倍数希釈して＜　ｏ。

５ｍ１）、浮遊示標性同様にこれにＢ剤、Ａ剤を混合し
、２時間静置後の沈澱によりっぎのように判定する。■
低希釈でも管底突起部に膜状（淡色）沈澱が形成され々
い場合−陰性。■管底突起部に青色がかった膜状沈澱が
形成された場合−ＩｇＭ陽性（膜状沈澱の大小にかかわ
らず青色が濃いほど早期）。■膜膜状沈澱血球色の場合
−ＩｇＭ陰性でＩｇＧ陽性（治ゆ）。

実施例３　ＨＢｓ抗原測定（螢光標識法）（Ａ剤の調製
）ハイブリドーマにより特異的に精製したＨＢｓＩｇＭ
　（マウス）にＦ’ｌ’ｌｌ”Ｃを吸着させ、０．０２
５％ＰＢＳ懸濁液とする。

（Ｂ剤の調製）同じ（Ｈ１３ｓＩｇＭ　（ウサギ）をホ
ルマリン固定、タンニン酸処理したニワトリ赤血球に吸
着させ、０．２５％ＰＢＳ　懸濁液とする。

（検査）実施例１の試験管で同様に被検血清を希釈し、
これに先ずＢ剤液を０．０２５　ｍ　ｌ混合して３７°
Ｃに静置し、２０〜３０分後、Ａ剤同量を滴下、攪拌し
て光度計試料室（３７°Ｃ）に静置し、以下、実施例１
と同様に自動測定する。

（微量検出）実施例１に同じ。

以上が代表的実施例であり、他の病棟々いし納期の抗体
または抗原を測定目的とする場合にも特別な条件を必要
としない。なお、沈澱分離をせずに検測する示標として
浮遊Ａ剤に代え、あるいは浮遊Ａ剤に併せて沈澱Ａ剤を
示標とする場合、最深部をとくに細く成型した試験管を
用いれば側面からの検測が可能である。（以上の説明中
、納期特異性とはｉ　ｇＭ、Ｉ’ｇＡ、ＩｇＧなど抗体
の分子量における個性をいう。）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■２反応原物質に螢光物質などの光学的標識を吸着させ
   たもの、またはこれをさらに被検液中において容易に沈
   降しない比重の粒子に感作させたものを主成分とする甲
   剤と、反応原物質を被＠液中において容易に沈降する比
   １の粒子に感作させたものを主成分とする乙剤とを試験
   管中において級検液に反応させることを特徴とする抗体
   捷たは病原体を測定する方法 を測定する方法