JPH02156157A - 正荷電イオン性バインディング支持体を使用するクラミジア抗原または淋菌抗原の測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物学的被験体中のクラミジア生菌体または
淋菌生菌体についての診断方法に関する。

より詳細には、正荷電固体支持体を使用するこれらの生
菌体から抽出される抗原の検出に関する。

〔従来の技術〕

最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、その上相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速で
あることも必要である。

イムノアッセイによって検出することができるかかる生
菌体の１つは、タラミジアーレス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
ｌｅｓ）目、タラミジアセｘ　（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃ
ｅａｅ）属の２つの菌種の１つであるクラミジア・トラ
コマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉ
ｓ）　（本明細書では、「Ｃ，トラコマチス」という）
である。トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性リンパ肉
芽腫、非淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を包含する多数
のヒトの眼および性器の疾病の原因となるこの種に属す
る１５以上の菌株が存在する。Ｃ，トラコマチスに由来
する感染症は、普通の人々の間で蔓延し、そのため非淋
菌性尿道炎だけをとっても各年毎に数百万人存在すると
信じられる。

淋病は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、特にＮ
。

ゴノロエｘ　（Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に属す
る細菌により惹起される性器接触で一般に伝播される疾
病である。この疾病は年に数千の人間を疫病にかからせ
、たとえ抗生物がその蔓延の抑制に役立っているとはい
え、いまだ世界の多くの地域の流行期にある人々の間に
存続している。この細菌の検出および処置の重要性は、
十分に認識されている。Ｎ。

メニンギチジス（Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）お
よびＮ。

ラクタミカ（Ｎ、　Ｉａｃｔａｍｉｃａ）もまた、無視
できない医療上ふよび診断上の対象の種である。

これらの疾病の広く蔓延する性質のため、クラミジア生
菌体および淋菌生菌体の検出に関する迅速、簡便かつ信
頼性のある試験法を人手することに相当な興味が注がれ
ている。クラミジア生菌体由来の検出可能な抗原を抽出
するための有用な方法を見い出すべく相当な数の研究が
行われてきた。

例えば、米国特許第４．４２７．７８２号および同４．
６６３．２９１号明細書ならびにヨーロッパ特許公開第
１７４．１０６号および同１９３．４３１号公報参照の
こと。

固体支持体を使用して実施されるＣ、）ラコマチスおよ
びＮ、ゴノロエエ用アッセイは、米国特許第４．４９７
．８９９号及び同４．４９７．９００号明細書に記載さ
れている。記載されたアッセイは、それらの生菌体から
抗原を抽出する工程およびそれを裸の固体支持体上に塗
布する工程により行われている。

次に、この塗布された抗原は、１種は適切に標識されて
いる１種または２種のいずれかの抗体により検出されて
いる。このアッセイの主な特徴は、どのような材料によ
る処理または塗布もされていない付着に適合する固体支
持体にある。すなわち、支持体と抗原との間に化学的ま
たは免疫学的バインディングは全ったく存在しない。抗
原の付着は、支持体上に抗原の吸着を起こさせるのに十
分長い時間その塗布支持体をインキュベーションするこ
とにより達成されていることが明らかである。

〔発明が解決しようとする課題〕

米国特許第４．４９７．８９９号明細書では、支持体に
抗原がバインディングするための時間が、高められた温
度（３７℃）で少なくとも３０分かかる。このアッセイ
全体を行うには少なくとも３時間かかる。

高い信頼性を有しそして室温で行うことのできるクラミ
ジア生菌体または淋菌生菌体についての遥かに迅速なア
ッセイを入手することが望まれるであろう。

〔課題を解決するための手段〕

前記課題は、Ａ、クラミジア生菌体または淋菌生菌体を
含むことが予測される被験体からそれぞれ抽出されたク
ラミジア抗原または淋菌抗原を、その抗原と反応するい
かなる生物学的化合物も実質的に含まないポリマー固体
支持体であって、その固体支持体にクラミジア抗原また
は淋菌抗原を直接イオン的にバインディングさせるよう
な複数の正荷電基をその表面上に有するポリマー固体支
持体と接触させる工程、 Ｂ、前記接触の１０分以内にイオン的にバインディング
した抗原からバインディングしていない物質を分離し、
次いでバインディングしたクラミジア抗原または淋菌抗
原をそれぞれクラミジア抗体または淋菌抗体と接触させ
ることにより、前記支持体上に免疫複合体を形成する工
程、ならびにＣ１前記抗体−抗原接触の１０分以内に複
合体化していない抗体から前記免疫複合体を分離し、次
いで被験体中のクラミジア抗原または淋菌抗原を測定す
る代わりに支持体上の前記複合体の存在をそれぞれ測定
する工程、を含んでなるクラミジア抗原または淋菌抗原
の測定方法によって解決される。

さらに詳しくは、Ａ、生物学的被験体中のクラミジア細
胞または淋菌細胞からそれぞれクラミジア抗原または淋
菌抗原を抽出する工程、Ｂ、そのクラミジア抗原または
淋菌抗原を、その抗原に対する抗体を実質的に全ったく
含まないポリマー固体支持体であって、その固体支持体
に抗原を直接イオン的にバインディングさせるような複
数の正荷電基をその表面上に有するポリマー固体支持体
と接触させる工程、 Ｃ９前記接触の５分以内にイオン的にバインディングし
た抗原からバインディングしていない物質を分離し、次
いでそのバインディングした抗原を未標識クラミジア抗
体または未標識淋菌抗体とそれぞれ接触させることによ
り、前記支持体上に免疫複合体を形成する工程、 Ｄ、複合体化していない物質から前記複合体を分離する
工程、 Ｅ、その複合体をクラミジア抗体または淋菌抗体に対す
る標識抗体と接触させることにより標識抗体−抗体−抗
原複合体を形成する工程、Ｆ、工程Ｅの接触５分以内に
複合体化していない物質から前記標識複合体を分離する
工程、ならびに Ｇ、被験体中のクラミジア生菌体量または淋菌生菌体■
を測定する代わりに前記支持体上の標識複合体を測定す
る工程、を含んでなるクラミジア生菌体または淋菌生菌
体の測定方法が提供される。

本発明は、いずれかの適当な医療または診断上の技術を
使用して患者から得られた生物学的・被験体中のＣ，）
ラコマチス（もしくは他のクラミジア種）の存在または
Ｎ、ゴノロエエ（もしくは他の淋菌種）の存在を測定す
る方法を含んでなる。

このような被験体としては、例えば、患者の頚管、尿道
、咽喉または肛門および滑液または病巣由来の流体のよ
うな体液から得られる綿棒被験体が挙げられる。こうし
て得られる生物学的被験体は、測定されるべきクラミジ
ア抗原または淋菌抗原（あるいはそれらの混合物）を含
む細菌を含有することが予測される。

このアッセイは、自然のままのクラミジア生菌体または
淋菌生菌体から抗原の検出を行うことができるが、アッ
セイ感度を高めるにはそれらの生菌体から抗原を抽出す
ることが一般に望ましい。

細菌を溶解し、含まれる抗原を遊離させるための標準的
な技法、例えば溶媒希釈もしくは高ｐＨ溶菌液、酵素処
理および超音波処理もしくは遠心のような物理的撹拌を
使用することができる。加熱もまた溶菌法として知られ
ている。アニオン洗剤またはドデシル硫酸ナトリウムお
よびデオキシコール酸ナトリウムのような塩もまた従来
技術に記載されている。

好ましい態様では、本発明はクラミジアのりポポリサッ
カライド（糖脂質群）抗原（例えば、ヨーロッパ特許公
關第１９３．４３１号公報に記載されるような）の検出
に使用することができる。抽出手順もその公報に記載さ
れている。もう一つの態様では、検出される抗原は、外
層膜蛋白を構成する全体の６０％を含む前記細菌のクラ
ミジア主要外層膜蛋白であってもよい。この抗原および
抽出方法は米国特許第４．４２７．７８２号明細書に記
載されている。ある例では、これらのクラミジア抗原混
合物が本発明を用いて検出され得る。さらにもう一つの
態様では、本発明が１種以上の淋菌抗原（ＩＡもしくは
ＩＢ蛋白）、または別個の淋菌株に由来する抗原混合物
の検出に使用される。

好ましい抽出組成物は、アルコールアミンを含み、高ｐ
Ｈを有するものである。この好ましい組成物のより詳細
は、例との関連で下記に示す。

さらに、抽出工程でプロテアーゼを使用して全血および
粘液を分解することが好ましい場合もある。

生菌体から抗原がひとたび抽出されてしまえば、必須で
はないが、次の処理をする前に被験体を予備濾過して細
胞残層、粒状物および他の不要物を除去することが望ま
しい。予備濾過は、ある型式のフィルターを備えた適当
な容器中で行うことができる。

抽出は、抗原の抽出のために特別に設計された装置を包
含するいずれかの適当な容器中で実施することができる
。有用な装置は、米国特許第４、７４６．６１４号明細
書を含む当該技術分野で知られている。

抽出された抗原は、表面上に複数の正荷電基を有するポ
リマー固体支持体と接触される。これらの正荷電基が支
持体表面上に正電荷（すなわち、広いｐＨ範囲にわたる
正のゼータ電位）を生じさせる。ゼータ電位は、支持体
とそれに接触する流体との間の電位として知られており
、一般に流体が支持体との接触により発生する電圧を測
定することによって決定される。また、荷電支持体を断
片化してそれを流体に分散させ、続いて得られた懸濁液
の電位を測定することによっても測定できる。

このような測定は、標準的な物理化学的技法を使用して
行うことができる。支持体上で所定のゼータ電位を発生
することができる正荷電化学残基のすべてが、本発明を
実施する上で利用できる。

例えば、この支持体は、抽出された抗原とイオン結合し
得る適当なカチオン基を表面上に有するいずれかの天然
または合成ポリマー材料で構築することができる。有用
なポリマーには、必要な荷電基を有するエチレン系不飽
和ビニルモノマーおよび当該技術分野で既知の他のモノ
マーから製造される付加ポリマー、ポリエステル、ポリ
アミド、ポリカーボネート、ポリエチレンイミン、セル
ロース系材料が含まれる。一般的に、カチオン基として
は、四級アンモニウム塩、四級ホスホニウム塩、四級ス
ルホニウム塩、四級ピリジニウム塩、四級ピリミジニウ
ム塩または四級イミダゾリウム塩が挙げられ、四級アン
モニウム塩が好ましいものである。

本発明の支持体は、ポリマー構造の一部として前記のよ
うなカチオン基を有しうるポリマーより成ることができ
る。これらの基は、カチオン基を含む出発原料（例えば
、モノマー）からポリマーを製造することにより支持体
中に組み込むことができる。また、ポリマーを正荷電基
を形成するための試薬と反応させることによって誘導ま
たは変性してもよく、例えば、クロロメチルフェニル基
を含有するポリマーをトリアルキルアミンと反応させて
ポリマー主鎖上に四級アンモニウム塩を形成することが
できる。また、イミダゾール基含有ポリマーは、クロロ
エタノールと反応させて四級イミダゾリウム塩を形成す
ることができる。これらの基はまた、正荷電出発原料（
例えば、正荷電エチレン系不飽和重合体モノマー）から
ポリマーを製造することによって組み込むこともできる
。

また一方、支持体は非イオン性ポリマーからなリ、それ
が適当に荷電した他の材料（一般に、もう一つのポリマ
ー）で被覆されていてもよい。例えば、ポリアミド、ポ
リエステルまたは付加ポリマーは、複数のカチオン基を
有する第二のポリマーを塗布することができる。

好ましいポリマー固体支持体は工業的に製造され、Ｐｏ
５ｉｄｙｎｅＴＸ膜またはＢｉｏｄｙｎｅ”膜として市
販されているものである。これらの膜は、細孔に四級ア
ンモニウム基を有するポリエステルで被覆されたナイロ
ン膜かみ成る。他の正荷電膜もまた本発明の実施に際し
て利用することができる。

ポリマー支持体は、適当な形状、例えばビーズ、フィル
ム、膜、ゲルまたはベレットのいずれにも成形すること
ができる。

本明細書で關示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また一
方、好ま七くは、アッセイを実施することができ、すべ
ての流体に適応できる使い捨て試験装置中に固定される
微孔質膜を有する。試験装置の有用な形状は、当該技術
分野で既知である。特に有用な装置は、特開昭６３−２
２３５６３号公報および特願昭６３−２３４６９２号明
細書に記載されている。

殆どの場合に、荷電支持体に抗原が接触するやいなや抗
原はそれに直接結合する。「直接」とは、支持体に付着
されている結合性成分または生物学的化合物（例えば、
抗体）を介して抗原が結合されないことを意味する。支
持体にある程度の抗原の吸着が起こるかも知れないが、
アッセイは必要量の抗原が支持体に吸着するには不十分
な時間適切でない条件下で実施されるので前記の現象は
重要でないと信じられる。いいかえれば、本発明のアッ
セイの読み取り時間内では吸着される抗原は少なすぎる
のでクラミジア抗原または淋菌抗原の検出感度を示さな
い。また、アッセイで使用される試薬または試験被験体
中に存在する可能性のある他の蛋白質、細胞成分もしく
は残層に比し、抗原は支持体へ優先的にバインディング
される。

その接触の１０分以内、好ましくは１〜５分以内にバイ
ンディングした抗原はクラミジア抗体または淋菌抗体と
接触され、こうして支持体上に免疫複合体が形成される
。同時に流体およびバインディングしていない物質は素
早く除去することができる。アッセイが使い捨て試験装
置を使用して行われる場合には、支持体は微孔質膜であ
ってもよく、この微孔質膜は抗原がこの膜にバインディ
ングされるにつれ被験体中の流体およびバインディング
していない物質がそれを通過することが可能なものであ
る。

このアッセイで使用される抗体は、１種以上のクラミジ
ア菌株または淋菌株（対象とする生菌体が何んであるか
に応じて）と特異的な免疫反応性を有する。それはモノ
クロナルまたはポリクロナルであってもよい。ポリクロ
ナルの場合には、それは市販されているか、または検出
される生菌体株に共通する抗原を使用して既知法により
各種動物で産生される。単一抗体またはそれらの混合物
を使用することができる。例えば、クラミジアのりポポ
リサッカライドもしくは主要な外層膜蛋白抗原のいずれ
かに対する抗体または両抗原に対する抗体が本発明のア
ッセイで使用することができる。好ましくは、抗体は市
販されているかまたは標準的なハイブリドーマ法を使用
して調製されるモノクロナルである。有用な抗体の調製
方法は当該技術分野で知られている。

−の態様では、抗原に対する抗体は検出のために標識さ
れる。利用可能な標識は当該技術分野で知られており、
適当な方法または装置を使用して直接検出することがで
きる化学的または生物学的な化合物、ならびに検出可能
な種を生ずるさらなる化学的または特異的バインディン
グ反応を介して検出することができる化合物が包含され
る。標識は、既知法を使用して抗体に結合することがで
きる。標識が直接検出できない場合には、試薬または化
合物に検出可能な反応を起こさせるかまたは特異的バイ
ンディング生成物を生じらすことが必要である。例えば
、標識がビオチンである場合、それは酵素に接合され検
出可能な種を提供するアビジンと反応することができる
。

特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであっ
て、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素
生成試薬を添加して検出可能な色素を提供する。例えば
、利用可能な色素生成試薬には、トリアリールイミダゾ
ールロイコ染料のようなロイコ染料またはペルオキシダ
ーゼと過酸化水素の存在下で反応して色素を生ずる他の
化合物（すなわち、ペルオキシダーゼの触媒活性に基き
反応して色素を生ずる化合物）が包含される。

好ましい態様では、クラミジア抗体または淋菌抗体は標
識されておらず、形成されそして支持体に結合される抗
体−抗原の検出は、前記の標識されていない抗体に対し
て特異的で、かつ適当に標識されている第二の抗体を使
用して遂行される。

前記のバインディングした抗原がクラミジア抗体または
淋菌抗体と接触された場合には、膜上にイオン的にバイ
ンディングした免疫複合体が形成される。この複合体の
形成を促進するには、抗体と抗原が一般に１５〜３０℃
の温度で１０分間未満インキュベーションされる。好ま
しくは、インキュベーションは１８〜２５℃（すなわち
、室温）で１〜５分間行われる。これらの温和なインキ
ュベーション条件は、従来技術で必要なものとして記載
される３７℃で３０分とは著しい対照を示す。

前記インキュベーション後であって、抗体−抗原接触の
１０分以内にバインディング複合体は、般にｐＨ７〜１
２の洗浄液により１度以上洗浄される。

前述の態様では、クラミジア抗原、または淋菌抗原が標
識されている場合、洗浄後のアッセイ手順は、標識を直
接検出するかまたは適当な試薬を添加した後に間接的に
検出することである。それはバインディングした複合体
を洗浄後、比較的早く、すなわち一般に１０分以内、好
ましくは１〜５分以内に行われる。場合により、標識の
検出は、試薬がインキュベーションを許容するならばそ
れによって促進してもよい。次に、標識は標準的な装置
および方法を使用して検出される。

好ましい態様では、クラミジア抗体または淋菌抗体は標
識されておらず、バインディングした複合体を洗浄した
後、それが標識されていない抗体に向けられる抗体と接
触される。この第二の抗体（すなわち、抗−抗体）は、
前述の標識のいずれかで適当に標識される。この抗体は
、モノクロナルまたはポリクロナルで市販のものかまた
は既知法を使用して調製されたいずれであってもよい。

クラミジアのアッセイでは、好ましくは抗−抗体がリポ
ポリサッカライドまたは主要外層膜蛋白抗原のいずれか
と反応するポリクロナル抗体である。

この接触後、支持体にイオン的にバインディングされる
得られた抗原−抗体−抗体複合体は、１５〜３０℃の温
度で１０分未満、好ましくは１８〜２５℃で１〜５分間
インキュベーションされる。

さらに洗浄を行って複合体化していない物質を除去し、
適当な酵素基質または必要な試薬を添加して検出可能な
種を提供する。次に、支持体上の前記バインディングし
た抗原−抗体−標識抗体複合体は、放射線、比色、蛍光
または他の標準的な検出法を使用して検出される。

〔実施例〕

以下の例で本発明をより具体的に説明するが、本発明の
範囲を限定するものでない。

これらの例を実施するために、クラミジアのりボボリサ
ッカライド抗原に対するマウスモノクロナル抗体を、標
準的なハイブリドーマ法およびマウス細胞系を使用して
調製し、０．０１重量％のアジ化ナトリウム含有リン酸
緩衝溶液（ＰＢＳ）　（ｐ、８７．４　）中で保存した
。アッセイで使用される抗体組成物は、蛋白質保護剤と
してカゼイン（０，５重量％）およびＬｏｎｚａ　１ｎ
ｅＴ′Ｃ両性界面活性剤（０，０１重量％）を含有する
ＰＢＳに前記抗体溶液試料（１９，’）を加えること（
希釈、１：８００）により調製し、次いで０．２２−の
フィルターで濾過して使用液を得た。

使用する標識ポリクロナル抗体は、ワサビペルオキシダ
ーゼに接合されたヤギ抗マウスエｇＧであった。この接
合体は、カゼイン（０，５重量％）およびＬｏｎｚａｉ
ｎｅ”Ｃ両性界面活性剤（０，０１重量％）を含有する
ＰＢＳで１：２０００に希釈し、０．２２−のフィルタ
ーで濾過して使用液を得た。

抗原抽出溶液は、以下の成分から調製した：アジ化ナト
リウム（０，０２７２７モル濃、塩化ナトリウム（０，
２７モル濃度）、塩酸エタノールアミン（０，４７％ル
濃度）、エチレンジアミン四酢酸・２ナトリウム（０，
０４５４５モル濃、！ＥｍｃｏｌＴＸＣＣ−３６カチオ
ン界面活性剤（ポリプロポキシ−ｔ−アミンの四級塩化
アンモニウム、１０％メタノール溶液中０．４５重量％
）および水酸化ナトリウム（０，６６モル濃度、ｐＨ１
１）。

この例は、一つはりポボリサッカライドＣ，）ラコマチ
ス（Ｃｌｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）抗原に向けられ、そ
して第二は標識されそのクラミジア抗体に向けられた２
種の抗体を使用する本発明の実施例である。

アッセイは、使い捨て試験装置で行った。これは表面に
四級アンモニウム基を有する微孔質Ｂｉｏｄｙｎｅ”−
８膜を備えていた。使用前に、この膜を２ｏｎｙｌＴｌ
″ＰＳＮ　（非イオン性フッ化界面活性剤）で処理した
。

Ｃ，トラコマチス生菌体の基本小体蛋白（ｅｌｅｍｅｎ
ｔａｒｙｂｏｄｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ）は、Ｗ、Ｊ、Ｎｅ
ｗｈａｌｌ教授（Ｉｎｄｉａｎａｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
）より人手した。リポポリサッカライド抗原は、綿棒上
の被験体を前述の抽出組成物を含有する抽出装置中で約
５分間回転させることによって約２０℃で抽出した。次
に、シトレート（０，７モル濃度溶液、１００ｊ＝ｆ　
）を添加してｐＨを約７〜８に低下させ、次いでプロテ
アーゼｌ”Ｐ４Ｏ１０，７〜１４車位／■、水１００ｍ
ｊ！中ＮａＣ１０，８７７ｇとトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノエタン塩酸含有溶液、ｐＨ８，０１を添加し
た。約２０℃でさらに５分間抽出を続けた後、過酸化水
素と水酸化ナトリウム（ｐＨ１０以上）を加えて内在す
るカタラーゼ、ペルオキシダーゼおよびミエロペルオキ
シダーゼを除去した。

次に処理した被験体を、５Ｊａ膜を通して濾過して不要
物を除去した。濾過抽出物（１２０Ａｆ）を使い捨て試
験装置の試験ウニ・ルに添加した。被験体流体を接触さ
せることにより膜を通して流出させた。

２または３秒以内に膜を通して全ての流体を排出し、次
いで前記モノクロナル抗体溶液（１２０１１１）を試験
ウェルに添加し、排液した。

膜にバインディングした免疫複合体を、ＰＢＳ（ｐＨ７
，２）中ＥｍｃｏｌＴｌ″ＣＣ−９力ｆ、ｔ：４面ｉ’
ｌ剤（０，７５重量％）溶液（１６０ｔ１りで２度洗浄
した。

２度目の洗浄の直後にペルオキシダーゼ標識ポリクロナ
ル抗体（１２０ｊ１１）を試験ウェルに添加し、次いで
流体を即座に排出した。約５分間約２０℃で再度インキ
ニペーションし、膜にイオン的に結合した抗原−抗体−
標識抗体を形成した。

前述の洗浄溶液（１６０４）で２度洗浄した後、色素生
成組成物（１２０ｔｔＩ）を試験ウェルに添加した。

この組成物は、過酸化水素（１０ミリモル濃度）、２−
　（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−４，５
−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾール・ロイコ
染料（０，００５重量％）、ポリ　（ビニルピロリドン
）（１重量％）、４′−ヒドロキシアセトアニリド（５
ミリモル濃度）およびエチレントリアミン五酢酸（１０
ミリモル濃度）を含む。

試験ウェル中で、室温で約５分後、被験体由来のクラミ
ジア抗原の存在を示す赤色色素が観察された。抗原抽出
以降の全アッセイは、３０分未満で行われた。

この例は、アッセイで単に１種の抗体が使用される以外
は例１と同様である。この抗体は、Ｃ。

トラコマチスのりボボリサッカライド抗原に対するペル
オキシダーゼ標識マウスモノクロナル抗体であった。こ
の標識抗体は、標準的なハイブリドーマ法を使用して得
た。

抗原は、ＰＢＳ中ポリオキシエチレン−９−ラウリルエ
ーテル（０，０５重量％、８０４）、２ｏｎｙｌＴＸＦ
ＳＮ（１重量％、８０Ｉ）およびエチレンジアミン四酢
酸（２０ミ！Ｊモル濃度、８０Ｉ）混合物を使用して基
本小体蛋白質から抽出した。ＰＢＳ量は、緩衝化対照溶
液について５６０１１１から抗原５７５０ｐｇ含有試料
について５１０ｊ７と変化させた。抽出は、４５℃で１
０分間行い、１０秒間撹拌し次いで室温まで冷却した。

使い捨て試験装置中のＰｏ５ｉｄｙｎｅ′ｒＭ膜を、ポ
リオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（０，００５
重量％、１００ｊ’　）、２ｏｎｙｌ”ＦＳＮ（０，１
重量％）およびエチレンジアミン四酢酸（２０ミリモル
濃度）で予備湿潤させ、次いで１５分間３７℃で乾燥さ
せた。

各種濃度の抗原（２８８，５７５，１１５０，２８７５
および５７５０ｐｇ　）を有する抽出抗原溶液と対照溶
液を、個別に使い捨て装置に加え、それぞれの流体を排
出した。

ペルオキシダーゼ標識接合体溶液（２００−’）を、容
易に入手できる脱脂乾燥乳（１重量％）で１＝４５０に
希釈し、０．０５モル濃度ＰＢＳ　（ｐ）１７．２）中
ウシ給仕血清（１重量％）を添加し、次いで反応混合物
を試験装置中負圧で膜の上端に流体を保持したまま温度
で５分間インキコペーションした。

次に、膜を通して流体を排出した。

ＰＢＳ中にＥｍｃａｌ”ＣＣ−９力チオン界面活性剤（
０，７５重量％）含有洗浄液（５００ｐ１）を試験装置
に加え、次いで排液した。

前述のロイコ染料溶液（５０−’）を試験装置に加え、
流体を負圧で膜の上端に維持させた。２または３秒後、
流体を排出して色素を生じさせた。

色素濃度を視覚的に読み取り爬階付けしたところ、試験
される抗原】の増加と共に色が段階的に増加することが
わかった。対照溶液では、全く色素は観察されなかった
。

例３：比較例 この例では、本発明のアッセイを、米国特許第４、４９
７．８９９号に記載されるのと同様のＡｂｂｏｔｔＣｈ
ｌａｍｙｄｉａｚｙｍｅＴＮ７　ッセイと比較した。

リポポリサッカライド抗原を、トリシン（ｔｒｉｃｉｎ
ｅ）緩衝液（０，０５モル濃度、ｐＨ８，７５）中エタ
ノールアミン（１重量％）、水酸化ナトリウム（０，０
２Ｎ）を用い室温で１０分間基本小体蛋白質から抽出し
、いろいろな量の抗原（１０〜１０．０００ｐｇ）を含
有する溶液を提供した。

従来技術のアッセイはパッケージ中の説明書〔説明書（
ｉｎｓｅｒｔ）　８３−１２９３／Ｒ４，１９８５年１
２月りの指示に従って行った。これらの指示は、米国特
許第４．４９７．８９９号明細書の例１に記載されるも
のと同一である。アッセイの合計時間は、少なくとも５
時間であった。

本発明のアッセイは、以下のように実施した。

使い捨て試験装置のＰｏ５ｉｄｙｎｅ”膜を、ポリオキ
シエチレン−９−ラウリルエーテル（０，００５重！ｉ
％、１００ＩＬｌ）、２：ｏｎｙｌ”ＦＳＮ（０，１重
量％）およびＥｍｃａｌ”ＣＣ−９力チオン界面活性剤
（０，７５重量％）で予備湿潤させた。

いろいろな濃度の抗原（１０〜１０．０００ｐｇ）を有
する抽出抗原を、個別に使い揄で装置に添加し、同時に
流体を排出させた。

容易に入手可能な脱脂乾燥乳（１重量％）およびウシ給
仕血清（１重量％）、またはカゼイン（０，０５重量％
）およびＬｏｎｚａｉｎｅＴＭＣ両性界面活性剤を含有
するＰＢＳで１：１５００に希釈したりボポリサッカラ
イド抗原（前記）に対するポリクロナル抗体溶液（２０
０Ａｆ）を、負圧で膜上に流体が維持されるように試験
装置に加えた。室温で５分間インキュベーションした後
、液体を排出させた。

ＰＢＳ中Ｅｍｃａｌ”ＣＣ−９力チオン界面活性剤（０
，７５重量％）を含有する洗浄溶液（５００４）を、試
験装置に添加し、次いで排液させた。市販の脱脂乾燥乳
（１重量％）、ウシ給仕血清（１１遣％）またはカゼイ
ン（０，０５重量％）およびＬｏｎｚａｉｎｅ”Ｃ両性
界面活性剤（０，０１重量％）含有ＰＢＳ　（０，０５
モル濃度ンで１：１０００希釈したペルオキシダーゼ標
識抗−クラミシア抗体接合体溶液（２００ｔｄ）を添加
し、次いで前記反応混合物を試験装置中で膜上に流体を
維持したまま室温で５分間インキュベーションした。次
に、流体は膜を通して排出させた。

ＰＢＳ中εｍｃｏ　ｌ　ＴＸＣＣ−９力チオン界面活性
剤（０，７５重量％）含有洗浄溶液（５００ｉｄ）を、
試験装置に加え、次いで流体を排出させた。

前述のロイコ染料溶液（５０ｄ）を試験装置に加え、流
体を膜中に残存させた。２または３秒後、流体を排出さ
せると色素を形成した。

色素濃度を読み取り段階付けしたところ、従来技術のア
ッセイと同様に、本発明で試験した抗原量が増加するに
ともない色の段階的増加が観察された。従来技術はイン
キュベーション工程が３７℃で実施され、最小限５時間
アッセイに必要であるが、一方、本発明は室温でほんの
３０〜４５分必要であるにすぎない。

〔発明の効果〕

本発明のアッセイは、使用が迅速で、かつ信頼性と簡便
さを有する。例えば、室温で３０分未満で実施すること
ができる。抽出クラミジア抗原（例えば、Ｃ，トラコマ
チス由来）、特にそのリポポリサッカライドの検出に高
い信頼性を有する。それはまた、淋菌抗原（例えば、Ｎ
、ゴノロエエ由来）の迅速かつ感度のよい検出にも使用
することができる。

本発明の長所は、検出される抗原がバインディングされ
る正荷電ポリマー固体支持体の使用により達成される。

支持体への抗原のバインディングは、イオン的である。

抗原のバインディングは、一般にイオン荷電支持体に付
着しない他の蛋白質や細胞成分に比し優先的である。

抗原のイオン付着の使用は、従来技術が教えるような抗
原の単なる吸着よりも遥かに堅牢である。

具体的に本発明は、−船釣には、抽出後３０分以内で実
施される。多くのアッセイで付、抽出工程でさえも３０
分間以内に実施することができない。さらに、従来の長
い吸着操作は、精巧な分析装置を必要とする高めた温度
（３７℃）で数度のインキュベーションを必要とする。

本発明は、最小限の装置と技術的熟練度により室温で実
施することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ、クラミジア生菌体または淋菌生菌体を含むこと
   が予測される被験体からそれぞれ抽出されたクラミジア
   抗原または淋菌抗原を、その抗原と反応するいかなる生
   物学的化合物も実質的に含まないポリマー固体支持体で
   あって、その固体支持体にクラミジア抗原または淋菌抗
   原を直接イオン的にバインディングさせるような複数の
   正荷電基をその表面上に有するポリマー固体支持体と接
   触させる工程、 Ｂ、前記接触の１０分以内にイオン的にバインディング
   した抗原からバインディングしていない物質を分離し、
   次いでバインディングしたクラミジア抗原または淋菌抗
   原をそれぞれクラミジア抗体または淋菌抗体と接触させ
   ることにより、前記支持体上に免疫複合体を形成する工
   程、ならびにＣ、前記抗体−抗原接触の１０分以内に複
   合体化していない抗体から前記免疫複合体を分離し、次
   いで被験体中のクラミジア抗原または淋菌抗原を測定す
   る代わりに支持体上の前記複合体の存在をそれぞれ測定
   する工程、を含んでなるクラミジア抗原または淋菌抗原
   の測定方法。 ２、Ａ、生物学的被験体中のクラミジア細胞または淋菌
   細胞からそれぞれクラミジア抗原または淋菌抗原を抽出
   する工程、 Ｂ、そのクラミジア抗原または淋菌抗原を、その抗原に
   対する抗体を実質的に全っく含まないポリマー固体支持
   体であって、その固体支持体に抗原を直接イオン的にバ
   インディングさせるような複数の正荷電基をその表面上
   に有するポリマー固体支持体と接触させる工程、 Ｃ、前記接触の５分以内にイオン的にバインディングし
   た抗原からバインディングしていない物質を分離し、次
   いでそのバインディングした抗原を未標識クラミジア抗
   体または未標識淋菌抗体とそれぞれ接触させることによ
   り、前記支持体上に免疫複合体を形成する工程、 Ｄ、複合体化していない物質から前記複合体を分離する
   工程、 Ｅ、その複合体をクラミジア抗体または淋菌抗体に対す
   る標識抗体と接触させることにより標識抗体−抗体−抗
   原複合体を形成する工程、 Ｆ、工程Ｅの接触５分以内に複合体化していない物質か
   ら前記標識複合体を分離する工程、ならびに Ｇ、被験体中のクラミジア生菌体量または淋菌生菌体量
   を測定する代わりに前記支持体上の標識複合体を測定す
   る工程、を含んでなるクラミジア生菌体または淋菌生菌
   体の測定方法。