JPH02211895A - 高ｐｈ抽出組成物ならびにクラミジア抗原の抽出および測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、抽出組成物およびクラミジア生菌体、淋菌
生菌体またはヘルペス生体の測定へのその使用に関する
。詳細には、適当な抗原の抽出に有用な組成物、その抗
原の抽出方法および測定方法に関する。

〔従来の技術〕

最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するための試金石とし
ては、加えて、相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速
であることも必要である。

イムノアッセイによって検出することができるかかる生
菌体の１つは、タラミジアーレス（Ｃｈｌａ−ｍｙｄｉ
ａｌｅｓ）　目、クラミジアセｘ　（Ｃｈｌａｍｙｄｉ
ａｃｅａｅ）属の２つの菌種の１つであるクラミジア・
トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　　ｔｒａｃｈｏｍ
ａｔｉｓ）　（本明細書では、「Ｃ，トラコマチス」と
いう）である。トラコーマ、佳人体性結膜炎、性病性リ
ンパ肉芽腫、非淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を包含す
る多数のヒトの眼および性器の疾病の原因となるこの種
に属する１５以上の菌株が存在する。Ｃ，）ラコマチス
に由来する感染症は、普通の人々の間で蔓延し、そのた
め非淋菌性尿道炎だけをとっても各年毎に数百万人存在
すると信じられる。

ワクチンや各種の抗ウィルス剤による様々なウィルスの
抑制方法の増加にもかかわらず、単純ヘルペスウィルス
（Ｈ３Ｖ）のような生物体による感染には重大な課題が
残存している。Ｈ３Ｖには２つの型が存在し、１型は人
体の口の周辺で主に感染を起こし、一方、２型は人体の
性器周辺で主に感染を起こす。皮膚感染とウィルス性脳
障害は、Ｈ３Ｖ感染由来の重大な疾病のうちのほんの２
種にすぎない。

淋病は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、特にＮ
。

ゴノロエｘ　（Ｎｌｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）　　に属
する細菌により惹起される性器接触で一般に伝播される
疾病である。この疾病は年に数千の人間を疾病にかから
るとはいえ、いまだ世界の多くの地域の流行期にある人
々の間に存続している。この生菌体の検出および処置の
重要性は、十分に認識されている。

Ｎ、メニンギチジス（Ｎｌｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）
およびＮ。

ラクタミカ（Ｎ、　Ｉａ（ｔａｍｉｃａ）　　もまた医
療上および診断上無視できない対象の種である。

これらの疾病の広く蔓延する性質のため、これらの原因
となる生物体の検出について迅速、簡便かつ信頼できる
試験を人手することに相当な興味が存在する。これらの
生物体から検出可能な抗原を抽出する有用な方法を見い
出すべく相当な研究が行われてきた。

生物学的被験体中の前記生物体からの抗原の抽出は、正
確、迅速かつ感度のよいアッセイを提供する上で重要で
ある。抽出について、超音波、加熱または遠心による細
胞の物理的崩壊を含む多種多様な方法が使用されてきた
。化学的抽出組成物もまた開発されてきている。例えば
、クラミジア生菌体のりポボリサッカライド抗原は、フ
ェノールと水の混合物を使用して抽出された。

エタノールアミンは、ヨーロッパ特許公開第１８３３８
３号公報に記載されるように８を下まわるｐＨで界面活
性剤と組み合わせ、そして高温（例えば、７０〜１１０
℃）に加熱してクラミジア抗原を抽出する目的で使用さ
れていた。

高いｐＨの抽出はヨーロッパ特許公開第１７４１０６号
公報に記載されており、その公報では、被験体をｐＨ６
〜８にさらし、次いでｐＨ８〜１２．５にさらした後中
和している。この高ｐＨ段階中にその被験体は５〜３０
分のインキュベーションにかけられ、その一定の時間は
高温（１００℃まで）である。

〔発明が解決しようとする課題〕

高い信頼性を有しそして室温で実施することが可能なり
ラミシア抗原、淋菌抗原およびヘルペス抗原のためのよ
り一層迅速な試験法を入手することが望まれるだろう。

このような試験法は、高温または長時間のインキュベー
ションを必要としない簡便、迅速かつ効率的な抽出組成
物に強く依存するであろう。

〔課題を解決するための手段〕

前記課題は、少なくともｐＨ８を有し強塩基および少な
くとも１ｍｇ／ｍｊ２の量で存在するアルコールアミン
を含んでなる組成物であって、クラミジア生菌体、淋菌
生菌体またはヘルペス生体から抗原を抽出するために有
用な抽出組成物によって解決される。

この発明は、また、Ａ、クラミジア生菌体、淋菌生菌体
またはヘルペス生体を含むことが予測される被験体を供
給する工程、ならびに Ｂ、検出する目的で前記被験体を、前記抽出組成物と接
触させ、それぞれクラミジア抗原、淋菌抗原またはヘル
ペス抗原を抽出する工程、を含んでなるクラミジア生菌
体、淋菌生菌体またはヘルペス生体から抗原を抽出する
ための方法も提供する。またさらに、Ａ、前述の組成物
で、クラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス生体
を含むことが予測される被験体から、それぞれクラミジ
ア抗原、淋菌抗原またはヘルペス抗原を抽出する工程、 Ｂ、前記抽出した抗原を、それらの抗体と接触させて免
疫複合体を形成する工程、ならびにＣ０被験体中の前記
生物体の存在を示すものとして前記複合体の存在を測定
する工程、を含んでなるクラミジア抗原、淋菌抗原また
はヘルペス抗原の測定方法も提供する。

本発明は、標準的な医療および微生物学的方法を使用し
て患者から得られた生物学的被験体中のクラミジア生菌
体、淋菌生菌体またはヘルペス生体の存在を測定するた
めの抽出組成物および抽出方法ならびにその測定方法を
含む。このような被験体としては、例えば、患者の頚管
、尿道、眼、咽喉または肛門から得られる綿棒、および
滑液または病巣由来の流体のような体液が挙げられる。

こうして得られる生物学的被験体は、測定されるべき抗
原を含むクラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス
生体を含むことが予測される。

当該技術分野の幾つかのアッセイは、細胞またはウィル
ス感染細胞をそのまま検出するようにも設計されてはい
るが、本発明の長所は、細菌細胞またはウィルスを効率
よく溶解して細胞質から完全に抗原を抽出し、比較的短
時間に感度のよいアッセイを提供することにある。抗原
は、感染した宿主細胞全体または試料中の綱状体もしく
は基本小体のいずれかから抽出される。

本発明により一般に検出されるクラミジア抗原は、その
生菌体のりボボリサッカライド（糖脂質群）抗原または
主要外層膜蛋白である。ある態様では両抗原が同時に検
出される。しかしながら、好ましい態様では、リポポリ
サッカライドがＣ。

トラコマチスを検出するのに最も興味のある対象である
。

もう一つの態様では、各種淋菌生菌体、例えばＮ、ゴノ
ロエエが、それらの生菌体から抽出された蛋白ＩＡもし
くはＩＢ外層膜抗原の存在を測定することによって検出
される。単一株を検出することができるが、好ましくは
混合株が検出される。

さらにもう一つの態様では、Ｈ３Ｖ株（Ｈ３Ｖ−１もし
くはＨ３Ｖ−２単独かまたは両者共）の検出が提供され
る。これらのピリオン（ｖｉｒｉｏｎ）の糖蛋白は、本
発明によって抽出されそして検出される。

さらに、ウィルス感染細胞を溶解し可溶化すると細胞内
ウィルスまたは膜会合性ウィルス抗原を遊離することが
できる。

この発明の抽出組成物は、いずれかの適当な緩衝剤、強
塩基またはそれらの混合物を使用して、少なくともｐＨ
８、好ましくは少なくともｐＨ９を有する。少なくとも
ｐｔ（１０であることが最も好ましい。

一般に、適切なｐＨは、組成物中に適当量の強塩基また
は緩衝剤を含ませることによって提供される。

本明細書で使用する「強塩基」の語は、２５℃で少なく
とも８のｐＫａを有する化合物を意味する。好ましい強
塩基は、２５℃で少なくとも９のｐＫａを有する。当業
者には極めて明らかであろうが、利用可能な塩基として
は、水酸化アルカリ金属、水酸化アルカリ土類金属およ
び水酸化アンモニウム（例えば、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム
および水酸化リチウム〉、リン酸塩（例えば、リン酸三
ナトリウムおよびリン酸三カリウム）、トリ　（ヒドロ
キシメチル）アミノエタンおよび類似化合物が挙げられ
る。組成物中の強塩基量は、塩基のｐＫａに応じて変化
し得るが、一般に１〜３０■／−が有用であり、そして
２〜２０ｍｇ／ｍｌが好ましい。

抽出組成物は、さらにアルコールアミンまたはその塩を
１〜３０■／ｍ！、好ましくは２〜３０ｍｇ／ｍｆの量
で含む。有用なアルコールアミンとしては、エタノール
アミン、ジェタノールアミン、プロパツールアミン、ト
リエタノールアミンおよびそれらの塩が挙げられる。そ
の他については当業者に明らかであろう。

本発明の抽出組成物に、カチオン界面活性剤（特に、主
要外層膜蛋白の抽出の際に望ましい）、１種以上の還元
剤、過酸化水素活性を抑制する保恒剤、キレ−ティング
剤および消泡剤を含む他の添加剤が好ましくは含まれる
。

好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｍｆ、好ましくは２〜
１０ｍｇ／ｍｊ！の１種以上の界面活性剤を加える。

このような化合物は電荷がポジティブである。また、全
体の化合物の電荷がポジティブである限り、各化合物が
ネガティブ電荷を有していてもよい。

ポジティブ電荷は、四級アンモニウム塩、四級ホスホニ
ウム塩、四級スルホニウム塩、四級ピリジニウム塩また
は当該技術分野で既知の他のものによって付与すること
ができる。

この発明の抽出組成物は、さらに、適当量の還元剤、例
えばジチオスレイトール、システィンおよびβ−メルカ
プトエタノールを含めてもよい。

ジチオスレイトールが好ましい。この還元剤は、一般に
少なくとも５ミリモル濃度、好ましくは２０〜５０ミリ
モル濃度で存在する。

試験の被験体が全血または粘液を含む場合には、この発
明の抽出組成物は１種以上のプロテアーゼ（以下に記載
する）と共に好ましくは使用される。

プロテアーゼは、蛋白質のペプチド結合を加水分解して
より小さなペプチドを生成する一群の酵素である。それ
らは、多様な起源から得ることができ、起源としては、
細菌およびカビのような微生物、動物またはヒトの器官
（例えば、膵臓）植物（例えば、パパイア）ならびに当
該技術分野で既知の他のものが挙げられる。プロテアー
ゼは、また、遺伝的に変異した微生物からも得ることが
できる。多くのプロテアーゼが市販されている。

抽出は、クラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス
生体を含有することが予測される生物学的被験体を供給
し、次いでこの発明の抽出組成物をそれと、アッセイの
ために前記細胞を溶解し抗原を抽出するのに十分な時間
適当な容器中で接触することによって行うことができる
。一般に、抽出工程には１０分未満かかるが、特定の被
験体ではより長時間要する場合もある。接触は、一般に
室温（すなわち、１８〜２５℃）で実施されるが、必要
があれば４０℃までの高温を使用することができる。

しかしながら、従来技術で要求されるより高い温度は、
この発明を実施することによって避けることができる。

被験体の撹拌が好ましい場合もある。

好ましくは、抽出の目的に特別に設計された適当な抽出
装置で抽出を行うことができる。多数のこのような装置
が、当該技術分野で知られている。

適当なインキ二ベーション後、抽出された抗［を含有す
る溶液は、必要により、ｐＨ６〜８まで適当な酸を用い
て中和してもよい。また、内因性のペルオキシダーゼを
除去するために処理を行ってもよい。生物体から抗原が
抽出されると、必要により次の操作を行う前に、その溶
液を予備濾過して細胞残層、微粒子物および不要物を除
去することが望ましい。予備濾過は、ある型のフィルタ
ーを備えた適当な容器で行うことができる。

次に、抽出された抗原の存在を測定するために、濾過さ
れた被験体をいくつかある分析法のいずれかにかける。

この工程には、好ましくないかも知れないが、特定の場
合にだけ選択される可能性のある培養法、カウンター免
疫電気泳動法および血清試験が含まれる。

好ましくは、抽出された抗原は、１種以上の適当な抗体
と免疫学的にそれが反応するイムノアッセイを使用して
検出される。得られた免疫複合体は、適する放射線、比
色、蛍光または酵素標識試薬を使用して検出される。あ
る場合には、試薬は抗原に対する標識抗体であり、別の
場合には、抗原と反応する未標識抗体に向けられる標識
抗−抗体である。このようなイムノアッセイは、一般に
、塗布されているかまたは塗布されていないある型の固
体支持体上での検出可能な免疫複合体の形成、それに続
く適当な検出法を含む。別のアッセイは、免疫複合体の
少なくとも１種の反応体（例えば、抗体）が複合体形成
中に一緒に凝集するようなある型の標識または未標識粒
子に付着された場合、免疫複合体の凝集を伴う。

有用なアッセイの例としては、コンペティティブイムノ
アッセイまたはエンザイム・リンクド・イムノアブソー
ベント・アッセイ（巳ＬＩＳ＾）が挙げられる。これら
のアッセイは、米国特許第４、４２７．７８２号明細書
およびＳｃｈｍｅｅｒらにより、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１５（５）、　
８３０〜８３４ページ（１９８２）に既述されている。

使用されるクラミジア抗体、淋菌抗体またはヘルペス抗
体は、それらの生物体から抽出される数種の抗原のどれ
かに向けることができる。ある態様では、抗体が単一抗
原、例えば、Ｃ，トラコマチスのりポポリサンヵライド
に向けられる。もう一つの態様では、種々の抗体混合物
が、種々の淋菌株から抽出されるような数種の抗原に向
けられる。

好ましいイムノアッセイは、複数の正荷電基を表面上に
有するポリマー固体支持体に抽出抗原を接触することに
より行われる。この支持体は、抽出抗原とイオン的に結
合し得る適当なカチオン基を表面上に有するいずれかの
天然または合成ポリマーから構築することができる。利
用可能なポリマーとしては、必要な荷電基を有するポリ
エステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレ
ンイミン、セルロース系材料およびエチレン系不飽和ビ
ニルモノマーから製造される付加ポリマーならびに当該
技術分野で既知の他のポリマーが挙げられる。一般に、
カチオン基としては、四級アンモニウム塩、四級ホスホ
ニウム塩、四級スルホニウム塩、四級ピリジニウム塩、
四級ピリミジニウム塩または四級イミダゾリウム塩が挙
げられ、四級アンモニウム塩が好ましいものである。

ポリマー支持体（塗布または未塗布）は、いずれかの適
当な形状、例えばビーズ、ゲル、フィルムまたは膜に成
形することができる。これらは、アッセイの性能を高め
るために界面活性剤を塗布してもよい。以下に言己載す
るような微孔質膜が好ましい。

本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品（ボトノペ試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ）と組み合わせて使用することができる。また、
好ましくは、支持体がアッセイを実施しそしてすべての
流体に適合しうる使い捨て試験装置中に固定された微孔
質膜を有する。

利用可能な試験装置の構成は、当該技術分野で知られて
いる。特に有用な装置は、特開昭６３−２２３５６３号
公報（昭和６３年９月１９日公開）および特願昭６３−
２３４６９２号明細書（昭和６３年９月１８日出願）に
記載されている。界面活性剤塗布またはイオン荷電支持
体と抗原の接触によりほとんど瞬間的に抗原は支持体に
直接結合する。「直接」とは、支持体に付着している結
合性生物学的化合物（例えば、抗体）を介して結合され
るものでないことを意味する。

従って、接触の１０分以内、好ましくは１〜５分以内に
結合抗原は、適当な抗体（クラミジア抗原、淋菌抗原ま
たはヘルペス抗原のいずれかに向けられた）と接触され
、こうして支持体上に免疫複合体が形成される。アッセ
イが使い捨て装置を使用して実施される場合、その支持
体は、被験体中の流体および複合体化していない物質を
通過させ、膜に抗原が結合するような微孔質膜であって
もよい。

このアッセイで使用される抗体は、市販または既知法を
使用して調製されうるポリクルナルまたはモノクロナル
であることができる。

−の態様では、抗原に対する抗体は検出のために標識さ
れる。利用可能な標識は、当該技術分野で既知であり、
これらには適当な方法および装置を使用して直接検出で
きる化学的または生物学的化合物、ならびに検出可能な
種を提供するさらなる化学的または特異的なパインディ
ング反応を介して検出することができる化合物が含まれ
る。有用な標識の例としては、放射性同位体、酵素、蛍
光化合物、化学発光化合物、リン光化合物、ビオチンま
たはその誘導体、アビジンまたはその誘導体、フェリチ
ン、磁性粒子、着色粒子および当業者に極めて明らかな
他の物質が挙げられる。放射性同位体または酵素が好ま
しい標識である。標識は、既知の方法を使用して抗体に
付着させることができる。標識が直接検出できない場合
には、検出できる反応または特異的パインディング生成
物を生ずる試薬または化合物がさらに必要である。

例えば、標識がビオチンであるならば、それは酵素で接
合されたアビジンと反応して検出可能な種を提供するこ
とができる。標識が酵素、例えば、グルコースオキシダ
ーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリホ
スファターゼなどである場合には、基質および色素生成
試薬もまた必要である。

特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであり
、アッセイのある時点で過酸化水素ふよび適当な色素生
成試薬を添加し、検出可能な色素を提供する。例えば、
有用な色素生成試薬には、テトラメチルベンジジンおよ
びその誘導体、ならびにトリアリールイミダゾールロイ
コ染料（米国特許第４．０８９．７４７号明細書に記載
されるような）またはペルオキシダーゼふよび過酸化水
素の存在下で反応して色素を提供する他の化合物（すな
わち、ペルオキシダーゼの触媒作用により反応して色素
を提供する化合物）のようなロイコ染料が含まれる。

最も好ましい態様では、クラミジア抗体、淋菌抗体また
はヘルペス抗体は標識されておらず、そして形成され支
持体に結合されている抗体−抗原複合体の検出は、それ
ぞれ前記クラミジア抗体、淋菌抗体またはヘルペス抗体
に特異性を有し、かつ適当に標識されている第二の抗体
（以下に記載する）を使用して行われる。

抗原−抗体の複合体は、支持体上での非特異的相互作用
を減少させた阻止（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）蛋白質１種以上
の存在下で形成することができる。利用可能な蛋白質は
周知であり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウシ胎
仔血清およびブタガンマ（γ）グロブリンを含む。特に
有用な阻止組成物は、非免疫蛋白質および両性界面活性
剤を含んでなる。

支持体に結合した免疫複合体の形成を促進するには、一
般に、１５〜３０℃の温度で１０分未満前記抗体と抗原
がインキュベーションされる。好ましくは、インキュベ
ーションは室温で５分未満である。

抗体−抗原の接触後１０分以内に、結合した複合体は、
一般にｐＨ７〜１１の緩衝化洗浄溶液で１度以上洗浄さ
れる。この洗浄溶液は、支持体上の複合体から複合体化
していない物質を分離するのに役立つ界面活性剤１種以
上を含めるのが好ましい。

特に、有用な界面活性剤は、カチオン界面活性剤である
。好ましい洗浄溶液はカチオン界面活性剤を含んでなる
。

前述の態様で、クラミジア抗体、淋菌抗体またはヘルペ
ス抗体が標識されている場合には、洗浄後のアッセイ手
順は、直接その標識の検出か、または適当な試薬添加後
の間接的な検出となる。検出は、結合複合体の洗浄後、
比較的速やかに行われる。場合により、標識の検出は、
試薬が許容するならばインキュベーションにより促進し
てもよい。次に標準的な装置ふよび方法を使用して標識
が検出される。

好ましい態様では、クラミジア抗体、淋菌抗体またはヘ
ルペス抗体は標識されておらず、そして結合複合体の洗
浄後にそれが、標識されていない抗体に向けられた抗体
と接触される。この第二の抗体（すなわち、抗−抗体）
は、前述した標識のいずれかにより適当に標識される。

この抗体は、市販または既知の方法を使用して調製され
るモノクロナルまたはポリクロナルであることができる
。

この接触後、支持体に結合されている得られた抗原−抗
体−抗体複合体は、１５〜３０℃の温度で１０分未満イ
ンキュベーションされる。このインキュベーションは、
室温で５分未満が好ましい。

さらに洗浄を行って複合体化していない物質を除去し、
次いで適当な酵素基質または他の必要な試薬を添加して
検出可能な種を提供する。次に、この抗原−抗体−標識
抗体複合体は、標準的な放射線、比色、蛍光または他の
検出法を使用して支持体上で検出される。

〔実施例〕

以下の例は、本発明を具体的に説明する目的で提供する
ものであって、本発明の範囲を限定するものでない。

なお、本明細書で特定の名称にｒＴＭＪが付されている
場合には、その名称が商品名または商標名であることを
意味する。

抗原の調製 血液型亜型Ｈ抗原精製基本小体は、ＩｎｄｉａｎａＵｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙのＷ、Ｊ、　Ｎｅｗｈａｌｌ教授から
入手した。保存抗原溶液（５ｐ’　、３２４０ｎｇ抗原
／Ｉを含有）を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）　（０，１
ｍｇ／＋＋＋ｊり中つシ血清アルブミン溶液（５０ＩＩ
Ｉ）に加え一８０℃に貯蔵して溶液Ａを得た。この溶液
を解凍し、超音波撹拌により混合し、次いで１５ｐＩを
撹拌しながらウシ血清アルブミン溶液（９４５ｐり　　
と混合して溶液Ｂを得たく抗原濃度は、４．６　ｘ１０
５ｐｇ　／１００ｄである）。次に、溶液Ｂ（１００ｉ
ｄ）を、ＰＢＳ　（９００１１Ｉ）中ウシ血清アルブミ
ンと混合して、抗原濃度４．６　ｘｌＯ’ｐｇ　／１０
０４の溶液Ｃを得た。

抗体の調製 タラミジアリポボリサッカライド（ＬＰＳ）抗原に対す
るマウスモノクロナル抗体は、標準的ハイブリドーマ法
およびマウス細胞系を使用して調製し、防腐剤としてア
ジド０．０１重量％を含有するＰＢＳ　（ｐＨ７，４）
溶液として貯蔵した。保護蛋白質としてカゼイン（０，
５重量％）および両性界面活性剤（０，０１重量％）含
有ＰＢＳに前記抗体溶液試料（１９１１’）を添加する
ことにより抗体溶液（１：８００希釈物）を調製し、次
いで０．２２−のフィルターで濾過して使用液を得た。

クラミジア主要外層膜蛋白（ＭＯＭＰ）に対するマウス
モノクロナル抗体は、標準的ハイブリドーマ法およびマ
ウス細胞系を使用して調製し、アジド０．０１重量％含
有ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）の溶液として貯蔵した。

阻止蛋白質としてカゼイン（０，５重量％）およびＬｏ
ｎｚａｉｎｅ”Ｃ両性界面活性剤（０，０１重量％）含
有ＰＢＳに前記抗体溶液試料（１４／’）を添加するこ
とにより抗体溶液（１：１１００希釈物）を調製し、次
いで０．２２−のフィルターで濾過して使用液を得た。

使用された標識ポリクロナル抗体は、ワサビペルオキシ
ダーゼに接合させたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体であった。

この接合体を、カゼイン（０，５重量％）およびＬｏｎ
ｚａ　１ｎｅＴＸＣ両性界面活性剤含有ＰＢＳで１：２
０００に希釈し、次いで０．２２１ｍフィルターで濾過
して使用液を得た。

例１：抽出組成物 抗原抽出溶液は、以下の成分から調製した。すなわち、
アジ化ナトリウム（０，０２７２７モル濃、塩化ナトリ
ウム（０，２７モル濃度）、塩酸エタノールアミン（０
，４７モル濃度）、エチレンジアミン四酢酸・２ナトリ
ウム（０，０４５４５モル濃　、ＩＥｍｃａｌ”ＣＣ−
３６力チオン界面活性剤（１０％メタノール溶液由来の
ポリプロポキシ−ｔ−アミンの塩化四級アンモニウムの
０．４５重量％）および水酸化ナトリウム（０，６６モ
ル濃度、ｐＨ１１） この例は、Ｃ，）ラコマチスのりボボリサツカライドお
よび主要外層膜蛋白抗原の抽出に関する本発明の実施例
を示す。

基本小体蛋白質（ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ８１．５
７１７中蛋白質２５．０００ｐｇ）を、本発明の抽出組
成物（１４１８，５ＩＩＺ　）に添加し、室温に持続し
ながら約５分間混合した。抗原を含まない２種の対応す
る抽出溶液を調製した。

各抽出溶液に過酸化水素溶液く８重量％、１５００１１
１）を加えて、内因性カタラーゼ、ペルオキシダーゼお
よびミエロペルオキシダーゼを除去した。

得られた混合物を、再び室温に５分間維持した。

各抽出溶液の一部（１２０ｍ）を、同時係属の米国特許
願第１肌８１０号（前述）明細書に記載されるのと同様
に設計された使い捨て装置それぞれのウェルに加え、次
いで流体を排出した。この装置は、Ｐａ１ｌ　Ｂｉｏｄ
ｙｎｅ”膜として市販されている表面上に四級アンモニ
ウム基を有する５ｊＩＩｌの微孔質膜を備えている。使
用前に、この膜はＺｏｎｙｌ”Ｆ５Ｍ（非イオンフッ化
界面活性剤）で処理した。

流体を排出しながら、抗ＬＰＳおよび抗ＭＯＭＰ溶液そ
れぞれの１部（１２０ＩＩＩ）　、ならびに組み合わせ
た両抗体溶液の１部（１２０，−’）を前記装置の各ウ
ェルに添加した。室温で約５分間インキュベーションを
行った。インキニベーション後、得られた抗原−抗体複
合体を、ＰＢＳ　（ｐＨ７，２）中Ｂｍｃａｌ”ＣＣ−
９力チオン界面活性剤（０，７５重量％）溶液（１６０
１１１）で２度洗浄した。

ペルオキシダーゼで標識したヤギ抗マウス抗体溶液（１
２０ｄ）を、各ウェルに添加しそして接触させながら膜
を通過させた。室温におけるインキ二ベーションを再び
５分間行い、膜にイオン結合した抗原−抗体−標識抗体
複合体を形成させた。

前述の洗浄溶液で２度洗浄後、色素生成組成物を各試験
ウェルに添加した。この組成物は、過酸化水素（１０ミ
リモル濃度”）　、２−　（４−ヒドロキシ−３−メト
キシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキシフェニル
）イミダゾールロイコ染料（０，００５重量％）、ポリ
　（ビニルピロリドン）（１重量％）、４′−ヒドロキ
シアセトアニリド（５ミリモル濃度）およびジエチレン
トリアミン五酢酸（１（Ｈ！Ｊモル濃度）を含めた。

約１０分以内に被験体由来のクラミジア抗原の存在を示
す赤色色素が試験ウェル中に観察された。

透過濃度を測定し、その結果を抗原を含む抽出溶液と抗
原を含まないものと差（ΔＤ、　）として以下の第１表
に示した。それらは、この発明の抽出組成物がクラミジ
ア生菌体から効率的に両抗原を抽出し、特に主要外層膜
蛋白抗原の抽出に有効であることを示す。

第１表 抗　原　　　　抽出組成物についてのΔＤｒＬＰＳ単独
　　　　　　　０．０８５ ＭＯＭＰ単独　　　　　　　　０．１７９ＬＰＳ　十Ｍ
ＯＭＰ　　　　　　　　　　０．１６５例３：クラミジ
ア抗原抽出におけるＨの効果血液型亜型に基本小体は、
Ｊ、　Ｎｅｗｈａｌｌ教授（Ｉｎｄｉａｎａ　Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ）から得、使用液は以下のように調製した
。

前記溶液Ｂ　（１８ｊ’）を、抽出溶液（１９８２１１
１）　と混合して５０００ｐｇ抗原／　１２０ｄを含有
する試験溶液を調製した。

溶液Ｂ　（９ｊ’）を、抽出溶液（１９９１１ｄ）　と
混合して２５００ｐｇ抗原／　１２０ｐＩを含有する試
験溶液を調製した。

溶液Ｃ（３６ｄ）を、抽出溶液（１９６４ｄ）と混合し
て１１０００ｐ抗原／　１２０ｍを含有する試験溶液を
調製した。

抗原を含まない抽出溶液（２０００／’）含有の対照溶
液も調製した。

マウス抗ＬＰＳモノクロナル抗体組成物は、抗体溶液（
１０，ｄ）　、カゼイン（０，５重量％）およびＬｏｎ
ｚａｉｎｅ”Ｃ界面活性剤（１４，９９ｄ中０．０１重
量％）を用いて調製した。

ワサビペルオキシダーゼ接合抗マウスモノクロナル抗体
は、組成物（１００ｍ）中にカゼイン（０，５重量％）
右よびＬｏｎｚａｉｎｅ７ＸＣ界面活性剤（９，９ｄ中
０．０１重量％）を含ませた。

血液型亜型に基本小体を、各種ｐＨ（９，５，１０，２
５および１１．０）で抽出した。この抽出抗原を使用し
て例１に記載したようにアッセイを実施し、得られた透
過濃度を以下の第■表に示した。データは、アルコール
アミンを使用するｐ）Ｉｌｌにおける抽出が低いバック
グランドを有する最高の感度を提供することを示す。

第■表 この例は、標識クラミジア抗体を使用するＣ０トラコマ
チスについてのアッセイ例を示す。既知の方法（Ｙｏｓ
ｈｉｔａｋｅ、　Ｂｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１
０１．３９５ページ、１９７９）で使用外層膜蛋白に対
する２種の抗体をワサビペルオキシダーゼに接合させた
。この接合体を、アッセイで使用するまでチメロサール
０．０１重量％含有ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）中に維持し
た。

血液型亜型Ｈ基本小体は、前述のようにして得た。抗原
溶液Ｂ（前記に同じ、２４．５４）を、室温で５分間例
１の抽出組成物（１４７５，５ｐ１）　と混合して抗原
１．１３　ｘ　１０’ｐｇを含有する第１抽出溶液を得
た（このものは、アッセイで試験試料１２０Ｉ中約４５
００ｐｇの最終抗原濃度をもたらす）。第２抽出溶液は
、第１抽出溶液の適当な希釈によって調製し、アッセイ
で試験試料１２Ｏｄ中１５００ｐｇの最終抗原濃度をも
たらす。

過酸化水素（８％溶液１．５ｒｎ！りを、前記の各抗原
抽出溶液に添加して混合し、室温で５分間維持した。

次に、Ｚｏｎｙｌ”ＰＳＮ界面活性剤（０，０５重量％
）を予め塗布したＢｉｏｄｙｎｅ”ナイロン微孔質膜を
備えた使い捨て試験装置に前記各溶液（１２０ｉｄ）を
加え、次いで膜を通して排液した。

ペルオキシダーゼ標識抗体は、以下のようにカゼインお
よびＬｏｎｚａｉｎｅ”両性界面活性剤の組み合わせ物
（１２０ｄ）が添加された。接合体１は、カゼイン１．
２５重量％および界面活性剤０．０２５重量％が添加さ
れ、接合体２は、カゼイン２重量％および界面活性剤０
．０４重量％が添加された。次に、室温で５分間インキ
ュベーションした。

その後、ＰＢＳ中Ｅｍｃａｌ”ＣＣ−９力チオン界面活
性剤溶液（０，７５重量％、１６０４’）で２度、膜を
洗浄した。

ロイコ染料溶液（１２０ｐ１）を各試験装置に添加し、
次いで室温で１０分間インキュベーションをした後、色
素濃度を測定した。

試験された抗原を含まない対照溶液は、バックグランド
と同様な濃度を示した。

結果を、試験溶液と対照溶液との間の透過濃度差（ΔＤ
Ｔ　）として次の第■表に示す。

第■表 出を伴う。

これらの利点は、高ｐ■を有しそしてアルコールアミン
またはその塩を少なくとも１ｍｇ／ｍＩ！量含む抽出組
成物の使用によって達成される。この組成物のｐＨは最
低８である。

〔発明の効果〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくともｐＨ８を有しそして強塩基および少なく
   とも１ｍｇ／ｍｌの量で存在するアルコールアミンまた
   はその塩を含んでなるクラミジア生菌体、淋菌生菌体ま
   たはヘルペス生体から抗原を抽出するために有用な抽出
   組成物。 ２、Ａ、クラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス
   生体を含むことが予測される被験体を供給する工程、な
   らびに Ｂ、前記被験体を、検出する目的で少なくともｐＨ８を
   有しそして強塩基および少なくとも１ｍｇ／ｍｌの量で
   存在するアルコールアミンまたはその塩を含んでなる抽
   出組成物と接触させ、それぞれクラミジア抗原、淋菌抗
   原またはヘルペス抗原を抽出する工程、を含んでなるク
   ラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘルペス生体から抗
   原を抽出するための方法。 ３、Ａ、少なくともｐＨ８を有しそして強塩基および少
   なくとも１ｍｇ／ｍｌの量で存在するアルコールアミン
   またはその塩を含んでなる抽出組成物で、クラミジア生
   菌体、淋菌生菌体またはヘルペス生体を含むことが予測
   される被験体から、それぞれクラミジア抗原、淋菌抗原
   またはヘルペス抗原を抽出する工程、 Ｂ、前記抽出した抗原を、それぞれクラミジア抗体、淋
   菌抗体またはヘルペス抗体と接触させて免疫複合体を形
   成する工程、ならびに Ｃ、被験体中のクラミジア生菌体、淋菌生菌体またはヘ
   ルペス生体の存在を示すものとして、それぞれ前記複合
   体の存在を測定する工程、を含んでなるクラミジア抗原
   、淋菌抗原またはヘルペス抗原の測定方法。