DE68924118T2 - Hoch-pH-Extraktionszusammensetzung und deren Verwendung zur Bestimmung von Antigenen aus Chlamydia, Gonokokken oder Herpes. - Google Patents
Hoch-pH-Extraktionszusammensetzung und deren Verwendung zur Bestimmung von Antigenen aus Chlamydia, Gonokokken oder Herpes.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft eine Extraktionszusammensetzung und ihre Verwendung bei der Bestimmung von Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen. Insbesondere betrifft sie eine Zusammensetzung, die zur Extraktion des geeigneten Antigens verwendbar ist, ein Extraktionsverfahren und ein Verfahren zur Bestimmung des Antigens.
- Immunoassays sind in den letzten Jahren zum Nachweis des Vorliegens von infektiösen Erkrankungen verwendet worden. Damit der Test brauchbar ist, muß er einen speziellen Organismus mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit nachweisen. In den meisten Fällen ist dazu die Isolierung und Reaktion von Antigenen, die für den Organismus spezifisch sind, mit entsprechenden Antikörpern notwendig. Damit der Test kommerziell erfolgreich ist, muß er auch relativ preisgünstig, einfach anzuwenden und schnell sein.
- Ein derartiger Organismus, der mittels Immunoassay nachgewiesen werden kann, ist Chlamydia trachomatis (hier C. trachomatis), einer der zwei Mikrobenarten des Genus Chlamydiaceae, Ordnung Chlamydiales. Es gibt 15 oder mehr Stämme dieser Spezies, die die Ursache einer Reihe von Augen- und Genitalerkrankungen beim Menschen sind, einschließlich Trachoma, Einschlußkonjunktivitis, Lymphogranuloma venerum, nicht-gonokokkale Urethritis und Proktitis. Infektionen mit C. trachomatis kommen in der gesamten Bevölkerung überall vor, so daß angenommen wird, daß es jedes Jahr Millionen von Fällen alleine von nichtgonokokkaler Urethritis gibt.
- Trotz der zunehmenden Kontrolle verschiedener Viren durch Impfung und verschiedene antivirale Mittel bleiben Infektionen mit Organismen wie dem Herpes simplex-Virus (HSV) ein ernsthaftes Problem. Es gibt zwei Arten von HSV, nämlich Typ 1, der hauptsächlich um den Mund herum auftritt, während Typ 2 in erster Linie um den Genitalbereich des menschlichen Körpers herum auftritt. Hautinfektionen und virale Enzephalitis sind lediglich zwei der ernsthaften Folgen einer HSV-Infektion.
- Gonorrhoe ist eine Erkrankung, die üblicherweise durch sexuellen Kontakt übertragen wird und durch ein Bakterium des Genus Neisseria, insbesondere N. gonorrhoeae, verursacht wird. Die Erkrankung hat die Menschheit seit Jahrtausenden geplagt, und in vielen Teilen der Welt besteht sie immer noch in epidemischen Ausmaßen. Die Bedeutung des Nachweises und der Behandlung dieses Organismusses wird durchaus erkannt. N. meningitidis und N. lactamica sind ebenfalls Spezies von beträchtlichem medizinischem und diagnostischem Interesse.
- Aufgrund der weit verbreiteten Natur dieser Erkrankungen besteht ein beträchtliches Interesse daran, einen raschen, einfachen und zuverlässigen Test zum Nachweis der verursachenden Organismen zu besitzen. Es sind beträchtliche Forschungen durchgeführt worden, um brauchbare Wege zu finden, aus den Organismen nachweisbare Antigene zu extrahieren.
- Die Extraktion von Antigen aus den Organismen in einer biologischen Probe ist entscheidend, um einen exakten, raschen und empfindlichen Test bereitzustellen. Viele verschiedene Techniken sind zur Extraktion verwendet worden, einschließlich physikalisches Aufbrechen der Zellen mittels Schallbehandlung, Erwärmen oder Zentrifugieren. Chemische Extraktionszusammensetzungen sind ebenfalls entwickelt worden. Das Lipopolysaccharid- Antigen von Chlamydienorganismen ist zum Beispiel mittels eines Gemischs aus Phenol und Wasser extrahiert worden.
- Eine Extraktion bei hohem pH ist in der EP-A-0 174 106 beschrieben, wobei eine Testprobe einem pH von 6 bis 8 ausgesetzt wird, anschließend einem pH von 8 bis 12,5 ausgesetzt wird und nachfolgend neutralisiert wird. Während des Verfahrensschritts bei hohem pH wird die Probe 5 - 30 Minuten lang inkubiert, einige Zeit davon bei hoher Temperatur (bis zu 100 ºC). Die Extraktion von Antigenen bei hohem pH ist auch in der FR-A-2 308 377 beschrieben.
- Ethanolamin ist in Kombination mit Surfactants und Erwärmen auf hohe Temperatur (z. B. 70 - 110 ºC) verwendet worden, um Gonokokken- oder Chlamydienantigene bei verschiedenen pH-Werten zu extrahieren, wie in der EP-A-0 183 383 und von Brinton et al, Proc. Am. Soc. Micro., 18. - 20. Januar 1978, Seiten 155 - 178, und von Newhall et al, Curr. Chemoth. Inf. Dis., Bd. 2, Seiten 1231 - 1234, 1979, beschrieben ist.
- Kationische Surfactants, wie Cetyltrimethylammoniumbromid, werden bei pH 8 verwendet, um das eisenregulierte Hauptprotein (MIRP) von Gonokokkenorganismen zu extrahieren, wie in der WO 87/02678 beschrieben ist.
- Es wäre wünschenswert, sehr viel raschere Tests für Chlamydien-, Gonokokken- und Herpesantigene zu besitzen, die eine hohe Zuverlässigkeit aufweisen und die bei Raumtemperatur durchgeführt werden können. Derartige Tests wären stark abhängig von einer einfachen, raschen und wirksamen Extraktionszusammensetzung und einem Verfahren, bei dem keine hohen Temperaturen oder lange Inkubationszeiten erforderlich sind.
- Die zuvor angesprochenen Probleme werden mit einer Extraktionszusammensetzung überwunden, die zum Extrahieren von Antigen aus Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen brauchbar ist, wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie einen pH von mindestens 9 aufweist und umfaßt:
- eine starke Base, ein Alkoholamin oder Salz davon, das in einer Menge von mindestens 1 mg/ml vorliegt,
- ein Reduktionsmittel und ein kationisches Surfactant.
- Eine Extraktionszusammensetzung, die zum Extrahieren von Lipopolysaccharid- oder Hauptproteinantigen der äußeren Membran von Chlamydia trachomatis besonders brauchbar ist, ist dadurch gekennzeichnet, daß sie einen pH von mindestens 10 aufweist und umfaßt:
- Membranproteinantigen von Chlamydia trachomatis, dadurch gekennzeichnet, daß es einen pH von mindestens 10 aufweist und umfaßt:
- a. von 2 bis 30 mg/ml eines Alkoholamins oder eines Salzes davon,
- b. von 2 bis 20 mg/ml eines Alkalimetallhydroxids,
- c. von 0,2 bis 2 mg/ml eines Reduktionsmittels, und
- d. von 2 bis 10 mg/ml eines quaternären ammoniumgruppenhaltigen Surfactants.
- Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zum Extrahieren von Antigen aus Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen, umfassend:
- A. Bereitstellen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen enthält, und
- B. In-Kontakt-Bringen der Probe mit der zuvor beschriebenen Extraktionszusammensetzung, um Chlamydien-, Gonokokken- oder respektive Herpesantigen zum Nachweis zu extrahieren.
- Ein Verfahren zur Bestimmung eines Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantigens umfaßt:
- A. Extrahieren von Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantigen aus einer Probe, von der angenommen wird, daß sie Chlamydien-, Gonokokken- bzw. Herpesorganismen enthält, mit der zuvor beschriebenen Extraktionszusammensetzung,
- B. In-Kontakt-Bringen des extrahierten Antigens mit Antikörpern dagegen, um einen immunologischen Komplex zu bilden, und
- C. Bestimmen des Vorliegens des Komplexes als eine Indikation bzw. einen Nachweis für das Vorliegen der Organismen in der Probe.
- Die erfindungsgemäße Extraktionszusammensetzung lysiert Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen in einer biologischen Probe rasch und effektiv, wobei für einen empfindlichen Test ausreichend Antigen freigesetzt wird. Die Lyse kann sehr rasch, üblicherweise in weniger als 10 Minuten, und bei Raumtemperatur mittels Standardausrüstung durchgeführt werden. Der Bediener braucht keine besonderen Kenntnisse, und eine Extraktion bei hoher Temperatur wird vermieden. Sowohl Lipopolysaccharid- als auch Hauptproteinantigene der äußeren Membran werden für Chlamydientests extrahiert, obwohl das Lipopolysaccharid in erster Linie von Interesse ist. Gonokokkentests betreffen die Extraktion eines Hauptproteins der äußeren Membran, wie Protein IA oder IB, während Herpestests die Extraktion von Membranglycoproteinen betreffen.
- Diese Vorteile werden durch die Verwendung einer Extraktionszusammensetzung erreicht, die einen hohen pH aufweist und eine starke Base, ein Alkoholamin oder ein Salz davon in einer Menge von mindestens 1 mg/ml und ein kationisches Surfactant enthält. Der pH der Zusammensetzung beträgt mindestens 9.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt eine Extraktionszusammensetzung und ein -verfahren, sowie ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen in einer biologischen Probe, die von einem Patienten mittels medizinischen und mikrobiologischen Standardtechniken erhalten worden ist. Derartige Proben umfassen z. B. Tupferproben, die aus Cervix, Urethra, Augen, Rachen oder Anus eines Patienten erhalten werden, und Körperflüssigkeiten, wie Synovialflüssigkeit oder Flüssigkeit aus Läsionen. Von den so erhaltenen biologischen Proben wird angenommen, daß sie Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen enthalten, die die zu bestimmenden Antigene umfassen.
- Obwohl einige Tests aus dem Stand der Technik zum Nachweisen ganzer bakterien- oder virusinfizierter Zellen ausgelegt sind, ist es ein Vorteil dieser Erfindung, daß die bakteriellen Zellen oder Viren wirksam lysiert werden und ausreichend Antigen aus dem zellulären Material extrahiert wird, um einen empfindlichen Test in einem relativ kurzen Zeitraum bereitzustellen. Antigene werden entweder aus infizierten ganzen Wirtszellen oder aus retikulären oder Elementarkörperchen, die in der Probe vorliegen, extrahiert.
- Die Chlamydienantigene, die erfindungsgemäß üblicherweise nachgewiesen werden, sind das Lipopolysaccharidantigen (Glycolipidgruppe) des Organismusses, wie beispielsweise in der EP-A-0 193 431 beschrieben ist, oder das Hauptprotein der äußeren Membran des Organimusses, wie im US- Patent 4,427,782 beschrieben ist. In einer Ausführungsform werden beide Antigene gleichzeitig nachgewiesen. Das Lipopolysaccharid ist jedoch bei der Durchführung einer bevorzugten Ausführungsform zum Nachweisen von C. trachomatis von größtem Interesse.
- In anderen Ausführungsformen werden verschiedene Gonokokkenorganismen, wie N. gonorrhoeae, durch Bestimmen des Vorliegens von extrahiertem Protein IA- oder IB-Antigenen der äußeren Membran der Organismen nachgewiesen. Es kann ein einzelner Stamm nachgewiesen werden, oder vorzugsweise wird ein Gemisch von Stämmen nachgewiesen.
- Mit noch anderen Ausführungsformen werden HSV-Stämme, entweder HSV-1 oder HSV-2 alleine oder beide zusammen, nachgewiesen. Glycoproteine der Virionen werden extrahiert und mit der vorliegenden Erfindung nachgewiesen. Zusätzlich können virusinfizierte Zellen lysiert und solubilisiert werden, um intrazelluläre Viren oder membrangebundene virale Antigene freizusetzen.
- Die erfindungsgemäße Extraktionszusammensetzung weist einen pH von mindestens 9 auf, wobei ein beliebiger geeigneter Puffer, eine starke Base oder ein Gemisch davon verwendet wird. Ein pH von mindestens 10 ist am meisten bevorzugt. Üblicherweise wird der geeignete pH bereitgestellt, indem geeignete Mengen einer starken Base oder eines Puffers in die Zusammensetzung aufgenommen werden. Der hier verwendete Begriff "starke Base" soll eine Verbindung bedeuten, die einen pKa von mindestens 8 bei 25 ºC aufweist. Bevorzugte starke Basen weisen bei 25 ºC einen pKa von mindestens 9 auf. Verwendbare Basen sind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich und umfassen Alkalimetall-, Erdalkali- und Ammoniumhydroxide (wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Calciumhydroxid, Ammoniumhydroxid und Lithiumhydroxid), Phosphate (wie Trinatriumphosphat und Trikaliumphosphat), Tri(hydroxymethyl)aminomethan und ähnliche Verbindungen. Die Menge der starken Base in der Zusammensetzung variiert je nach dem pKa der Base, üblicherweise sind jedoch 1 bis 30 mg/ml brauchbar, und 2 bis 20 mg/ml sind bevorzugt.
- Die Extraktionszusammensetzung umfaßt darüber hinaus ein Alkoholamin oder ein Salz davon in einer Menge von 1, und vorzugsweise von 2 bis 30 mg/ml. Brauchbare Alkoholamine umfassen Ethanolamin, Diethanolamin, Propanolamin, Triethanolamin und Salze davon. Andere sind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
- Andere Zusätze sind vorzugsweise in der Extraktionszusammensetzung enthalten, einschließlich Konservierungsmittel, um die Wirkung von Wasserstoffperoxid zu verhindern, Chelatbildner und Antischaummittel.
- Darüber hinaus liegen mindestens 1 und bevorzugter 2 bis 10 mg/ml eines oder mehrerer kationischer Surfactants vor. Solche Verbindungen weisen eine positive Ladung auf. Jede Verbindung kann auch negative Ladungen aufweisen, so lange die Nettoladung der Verbindung positiv ist. Die positiven Ladungen können durch quaternäre Ammoniumsalze, quaternäre Phosphoniumsalze, quaternäre Sulfoniumsalze, quaternäre Pyridiniumsalze oder andere aus dem Stand der Technik bekannte bereitgestellt werden. Vorzugsweise werden die Ladungen durch quaternäre Ammoniumgruppen bereitgestellt.
- Die erfindungsgemäße Extraktionszusammensetzung enthält auch eine geeignete Menge eines Reduktionsmittels, wie Dithiothreit, Cystein und β-Mercaptoethanol. Dithiothreit ist bevorzugt. Das Reduktionsmittel liegt üblicherweise in einer Menge von mindestens 5 mmolar, und vorzugsweise von 20 bis 50 mmolar vor.
- Wenn die Testprobe Vollblut oder Schleim enthält, wird die erfindungsgemäße Extraktionszusammensetzung vorzugsweise mit einer oder mehreren Proteasen verwendet. Proteasen sind eine Gruppe von Enzymen, die die Peptidbindungen von Proteinen hydrolysieren und kleinere Peptide bilden. Sie können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, einschließlich Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, tierischen oder menschlichen Organen (beispielsweise dem Pankreas), Pflanzen (wie Papaya) und anderen aus dem Stand der Technik bekannten. Proteasen können auch aus genetisch veränderten Mikroorganismen erhalten werden. Viele Proteasen sind im Handel erhältlich.
- Die Extraktion kann durchgeführt werden, indem eine biologische Probe bereitgestellt wird, von der angenommen wird, daß sie Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesorganismen enthält, und sie mit der erfindungsgemäßen Extraktionszusammensetzung in einem geeigneten Behälter für einen Zeitraum in Kontakt gebracht wird, der ausreicht, die Zellen zu lysieren und Antigen für den Test zu extrahieren. Im allgemeinen dauert das Extraktionsverfahren weniger als 10 Minuten, obwohl bei bestimmten Proben eine längere Zeit erwünscht sein kann. Der Kontakt wird üblicherweise bei Raumtemperatur durchgeführt (d. h. von 18 - 25 ºC), es können jedoch höhere Temperaturen bis zu 40 ºC verwendet werden, falls dies erwünscht ist. Die höheren Temperaturen, die beim Stand der Technik erforderlich sind, können jedoch bei der Durchführung dieser Erfindung vermieden werden. Ein Bewegen der Probe kann erwünscht sein. Vorzugsweise wird die Extraktion in einer geeigneten Extraktionsvorrichtung durchgeführt, die speziell für diesen Zweck gestaltet sein kann. Eine Reihe solcher Vorrichtungen sind aus dem Stand der Technik bekannt, wie beispielsweise dem US-Patent 4,746,614.
- Nach geeigneter Inkubation kann die Lösung, die extrahiertes Antigen enthält, mit einer geeigneten Säure neutralisiert werden, um den pH auf zwischen 6 und 8 zu senken, falls dies gewünscht ist. Sie kann auch behandelt werden, um endogene Peroxide zu entfernen. Wenn das Antigen von den Organismen extrahiert ist, ist es wünschenswert, wenn auch nicht notwendig, daß die bezeichnete Lösung vorgefiltert wird, um Zelltrümmer, teilchenförmiges Material und andere unerwünschte Materialien vor der weiteren Handhabung zu entfernen.
- Das Vorfiltern kann in einem geeigneten Gefäß durchgeführt werden, das einen beliebigen Filter aufweist.
- Die filtrierte Probe wird dann einer beliebigen Anzahl analytischer Verfahren unterzogen, um das Vorliegen von extrahiertem Antigen zu bestimmen. Derartige Verfahren umfassen Kulturtechniken, sogenannte Counterimmunoelektrophorese und serologische Tests, die, obwohl nicht bevorzugt, in bestimmten Fällen die einzige Wahl sein können.
- Vorzugsweise wird das extrahierte Antigen mittels eines Immunoassays nachgewiesen, bei dem es mit einem oder mehreren geeigneten Antikörpern immunologisch reagiert. Der erhaltene immunologische Komplex wird mittels eines geeigneten radiometrischen, kolorimetrischen, fluorometrischen oder enzymmarkierten Reagenzes nachgewiesen. In einigen Fällen ist das Reagenz ein markierter Antikörper gegen das Antigen, und in anderen Fällen ist der markierte anti-Antikörper gegen einen unmarkierten Antikörper gerichtet, der mit dem Antigen reagiert. Solche Immunoassays umfassen üblicherweise die Bildung eines nachweisbaren immunologischen Komplexes auf einem festen Träger einer beliebigen Art, entweder beschichtet oder unbeschichtet, worauf sich geeignete Nachweisverfahren anschließen. Andere Tests umfassen eine Agglutination des immunologischen Komplexes, wenn mindestens ein Reaktant (beispielsweise ein Antikörper) des Komplexes an markierte oder nicht markierte Teilchen eines Typs gebunden wird, die während der Komplexbildung zusammenklumpen.
- Beispiele für verwendbare Tests umfassen kompetitive Immunoassays oder die allgemein als "ELISA" bezeichneten Tests (enzyme-linked immunoabsorbent assays). Solche Tests sind allgemein im US-Patent 4,427,782 und von Schmeer et al, J. Clin. Microbiol., 15(5), S. 830 - 834 (1982), beschrieben. Die verwendeten Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantikörper können gegen jedes oder mehrere Antigene gerichtet sein, die aus den Organismen extrahiert werden. In einer Ausführungsform sind Antikörper gegen ein einziges Antigen gerichtet, wie beispielsweise das Lipopolysaccharid von C. trachomatis. In anderen Ausführungsformen ist ein Gemisch verschiedener Antikörper gegen mehrere Antigene gerichtet, wie beispielsweise die aus verschiedenen Gonokokkenstämmen extrahierten.
- Ein ähnlicher Festphasen-Immunoassay ist in den US- Patenten 4,497,899 und 4,497,900 beschrieben, bei dem extrahiertes Antigen an einen nicht beschichteten Träger mittels Inkubation bei erhöhten Temperaturen über einen längeren Zeitraum absorbiert wird.
- Ein bevorzugter Immunoassay wird durchgeführt, indem extrahiertes Antigen mit einem polymeren festen Träger in Kontakt gebracht wird, der eine Vielzahl positiv geladener Gruppen auf seiner Oberfläche aufweist. Dieser Träger kann aus beliebigem natürlichem oder synthetischem polymeren Material gebaut sein, auf dem geeignete kationische Gruppen sind, die mit dem extrahierten Antigen ionisch binden. Brauchbare geladene Polymere umfassen Polyester, Polyamide, Polycarbonate, Polyethylenimine, Cellulosematerialien und Additionspolymere, die aus ethylenisch ungesättigten Vinylmonomeren hergestellt sind, und anderen aus dem Stand der Technik bekannten, die die erforderlichen geladenen Gruppen aufweisen. Im allgemeinen sind die kationischen Gruppen quaternäre Ammoniumsalze, quaternäre Phosphoniumsalze, quaternäre Sulfoniumsalze, quaternäre Pyridiniumsalze, quaternäre Pyrimidiniumsalze oder quaternäre Imidazoliumsalze, wobei quaternäre Ammoniumsalze bevorzugt sind.
- Der polymere Träger (beschichtet oder unbeschichtet) kann in jeder beliebigen geeigneten Form gestaltet sein, beispielsweise als Beads, Gele, Filme oder Membranen. Er kann mit einem Surfactant beschichtet sein, das die Durchführung des Tests verbessert. Eine mikroporöse Membran ist bevorzugt, wie im folgenden beschrieben ist.
- Der hier beschriebene Träger kann in Kombination mit anderer Ausstattung (Flaschen, Teströhrchen, Tupfer, Bechergläser oder Tiegel) verwendet werden, um den Test auszuführen. Alternativ und bevorzugt ist der Träger eine mikroporöse Membran, die in eine Einwegtestvorrichtung paßt, in der der Test durchgeführt werden und sämtliche Fluids untergebracht werden können. Brauchbare Ausgestaltungen von Testvorrichtungen sind aus dem Stand der Technik bekannt, einschließlich der US-Patente 3,825,410, 3,888,629, 3,970,429 und 4,446,232. Besonders brauchbare Vorrichtungen sind in der EP-A-0 280 558 und der EP-A-0 308 231 beschrieben.
- Nahezu unmittelbar bei Kontakt des Antigens mit dem Surfactant-beschichteten oder ionisch geladenen Träger wird das Antigen direkt an den Träger gebunden. "Direkt" bedeutet, daß das Antigen nicht durch eine an den Träger gebundene biologische Linker-Verbindung (wie beispielsweise einen Antikörper) gebunden ist.
- Daher wird innerhalb von 10 Minuten, und vorzugsweise innerhalb von 1 bis 5 Minuten, nach dem Kontakt das gebundene Antigen mit geeignetem Antikörper (der entweder gegen ein Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantigen gerichtet ist) in Kontakt gebracht, um einen immunologischen Komplex auf dem Träger zu bilden. Wenn der Test mittels einer Einwegtestvorrichtung durchgeführt wird, kann der Träger eine mikroporöse Membran sein, durch die Flüssigkeit und nicht komplexierte Materialien in der Probe durchfließen können, wenn das Antigen an die Membran gebunden wird.
- Die in diesem Test verwendeten Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und können gekauft oder mittels bekannter Verfahren hergestellt werden.
- In einer Ausführungsform ist der Antikörper gegen das Antigen für den Nachweis markiert. Brauchbare Marker sind aus dem Stand der Technik bekannt und umfassen chemische oder biologische Verbindungen, die mittels geeigneter Verfahren und Geräte direkt nachweisbar sind, sowie Verbindungen, die durch weitere chemische oder spezifisch bindende Reaktionen, bei denen nachweisbare Spezies gebildet werden, nachgewiesen werden. Beispiele für brauchbare Narker umfassen Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, phosphoreszierende Verbindungen, Biotin oder seine Derivate, Avidin oder seine Derivate, Ferritin, magnetisierbare Partikel, gefärbte Partikel und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Radioisotope oder Enzyme sind bevorzugte Marker. Die Marker können mittels bekannter Techniken an die Antikörper gebunden sein. Wenn der Marker nicht direkt nachweisbar ist, sind weitere Reagenzien oder Verbindungen notwendig, um die Reaktion oder das spezifisch bindende Produkt nachweisbar zu machen. Wenn der Marker beispielsweise Biotin ist, kann er mit Avidin umgesetzt werden, das mit einem Enzym konjugiert ist, um eine nachweisbare Spezies zu bilden. Wenn der Marker ein Enzym ist, wie Glucoseoxidase, Urease, Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere, sind ebenfalls Substrate und farbstoffbildende Reagenzien notwendig.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Marker Peroxidase, und an irgendeinem Punkt des Tests werden Wasserstoffperoxid und geeignete farbstoffbildende Reagenzien zugegeben, um einen nachweisbaren Farbstoff zu bilden. Verwendbare farbstoffbildende Reagenzien umfassen z. B. Tetramethylbenzidin und seine Derivate und Leukofarbstoffe, wie Triarylimidazol-Leukofarbstoffe (wie im US-Patent 4,089,747 beschrieben ist), oder andere Verbindungen, die unter Bildung eines Farbstoffs in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid reagieren (d. h. Verbindungen, die bei katalytischer Wirkung von Peroxidase unter Bildung eines Farbstoffes reagieren).
- In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist der Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantikörper nicht markiert, und der Nachweis des gebildeten und an den Träger gebundenen Antikörper-Antigen-Komplexes wird mittels eines zweiten Antikörpers (im folgenden beschrieben) erreicht, der für den Chlamydien-, Gonokokken- bzw. Herpesantikörper spezifisch ist und geeignet markiert ist.
- Der Antigen-Antikörper-Komplex kann in Gegenwart von einem oder mehreren blockierenden Proteinen gebildet werden, die nicht-spezifische Wechselwirkungen auf dem Träger reduzieren. Brauchbare Proteine sind gut bekannt und umfassen beispielsweise Casein, α-Casein, fetales Rinderserum und Schweinegammaglobulin. Eine besonders brauchbare Blockierungszusammensetzung umfaßt ein nicht immunologisches Protein und ein amphoteres Surfactant.
- Um die Bildung des an den Träger gebundenen immunologischen Komplexes zu beschleunigen, werden der Antikörper und das Antigen üblicherweise bis zu 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 15 bis 30 ºC inkubiert. Vorzugsweise wird bei Raumtemperatur (d. h. von 18 bis 25 ºC) bis zu 5 Minuten lang inkubiert.
- Nach der Inkubation und innerhalb von 10 Minuten nach dem Antikörper-Antigen-Kontakt wird der gebundene Komplex ein oder mehrmals mit einer gepufferten Waschlösung gewaschen, die üblicherweise einen pH von 7 bis 11 aufweist. Die Lösung enthält vorzugsweise ein oder mehrere Surfactants, um das Abtrennen von nicht komplexierten Materialien von dem Komplex auf dem Träger zu unterstützen. Besonders brauchbare Surfactants sind kationische Surfactants. Bevorzugte Waschlösungen umfassen kationische Surfactants.
- In der zuvor beschriebenen Ausführungsform, bei der der Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantikörper markiert ist, wird bei dem Testverfahren nach dem Waschen der Marker direkt oder indirekt nach Zugabe der geeigneten Reagentien nachgewiesen. Dies wird relativ rasch nach dem Waschen des gebundenen Komplexes durchgeführt. Falls gewünscht, kann der Nachweis des Markers mittels Inkubation beschleunigt werden, falls die Reagentien dies erlauben. Der Marker wird dann mittels Standardausrüstung und -verfahren nachgewiesen.
- In der bevorzugten Ausführungsform ist der Chlamydien-, Gonokokken- oder Herpesantikörper unmarkiert und nach dem Waschen des gebundenen Komplexes wird er mit einem Antikörper in Kontakt gebracht, der gegen den nicht markierten Antikörper gerichtet ist. Dieser zweite Antikörper (d. h. ein anti-Antikörper) ist mit einem der zuvor beschriebenen Marker geeignet markiert. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und entweder gekauft oder mittels bekannter Techniken hergestellt werden.
- Nach diesem Kontakt wird der erhaltene Antigen-Antikörper-Antikörper-Komplex, der an den Träger gebunden ist, bis zu 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 15 bis 30 ºC inkubiert. Vorzugsweise wird bei Raumtemperatur bis zu 5 Minuten lang inkubiert.
- Es wird ein weiterer Waschschritt durchgeführt, um nicht komplexierte Materialien zu entfernen, und geeignete Enzymsubstrate oder andere benötigte Reagentien werden zugegeben, um eine nachweisbare Spezies zu bilden. Der gebundene Antigen-Antikörper-markierter Antikörper-Komplex wird dann auf dem Träger mittels radiometrischer, kolorimetrischer, Fluoreszenz- oder anderer Standardnachweistechniken nachgewiesen.
- Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen, ihren Inhalt jedoch nicht einschränken.
- Serovar H-Antigen-gereinigte Elementarkörperchen wurden von Professor W. J. Newhall der Indiana University erhalten. Eine Antigenvorratslösung (5 ul, die 3240 ng Antigen/ul enthält) wurde zu einer Lösung (50 ul) von Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Salzlösung (0,1 mg/ml) zugegeben und bei -80 ºC aufbewahrt, wobei man Lösung A erhielt. Diese Lösung wurde aufgetaut und mittels Verwirbeln und Schallbehandlung gemischt und anschließend wurden 15 ul mit der Rinderserumalbumin-Lösung (945 ul) mittels Verwirbeln gemischt, wobei man Lösung B erhielt und wobei die Antigenkonzentration 4,6 x 10&sup5; pg/100 ul betrug. Lösung B (100 ul) wurde dann mit Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Salzlösung (900 ul) gemischt, wobei man Lösung C erhielt, die eine Antigenkonzentration von 4,6 x 10&sup4; pg/100 ul aufwies.
- Der monoklonale Mausantikörper gegen das chlamydiale Lipopolysaccharid (LPS)-Antigen wurde mittels Standardhybridomatechnologie und Mauszellinie hergestellt und in einer Lösung von phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4), die 0,01 Gewichts-% Azid als ein Konservierungsmittel enthielt, aufbewahrt. Es wurde eine Antikörperlösung hergestellt, indem eine Probe (19 ul) der Antikörperlösung zu einer phosphatgepufferten Salzlösung (Verdünnung 1:800) zugegeben wurde, die Casein (0,5 Gewichts-%) als ein Blockierungsprotein und amphoterisches Surfactant Lonzainet C (0,01 Gewichts-%) enthielt, dann durch einen 0,22 um Filter filtriert, wobei man eine Arbeitslösung erhielt.
- Der monoklonale Mausantikörper gegen das chlamydiale Hauptproteinantigen der äußeren Membran (MOMP) wurde mittels Standardhybridomatechnologie und einer Mauszelllinie hergestellt und in einer Lösung aus phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4), die 0,01 Gewichts-% Azid enthielt, aufbewahrt. Es wurde eine Antikörperlösung hergestellt, indem eine Probe (14 ul) der Antikörperlösung zu einer phosphatgepufferten Salzlösung (Verdünnung 1:1100) zugegeben wurde, die Casein (0,5 Gewichts-%) als ein Blockierungsprotein und amphoterisches Surfactant Lonzainet C (0,01 Gewichts-%) enthielt, dann wurde durch einen 0,22 um Filter filtriert, wobei man eine Arbeitslösung erhielt.
- Der verwendete markierte polyklonale Antikörper war ein Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war. Dieses Konjugat wurde in einer phosphatgepufferten Salzlösung, die Casein (0,5 Gewichts-%) und amphoterisches Surfactant Lonzaine C (0,01 Gewichts-%) enthielt, auf 1 : 2000 verdünnt, dann durch einen 0,22 um Filter filtriert, wobei man eine Arbeitslösung erhielt.
- Es wurde eine Antigen-Extraktionslösung aus den folgenden Komponenten hergestellt: Natriumazid (0,027 molar), Natriumchlorid (0,27 molar), Ethanolaminhydrochlorid (0,47 molar), Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (0,045 molar), kationisches Surfactant Emcolt CC-36 (quaternäre Ammoniumchloride von Polypropoxy-t-aminen, 0,45 Gewichtsprozent einer 10 %-igen Lösung in Methanol) und Natriumhydroxid (0,66 molar, pH 11).
- Dieses Beispiel demonstriert die Durchführung der vorliegenden Erfindung zum Extrahieren von C. trachomatis- Lipopolysaccharid und Hauptproteinantigenen der äußeren Membran.
- Elementarkörperchenprotein (25 000 pg Protein in 81,5 ul Rinderserumalbumin/phosphatgepufferter Salzlösung) wurden zu einer Extraktionszusammensetzung (1418,5 ul) der vorliegenden Erfindung zugegeben und gemischt und etwa 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten. Zwei entsprechende Extraktionslösungen wurden ohne Antigen hergestellt.
- Wasserstoffperoxidlösung (8 Gewichts-%, 1500 ul) wurden zu jeder Extraktionslösung zugegeben, um endogene Katalase, Peroxidase und Myeloperoxidase zu entfernen. Die erhaltenen Gemische wurden wiederum 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten.
- Ein Teil einer jeden Extraktionslösung (120 ul) wurde in die Mikrotiterplattenvertiefungen einer individuellen Einwegtestvorrichtung gegeben, die ähnlich gestaltet war wie die in der EP-A-0 280 558 beschriebene (zuvor angegeben), und man ließ die Flüssigkeiten durchlaufen. Die Vorrichtung enthielt eine mikroporöse 5 um-Membran, die auf ihrer Oberfläche quaternäre Ammoniumgruppen aufweist und im Handel als Pall Biodyne B-Membran erhältlich ist. Vor der Verwendung wurde die Membran mit nicht-ionischem Surfactant Zonyl FSN behandelt.
- Portionen (120 ul) von jeder der anti-LPS- und anti-MOMP- Lösungen (zuvor beschrieben) und eine Portion (120 ul) von beiden vereinigten Antikörperlösungen wurden in jede Vertiefung der Testvorrichtung zugegeben, während man Flüssigkeit durchlaufen ließ. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten lang durchgeführt. Anschließend an die Inkubation wurde der erhaltene Antigen-Antikörper- Komplex zweimal mit einer Lösung (160 ul) von kationischem Surfactant Emcol CC-9 (0,75 Gewichts-%) in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,2) gewaschen.
- Eine Lösung (120 ul) der mit Peroxidase markierten Ziegeanti-Maus-Antikörper wurden in jede Vertiefung gegeben und man ließ sie nach dem Kontakt durch die Membran fließen. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur wiederum für 5 Minuten durchgeführt, um einen ionisch an die Membran gebundenen Antigen-Antikörper-markierter Antikörper-Komplex zu bilden.
- Nach zweimaligem Waschen mit der zuvor beschriebenen Waschlösung wurde eine farbstoffbildende Zusammensetzung zu jeder Vertiefung zugegeben. Diese Zusammensetzung enthielt Wasserstoffperoxid (10 mmolar), 2-(4-Hydroxy-3- methoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol-Leukofarbstoff (0,005 Gewichts-%), Poly(vinylpyrrolidon) (1 Gewichts-%), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 mmolar).
- Innerhalb von etwa 10 Minuten wurde ein roter Farbstoff in der Vertiefung beobachtet, der das Vorliegen von aus der Probe erhaltenem Chlamydienantigen anzeigte. Die Transmissionsdichte wurde gemessen, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I als die Differenz (ΔDT) zwischen Extraktionslösungen mit Antigen und solchen ohne Antigen dargestellt. Sie zeigen an, daß die erfindungsgemäße Extraktionszusammensetzung für die Extraktion beider Antigene aus den Chlamydienorganismen wirksam war und insbesondere für die Extraktion des Hauptproteinantigens der äußeren Membran wirksam war. TABELLE I Antigen ΔT für Extraktionszusammensetzungen LPS alleine MOMP alleine LPS + MOMP
- Serovar K-Elementarkörperchen wurden von Professor J. Newhall (Indiana University) erhalten, und es wurden wie folgt Arbeitslösungen hergestellt:
- Die zuvor beschriebene Lösung B (18 ul) wurde mit Extraktionslösung (1982 ul) gemischt, um eine Testlösung herzustellen, die 5000 pg Antigen/120 ul enthielt.
- Lösung B (9 ul) und Extraktionslösung (1991 ul) wurden gemischt, um eine Testlösung herzustellen, die 2500 pg Antigen/120 ul enthielt.
- Lösung C (36 ul) und Extraktionslösung (1964 ul) wurden gemischt, um eine Testlösung herzustellen, die 1000 pg Antigen/120 ml enthielt.
- Es wurde auch eine Kontrollösung hergestellt, die Extraktionslösung (2000 ul) ohne Antigen enthielt.
- Es wurde monoklonale Maus-anti-LPS-Antikörperzusammensetzung hergestellt mit Antikörperlösung (10 ul), Casein (0,5 Gewichts-%) und Lonzaine C-Surfactant (0,01 Gewichts-% in 14,99 ul).
- Mit Meerrettichperoxidase konjugierter monoklonaler anti- Maus-Antikörper wurde in eine Zusammensetzung (100 ul) mit Casein (0,5 Gewichts-%) und Lonzaine C-Surfactant (0,01 Gewichts-% in 9,9 ul) eingebracht.
- Serovar K-Elementarkörperchen wurden bei verschiedenen pH-Werten (9,5, 10,25 und 11,0) extrahiert. Das extrahierte Antigen wurde in Tests verwendet, die wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt wurden, und die erhaltenen Transmissionsdichten sind in der folgenden Tabelle II angegeben. Die Daten zeigen, daß eine Extraktion bei pH 11 mittels eines Alkoholamins die beste Empfindlichkeit mit geringstem Hintergrund ergibt. TABELLE II Antigen-Konzentration (pg) DT bei Extraktions-pH Kontrolle (0)
- Dieses Beispiel veranschaulicht einen Test für C. trachomatis mittels eines markierten Chlamydienantikörpers. Zwei verschiedene Antikörper, die gegen das Hauptprotein der äußeren Membran gerichtet sind, wurden mittels eines bekannten Verfahrens mit Meerrettichperoxidase konjugiert (Yoshitake, Eur. J. Biochem., 101, 395, 1979). Die Konjugate wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4) gehalten, die 0,01 (Gewichts)-% Thimerosal enthielt, bis sie in dem Test verwendet wurden.
- Serovar H-Elementarkörperchen wurden wie zuvor beschrieben erhalten. Antigenlösung B (zuvor näher beschrieben, 24,5 ul) wurde mit der Extraktionszusammensetzung von Beispiel 1 (1475,5 ul) 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gemischt, wobei man eine erste Extraktlösung (1500 ul) erhielt, die 1,13 x 10&sup5; pg Antigen enthielt (dies ergibt eine Antigen- Endkonzentration in dem Test von etwa 4500 pg/120 ul Testprobe). Eine zweite Extraktlösung wurde durch geeignete Verdünnung der ersten Extraktlösung hergestellt, wobei man eine Antigen-Endkonzentration in dem Test von 1500 pg/120 ul Testprobe erhielt.
- Wasserstoffperoxid (1,5 ml einer 8 %-igen Lösung) wurde zu jeder der zuvor näher beschriebenen Antigenextraktlösung zugegeben, gemischt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten.
- Die Lösungen (120 ul) wurden dann zu Einwegtestvorrichtungen zugegeben, die mikroporöse Biodyne Nylonmembran enthielten, die mit Zonyl FSN-Surfactant (0,05 Gewichts-%) vorbeschichtet worden war und dann durchfließen gelassen.
- Die peroxidasemarkierten Antikörper wurden in Kombination (120 ul) mit Casein und amphoterem Surfactant Lonzaine wie folgt zugegeben: Konjugat 1 wurde mit 1,25 % (Gewichts)-% Casein und 0,025 % (Gewichts)-% Surfactant zugegeben, und Konjugat 2 wurde mit 2 % (Gewichts)-% Casein und 0,04 % (Gewichts)-% Surfactant zugegeben. Anschließend wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
- Die Membranen wurden dann zweimal mit einer Lösung von kationischem Surfactant Emcol CC-9 (0,75 Gewichts-%, 160 ul) in phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen.
- Leukofarbstofflösung (120 ul) wurde zu den Testvorrichtungen zugegeben, anschließend 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, und die Farbstoffdichte wurde bestimmt.
- Eine Kontrollösung, die kein Antigen enthielt, wurde auf ähnliche Weise getestet, um die Hintergrunddichte anzuzeigen.
- Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III als die Differenz in der Transmissionsdichte (ΔDT) zwischen der Testlösung und der Kontrollösung angegeben. TABELLE III ΔDT Antigen-End-konzentration Antikörperkonjugat
Claims (12)
1. Extraktionszusammentzung die zum Extrahieren von
Antigen aus Chlamydien- Gonokken- oder
Herpes-Organismen verwendbar ist.
wobei die Zusammensetszung dadurch gekennzeichnet ist,
daß sie einen pH von mindestens 9 aufweist und daß sie
umfaßt
eine starke Base,
ein Alkoholamin oder ein Salz davon das in einer
Menge von mindestens 1 mg/ml vorliegt.
ein Reduktionsmittel und
ein kationishes Surfakant.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1. in der die starke
Base Natriumhydroxid ist.
3. Zusammeensetzung nach Anspruch 1. in der das
kationische Surfakant quaternäre Ammoniumgruppen enthält.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der das
Reduktionsmittel Dithiothreitol ist.
5. Extraktionzusammensetzung, die zum Extrahieren von
Lipopolysaccharid oder Hauptproteinantigen der äußeren
Membran von Clamydia trachomatis verwendbar ist.
wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist,
daß sie einen pH von mindestens 10 aufweist und umfaßt:
a. von 2 bis 30mg/ml eines Alkoholamins oder eines
seiner Salze.
b. von 2 bis 20 mg/ml eines Alkalimetallhydroxids,
c. von 0,2 bis 2 mg/ml eines Reduktionsmittels und
d. von 2 bis 10 mg/ml eines quaternären
Ammoniumgruppen enthaltenden Surfaktants.
6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, in der das
Alkoholamin Ethanolamin oder eines seiner Salze ist, das Hydroxid
Natriumhydroxid ist das Reduktionsmittel Dithiothreitol
ist und das Surfaktant ein Gemisch aus quaternären
Ammoniumchloriden von Polypropoxy-t-aminen ist.
7. Verfahren zum Extrahieren von Antigen aus
Chlamydien- Gonokokken- oder Herpes-Organismen,
umfassend:
A. Bereitstellen einer Probe, von der angenommen
wird, daß sie Chlamydien- Gonokokken- oder
Herpes-Organismen enthält und
B. In-Kontakt-bringen der Probe mit einer
Extraktionszusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, um
chlamydiales, gonokokkales oder respektive Herpes-Antigen
zum Nachweis zu extrahieren.
8. Verfahren nach Anspruch 7, das in einer
Extraktionsvorrichtung durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8 zur
Extraktion eines chlamydialen Antigens.
10. Verfahren zur Bestimmung eines chlamydialen,
gonokokkalen oder Herpes-Antigens, umfassend:
A. Extrahieren des chlamydialen, gonokokkalen oder
Herpes-Antigens aus einer Probe, von der angenommen wird
daß sie Chlamydien-, Gonokokken- oder respektive Herpes-
Organismen enthält, mit einer Extraktionszusammensetzung
nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
B. In-Kontakt-bringen des extrahierten Antigens mit
chlamydialen, gonokokkalen oder respektive
Herpes-Antikörpern, um einen immunologischen Komplex zu bilden, und
C. Bestimmen des Vorliegens des Komplexes als
Nachweis für das Vorliegen von Chlamydien-
Gonokokken- oder respektive Herpes-Organismen in der Probe.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Antikörper
zum Nachweis markiert sind.
12. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Antikörper
nicht markiert sind und der Antikörper-Antigen-Komplex
unter Verwendung eines Anti-Antikörpers bestimmt wird, der
zum Nachweis markiert ist.
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