DE68918256T2 - Chlamydia-Test. - Google Patents
Chlamydia-Test.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft einen Test zum Nachweis eines Analyten und insbesondere einen verbesserten Festphasentest für Chlamydia.
- Die Gattung Chlamydiaceae umfaßt zwei Arten, Chlamydia trachomatis und Chlamydia psittaci. Chlamydia trachomatis mit ihren etwa fünfzehn verschiedenen Stämmen ist ein ätiologisches Agens für eine Anzahl menschlicher Augen- und Geschlechtskrankheiten, zu denen Trachom, Einschlußkonjunktivitis, Lymphogranulomatosis venerea, "unspezifische" oder nicht gonokokkische Urethritis und Proktitis gehören. Infektion mit C. trachomatis ist in der gesamten Bevölkerung verbreitet. Es ist zum Beispiel eingeschätzt worden, daß C. trachomatis für mehrere Millionen Fälle von nicht gonokokkischer Urethritis pro Jahr verantwortlich ist.
- Wegen der weiten Verbreitung der durch C. trachomatis übertragenen Krankheit ist ein zuverlässiger, einfacher und billiger Test zum Nachweis des Organismus in hohem Maße wünschenswert und von großer Bedeutung, um eine angemessene Behandlung zu ermöglichen. Der einzige gegenwärtig angewandte serologische Test ist der Mikroimmunofluoreszenztest. Dieser Test erfordert jedoch, daß die Stämme der C. trachomatis als serologisches Testantigen verwendet werden. Außerdem sind die Einrichtungen zur Durchführung dieses Tests weltweit nur in einer begrenzten Zahl von Laboratorien verfügbar. Der Test ist sehr mühsam, zeitraubend und schwierig in der Ausführung.
- Es sind verschiedene Immunoassay-Verfahren für Chlamydia offenbart worden. In der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 86/02733 wird ein Test für verschiedene Antigene einschließlich Chlamydia offenbart, die Augeninfektionen verursachen. Der Test schließt die Immobilisierung des Antigens auf einer festen Trägersubstanz durch Bindung an einen auf der Trägersubstanz absorbierten monoklonalen Antikörper ein, oder das Antigen wird direkt auf der festen Trägersubstanz absorbiert.
- Die EP-O 183 383 offenbart einen Test für Chlamydia-Antigen mit Isolierungsverfahren, bei dem das Antigen auf eine Temperatur von etwa 100ºC erhitzt wird, um die unspezifische Bindung zu reduzieren.
- In der US-PS-4 663 291 offenbart Rose die Behandlung einer Probe, die im Verdacht steht, Chlamydia-Organismen zu enthalten, mit einem oberflächenaktiven Mittel und einem Metallion, um das Chlamydia-Antigen freizusetzen und nach bekannten Verfahren zu testen. Gemäß dem Verfahren tritt die bekannte Hemmung der Bindung des Antigens an Anti-Chlamydia- Antikörper durch das oberflächenaktive Mittel nicht auf.
- In der US-PS-4 497 899 offenbaren Armstrong u. a. ein Immunoassay für Chlamydia-Antigen, bei dem eine Probe, die im Verdacht steht, Chlamydia- Organismen zu enthalten, lysiert wird, um das Antigen freizusetzen, das direkt auf einer festen Trägersubstanz absorbiert wird.
- Trotz der obigen Offenbarungen besteht nach wie vor ein ausgesprochen dringender Bedarf für eine weitere Verbesserung der Chlamydia-Tests. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, diesen Bedarf zu befriedigen.
- Ein Verfahren zur Bestimmung von Chlamydia-Antigen weist die folgenden Schritte auf: Anhaften des Chlamydia-Antigens an eine amidinderivierte feste Trägersubstanz in einer Flüssigkeit; Inkontaktbringen des an der Trägersubstanz anhaftenden Antigens mit einem Anti-Chlamydia- Antikörper mit ankonjugierter Markierung, wobei das Antigen mit dem Antikörper eine Bindung eingeht und eine die Markierung enthaltende gebundene Fraktion auf der Trägersubstanz bildet; Trennen der Trägersubstanz von der Flüssigkeit; und Nachweis des Antigens durch ein mit der Markierung verbundenes Signal.
- In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist das Verfahren die folgenden Schritte auf: Inkontaktbringen von Teilchen eines amidinmodifizierten Latex mit einer Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie Chlamydia-Antigen enthält, wodurch das Antigen an den Teilchen anhaftet; Inkontaktbringen der Teilchen mit dem anhaftenden Antigen mit einem Anti- Chlamydia-Antikörper, der an ein Enzym konjugiert ist, wodurch das an den Teilchen anhaftende Antigen eine Bindung mit dem Antikörper eingeht und auf den Teilchen eine gebundene Fraktion bildet, welche das Enzym enthält; Trennen der Teilchen mit der anhaftenden gebundenen Fraktion von der Flüssigkeit; Inkontaktbringen des Enzyms auf den abgetrennten Teilchen mit einem Substrat, das mit dem Enzym reaktionsfähig ist, wodurch das Enzym das Substrat in ein Produkt umwandelt; und Nachweis des Chlamydia-Antigens in der Probe durch das Auftreten einer mit dem Produkt verbundenen Farbe.
- Vorzugsweise werden die Organismen durch Behandlung mit einem Reinigungsmittel verändert, um das Antigen der Trägersubstanz stärker auszusetzen. In der vorliegenden Offenbarung ist mit dem Ausdruck "Bestimmung" der qualitative Nachweis des Vorhandenseins von Chlamydia- Organismen in der Körperprobe oder die quantitative Bestimmung der Anzahl solcher Organismen gemeint.
- Die bevorzugte feste Trägersubstanz ist ein Polystyrol-Latex aus amidin-derivierten Teilchen, und die bevorzugte Markierung ist ein an den Antikörper ankonjugiertes Enzym. Ein bevorzugtes Trennverfahren ist das Filtern der Teilchen durch eine geeignete Membran. Die gefilterten Teilchen werden dann vorzugsweise nachgewiesen, indem sie auf der Membran mit einem Substrat in Kontakt gebracht werden, das mit dem Enzym reagiert, um eine Farbe zu erzeugen. Eine bevorzugte Enzym-Substrat-Kombination ist alkalisches Phosphataseindoxylphosphat, wobei eine Blaufärbung Chlamydia- Organismen in der Körperprobe anzeigt. Die Färbung kann vorzugsweise dadurch intensiviert werden, daß das Enzym und das Substrat beispielsweise in Gegenwart eines Tetrazoliumsalzes zur Reaktion gebracht werden.
- Ein Materialsatz zur Durchführung des Tests ist in der Erfindung eingeschlossen.
- Der amidin-modifizierte Latex liefert einen Test, der gegenüber einem weitgehend identischen Test unter Verwendung eines Latex mit nicht amidinmodifizierten Teilchen stark verbessert ist. Da sich das Antigen ohne weiteres an die Amidingruppen bindet, wird kein einfangender Antikörper benötigt. Neben einer höheren Empfindlichkeit, die dem stärkeren Anhaften des Antigens an den Amidingruppen zugeschrieben wird, ist der Test leicht ausführbar, erfordert nur wenige einfache Schritte und kann in etwa 30 Minuten oder weniger beendet werden.
- Die Erfindung kann zwar durch Ausführungsbeispiele in vielen verschiedenen Formen realisiert werden; hier werden aber bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung ausführlich beschrieben, wobei die vorliegende Offenbarung als Erläuterung der Prinzipien der Erfindung anhand von Beispielen aufzufassen ist und die Erfindung nicht auf die geschilderten Ausführungsbeispiele einschränken soll. Der Schutzumfang der Erfindung ist nach den beigefügten Ansprüchen und ihren Äquivalenten zu beurteilen.
- Erfindungsgemäß kann das Vorhandensein von Chlamydia-Organismen durch einen Antigen-Test unter Verwendung einer bestimmten festen Trägersubstanz nachgewiesen werden. Es hat sich gezeigt, daß bei der Inkubation von Chlamydia-Antigen mit einer polymeren Trägersubstanz, die mit Amidingruppen modifiziert ist, durch das wesentlich stärkere Anhaften des Antigens an der Trägersubstanz als bei einer herkömmlichen Trägersubstanz ein Test mit höherer Empfindlichkeit erzielt wird.
- Bei dem erfindungsgemäßen Test kann irgendeine polymere Trägersubstanz mit Amidin-Seitengruppen verwendet werden. So kann die Trägersubstanz zum Beispiel ein Styrol-Butadien-Copolymer, ein Polyacrylat oder vorzugsweise ein amidin-modifiziertes Polystyrol sein. Amidinmodifizierte Polymere können durch Polymerisieren von carbonsäuresubstituierten olefinischen Monomeren und Umwandlung der Carbonsäure- oder Carbonsäureestergruppen in Amidingruppen oder vorzugsweise durch Umwandlung von säure- oder ester-substituierten olefinischen Monomeren in die entsprechenden amidin-substituierten Monomere und Polymerisation hergestellt werden. Die Umwandlung von Carbonsäuren oder Carbonsäureestern in Amidine ist routinemäßige organische Chemie und dem Fachmann gut bekannt.
- Der feste Träger kann in irgendeiner herkömmlichen Form oder Gestalt vorliegen, wie z. B. in Form von Platten, Tafeln, Mulden, Perlen, Tauchstäben, Röhrchen und dergleichen. Bevorzugte feste Träger sind Perlen, besonders bevorzugt sind Latexteilchen. Ein besonders bevorzugter fester Träger ist amidin-modifizierter Polystyrollatex, erhältlich von Interfacial Dynamics, Portland, Oregon. Die Teilchen des bevorzugten Latex können eine Korngröße von etwa 0,01 bis 50 um haben, vorzugsweise von 0,1 bis 10 um, und am besten von etwa 0,4 bis 1,0 um. Der Latex kann etwa 0,01 bis 10, vorzugsweise etwa 0,1 bis 4, am besten etwa 1,0 % Gew./Vol. Feststoffe enthalten.
- Die amidin-modifizierten Latexteilchen werden mit Chlamydia-Antigen inkubiert. Das Antigen kann aus einer Körperflüssigkeitsprobe eines Patienten gewonnen werden, die im Verdacht steht, Chlamydia-Organismen zu enthalten. Eine mit einem Tupfer entnommene Genitalprobe wird im allgemeinen bevorzugt. Die Probe kann in einer Flüssigkeit, wie z. B. einem Puffer, durch Rühren mit dem Tupfer suspendiert werden, um die Organismen in den Puffer freizusetzen.
- Der Test kann mit intakten Zellen ausgeführt werden, vorzugsweise werden jedoch die Chlamydia-Organismen vorbehandelt, um die Zellen zu verändern und eine stärkere Exponierung des Chlamydia-Antigens zu erreichen. Es kann jedes Reagens verwendet werden, das die Chlamydia-Zellen auf eine Weise verändert, die das Antigen für das Anhaften an den amidinmodifizierten Latex und die Bindung an den Tracer besser verfügbar macht. Herkömmliche Verfahren, wie sie von den oben zitierten Armstrong u. a. beschrieben werden, oder das oben zitierte patentierte Verfahren von Rose können angewendet werden. Ein bevorzugtes Reagens für die Veränderung der Chlamydia-Zellen enthält einen Chelatbildner, ein Protein und eine oberflächenaktive Substanz in einem Puffer und wird ausführlich in einem der Beispiele beschrieben.
- Das Anhaften des Chlamydia-Antigens an die Amidinlatexteilchen kann innerhalb irgendeiner Zeitdauer von vorzugsweise 1 bis 60 Minuten bei irgendeiner geeigneten, zum Herbeiführen einer festen Haftung ausreichenden Temperatur, vorzugsweise bei etwa 10 bis 40ºC, ausgeführt werden. Im allgemeinen erfolgt das Anhaften des Antigens mit Leichtigkeit und ist nach etwa 15 Minuten bei 37ºC weitgehend abgeschlossen.
- Erfindungsgemäß wird durch die Verwendung eines amidin-modifizierten Latex ein stark verbesserter Test erzielt. Es besteht die - allerdings unbewiesene - Ansicht, daß zwischen den Amidingruppen auf den Latexteilchen und dem Chlamydia-Antigen eine spezifische Wechselwirkung auftritt, wie durch die schlechteren Ergebnisse belegt wird, die bei Abwesenheit der Amidingruppen erzielt werden.
- Das an dem amidin-modifizierten Latex anhaftende Chlamydia-Antigen kann mit einem Tracer für das Antigen in Kontakt gebracht werden. Der Tracer ist ein für das Antigen spezifischer Antikörper mit einer an den Antikörper ankonjugierten Markierung. Die Markierung kann ein radioaktives Atom, ein Fluoreszenzfarbstoff oder ein Enzym sein, die durch ein mit der Markierung verbundenes Signal nachgewiesen werden können. Der besonders bevorzugte Tracer ist ein monoklonaler Anti-Chlamydia-Antikörper mit einem ankonjugierten Enzym, der durch herkömmliche Aufschluß- und Selektionsverfahren vermehrt worden ist. Verfahren zur Vermehrung monoklonaler Antikörper und zum Ankonjugieren einer radioaktiven Markierung, eines Farbstoffs oder Enzyms an einen Antikörper sind gut bekannt, und zum völligen Verständnis dieses Aspekts der Erfindung sind für den Fachmann keine weiteren Details erforderlich.
- Als Markierung kann ein beliebiges Enzym dienen, das an einen Antikörper ankonjugiert werden und ein Substrat in ein farbiges Produkt umwandeln kann. Ein bevorzugtes Enzym ist eine Peroxidase, wie z. B. Meerrettichperoxidase (HRP), oder am besten eine Hydrolase. Eine geeignete Hydrolase ist zum Beispiel eine Peptidase, eine Esterase wie etwa Carboxyesterase, eine Glycosidase wie Galactosidase, oder am besten eine Phosphatase wie z. B. alkalische Phosphatase (AP).
- Die Bindung der Antikörperkomponente an das am Latex anhaftende Antigen erfolgt auf ganz und gar herkömmliche Weise und ist im allgemeinen innerhalb von etwa 1 bis 10 Minuten bei Umgebungstemperatur abgeschlossen.
- Die Latexteilchen mit einer daran gebundenen Fraktion werden von der Flüssigkeit nach irgendeinem herkömmlichen Verfahren abgetrennt. Zum Beispiel kann das Testmedium zentrifugiert werden, das Teilchenpellet kann durch Abgießen der Flüssigkeit abgetrennt und in einer zweiten Flüssigkeit wieder suspendiert werden. In diesem Ausführungsbeispiel der Erfindung kann das Substrat der zweiten Flüssigkeit zugesetzt werden, und das Vorhandensein von Chlamydia in der Körperprobe kann durch Entwickeln der Farbe in der zweiten Flüssigkeit festgestellt werden. Dieses Ausführungsbeispiel der Erfindung wird bevorzugt, wenn das Antigen quantitativ bestimmt werden soll. So kann die Farbintensität mit einem Meßgerät, etwa mit einem Kolorimeter oder einem Spektrophotometer, gemessen und mit Farbintensität verglichen werden, die sich bei einer Wiederholung des Tests mit Flüssigkeiten ausbildet, die eine bekannte Menge des Antigens enthalten. Es ist klar, daß dieses Ausführungsbeispiel auch bei Verwendung eines Farbstoffs oder einer radioaktiven Markierung bevorzugt wird, in welchem Falle das Antigen durch die Fluoreszenz des Farbstoffs nach einer Bestrahlung mit Anregungslicht oder durch die Bestimmung radioaktiver Zählimpulse nachgewiesen wird.
- Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, das nur den Nachweis des Antigens erfordert, kann die Abtrennung der Teilchen von der Flüssigkeit durch Filtration unter Verwendung einer Membran mit einer Porengröße erfolgen, die für das Zurückhalten der Teilchen auf der Membranoberfläche geeignet ist. Geeignete Membranen sind z. B. Nylonmembranen wie Immunodyne von der Pall Corp., Glen Cove, New York; Immobilon von der Millipore Corp., Bedford, Massachusetts; und Nitrocellulosemembranen, die von der MSI, Westboro, Massachusetts, und von Millipore bezogen werden können. Am besten wird die Membran mit einem inerten Protein vorbehandelt, wie z. B. mit Casein oder Albumin, um Bindungsplätze auf der Membran zu füllen, die sonst unspezifische Bindungen mit ungebundenem Tracer in der Flüssigkeit eingehen würden, wodurch eine Färbung entstehen würde, die nicht auf gebundenes Antigen zurückzuführen wäre. Auf Wunsch können die Membranfilter in Form von Mulden bereitgestellt werden, wie z. B. die Mulden einer herkömmlichen Mikrotiterplatte, und sie können außerdem mit einer Struktur zur Unterstützung der Filtration versehen werden, etwa mit einem Anschluß an eine Unterdruckquelle oder mit einer Schicht aus saugfähigem Material unterhalb des Filters.
- Nach dem Filtern werden die Teilchen auf der Membranoberfläche am besten gewaschen, vorzugsweise mit einem Reinigungsmittel wie etwa Natriumdodecylsulfat (SDS), und schließlich mit entionisiertem Wasser. Die gewaschene Membran kann dann mit Substratlösung behandelt werden. Es kann irgendein Substrat verwendet werden, das mit der Enzymmarkierung zu einem farbigen Produkt reagiert. So können, wenn es sich bei dem Enzym um Meerrettichperoxidase (HRP) handelt, Diaminobenzidin oder vorzugsweise Orthophenylendiamin als geeignete Substrate verwendet werden. Wenn das Enzym eine Esterase ist, dann kann das Substrat zum Beispiel p-Nitrophenylacetat oder -butyrat sein. Ist das Enzym eine Phosphatase wie z. B. die bevorzugte alkalische Phosphatase, dann sind Phosphate geeignete Substrate, wie z. B. p-Nitrophenylphosphat oder Indoxylphosphat. Das Substrat kann in der Substratlösung in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 mM, vorzugsweise von etwa 1 bis 5 mM enthalten sein. Die Auswahl eines geeigneten Substrats und seiner Konzentration kann von einem Fachmann mit Leichtigkeit vorgenommen werden.
- Es hat sich gezeigt, daß sich die Farbintensität verstärkt, wenn die Substratlösung zusätzlich eine geringe Menge eines Farbverstärkers enthält. Ein geeigneter Farbverstärker ist zum Beispiel ein Tetrazoliumsalz. Dementsprechend enthält die besonders bevorzugte Substratlösung etwa 0,01 bis 0,1 mg/ml Nitroblau-Tetrazolium in Methanol.
- Im allgemeinen läuft die Reaktion des Enzyms mit dem Substrat zur Bildung des farbigen Produkts schnell ab, und eine Zeitdauer von etwa 1 bis 15 Minuten, vorzugsweise von 3 bis 5 Minuten ist ausreichend für die Färbung. Man kann die Färbungsreaktion beliebig lange andauern lassen, bevor man sie als positiv (Färbung, daher Antigen vorhanden) oder negativ (keine Färbung, daher kein Antigen) beurteilt. Man kann die Reaktion auch zu irgendeinem Zeitpunkt nach der Vereinigung von Enzym und Substrat mit einer Unterbrechungslösung stoppen. Die Unterbrechungslösung hemmt die Enzymaktivität und friert dadurch die Farbentwicklung zum Zeitpunkt der Beimischung der Unterbrechungslösung ein. Eine geeignete Unterbrechungslösung ist zum Beispiel 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure in 0,2 M Natriumphosphat.
- Wenn, wie oben erwähnt, die Markierungssubstanz ein Fluoreszenzfarbstoff ist, wie z. B. Fluoreszein, dann kann das Antigen nachgewiesen werden, indem der Farbstoff einer Bestrahlung mit Anregungslicht ausgesetzt und die Fluoreszenz nachgewiesen wird. Bei Verwendung einer radioaktiven Markierung kann das Antigen durch die Bestimmung radioaktiver Zählimpulse nachgewiesen werden.
- Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Materialsatz zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Satz kann einen Latex aus amidin-modifizierten Polystyrolteilchen, einen an ein Enzym konjugierten Anti-Chlamydia-Antikörper, ein mit dem Enzym reaktionsfähiges Substrat und eine Membran mit einer ausreichenden Porengröße zum Entfernen der Teilchen beim Durchfließen des Latex durch die Membran enthalten. Der Satz kann außerdem ein Reagens zur Veränderung von Chlamydia-Organismen, Lösungen wie z. B. Pufferlösungen und physiologische Kochsalzlösung, eine oder mehrere Lösungen, die eine vorgegebene Menge Chlamydia-Antigen enthalten, und verschiedene Geräte wie z. B. Behälter und Tropfer einschließen, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Tests nützlich sind. Der Satz kann in einem Behälter, vorzugsweise aus Kunststoff, zusammengestellt werden, der ein Material enthält, das unter die Membran gelegt wird, wie z. B. Fließpapier, um den Durchfluß von Testflüssigkeiten durch die Membran zu erleichtern.
- Die folgenden Beispiele werden zur näheren Erläuterung der Erfindung angegeben, sollen die Erfindung aber in keiner Weise einschränken.
- In ein DispensTube (Becton Dickinson) wurden 40 ul eines Extraktionsmittels (5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,5% Rinderserumalbumin, 5 Vol.-% oberflächenaktives Polyoxyethylen-p-t- octylphenol in mit 0,5 % Gew./Vol. Chenodeoxycholat/Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,2) und 130 ul einer klinischen Chlamydia-Probe in der obigen Pufferlösung eingefüllt. Die Flüssigkeit mit einem Endvolumen von 200 ul wurde verwirbelt, 5 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen, und dann wurden 50 ul 1%-iger Amidinpolystyrollatex, 1,15 um, zugesetzt. Die Mischung wurde verwirbelt und 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
- Es wurde eine Lösung von 250 ul des monoklonalen Anti-Chlamydia/AP- Konjugats, verdünnt mit 40 Vol.-% fötalem Rinderserum und 0,5 % Gew./Vol. Caseinpuffer, der 10 mM TRIS und 154 mM NaCl enthielt, pH-Wert 7,6, zugesetzt, so daß man eine Konjugat-konzentration von 1,5 ug/ml erhielt. Nach dem Verwirbeln und einer 5-minütigen Inkubation wurde die Mischung auf eine casein-blockierte 0,65 um-Immunodyne -Membran pipettiert, die durch ein Stück #5-S-Kunstseide (Schleicher and Schnell) von 3 Schichten Fließpapier getrennt war.
- Den so auf der Membranoberfläche gefilterten Amidinlatexteilchen wurden 600 ul 5 mM Natriumdodecylsulfat (SDS), pH 7, zugesetzt, gefolgt von 300 ul destilliertem Wasser. Nach dem Durchlaufen des Waschwassers durch das Filter wurden 150 ul Substratlösung (1,5 mM Dinatriumindoxylphosphat, 0,5 mM Magnesiumchlorid und 0,01 % Gew./Vol. Nitroblau-Tetrazolium) zugesetzt. Die Farbentwicklung wurde 3 bis 5 Minuten lang abgewartet und dann mit einer Lösung gestoppt, die 0,2 M Natriumphosphat und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure enthielt.
- Das Vorhandensein von Chlamydia in der klinischen Probe wurde durch die dunkle Farbe auf der Membran angezeigt. Eine negative Kontrollprobe (keine Chlamydia) wurde durch die fehlende Farbe auf der Membran indiziert.
- Das Verfahren von Beispiel I wurde mit einer auf Gewebe kultivierten Chlamydia-Probe und mehreren Latices wiederholt, die keine Amidingruppen enthielten. Es wurden die folgenden Ergebnisse erzielt, wobei die densitometrischen Signale in willkürlichen Farbdichteeinheiten angegeben werden: Latex densitometrische Signale (Extinktion) carboxyliert (1,02 um, Polyscience, Warrington, Pennsylvania) sulfatisiert (1,05 um, Interfacial Dynamics, Portland, Oregon) Methylmethacrylat (0,3 - 0,4 um) carboxy-modifiziert (Seragen, Indianapolis, Indiana) Amidin (Latex von Beispiel I)
- Man erkennt, daß bei Verwendung des amidin-modifizierten Latex die Farbdichte bis zu zehnmal größer ist. Der erfindungsgemäße Test unter Verwendung des amidin-modifizierten Latex ist folglich von höherer Empfindlichkeit, und man kann erwarten, daß mit diesem Test Chlamydia- Organismen in Proben nachweisbar sind, die bei Tests ohne amidinmodifizierten Latex u. U. als negativ diagnostiziert werden.
- Das Verfahren schließt somit das Anhaften des Chlamydia-Antigens an amidin-modifizierte Latexteilchen ein. Die Verwendung des amidinmodifizierten Latex ergibt einen Test von gesteigerter Empfindlichkeit, da das Antigen in größerer Menge fest an dem amidin-modifizierten Latex haftet als bei anderen Latices, die nicht amidin-modifiziert sind.
Claims (10)
1. Verfahren zur Bestimmung von Chlamydia-Antigen, mit:
a) Anhaften des Chlamydia-Antigens an eine amidin-derivierte feste
Trägersubstanz in einer Flüssigkeit;
b) Inkontaktbringen des an der Trägersubstanz anhaftenden Antigens
mit einem Anti-Chlamydia-Antikörper mit konjugierter Markierung, wobei das
Antigen mit dem Antikörper eine Bindung eingeht und eine die Markierung
enthaltende gebundene Fraktion auf der Trägersubstanz bildet;
c) Trennen der Trägersubstanz von der Flüssigkeit; und
d) Nachweis des Antigens durch ein mit der Markierung verbundenes
Signal.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung aus der Gruppe
ausgewählt wird, die aus einem radioaktiven Atom, einem
Fluoreszenzfarbstoff und einem Enzym besteht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung von Chlamydia-Antigen, mit:
a) Inkontaktbringen von Teilchen eines amidin-modifizierten Latex
mit einer Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie Chlamydia-Antigen
enthält, wodurch das Antigen an den Teilchen anhaftet;
b) Inkontaktbringen der Teilchen mit dem anhaftenden Antigen mit
einem Anti-Chlamydia-Antikörper, der an ein Enzym konjugiert ist, wodurch
das an den Teilchen anhaftende Antigen eine Bindung mit dem Antikörper
eingeht und auf den Teilchen eine gebundene Fraktion bildet, welche das
Enzym enthält;
c) Trennen der Teilchen mit der anhaftenden gebundenen Fraktion
von der Flüssigkeit;
d) Inkontaktbringen des Enzyms auf den abgetrennten Teilchen mit
einem Substrat, das mit dem Enzym reaktionsfähig ist, wodurch das Enzym das
Substrat in ein Produkt umwandelt; und
e) Nachweis des Chlamydia-Antigens in der Probe durch das
Auftreten einer mit dem Produkt verbundenen Farbe.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Enzym aus der Gruppe ausgewählt
wird, die aus einer Peroxidase und einer Hydrolase besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Abtrennen mittels Filtern durch
eine Membran ausgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Membran mit einem inerten
Protein vorbehandelt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Enzym auf den abgetrennten
Teilchen zusätzlich mit Tetrazolsalz in Kontakt gebracht wird.
8. Materialsatz zur Ausführung eines Chlamydia-Tests mit einem Latex aus
amidin-modifizierten Polystyrolteilchen, einem an ein Enzym konjugierten
Anti-Clamydia-Antikörper, einem mit dem Enzym reaktionsfähigen Substrat und
einer Membran zum Filtern der Teilchen.
9. Materialsatz nach Anspruch 8, der ferner ein Reagens zu Veränderung
von Chlamydia-Organismen aufweist.
10. Materialsatz nach Anspruch 8, der ferner ein Gehäuse zum
Zusammenbringen der Komponenten des Satzes aufweist, wobei das Gehäuse ein
unter der Membran angeordnetes Absorptionsmittel enthält.
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