JPH0343094A - 単純ヘルペスウイルス抗原の抽出または測定のための抽出組成物、抽出方法および診断試験キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、単純ヘルペスウィルス抗原の抽出および測
定に向けられる抽出組成物およびその使用に間する。こ
の発明は、また、その抽出組成物を含む診断試験キット
にも関する０本発明は、生物学的被検体中の単純ヘルペ
スウィルスを検出するための診断法において有用である
。

〔従来の技術〕

最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生体を検出しな
ければならない、これには殆どの場合に、生体に特有な
抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との反応が必
要である。商業的に成功するための試金石としては、さ
らに相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速であること
も必要である。

イムノアッセイによって検出することができるかかる生
体の１つは、単純ヘルペスウィルスである。

ワクチンや各種の抗ウィルス剤による各種ウィルスの抑
制が増大しているにもかかわらず、−単純ヘルペスウィ
ルス（以下ｒＨ３ＶＪという）などの生体による感染に
は重大な課題が残存する。

ＨＳＶには２つの型が存在し、第１の型は口の周辺で主
に生じ、第２の型は人体の性器周辺に主に生ずる。皮膚
感染およびウィルス性脳炎は、Ｈ３■感染によりもたら
される主な症例の単に２つの例にすぎない。

ヘルペス感染の広く蔓延する性質のため、原因ウィルス
の検出のための迅速、簡便かつ信頼できる試験法を人手
することに相当な興味が存在する。

しかしながら、既知の診断法の使用では、しばしばＨＳ
Ｖから区別できない類似する数種のウィルスが存在する
。従って、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２について有用な
診断試験は、これらのウィルスにのみ特異的であり、Ｅ
Ｂウィルス、サイトメガロウィルス、水痘帯状庖疹ウィ
ルスまたは他のすべてのウィルス群に感受性を有しない
ものでなければならない。

生物学的被検体中の生体からの抗原の抽出が、正確さ、
迅速さおよびアッセイ高感度を提供するのに重要事項と
なる。抽出には、超音波、加熱または遠心による細胞の
物理的な破砕を含む多種多様な方法が使用されている。

化学的な抽出組成物もまた開発されてきた。例えば、米
国特許第４．６６１．３４９号明細書は、ワクチンの調
製に際して、ＨＳＶから９０．０００〜９５．０００ダ
ＪＬ／）ン（７）分子量を有する糖タンパク質Ｂの抽出
および精製を記載する。

抽出は、中性ｐｉでいくつかの非イオン界面活性剤また
はアニオン界面活性剤を使用して行われている。

米国特許第４．４３０．４３７号明細書は、最初にｐＨ
８にてグリセリン、ノニデート（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ
−４０非イオン界面活性剤、デオキシコール酸ナトリウ
ムおよびフェニルメチルスルホニルフルオライドの混合
物を使用し、次いでｐＨ８、ｉｏｏ”ｃにてドデシル硫
酸ナトリウム、メルカプトエタノールで処理するＨＳＶ
からヌクレオキャプシドタンパク質の抽出を記載する。

記載されている抽出方法には低いｐＨと高い温度が重要
である点が注目される。

〔発明が解決しようとする課題〕

当該技術分野では、単一試験装置に容易に適用できる感
度がよく、かつ迅速なアッセイを提供するための単純ヘ
ルペスウィルス抗原の抽出手段に対する需要が存在する
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、ｐＨ８，５〜１２を有しそしてアルコールア
ミンもしくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオ
キシドとの縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コー
ル酸もしくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン
界面活性剤を含んでなる単純ヘルペスウィルスから抗原
を抽出するのに有用な抽出組成物を提供する。

さらに、単純ヘルペスウィルスを含有することが予期さ
れる被検体を前記抽出組成物と接触させることを特徴と
する単純ヘルペスウィルスからの抗原の抽出方法を提供
する。

また、この発明は、 Ａ、前記抽出組成物で単純ヘルペスウィルスを含有する
ことが予期される被検体から単純ヘルペスウィルス抗原
を抽出する工程、 Ｂ、抽出された抗原をそれに対する抗体と接触させて免
疫学的複合体を形成する工程、Ｃ０被検体中の単純ヘル
ペスウィルスの存在の指標として前記複合体の存在を測
定する工程、を含んでなる単純ヘルペスウィルスの測定
方法も提供する。

さらに、前記抽出組成物を含んでなる単純ヘルペスウィ
ルスの測定に有用な診断試験キットを提供する。

好ましい態様では、本発明で使用される単純ヘルペスウ
ィルス抗体がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（Ａ＋ｗｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎＨＲｏｃｋｖｉ１１ｅ、Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ、Ｕ、Ｓ、）にＨＢ−９６８４として寄託さ
れているハイブリドーマ細胞系２８３−２Ａ１−１０４
−２Ｃ３に由来するモノクローナル抗体である。

〔具体的な態様〕

本発明は、標準的な医療および微生物学的手法により患
者から得られた生物学的被検体中のＨ３■の存在を測定
するための抽出組成物および抽出方法ならびにその測定
方法を含む。生物学的被検体としては、例えば、患者の
頚管、尿道、眼、咽喉または肛門に由来する被検体、な
らびに滑液または病巣由来の流体のごとき体液が含まれ
る。こうして得られる生物学的被検体は、測定される目
的の抗原を含むＨ３ＶまたはＨ３Ｖ感染細胞を含むこと
が予測される。

従来技術の幾つかのアッセイは、ウィルス感染細胞その
ものの検出を目的として設計されているが、この発明の
利点はウィルスまたはウィルス感染細胞もしくは膜が効
率よく溶解され、比較的短時間で感度のよいアッセイを
提供するのに十分な抗原が抽出される点にある。抗原は
、試料中に存在する感染した宿主細胞そのものまたは細
胞膜、あるいはウィルス粒子から抽出されうる。

本発明で検出可能な抗原は、Ｈ５Ｖ−１もしくはＨ５Ｖ
−２またはその両者のいずれかに存在する。ウィルス粒
子の抗原が抽出され、本発明により検出される。就中、
糖タンパク質抗原が容易に抽出され、本発明により検出
される。

この発明の抽出Ｕ放物は、ｐＨ１８，５〜１２を有し、
好ましくはｐｉ（９〜１１を有する。目的のｐｏは、適
当な緩衝剤または塩基を使用して得ることができる。

ある種の緩衝剤は、アルカリ条件ならびに緩衝能を提供
するのに十分強い塩基でもある。緩衝剤でない場合には
、強塩基（例えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリ
ウムのような水酸化＠Ｉｊ）が目的のｐＨを得るのに使
用され、次いでそのｐＨを維持するのに緩衝剤が使用さ
れる。例えば、エタノールアミンの塩が緩衝剤として使
用される場合には、強塩基を使用してｐＨ９，５を得る
。

本発明の組成物は、少なくとも０．０５モル濃度、好ま
しくは０．１〜１モル濃度の量で１種以上のアルコール
アミン類またはそれらの塩を含んでなる。

使用できるアルコールアミン類としては、エタノ−ルア
逅ン、ジェタノールアミン、プロパノ−ルアξン、トリ
エタノールアミンおよびそれらの塩（例えば、塩酸塩、
硫酸塩、酢酸塩、ピクリン酸塩および修酸塩）が挙げら
れる。その他は、当業者にとって容易に明らかとなるで
あろう。場合によって、アルコールアミン類またはそれ
らの塩の混合物を使用してもよい。エタノールアミンま
たはその塩が特に好ましい。

本発明の組成物は、また、アルキルフェノールとエチレ
ンオキシドの縮合生成物である非イオン界面活性剤１種
以上を含む、好ましいアルキルフェノール類は、フェノ
ール上に炭素原子１〜２０個の直鎖または分枝したアル
キル基を有する。オクチルフェノールが最も好ましい。

一般に、これらの化合物はエチレンオキシド基５〜３５
個を有する。

それらは、好ましくは７〜１５個のエチレンオキシド基
を有する。これらの非イオン界面活性剤は、既知の方法
と出発原料を使用して容易に製造されるが、多くは市販
されてもいる。最も好ましい界面活性剤は、商品名Ｎｏ
ｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０の下で販売されている。

限定されるものでないが、・その他の有用な非イオン界
面活性剤としては、商標ＴｒｉｔｏｎＯ下で販売されて
いる、例えばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００およびＴｒｉ　
ｔｏｎＮｌｏｌ、または商標Ｂｒ１ｊの下で販売されて
いるもののようなポリオキシエチレンエーテル類、商標
Ｔｗｅｅｎ　（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）の下で販売
されているもののようなポリオキシエチレンソルビタン
誘導体類、ならびに商標Ｔｅｒｇｉｔｏｌ　（例えば、
ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰＸおよびＮＰ−７）の下で販売さ
れているもののようなポリグリコールエーテル類が挙げ
られる。他の有用な材料は、特に界面活性剤の標準的な
文献、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅ
ｒｓ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｒ　ｅｎｔｓ　１９８６＆ｌｌ
ｉｉ（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、ＧｌｅｎＲｏｃｋ、Ｎ、Ｊ
、Ｕ、Ｓ）を参考にした後の当業者にとって容易に明ら
かであろう。

前記非イオン界面活性剤１種以上が、少なくとも１重量
％、好ましくは４〜１０重量％（＃１１戒物の総重量当
たり）の量で本発明の抽出組成物中に存在する。

この発明の抽出組成物の第３の重要な成分は、１種以上
のコール酸、その塩またはその誘導体である。限定され
るものでないが、使用可能な材料としては、コール酸、
ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、デオキシコ
ール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸カリウム、コ
ール酸アンモニウムおよび当業者に容易に明らかとなる
他の化合物が挙げられる。最も好ましいものはデオキシ
コール酸ナトリウムである。この成分は、少なくとも０
．２重量％、好ましくは０．５〜５重量％（組戒物総重
量当たり）の量で組成物中に存在する。

本発明の組成物は、また、少なくとも０．１重量％、好
ましくは０．２〜１重量％（組成物総重量当たり）の量
でアニオン界面活性剤も含む、限定されるものでないが
、使用可能なアニオン界面活性剤としては、アルキル硫
酸アニオンとアルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリ
ウムもしくはカリウム）カチオンまたはアンモニウムカ
チオンからなり、アルキル基が炭素原子６〜２０個を有
する水溶性または水分散性化合物が挙げられる。好まし
くは、アルキルが炭素原子６〜１２個（例えば、直鎖ま
たは分枝したヘキシル基、オクチル基、デシル基、２−
メチルヘキシル基およびドデシル基）である、アリール
核中に炭素原子６〜１０個を有するアリールスルホン酸
類またはそれらの塩（前述のような〉もまた使用可能で
ある。アルキル硫酸塩類が好ましく、デシル硫酸塩およ
びドデシル硫酸塩が最も好ましいものである。代表的な
アニオン界面活性剤としては、ドデシル硫酸アンモニウ
ム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ルビジウム
、デシル硫酸ナトリウム、ヘキシル硫酸リチウム、オク
チル硫酸カリウムおよびデシル硫酸リチウムが挙げられ
る。最も好ましい化合物は、デシル硫酸ナトリウムおよ
びドデシル硫酸ナトリウムである。

場合により重要になる抽出組成物成分は、アルカリ金属
塩、アンモニウム塩またはアルカリ土類金属塩のような
１種以上の無機塩である。限定されるものでないが、代
表的な塩としては、塩化ナトリウム（これが最も好まし
い）、塩化カリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウ
ム、硫酸アンモニウム、硫酸バリウムおよび当業者に容
易に明らかとなる他の塩が挙げられる。この塩は、好ま
しくは少なくとも０．３モル濃度、より好ましくは０．
５〜２モル濃度の量で存在する。

必要があれば、防腐剤、還元剤、キレート剤消泡剤を包
含する他の添加剤を本発明の抽出組成物に含めることが
できる。

抽出は、ＨＳＶまたはＨ３Ｖ感染細胞を含有することが
予期される生物学的被検体を提供し、次いでこのものを
、ウィルスまたはそれを含有する細胞を溶解するのに十
分な時間適当な容器中でこの発明の抽出組成物と接触さ
せ、そしてアッセイ用の抗原を抽出することにより実施
することができる。特定の被検体には長時間必要な場合
もあるが、一般には、この抽出方法が２分未満で行われ
る。接触は、室温（すなわち、１８〜２５°Ｃ）で行わ
れるのが一般であるが、場合により４０″Ｃまでのより
高い温度であってもよい。しかしながら、従来技術で必
要とされるより高い温度は、この発明を実施することに
より避けることができる。被検体の混合が必要な場合も
ある。好ましくは、目的に応じて特別に設計されうる適
当な抽出装置中で抽出が実施される。多くのこのような
装置が従来技術文献中に示されている。

適当なインキュベーシゴン後、必要があれば、抽出され
た抗原を含有する溶液は適当な酸で中和し、６〜８まで
ｐＨを低下させることができる。ここでまた、内在性の
過酸化物を除去するために処理してもよい。生体から抗
原が抽出されると、必ずしも必要ではないが、次の処理
の前に前記溶液を予備濾過し、細胞残層、粒状物および
他の不要物を除去することが望ましい。予備濾過は、あ
る種のフィルターを備えた適当な容器中で行うことがで
きる。

次に、濾過された被検体は、抽出された抗原の存在を測
定するために数種の分析方法のいずれかにかけられる。

これらの方法には、必ずしも好ましくはなく、特定の実
例において選ばれるだけのものもありうるが、培養法、
カウンター免疫電気泳動法および血清法が含まれる。

好ましくは、抽出された抗原が１種以上の適当な抗体と
免疫学的に反応するイムノアッセイを使用して検出され
る。ＨＳＶ−１もしくはＨＳＶ−２の両者またはいずれ
かに由来する抗原が検出されうる。

好ましくは両者が同時に検出される。こうして得られた
免疫複合体は、適当な放射線測定法、比色法、蛍光法ま
たは酵素標識試薬を使用して検出される。ある場合には
、試薬が抗原に対する標識抗体であり、別の場合には、
試薬が抗原と反応する未標識抗体に向けられる標識抗−
抗体である。このようなイムノアッセイは、一般に、適
当な手段で結合していない物質から分離される検出可能
な免疫複合体の形成を含む。好ましい態様では、被覆さ
れているかまたは被覆されていないある種の固体支持体
上に前記複合体が固定され、次いで適当な検出手段が構
しられる。

他のアッセイでは、前記複合体の少なくとも１種の反応
体（例えば、抗体）が、複合体形成中に共に凝集するあ
る種の標識粒子または未標識粒子に付着するとき、免疫
複合体の凝集を伴う。凝集アッセイはヨーロッパ特許公
開票１８３，２１５号公報（１９８６年６月４日付公表
）に具体的に記載されている。

有用なアッセイ例としては、コンペティティブイムノア
ッセイ、ラジオイムノアッセイまたはエンザイム・リン
クド・イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙
げられる。使用されるＨ３Ｖ抗体は、生体から抽出され
ているいずれかまたは数種の抗原に向けられるものであ
ることができる。ある態様では、ＨＳＶ−１またはＨＳ
Ｖ−２のいずれか単一の糖タンパク質に抗体が向けられ
る。もう一つの態様では、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２
の両者に由来する糖タンパク質のような数種の抗原に数
種の抗体混合物が向けられる。さらに、第３の好ましい
態様では、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両者に由来す
る特異的な糖タンパク質と反応性を有する単一の抗体が
使用される。

このアッセイで使用される抗体は、市販されているかま
たは既知の方法を使用して調製することができるポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体であることができる
。好ましい抗体は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両者
に由来する糖タンパク質と反応性のモノクローナルであ
る。このようなモノクローナル抗体の一つは、ハイブリ
ドーマ細胞系２８３−２ＡＩ−１０４−２Ｃ３（ＡＴＣ
Ｃ寄託番号ＨＢ−９６８４）から標準的な方法を使用し
て得られる。

有用な固相イムノアッセイでは、抽出された抗原が、吸
着または遊離アミンもしくはスルフヒドリル基と反応す
る小さなポリマー粒子上の反応性基との共有結合生成反
応によりその粒子上に「捕捉」　（または結合）される
０次に、捕捉された抗原は適当な抗体と反応してパイン
ディングした免疫学的複合体を形成する。未複合化物質
は、同時係属中の出願により詳細に記載される微孔質膜
フィルターを使用して分離される。

好ましいイムノアッセイは、得られた免疫学的複合体か
ら未複合化物質を分離するためにも使用される被覆もし
くは未被覆微孔質膜フィルター上に抽出された抗原をパ
インディングすることにより実施される。もう一つのイ
ムノアッセイは、界面活性剤で被覆した微孔を膜を使用
して実施される。最も好ましくは、微孔質膜が下記例２
に示されるような未被覆または未処理ナイロン製品であ
る。

一般に、ある種の固体支持体（好ましくは、前述のよう
な膜または粒子）を使用するこの発明のアッセイは、以
下のように実施される。抽出された抗原はガラス、セル
ロース系、セラ逅ツクス系またはポリマー系材料のよう
な固体支持体と接触される。好ましくは、この支持体は
過度なインキュベーションまたは他の条件を伴うことな
く抽出された抗原が迅速にパインディングしうるいずれ
かの天然または合成ポリマー材料から槽底される。

有用なポリマーとしては、ポリエステル、ポリアミド、
ポリカーボネート、ポリエチレンイミン、セルロース系
材料およびエチレン系不飽和ビニルモノマーから製造さ
れる付加ポリマーならびに当該技術分野で既知の他の材
料が挙げられる。一般に、膜が正に荷電している場合に
は、カチオン基が第四級アンモニウム塩、第四級ホスホ
ニウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウム
塩、第四級ピリ逅ジニウム塩または第四級イミダゾリウ
塩であり、第四級アンモニウム塩が好ましいものである
。

好ましい態様の一つは、微孔質膜上の粒子を使用し、前
述のような膜および粒子で抽出された抗原を捕捉する。

この支持体は、ビーズ、ゲル、フィルムまたは膜のよう
ないずれかの適当な形状で作製することができる０本明
細書で開示されるような微孔質膜が好ましい。

本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また一
方、好ましくは、アッセイを実施することができ、すべ
ての流体に適応できる使い捨て試験装置中に膜が固定さ
れる微孔質膜を支持体が有する。試験装置の有用な形状
は、当該技術分野で知られている。特に有用な装置は、
ヨーロッパ特許公開第２８０５５８号公報に記載されて
いる。

この支持体に抗原が接触すると殆んど瞬間的に抗原がそ
れにパインディングされる。パインディングは、支持体
に付着されている結合性生物学的化合物（例えば、抗体
）を介して抗原が結合されるものでないことを意味する
直接的な手段によるか、またはパインディングがかかる
結合性化合物を介して間接的なものであってもよい。

従って、接触の１０分以内、好ましくは１０〜１２０秒
の範囲内でパインディングした抗原は、支持体上に免疫
学的複合体を形成するように、それらに対する適当な抗
体（またはその混合物）と接触される。アッセイが使い
捨て試験装置を使用して実施される場合には、支持体は
、抗原が膜にパインディングされると同時に被検体中の
流体および複合化しない物質が膜を通過する微孔質膜を
有することができる。

好ましい態様では、抗原に対する抗体は検出のために標
識される。有用な標識は、当該技術分野で既知であり、
適当な手段および装置を使用して直接的または間接的に
検出可能な化学または生物学的化合物、ならびに検出可
能な種を提供するさらなる化学または特異的パインディ
ング反応を介して検出しうる化合物を包含する。有用な
標識の例としては、放射性同位体、酵素、補酵素、蛍光
化合物、補因子、化学発光化合物、リン光化合物、ビオ
チンまたはその誘導体、アビジンまたはその誘導体、フ
ェリチン、磁性粒子、色素粒子および当業者に容易に明
らかとなる他の物質を挙げることができる。標識は、既
知の方法を使用して抗体に付着することができる。標識
が直接検出できない場合には、検出可能に反応または特
異的にパインディングする生成を与えるのにさらなる試
薬または化合物が必要である。例えば、標識がビオチン
である場合、酵素と接合されているアビジンと反応させ
、検出可能な種を提供することができる。

標識がグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキ
シダーゼおよびアルカリホスファターゼなどの酵素であ
る場合には、基質と共に色素を提供する試験も必要であ
る。

特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであり
、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素生
成試薬が添加され、検出可能な色素が生ずる。例えば、
有用な色素生成試薬としては、テトラメチルベンジジン
類およびそれらの誘導体、トリアリールイミダゾールロ
イコ染料（米国特許第４，０８９．７４７号明細書に記
載されるような）のごときロイコ染料、あるいはペルオ
キシダーゼと過酸化水素の存在下で反応して色素を提供
する化合物（すなわち、ペルオキシダーゼの触媒作用に
より色素を提供する化合物）が挙げられる。

もう一つの態様では、ヘルペス抗体が標識されておらず
、支持体にパインディングし、形成された抗体−抗原の
複合体の検出が、前記Ｈ３Ｖ抗体に特異的で検出のため
に適当に標識されている（前述のように）第二の抗体を
使用して行われる。

アッセイで使用される抗体は、支持体上で非特異的な相
互作用を減少させる１種以上のブロッキングタンパク質
との混合状態で供給することができる。有用なタンパク
質は周知であり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウ
シ胎児血清およびブタγ−グロブリンが挙げられる。−
の有用なブロッキング組成物は、非免疫学的なブロッキ
ングタンパク質および両性界面活性剤を含んでなる。

支持体にパインディングする免疫学的複合体の形成を促
進するには、一般に、抗体と抗原が１５〜３０°Ｃの温
度で１０分未満インキュベーションされる。

好ましくは、５分未満室温でインキュベーションされる
。

インキュベーション後、抗体−抗原接触の１０分以内に
パインディングされた複合体は、リン酸緩衝液、非イオ
ン界面活性剤の緩衝溶液および当該技術分野で既知の他
の溶液などの緩衝化洗液で１度以上洗浄される。

Ｈ３Ｖ抗体が標識されている前述のＨ様では、洗浄後の
アッセイ手順が直接的または適当な試薬の添加後の間接
的な標識の検出となる。これは、パインディングした複
合体を洗浄した後、相当迅速に行われる。必要があり、
試薬類が許容する場合には、標識の検出がインキュベー
ションにより促進される０次に、適当な時間後に標準的
な装置および方法を使用して標識が検出される。

Ｈ３Ｖ抗体が標識されていない場合には、パインディン
グした複合体を洗浄した後、それが標識されていない抗
体に対する抗体と接触される。この第２の抗体（すなわ
ち抗−抗体）は、前記標識のいずれかで適当に標識され
、前述のようなブロッキングｍ酸物と共に供給すること
ができる。この抗体はモノクローナルまたはポリクロー
ナルであってよく、市販のものか、または既知の方法を
使用して調製することもできる。

この接触後、支持体にパインディングして得られた抗原
−抗体−抗体複合体は、１５〜３０゛Ｃの温度で１０分
未満インキュベーションされる。好ましくは、このイン
キュベーションは５分未満室温である。

さらに洗浄が行われて未複合化物を除去し、次いで適当
な酵素基質または他の必要な試薬を添加して検出可能な
種を提供する。次に、パインディングした抗原−抗体−
標識抗体複合体は、標準的な放射能測定、比色法、蛍光
法または他の検出法を使用して支持体上で検出される。

この発明の抽出ｍ酸物は、必要があれば他の試薬、診断
装置の部品または他の有用な材料の１種以上を含んでな
る診断試験キットの一部として提供することができる。

一般に、キットは単純ヘルペスウィルス抗原に向けられ
る抗体（標識されたまたは標識されていない）少なくと
も１種を含む。

それはまた、抗−抗体（必要があれば）、洗液、抽出装
置、試験装置、色素生成試薬もしくはｍ放物、ピペット
、説明書、綿棒およびアッセイを実施するのに有用な他
のいずれかの部材をも含めることができる。これらの部
材は、いずれかの適当な形態で梱包することができ、１
以上の包装または容器で提供することができる。

（実施例〕 下記の材料、ｍ酸物および溶液が以下の例で使用され、
例は具体的に示されるが本発明の範囲限定するものでな
い。

抗佳少里盟 ＨＳＶに対するモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ
細胞は、ケラ−（Ｋ６ｈｌｅｒ）らにより公表される既
知の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６　４９５〜４９７ペ
ージ、１９７５）を使用して調製した。ＨＳＶ−１とＨ
ＳＶ−２ノ両方に共通する糖タンパク質抗原上のエピト
ープに反応するモノクローナル抗体を産生ずるハイプリ
ドーマ細胞系が得られた。このハイプリドーマ細胞系は
、ＡＴＣＣＨＢ−９６８４として寄託された。

抗凰坐姐製 正対照として使用するための抗体を調製するたメニ、Ｈ
ＥＰ−２細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２３）中”ｉ’ＨＳＶ
−Ｉ　Ｆ株Ｈ５Ｖ−２Ｇ株を個別に増殖させた。−感染
細胞を低速で遠心してペレット化し、これらのペレット
を５０−のコレックス（Ｃｏｒｅｘ）チューブでリン酸
緩衝溶液１５ｍに懸濁させた。この懸濁細胞を超音波処
理し、１５分間アξノメチルトリオキサレン（ａｍｉｎ
ｏ−ｇｍｅｔｈｙｌｔｒｉｏｘｓａｌｅｎ）　（５００
ｆｆｉｇ／　ｄ）にさらし、次いで断え間なく撹拌しな
がら１５分間紫外線を照射した。

試験装置の正対照ウェルは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−
２抗原（ＵＶで不活化しそして洗剤で溶解した）を含ま
せ、この試験ウェルのフィルター膜上にウシ胎児アルブ
ミン（０，１重量％）と親水性ポリマー（５重量％）を
混入させた。

抗生接丘迷生貝製 ＨＳＶ　（前述）に対するモノクローナル抗体を、７ワ
サビペルオキシダーゼにＹｏｓｈｉｔａｋｅら（ｆ！ｕ
ｒ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、、　１０１　３９５ページ（１９７
９）　）に記載された方法を使用して接合させた。得ら
れた接合体を、α−カゼイン（０，５重量％）　、Ｔｗ
ｅｅｎ　２０非イオン界面活性剤（０，１重量％）、チ
メロサル防腐剤（０，０１重量％〉およびＰ−メトキシ
フェノール（１００ミリモル濃度）を含有するブロッキ
ング組成物と混合した。この溶液における最終抗体濃度
は１．５ｎ／ｄであった。このものを、ウシ血清アルブ
ミン（１重量％）と共に保存した。試験装置の負対照ウ
ェルのための接合体は、前記方法を使用して調製したタ
レアチンキナーゼに対するペルオキシダーゼ標識抗体で
あった。

ロイコ色、 この組成物は、過酸化水素（１０ミリモル濃度）、２−
（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−４，５−
ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染料
（０，００５重量％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１
重量％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモ
ル濃度）およびジエチレントリアミン五酢酸（１０ミリ
モル濃度）を含めた。

過菫止裏塞橙且 水溶液は、過酸化水素（１０重量％）、ジエチレントリ
アミン五酢酸（０，００５重量％）および防腐剤（０，
０１重量％）を含むように調製した。

迭櫃 水性洗液は、Ｔｒｉｔｏｎ　（商品名）Ｘ−１００非イ
オン界面活性剤（０，１重量％）、エタノールアミン塩
酸塩（０，２６モル濃度）および防腐剤（０，０１重量
％）となるように調製し、１２Ｎ水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ１０，７５に調節した。

１２（Ｕ０組免液 この溶液（０，０５モル濃度）は、塩化ナトリウム（０
，１５モル濃度）、リン酸二水素ナトリウム（０，０１
モル濃度）およびリン酸水素ナトリウム（ｐＨ７，２，
０，０４モル濃度）から調製した。

フ゛口・・キング且 水性ブロッキング組成物は、α−カゼイン（０，５重量
％）　、Ｔｗｅｅｎ　２０　（０，１重量％）、ｐ−メ
トキシフェノール（１００主すモル濃度）および防瘍剤
（０，０１重量％）を含むように調製した。

３個の試験ウェルを有する使い捨て試験装置をアッセイ
で使用した。この試験装置は、各試験ウェル中に被覆（
塗布）されていないナイロン微孔質膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ
（商品名）　、ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐ製）を有していた。

較ユ三」七泪走炙豐 本発明の抽出組成物は、水中で次の成分を混合すること
により調製した。

Ｎｏｎ１ｄｅｔ　ＮＰ−４０非イオン界面活性剤（５重
量％）、デオキシコール酸ナトリウム（０，７５重量％
）、ドデシル硫酸ナトリウムアニオン界面活性剤（０，
４重量％）および塩化ナトリウム（１モル濃度）。

この組成物のｐＨは、１２Ｎ水酸化ナトリウムで１０．
７５に調節した。

２：ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２についてのアッセイこ
の例は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方またはいず
れかを含有する患者の被検体を使用してこの発明の詳細
な説明する。

被検体は、各患者について２つの綿棒を使用して医院お
よび病院の各種患者から得た。１つの綿棒は医院または
病院において５ｕｒｅｃｅｌｌ　（商品名）試験装置で
この発明を実施するために使用し、第二の綿棒は標準的
な培養方法を使用する確認試験について使用した。

各患者に由来する第１の綿棒を抽出チューブに入れ、例
１の組成物（ｌＩｌｌ）を加えた。各綿棒を抽出溶液中
で１〜２分間渦を巻かせた後、フィルター装置〔上層と
してポリエステルプラグ、中間に１０ｍのＨＤＣおよび
底面に５μのＬｏｐｒｏｄｙｎｅ　（商品名）フィルタ
ーから戒る〕を通して得られた抽出物を予備濾過した。

次に、予備濾過した抽出物（２００ｍ　）を、各試験装
置の各ウェル中に入れ、ウェル中の膜にすべてのＨ３Ｖ
抗原を吸着させた。

各試験ウェルを、前記洗液（１２０ｄ）で洗浄し、次い
で前記過酸化水素溶液（１２０ｄ）を加えてすべての非
特異的オキシダーゼを除去した。各ウェルを、再度洗液
（１２０ｐ１）で洗浄した。前記ブロッキング組成物中
標識した抗−クレアチンキナーゼ接合体の試料（４０Ｉ
ＩＩ）を、各試験装置の負対照ウェルに加えた。抗−Ｈ
３Ｖ接合体の試料（４０ｄ　）を、各装置の他の２つの
ウェルに加えた。

抗体−抗原複合体化を行うため室温で５分インキュベー
ション後、それぞれのウェルを前記洗液で（各毎に２０
０１１１’）で２度洗浄した。

前記ロイコ染料組成物（４０Ｉ１１）を、各試験ウェル
に加え、室温で５分インキュベーション後、膜上の赤味
がかった色素の存在を被検体中のＨ３■抗原の存在を示
すものとして評価した。試験した患者の試料については
、感度（真の陽性数を、真の陽性数と偽の陰性数との総
和で割った値）が８３％で、特異性（真の陰性数を真の
陰性数と偽の陽性数との総和で割った値）が１００％で
あった。この方法の陽性の結果のすべては、培養の結果
により確認された。

３：　　　Ｈにおける　“ この例は、抽出組成物が低いｐＨ（８，５未満）に緩衝
化した類似の方法と本発明の実施例を比較する。

材ニレ 各試験ウェルに５μのナイロン微孔質膜を含有するシュ
アセル（Ｓｕｒｅｃｅｌｌ　（商品名））試験装置を使
用した。

この発明の水性抽出組成物は、エタノ−ルアξン塩酸塩
（０，２６モル濃度）中、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ
）ＮＰ４０非イオン界面活性剤（５重量％）、ドデシル
硫酸ナトリウム（０，５重量％）およびデオキシコール
酸ナトリウム（１重量％）から調製した。これらの抽出
組１′Ｉｉ、物のｐＨは、９〜１２であった。ｐＨ７を
有する対照の抽出組成物は、リン酸緩衝溶液で調製した
。

洗液は、エタノールアミン塩酸塩（０，２６モル濃度）
、ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０非イオイ界面活性剤
（０，１重量％）および防腐剤（０，０１重量％）を含
むように調製した。１２Ｎ水酸化ナトリウムを使用して
ｐＨ１０，７まで上昇させた。

その他の組成物および溶液は、前述したものを使用した
。

１」二り土： ＨＳＶ−１抗原および妨害物質を含有する試料は、リン
酸緩衝溶液（０，１■／ｒｄウシ胎児血清、１００ｐｌ
’）　中、全血（２５１！１）、ＨＬ−６０１ｉ１胞（
５ＸＩＯ’　個細胞／ａｄ、＾ＴＣＣＣＣＬ−２４０，
５０Ｊ１１）　、ＨＥＰ−２細胞（１０４個細胞／ｄ、
　ＡＴＣＣＣＣＬ−２３，５ｄ）　、ブタのムチン（２
００〆）およびＨＳＶ−１抗原から調製し、１：４００
０希釈物を各試験ウェルに加えた。

バックグランド試料は、妨害物質だけを含むように調製
した。

試験試料とバックグランド試料（６５ｄ　）の両者を、
各抽出組成物（９２５ｉｌｌ”）と混合した。室温で１
〜２分インキュベージ５ンした後、溶液を予備濾過し、
試験装置の各試験ウェルに加えた（ウェル当たり２００
ｄ）　。

洗液（２００ｄ　）を各ウェルに加え、次いで過酸化水
素溶液（１２０，ｄ）を加えた。次に、２度目の洗液（
１２０〆）を各ウェルに加えた。

ブロッキング組成物中ペルオキシダーゼ標識抗Ｈ３Ｖ　
（１，８ａｔ／ｄ）を各ウェルニ加え、次イテ５分間室
温でインキュベーションした。もう−度洗浄（２００Ｉ
！１）　した後、ロイコ色素生成組酸物（４０１）を加
えた。室温でさらに５分インキエベーションした後、各
膜上の色素を透過濃度（Ｄｒ　）で測定した。結果は、
下記の第１表に示す。表は、低いｐｉｔの抽出組成物を
使用すると何も試験装置の膜を通過しないことを明らか
にする。従って、アッセイは実施できなかった。しかし
ながら、ｐＨ９〜１２を有するこの発明の抽出組成物で
は、良好な感度と通過が達成された。

対照（７，０） 例３　（９，０）　　　０．１９８　　　　　０．０２
３例３　（１０，４）　　　０．２３５　　　　　０．
０３３例３　（１２，０）　　　０．１５６　　　　　
０．０２３０膜を通過する流体は得られなかった。膜は
目詰りを起こし、何等の試験結果も得られなかった。

４　：　　　　　　　　で　　　　　　　　　　を　　
　　　るこの例は、ヘルペスアッセイで目的の膜通過性
および感度を得るには、本発明の抽出組成物を特徴付け
る全成分を有することが重要であることを例示する。

ｌＬ＝ 試験ウェルに特定のポリマービーズ〔２μ、ポリ（スチ
レン−ニーｍおよびｐ−クロロメチルスチレン）、リン
酸緩衝溶液中０．１％の固形分〕を付着して担持する５
ｕｒｅｃｅｌｌ　（商品名）試験装置を使用した。

水性抽出組成物は次のように調製した：この発明の組成
物は、ドデシル硫酸ナトリウム（０，１重量％）、デオ
キシコール酸塩（０，２重量％）　、Ｎｏｎ１ｄｅｔ　
ＮＰ４０非イオン界面活性剤（１重量％）およびエタノ
−ルアξン塩酸塩（０，２６モル濃度）を含んでなり、
そしてｐＨ９を有する。

対照ＩＪＩ或物放物、ドデシル硫酸ナトリウム（１，３
重量％）およびエタノールアミン塩酸塩（０，２６モル
濃度）のみを含んでなり、そしてｐＨ９を有する。

対照ｍ酸物Ｂは、デオキシコール酸塩（１，３゛重量％
〉およびエタノ−ルアξン塩酸塩（０，２６モル濃度）
のみを含んでなり、そしてｐＨ９を有する。

対照組成物Ｃは、Ｎｏｎ１ｄｅｔ　ＮＰ４０非イオン界
面活性剤（１，３重量％）およびエタノールアミン塩酸
塩（０，２６モル濃度）のみを含んでなり、モしてｐ）
Ｉ９を有する。

洗液は、エタノールアミン塩酸塩（０，２６モル濃度〉
およびＴｗｅｅｎ　２０非イオン界面活性剤（１重量％
）を有するように頁製し、１２Ｎ水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ１０，４とした。

抗原を含有する試験試料は、前述のＨ３Ｖ細胞溶解物（
１０ｄ）から調製し、ウシ血清アルブミン含有（０，１
■／Ｉｄ）リン酸緩衝溶液で１：４０に希釈した。各試
験ウェルに１＝４０００希釈物を加えた。

次の妨害物質を含有するバックグランド試料を調製した
ニリン酸緩衝溶液（抽出溶液ｌ−当たり８０１１り中、
全血（２５ＪＩＩ／ｄ）　、ブタノムチ７　（２０ｔｄ
／戚）、ＨＬ−６０細胞（５ｔ１！／ｄ）およびＨＥＰ
−２細胞（５パ／ｄ）。

他の溶液および組成物は前述の例１と同様なものを使用
した。

１」５立」−： 試験試料およびバックグランド試料（１３５１１１）の
それぞれを、各抽出組成物（８６５ｍ）に加え、５分間
室温で混合した。得られた混合物を予備濾過した後、各
試料（２００Ｉ！！’）毎に各試験ウェルに加え、次い
で洗浄（２００ｍ）した。次いで、各試験ウヱルに過酸
化水素溶液（１２０１１りを加え、さらにもう−度洗浄
（２００ｍ）した。

ペルオキシダーゼ標識抗ヘルペス接合体（４０ｍ）の添
加後、室温で５分間インキュベーションした。

さらに洗浄（４００ｄ）を行い、ロイコ色素生成組成物
（８０ｍ　）を各試験ウェルに加えた。室温で５分間イ
ンキュベーションを続けた。アジ化ナトリウム（８０ｍ
、０．１重量％）を添加することにより色素生成を停止
させ、Ｄ、を測定した。結果を第■表に示す、これらの
結果は、抽出組成物中に本発明で特定した成分のすべて
を有するものだけが良好な通過が可能で、かつ高感度が
得られることを示す。

員−１−天 ７ 対照Ａ　　速い　　　０．０．３３　　　　　　０．０
１７対照Ｂ　　　遅い　　　０．１１１　　　　　　０
．０１７対照Ｃ非常に遅い　０．１５７　　　　　　０
．０１１〔発明の効果〕 この発明の抽出組成物は、迅速かつ効果的に生物学的被
検体中のＨ３ＶまたはＨ３Ｖ感染細胞を溶解して感度の
よいアッセイのために十分な抗原を遊離させる。溶解は
、一般に２分未満で非常に迅速で、かつ標準的な装置を
使用して室温で実施することができる。そのため、抽出
段階で高温が避けられる。一般に、オペレーターの熟練
度は必要でない。

目的のエピトープ部位を破壊することなく妨害物質が除
去される抽出組成物および抽出方法を使用する本発明に
よればＨ３Ｖが効率よく検出される。

また、固体支持体（例えば、微孔質膜）および単一試験
装置を使用してこの発明のアッセイが効率よ〈実施でき
ることもわかった。既知の抽出組成を使用するアッセイ
と異なり、この発明は、前記試験装置を使用して可溶性
？ｌ質と不溶性物質の迅速な分離を提供する。

これらの利点は、高ｐＨ（８，５〜１２）に緩衝化され
そしてアルコールアミンもしくはその塩、特殊の非イオ
ン界面活性剤、コール酸もしくはその誘導体もしくはそ
の塩およびアニオン界面活性剤の特定の組み合わせを含
むこの発明の特殊な抽出組成物を使用することで達成さ
れる。好ましい態様では、この組成物の特に有用な任意
の成分が無機塩である。それらの物質は前述されている
。必要な材料をより少なく含有する組成物は、目的の結
果を提供するのに有効でない（前記例３を参照のこと）
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｐＨ８．５〜１２を有し、そしてアルコールアミン
   もしくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオキシ
   ドとの縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コール酸
   もしくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン界面
   活性剤を含んでなる単純ヘルペスウィルスから抗原を抽
   出するのに有用な抽出組成物。 ２、単純ヘルペスウィルスを含有することが予期される
   被検体を、ｐＨ８．５〜１２を有しそしてアルコールア
   ミンもしくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオ
   キシドとの縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コー
   ル酸もしくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン
   界面活性剤を含んでなる抽出組成物と接触させることを
   特徴とする単純ヘルペスウィルスからの糖タンパク質抗
   原の抽出方法。 ３、Ａ、ｐＨ８．５〜１２を有しそしてアルコールアミ
   ンもしくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオキ
   シドとの縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コール
   酸もしくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン界
   面活性剤を含んでなる抽出組成物により単純ヘルペスウ
   ィルスを含有することが予期される被検体から単純ヘル
   ペスウィルス抗原を抽出する工程、 Ｂ、抽出された抗原をそれに対する抗体と 接触させて免疫学的複合体を形成する工程、ならびに Ｃ、被検体中の単純ヘルペスウィルスの存在の指標とし
   て前記複合体の存在を測定する工程、を含んでなる単純
   ヘルペスウィルスの測定方法。 ４、ｐＨ８．５〜１２を有しそしてアルコールアミンも
   しくはその塩、アルキルフェノールとエチレンオキシド
   との縮合生成物を含む非イオン界面活性剤、コール酸も
   しくはその誘導体もしくはその塩およびアニオン界面活
   性剤を含む抽出組成物を含んでなる単純ヘルペスウィル
   スの測定に有用な診断試験キット。 ５、ＡＴＣＣＨＢ−９６８４として寄託されているハイ
   ブリドーマ細胞系２８３−２Ａ１−１Ｄ４−２Ｃ３。 ６、単純ヘルペスウイルス−１と単純ヘルペスウイルス
   −２とに共通な糖タンパク質抗原上のエピトープに反応
   性であり、ＡＴＣＣＨＢ−９６８４として寄託されてい
   るハイブリドーマ細胞系２８３−２Ａ１−１Ｄ４−２Ｃ
   ３に由来するモノクローナル抗体。