DE69627668T2

DE69627668T2 - Verfahren und vorrichtung für den chlamydiennachweis

Info

Publication number: DE69627668T2
Application number: DE69627668T
Authority: DE
Inventors: D. Allan PRONOVOST; E. Robert KLEPPER; Catherine Pawlak
Original assignee: Quidel Corp
Current assignee: Quidel Corp
Priority date: 1995-08-07
Filing date: 1996-07-18
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2016-07-19
Also published as: EP0843815B1; EP0843815A1; ES2198494T3; US5773234A; WO1997006436A1; EP0843815A4; DE69627668D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren und Vorrichtungen zur Detektion des Vorhandenseins von Chlamydia-Antigen in Patientenproben. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein laterales Fließassaysystem zur Detektion von Chlamydia-Antigen in flüssigen Extrakten von Patientenabstrichproben.
Chlamydia schließt zwei Spezies intrazellulärer Parasiten ein, die den Menschen, andere Säugetiere und Vögel infizieren. Chlamydia trachomatis ist die am häufigsten im Menschen gefundene Spezies und infiziert die urogentialen Organe, Augen und den Atmungstrakt. Die urogenitale Chlamydia-Infektion ist zu einer der häufigsten sexuell übertragenen Krankheiten geworden und ist ein besonderes Problem, wenn sie von Müttern auf die neugeborenen Kinder übertragen wird. Mit Chlamydia infizierte Kinder leiden häufig unter einer Augeninfektion, die zur Blindheit führen kann. Eine Chlamydia-Infektion bei Frauen, die unbehandelt bleibt, kann Sterilität verursachen.
Die Symptome einer Chlamydia-Infektion sind häufig unbestimmt und werden von Ärzten leicht übersehen. Folglich bestand ein beträchtliches Interesse in der Entwicklung von Assays zur Detektion einer Chlamydia-Infektion, wobei die Assays nützlich wären, um sowohl eine vermutete Krankheit zu bestätigen als auch ein Routine-Screening in speziellen Patientengruppen wie schwangeren Frauen bereitzustellen.
Assays zur Detektion einer Chlamydia-Infektion bedeuten eine Vielzahl von Anforderungen an den Entwickler. Insbesondere ist Chlamydia in Proben infizierter Individuen (z. B. endozervikalen Gewebeproben infizierter Frauen) in sehr geringen Mengen vorhanden, was eine sehr hohe Sensitivität erfordert. Alle Tests für eine Vielzahl von Mikroorganismen wie Streptococcus und Candida erfordern eine Sensitivität von nur ungefähr 5 × 10⁵ Organismen/ml. Eine Chlamydia-Detektion hingegen erfordert eine Sensitivität von 10 bis 10² Organismen/ml. Während solche Sensitivitäten mit erhältlichen Technologien wie ELISA erreicht werden können, erfordern solche Tests im Allgemeinen mehrere Schritte und sind schwierig durchzuführen.
Ein zweites Problem bei der Durchführung von Chlamydia-Assays bezieht sich auf die Art der Patientenprobe. Die Detektion von Chlamydia im urogenitalen Trakt von Frauen erfordert eine Probe, typischerweise unter Verwendung eines endozervikalen Abstriches. Solche endozervikalen Abstrichproben enthalten Schleimhaut, DNA, Protein, Zelltrümmer, andere Bakterien und polymorphe kernhaltige Leukozyten (PMNL). Die Assays müssen also eine Extraktion und Solubilisierung bereitstellen, um das Chlamydia-Targetantigen von infizierten Zellen und kontaminierenden Materialien zu separieren. Die Extraktionsbedingungen dürfen jedoch nicht allzu harsch sein, da das Antigen in einer immunologisch erkennbaren Form bleiben muss, um eine Detektion in dem Immunoassay zu erlauben. Insbesondere muss durch die Extraktionsbedingungen eine Adhäsion oder Aggregation des Targetantigens an andere solubilisierte Materialien in den gebildeten komplexen Mischungen verhindert werden. Bis jetzt sind in Chlamydia-Tests verwendete Extraktionsverfahren auf komplexe Vorgehensweisen und Formulierungen, die Kombinationen aus Wärme, oberflächenaktiven Mitteln, pH-Wert-Veränderungen, die Verwendung von co-oberflächenaktiven Mitteln, Kationen, Reduktionsmitteln, Chelatisierungsmitteln, Alkylierungsmitteln und enzymatischem Verdau verwenden, angewiesen. Zusätzlich dazu, dass sie kompliziert sind, waren die Vorgehensweisen häufig nur minimal wirksam und erfordern häufig Reagenzien, die nicht leicht aufbewahrt werden können und in Immunoassay-Kits anwendbar sind. Ein spezielles Extraktionsverfahren, in welchem starkes Alkali gefolgt von einer Säureneutralisierung verwendet werden, ist in WO 89/08262 beschrieben. Ein solches Extraktionsverfahren führte jedoch zu Assays mit nur einer mittelmäßigen Sensitivität.
Es wurden Chlamydia-Tests basierend auf einem Membranassayformat kommerziell entwickelt. Ein solches System ist der SureCell^TM-Assay, der von Eastman Kodak, Rochester, New York erhältlich ist. In diesem Assay wird ein positiv geladener Träger verwendet, um negativ geladenes Chlamydia-Antigen einzufangen. Wenn es auf der Membran eingefangen ist, wird das Chlamydia-Antigen mit einem markierten Antikörper, der für das Lipopolysaccharid von Chlamydia spezifisch ist, detektiert. Diese Assays weisen eine mittelmäßige Sensitivität auf und neigen dazu, mit der Probe zu interferieren.
Aus diesen Gründen wäre es wünschenswert, Assays und Vorrichtungen zur Detektion von Chlamydia in Patientenproben bereitzustellen. Diese Assays sollten sensitiv und spezifisch für Chlamydia sein (d. h. keine Kreuzreaktivität mit anderen Organismen als Chlamydia zeigen) und sollten so wenig Schritte wie möglich für ihre Durchführung benötigen. Die Assays sollten ferner schnelle Ergebnisse bereitstellen und zur Verwendung mit einer Vielzahl von Proben, in welchen Chlamydia vermutet wird, insbesondere Abstrichproben zur Detektion von Chlamydia im urogenitalen Trakt, geeignet sein. Die Assays sollten außerdem geeignet sein zur Verwendung in einer Vielzahl von verschiedenen Umgebungen, einschließlich in klinischen und anderen Laboratorien zum Zeitpunkt der Behandlung und durch die Patienten selbst (Selbsttesten).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Assays, Vorrichtungen und Kits zur Detektion von Chlamydia in Patientenproben, insbesondere in endozervikalen Abstrichproben bereit. Die Assays beruhen auf dem Aufbringen eines Untersuchungsmaterials, das solubilisiertes Chlamydia-Antigen enthält, das von der Probe erhalten wurde, auf eine Matrix, die einen Fließweg definiert, der mindestens eine Markierungszone und eine Einfangzone einschließt. Die Markierungszone enthält nicht gebundenen Markierungskomplex, umfassend einen sichtbaren Marker, der an eine für Chlamydia-Lipopolysaccharid, insbesondere für ein Epitop auf der KDO-Einheit des Chlamydia-Lipopolysaccharid-Antigens, spezifische Einfangbindesubstanz gebunden ist. Die Einfangzone enthält eine immobilisierte Markierungsbindesubstanz, die auch für Chlamydia-Lipopolysaccharid, wie ein Epitop auf der KDO-Einheit des Chlamydia- Lipopolysaccharid-Antigens, spezifisch ist. Die solubilisierte Probe wird somit durch die Markierungszone fließen, wo das Chlamydia-Antigen, wenn es vorhanden ist, an den Markierungskomplex binden wird. Das Markierungskomplex-gebundene Antigen wird weiter in die Einfangzone fließen, wo es durch die immobilisierte Markierungsbindesubstanz eingefangen werden wird und akkumulieren wird, bis sich ausreichend Marker angesammelt hat, um für den Benutzer sichtbar zu sein. Das Auftreten von sichtbarem Marker innerhalb der Markierungszone ist also ein Anzeichen für anfänglich in der Probe vorhandene Chlamydia.
In einem bevorzugten Aspekt des Assays der vorliegenden Erfindung wird das solubilisierte Antigen erhalten, indem eine endozervikale Abstrichprobe vorbehandelt wird, um das Chlamydia-Antigen zu extrahieren und das Extrakt vor dem Aufbringen der Probe auf die Matrix zu neutralisieren. Es wurde gefunden, dass eine anfängliche Extraktion des Antigens durch Inkubation der Abstrichprobe mit einer starken Base, wie Natriumhydroxid (NaOH) das Lipopolysaccharid-Antigen von dem Komplex freisetzt. Anschließende Neutralisation mit einem zwitterionischen Detergenz und einem Blockierungsprotein wie einem Albumin, insbesondere Rinderserumalbumin (BSA), fördert ferner die Solubilisierung des Antigens und inhibiert eine Aggregation des Antigens und eine Wechselwirkung ausgehend von anderen in der solubilisierten Mischung enthaltenen Substanzen.
Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen eine Matrix, die einen Fließweg definiert, der mindestens eine Markierungszone und eine Einfangzone einschließt. Markierungskomplex ist innerhalb der Markierungszone vorhanden und umfasst einen sichtbaren Marker, der an eine Bindesubstanz, die für Chlamydia-Lipopolysaccharid, insbesondere ein Epitop auf der 2-Keto-3-deoxyoctulsonat-Einheit des Chlamydia-Lipopolysaccharid-Antigens, spezifisch ist, gebunden ist. Eine Bindesubstanz, die für Chlamydia-Lipopolysaccharid, insbesondere ein Epitop auf der KDO-Einheit auf Chlamydia-Lipopolysaccharid-Antigen, spezifisch ist, ist auch innerhalb der Einfangzone immobilisiert, so dass sie unter den Bedingungen des Assays fixiert bleibt, so dass sie den Antigen-gebundenen Markierungskomplex einfangen und immobilisieren kann. Der anfänglich in der Markierungszone vorhandene Markierungskomplex ist natürlich nicht immobilisiert und wird anstelle dessen auf eine solche Weise eingeführt werden, dass er durch den Durchlauf der solubilisierten Probe vollständig mobilisiert ist und somit frei ist, um mit Markierungskomplex zu reagieren und sich mit dem Markierungskomplex zur Einfangzone fortbewegen zu können.
Kits gemäß der vorliegenden Erfindung schließen die Assayvorrichtung, im Allgemeinen wie oben beschrieben, in Kombination mit einem Abstrichbehälter, einem ersten Reagenzgefäß, das eine basische Lösung für eine anfängliche Inkubation des Abstriches in dem Behälter enthält, und einem zweiten Reagenzgefäß, das eine Lösung aus einem zwitterionischen Detergenz und einem Blockierungsprotein zur Neutralisation einer Probe enthält, die unter Verwendung der basischen Lösung extrahiert worden war. Die Vorrichtung, der Abstrichbehälter und beide Reagenzgefäße sind ferner in einer Verpackung vorhanden, wie eine Kiste, einer Tüte, einer Wärmeschrumpffolienanzeigekarte (heat shrink display card) oder dgl., um den Kit zu vervollständigen. Ggf. kann der Kit ferner schriftliche Instruktionen umfassen, um die zur Durchführung des Assays der vorliegenden Endung notwendigen Schritte anzugeben.
Es wurde gefunden, dass die Assays, Vorrichtungen und Kits der vorliegenden Erfindung Assays mit sehr hohen Sensitivitäten und Spezifitäten bereitstellen. Insbesondere werden die Daten im experimentellen Teil der vorliegenden Erfindung zeigen, dass die Assays der vorliegenden Erfindung eine Sensitivität von 90% für symptomatische Patienten und 94% für asymptomatische Patienten aufweisen. Die Spezifität, d. h. die Fähigkeit zur Unterscheidung von anderen Mikroorganismen, liegt oberhalb 99%. Die Fähigkeit, solche hohen Sensitivitäten und Spezifitäten unter Verwendung eines lateralen Fließassay-Detektionsprotokolls zu erreichen, konnte vor der in der vorliegenden Anmeldung berichteten Arbeit nicht vorausgesagt werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht eine Assaymatrix, die eine Probenaufnahmezone, eine Markierungszone, eine Einfangzone und ein Absorber-Pad einschließt, die zur Detektion von Chlamydia-Antigen gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung gestaltet ist.
2 veranschaulicht eine Aufbautechnik zum Einbau der Assaymatrix von 1 in eine Vorrichtung mit einem geeigneten Gehäuse oder einer geeigneten Bedeckung.
3 ist eine detaillierte Ansicht der Vorrichtung von 2, vor der Durchführung eines Assays, d. h. ohne sichtbaren Marker in der Einfangzone davon.
4 ist eine Ansicht ähnlich der 2, gezeigt mit einem in der Kontrollregion der Einfangzone vorhandenen Marker.
5 ist eine Ansicht ähnlich den 3 und 4, gezeigt mit Marker, der sowohl in den Kontroll- als auch Assayregionen der Einfangzone vorhanden ist.
6a–6d veranschaulichen die Konstruktion der Testvorrichtung, die im experimentellen Teil verwendet wird.
In den 7a und 7b sind die Organismus-Sensitivitäten einer Vorrichtung des Standes der Technik mit denen der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verglichen.
BESCHREIBUNG VON SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Assays, Vorrichtungen und Kits zur Detektion des Vorhandenseins von Chlamydia in Patientenproben bereitgestellt. Die Detektion ist immunologisch und beruht auf Antikörpern, die für Chlamydia-Lipopolysaccharid (LPS), insbesondere für ein Epitop auf der KDO-Einheit des Chlamydia-Lipopolysaccharid-Antigens, spezifisch sind. Da dieses Antigen sowohl Chlamydia-spezifisch ist (ohne Kreuzreaktivität mit anderen Bakterien) als auch unter allen Spezies von Chlamydia konserviert ist, sind die Tests der vorliegenden Erfindung zur Detektion von sowohl Chlamydia trachomatis als auch Chlamydia psitaccai nützlich, welche beide potentiell in Menschen gefunden werden. Die Assays und Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere zur Detektion von Chlamydia trachomatis gedacht, die in vaginalen Sekretionen von infizierten weiblichen Patienten vorhanden sein kann. In solchen Fällen werden die Proben unter Verwendung konventioneller Techniken, bei denen Abstriche verwendet werden, um zelluläre Proben von der Cervix der Patienten zu erhalten, erhalten werden. Solche endozervikalen Abstrichproben werden vorzugsweise gemäß dem bevorzugten Extraktionsprotokoll, das unten beschrieben ist, behandelt werden. Die Assays der vorliegenden Erfindung sind jedoch auch nützlich zur Detektion von Chlamydia in anderen Proben, in welchen diese vorhanden sein kann, einschließlich Sputum, nasaler Sekretionen, pharyngialer Exudate und dgl., wo eine respiratorische Infektion detektiert werden kann.
Das bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Extraktion von Chlamydia-Antigen von endozervikalen Abstrichproben umfasst einen Extraktionsschritt gefolgt von einem Neutralisationsschritt. Der Abstrich wird anfänglich bei Raumtemperatur für eine ausreichende Dauer, um das Antigen freizusetzen, typischerweise von 0,1 min bis 10 min, in einer starken Base extrahiert, typischerweise 0,05 N bis 0,3 N Natriumhydroxid (NaOH). Die Extraktion wird vorzugsweise in Gegenwart von 0,05 bis 0,3 M NaCl durchgeführt. Nach der Extraktion wird das Extrakt neutralisiert, indem ein zwitterionisches Detergenz wie 3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) und ein Blockierungsprotein, wie ein Albumin, insbesondere Rinderserumalbumin (BSA), welches in einem zwitterionischen Puffer vorliegt, zu dem Extrakt zugegeben werden. Es wurde gefunden, dass die Kombination eines zwitterionischen Detergenz und eines Blockierungsproteins in dem zwitterionischen Puffer eine adäquate Solubilisierung des Antigens bereitstellt und beibehält, so dass es in den im Folgenden beschriebenen lateralen Fließprotokollen leicht detektiert werden kann.
Indem das zwitterionische Detergenz und das Blockierungsprotein im Extraktionsschritt enthalten sind, wurden Sensitivitäten beobachtet, die 10 bis 50 × größer sind als die, die durch das herkömmliche Alkaliextraktionsverfahren aus WO 89/08262 erreicht werden. Darüber hinaus stellt die Bereitstellung eines zwitterionischen Puffers im Neutralisationsmedium eine 5- bis 10-fache Erhöhung der Sensitivität gegenüber kationischen Puffern bereit. Geeignete zwitterionische Puffer schließen Tricin; (N-[2-hydroxy-1,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]glycin; TAPSO (3-[N-tris(hydroxymethyl)methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure; und BES (2-[Bis(2-hydroxyethyl)amino]ethansulfonsäure) ein. Vorzugsweise wird der zwitterionische Puffer als ein Verdünnungspuffer in die Probe und Markerzonen der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung und als ein Blockierungslösungspuffer in die Einfangzone inkorporiert.
Das Vorhandensein von NaCl im Extraktionspuffer ist vorteilhaft, da es hilft, falsch positive Ergebnisse, die mit milden Extraktionsbedingungen verbunden sind, zu verhindern. Während falsch positive Ergebnisse bei aggressiven Extraktionsbedingungen, z. B. 80°C bis 100°C für mehrere Minuten, kein Problem sind, sind solche Bedingungen unhandlich und unsicher.
Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind geeignet zur Bereitstellung einer "Einschritt"- oder "lateralen Fließ"-Detektion von Chlamydia-Antigen in dem solubilisierten Extrakt. Insbesondere wird es, nachdem das Antigen extrahiert worden ist, notwendig sein, nur ein vorbestimmtes Volumen des Extrakts auf die Assayvorrichtung aufzubringen, für eine vorbestimmte Zeitdauer zu warten und danach die Assayergebnisse ohne Durchführung irgendwelcher zusätzlicher Schritte abzulesen. Solche lateralen Fließassayvorrichtungen und -verfahren sind in der Patent- und technischen Literatur gut beschrieben. Siehe z. B. die US-Patente Nr. 5,415,994; 4,943,522; 4,861,711; 4,857,453; 4,855,240; 4,775,636; 4,730,017; 4,361,537; 4,235,601; 4,168,146; 4,094,647; europäische Patentanmeldungen Nr. 451 800; 158 746; 276 152; 306 772; britische Patentanmeldung Nr. 2,204,398; und PCT-Veröffentlichung WO 94/15215, wobei jede davon durch Bezugnahme darauf enthalten ist.
Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung umfassen im Allgemeinen eine Matrix, die aus einem Material zusammengesetzt ist, welches einen kapillarischen Fluss der extrahierten Probelösung entlang des Fließweges erlaubt. Die Matrix definiert mindestens eine Markierungszone, die ein Mittel zur spezifischen Markierung von Chlamydia-Antigen, das in der Probe vorhanden ist, aufweist, und eine Einfangzone, die Mittel zum Einfangen des markierten Antigens aufweist. Gewöhnlich wird die Matrix ferner eine Probenaufnahmezone stromaufwärts der Markierungszone und eine Absorptivmatrix stromabwärts der Einfangzone definieren. Mit "stromaufwärts von der Markierungszone" ist gemeint, dass die Probe, die auf die Probenaufnahmezone aufgebracht ist, in die Markierungszone fließen wird. Entsprechend ist mit "stromabwärts von der Einfangzone" gemeint, dass die Probe in den Absorptivweg fließen wird, um den gewünschten kapillarischen Fluss entlang des Fließweges beizubehalten.
Die Matrix der Assayvorrichtung wird typischerweise zu einem nicht-absorptiven (non-bibulous) lateralen Fluss in der Lage sein. Mit "nicht-absorptivem lateralem Fluss" ist ein Flüssigkeitsfluss gemeint, in welchem die gesamten gelösten oder dispergierten Komponenten der Flüssigkeit mit im Wesentlichen gleichen Raten und mit einem relativ ungestörten Fluss lateral durch die Membran getragen werden, im Gegensatz zu einem bevorzugten Rückhalten einer oder mehrerer Komponenten wie es z. B. bei Materialien auftreten würde, die eine oder mehrere Komponenten absorbieren oder aufsaugen können.
Ein typisches, nicht absorbierendes Matrixmaterial ist ein Polyethylen-Schichtmaterial mit hoher Dichte wie des Typs wie es von Porex Technologies Corp. of Fairburn, Georgia, USA hergestellt wird. Diese Membran weist eine offenporige Struktur mit einer typischen Dichte, bei einem 40% Hohlraumvolumen, von 0,57 g/cm³ und einem mittleren Porendurchmesser von 1 bis 250 μm, gewöhnlich von 3 bis 100 μm, auf. Der optimale Porendurchmesser für die Membran zur Verwendung in der Erfindung ist ungefähr 90 bis ungefähr 140 μm. Die Membranen haben eine Dicke von wenigen mil (0,001 Zoll) bis mehreren mil, typischerweise im Bereich von 5 bis 10 mil, und bis zu 200 mil. Die Membran hat im Allgemeinen eine Rückseite aus einer im Allgemeinen wasserundurchlässigen Schicht, kann aber vollständig freistehend sein. Weitere nicht absorbierende Membranen wie Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat, Copolymere von Vinylacetat und Vinylchlorid, Polyamid, Polycarbonat, Nylon, Glasfaser, Orlon, Polyester, Polystyrol und dgl. oder Mischungen können auch verwendet werden.
Absorbierende Materialien wie unbehandeltes Papier, Nitrocellulose, derivatisiertes Nylon, Cellulose und dgl. können auch verwendet werden, wobei darauf ein Bearbeiten folgt, um einen nicht-absorptiven Fluss bereitzustellen. Blockierungsmittel können die durch die absorbierende Natur von absorbierenden Membranen verursachten Kräfte blockieren. Geeignete Blockierungsmittel schließen ganzes oder derivatisiertes Rinderserumalbum oder Albumin von anderen Tieren, ganzes Tierserum, Kasein und Trockenmilch ohne Fett ein.
Die Matrix umfasst mindestens zwei Zonen, eine Probenaufnahmezone und eine Einfangzone. Die Größe und Form der Matrix sind nicht kritisch und können variieren. Die Matrix definiert einen lateralen Fließweg. Im Allgemeinen ist die Matrix rechteckig und der Fließweg ist axial.
Eine solubilisierte Patientenprobe, typischerweise eine extrahierte endozervikale Abstrichprobe wie oben beschrieben, wird bei der Probenaufnahmezone auf die Matrix aufgebracht. Die Probenaufnahmezone kann ein Neutralisationsmittel enthalten, das die Extraktionslösung vor dem Assay neutralisieren wird. Gewöhnlich wird jedoch die Neutralisation im Neutralisationsschritt der oben beschriebenen Extraktionsvorgehensweise erreicht worden sein.
Im Allgemeinen liegt die Markierungszone auf dem Matrixfließweg zwischen der Probenaufnahmezone und der Einfangzone. Die Markierungszone enthält ein Mittel zur spezifischen Markierung des Targetanalyten. Das Markierungsmittel wird im Allgemeinen ein markiertes Immunoglobulin, wie ein Antikörper, sein, spezifisch für den Targetanalyten, d. h. ein Epitop auf der KDO-Einheit des Chlamydia-LPS-Antigens. Die Immunoglobuline können Antikörper jeden Isotyps sein, wie IgE, IgG oder IgM, Fab-Fragmente, F(ab')₂-Fragmente, Fab'-Fragmente oder dgl. Alternativ können die Markierungsmittel eine markierte Nicht-Immunoglobulinverbindung sein, die den Targetanalyten spezifisch bindet. Z. B. kann das Markierungsmittel, wenn der Targetanalyt ein Rezeptormolekül ist, ein markierter Ligand für dieses Rezeptormolekül sein. Im Folgenden wird der Ausdruck "Bindesubstanz" so verwendet werden, dass er sich auf Immunoglobuline sowie andere Substanzen, die Targetanalyten spezifisch binden, bezieht.
Für Chlamydia-LPS, insbesondere für die KDO-Einheit von Chlamydia (LPS), spezifische Antikörper, können durch konventionelle Antikörper-Entwicklungstechniken erhalten werden. Siehe z. B. Harlow und Lane, Herausgeber, Antibodies; A Laboratory Manual, and Laboratories, Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring, New York. Geeignete Immunogene zur Herstellung der Antikörper schließen die Elementarkörperchen einer großen Vielzahl von Chlamydia trachomatis und Chlamydia psitaccai-Serovare ein. Geeignete Antikörper werden eine Bindungsaffinität für die KDO-Einheit von mindestens ungefähr 10⁷ M^–1, vorzugsweise mindestens 10⁵ M^–1 aufweisen. Geeignete monoklonale Antikörper, die zur Durchführung der Assays der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind von Oy Medix Biochemica AB, Kauniainen, Finnland, kommerziell erhältlich. Insbesondere können Antikörper, die als Markierungsantikörper in den Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, von dem 6701 genannten Klon erhalten werden, während der Einfangantikörper von dem als 6703 bezeichneten Klon erhalten werden kann.
Die Marker können löslich oder teilchenförmig sein und können gefärbte Immunoglobulin-Bindesubstanzen, einfache Farbstoffe oder Farbstoffpolymere, gefärbte Latexbeads, Farbstoff-enthaltende Liposomen (wie in US-Patent Nr. 4,695,554 beschrieben, hierin durch Bezugnahme darauf enthalten), gefärbte Zellen oder Organismen oder metallische, organische, anorganische oder Farbstoffsols einschließen. Die Marker können mittels einer Vielzahl von Mitteln, die im Fachgebiet wohlbekannt sind, wie es in den US-Patenten Nr. 4,863,875 und 4,373,932, die jeweils hierin durch Bezugnahme darauf enthalten sind, beschrieben ist, an die Analyt-spezifischen Immunoglobuline gebunden werden.
Wenn die behandelte Probe durch die Markierungszone fließt, bindet der Targetanalyt in der Probe den markierten Antikörper, wobei der Targetanalyt indirekt markiert wird. Die Probe läuft weiter in die Einfangzone auf der Matrix. Eine Verbindung, die den markierten Targetanalyten spezifisch binden kann, wird in der Einfangzone immobilisiert. Im Allgemeinen werden Targetanalyt-spezifische Immunoglobuline in der Einfangzone immobilisiert. Wenn die Probe in die Einfangzone fließt, werden markierte Targetanalyten die immobilisierten Immunoglobuline binden, wobei in der Einfangzone Marker verbleibt. Das Vorhandensein von Analyt in der Probe kann dann durch visuelle Identifikation von zurückbleibendem Marker in der Einfangzone bestimmt werden.
Die Einfangzone von Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung kann eine Verfahrenskontrollregion oder -linie einschließen. Die Verfahrenskontrolllinie ist im Allgemeinen stromabwärts von der in der Einfangzone immobilisierten Analyt-spezifischen bindenden Verbindung vorhanden. Ein Zurückhalten von Marker durch die Verfahrenskontrolllinie zeigt an, dass die Probe durch die Einfangzone geflossen ist und die immobilisierte Target-spezifische Bindesubstanz kontaktiert hat. Spezifische Verfahren zum Einbau einer Kontrollregion sind in dem experimentellen Teil detailliert beschrieben.
Die Akkumulation sichtbaren Markers kann entweder visuell oder durch optische Detektionsvorrichtungen wie Reflexionsanalysierer, Videobildanalysierer und dgl. bestimmt werden. Die Akkumulation von sichtbarem Marker kann entweder bestimmt werden, um das Vorhandensein oder das Nichtvorhandensein von Marker in der Einfangzone oder die sichtbare Intensität von akkumuliertem Marker zu bestimmen, welche dann mit der Konzentration oder dem Titer (Verdünnung) des Analyten in der Patientenprobe korreliert werden kann. Die Korrelation zwischen der sichtbaren Intensität von akkumuliertem Marker und der Analytkonzentration kann durchgeführt werden, indem die sichtbare Intensität mit einem Referenzstandard verglichen wird. Optische Detektionsvorrichtungen können programmiert werden, um diesen Vergleich automatisch mit Mitteln durchzuführen, die denen ähnlich sind, welche im Quidel Reflective Analyzer, Catalog Nr. QU0801 (Quidel Corp., San Diego, CA) verwendet werden. Ein visueller Vergleich ist auch durch eine visuelle Evaluierung der Intensität und eines Farbschlüssels möglich, wie es im Quidel Total IgE Test Catalog Nr. 0701 (ein Mehrschritt-ELISA-Assay) verwendet wird. Somit können durch Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung Targetanalytmengen bestimmt werden.
Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung können ferner einen Indikator für das Ende des Assays einschließen, um dem Durchführenden die Testablesezeit anzuzeigen. Der Indikator für das Ende des Assays ist im Allgemeinen auf der Matrix stromabwärts von der Einfangzone vorhanden.
In den Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung ist im Allgemeinen eine absorptive Absorptivzone eingeschlossen. Die Absorptivzone ist stromabwärts von der Einfangzone angeordnet. Die Absorptivzone ist ein Mittel zur Entfernung überschüssiger Probe und ungebundenen Markers von der Matrix der Vorrichtung. Im Allgemeinen wird die Absorptivzone aus einem Absorbermaterial wie einem Filterpapier, einem Glasfaserfilter oder dgl. bestehen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Kits zur Vorbehandlung endozervikaler Abstrichproben und zur Detektion von Chlamydia-Antigen in solchen Proben unter Verwendung der Vorrichtungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung bereit. Die Kits umfassen im Allgemeinen die Vorrichtung wie sie oben beschrieben ist, ein erstes Gefäß, das die Extraktionslösung einschließt, ein zweites Reagenzgefäß, das die Neutralisationslösung einschließt und einen Abstrichbehälter, um den Abstrich in den ersten und zweiten Reagenzien zu waschen. Die Vorrichtung, Reagenzgefäße und Abstrichbehälter werden im Allgemeinen zusammen enthalten sein und auf die Weise verpackt sein, wie es für Immunoassay-Kits üblich ist, z. B. Kästen, Tüten, Zylinder, Schrumpffolienkarten und dgl. Ggf. kann der Kit ferner schriftliche Instruktionen einschließen, welche die Verfahrensschritte der vorliegenden Erfindung angeben.
Bezugnehmend auf die 1 und 2 wird jetzt eine Vorrichtung 10, die geeignet ist, um die Assayverfahren der vorliegenden Erfindung durchzuführen, beschrieben werden. Die Vorrichtung 10 schließt eine Assaymatrix 12 ein, die ein Probeaufnahmepad 14, ein Markierungspad 16 und ein Einfangpad 18 einschließt. Es wird auch ein Absorbenspad 20 bereitgestellt, um die gesamte flüssige Probe, die auf die Probenaufnahmezone 14 aufgebracht wird, zu absorbieren, so dass die Probe vollständig durch die Matrix fließen wird. Ein Markierungskomplex, der den an einen sichtbaren Marker gebundenen Anti-Chlamydia-Antikörper umfasst, wird innerhalb des Markierungspads 16 vorhanden sein (aber ungebunden), während immobilisierter Antikörper zum Einfangen von Chlamydia-Antigen innerhalb einer Einfangregion 22 innerhalb des Einfangpads 18 gebunden sein wird. Gewöhnlich wird auch eine Kontrollregion 24 bereitgestellt, wie es allgemein oben diskutiert ist. Die Assaymatrix 12 wird eine Rückseite 30 einschließen, und die Vorrichtung 10 wird durch eine Bedeckung 32 oberhalb der Matrix 12 und der Rückseite 30, vervollständigt sein, wie es am besten in 2 dargestellt ist. Die Bedeckung 32 schließt einen Probenaufbringbereich 34 an einem Einfangpad-Betrachtungsbereich 36 ein.
Die Ergebnisse des Assays werden durch die Einfangzonenöffnung 36 abgelesen, wie es am besten in den 3–5 dargestellt ist. Zunächst, vor dem Aufbringen der Probe, wird das Einfangpad 18 durch die Öffnung 36 sauber erscheinen, d. h. ohne eingefangenen Marker, wie es in 3 dargestellt ist. Nach dem Aufbringen einer Negativprobe, d. h. einer Probe, die kein Chlamydia-Antigen enthält, wird das Einfangpad 18 aussehen, wie es in 4 dargestellt ist, d. h., dass Marker entlang der Kontrollregion 24, aber kein Marker innerhalb der Testregion 22 zu sehen ist. Wenn die Probe hingegen positiv ist, wird das Einfangpad 18 so erscheinen, wie es in 5 dargestellt ist, d. h. sowohl in der Kontrollregion 24 als auch in der Testregion 22 wird Marker akkumuliert sein.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Begrenzung vorgelegt.
EXPERIMENTELLER TEIL
Beispiel 1
Herstellung einer lateralen Fließassayvorrichtung zur Detektion von Chlamydia
Es wurden nicht-absoptive laterale Fließassay-Teststreifen hergestellt, um drei aktive Zonen und eine vierte Absorptivzone einzuschließen, die als ein Docht oder als eine Senke (sink) agiert, um einen Probenfluss von den aktiven Zonen zu erhalten. Die aktiven Zonen umfassen eine Probenaufnahmezone, eine Markierungszone und eine Einfangzone, wie es im Allgemeinen oben und im Detail unten beschrieben ist.
Herstellung der Probenaufnahmezone
Die Probenaufnahmezone wurde aus Sontara® 0-100 DuPont Orlon® gesponnenem (spunlace) Gewebe hergestellt. Das Gewebe wurde nicht-absorptiv gemacht, indem es mit methyliertem Rinderserumalbumin (methyliertes BSA) gesättigt wurde. Die Umwandlung zu nicht-absorbierendem Material wurde durch Behandlung bei 39 μl/cm² mit einer 10 mg/ml Lösung des methylierten BSA in 100 mM Tricinpuffer, pH 8,0 bei Raumtemperatur für 5–30 min erreicht. Das Sontara®-Pad wurde dann bei –70°C zusammen mit einem Lyophilisierungskolben für mindestens 1 h gefroren. Die Sontara®-Membran wurde dann über Nacht auf einem Virtis Freezemobile lyophilisiert. Die behandelte Probenaufnahmezone wurde in 10 × 9 mm Rechtecke geschnitten, wobei die gesponnenen Fasern parallel zu der längeren Seite des Pads waren.
Antikörper
Einfangantikörper war gegen Chlamydia gerichteter monoklonaler Antikörper der Maus, mit 6703 bezeichneter Klon, erhalten von Oy Medix Biochemica, Finnland. Splenozyten einer immunen Maus (immunisiert mit Elementarkörperchen von C. trachomatis Serovar LGV2) wurden mit Myeloma-Zelllinie vereinigt und in vitro in einer Hohlfaserzellkultur kultiviert. Das Immunoglobulin wurde vom Kulturüberstand durch FPLC-Protein-A-Affinitätsaufreinigung unter Verwendung von Citratpuffer-, pH 4,5, Elution isoliert. Das Elutionsmittel wurde auf 0,9% NaCl mit 0,1% NaN₃ als Konservierungsmittel dialysiert und in dieser Form in einer Konzentration von 1 mg/ml bereitgestellt. Der Klon 6703 ist gattungsspezifisch, Anti-Chlamydia-LPS-Antikörper und gehört zur IgG_2a-Klasse. Seine chemische Identität wurde durch isoelektrische Fokussierung mit internen Kalibratoren und einem vorangehenden Referenzposten bestimmt. Die Immunreaktivität wurde durch eine Antigen-beschichtete ELISA-Titration gegen den vorangehenden Referenzposten bestimmt.
Markerantikörper war ein gegen Chlamydia gerichteter monoklonaler Antikörper der Maus, als 6701 bezeichneter Klon, erhalten von Oy Medix Biochemica, Finnland. Splenozyten einer immunen Maus (immunisiert mit Elementarkörperchen von C. trachomatis Serovar LGV2) wurden mit Myeloma-Zelllinie vereinigt und in vitro in einer Hohlfaserzellkultur kultiviert. Das Immunoglobulin wurde vom Kulturüberstand durch FPLC-Protein-A-Affinitätsaufreinigung unter Verwendung von Citratpuffer-, pH 4,5, Elution isoliert. Das Elutionsmittel wurde auf 0,9% NaCl mit 0,1 % NaN₃ als Konservierungsmittel dialysiert und in dieser Form in einer Konzentration von 1 mg/ml bereitgestellt. Der Klon 6701 ist gattungsspezifisch, Anti-Chlamydia-LPS-Antikörper und gehört zur IgG₁-Klasse. Seine chemische Identität wurde durch isoelektrische Fokussierung mit internen Kalibratoren und einem vorangehenden Referenzposten bestimmt. Die Immunreaktivität wurde durch eine Antigen-beschichtete ELISA-Titration gegen den vorangehenden Referenzposten bestimmt.
Herstellung der Markierungszone
Hellblaue "Kontroll"-Beads (Polymer Labs) wurden auf 1,25% Feststoff mit 25 Mm Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, enthaltend Glucoseoxidase mit 0,5 mg/ml, Endkonzentration, verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur rotiert. Die Beadpräparation wurde dann für 3 min zentrifugiert und der Überstand wurde durch Saugen entfernt. Das Beadpellet wurde dann in 0,5 ml des 10 mg/ml methylierten BSA in 50 Mm Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, resuspendiert. Diese Mischung wurde alles in allem für 4 h bei Raumtemperatur rotiert und die Beadpräparation wurde zentrifugiert, um das Pellet zu gewinnen. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet wurde in 10 mg/ml methyliertem BSA mit 1% Feststoff suspendiert.
Dunkelblaue "Test"-Beads zur Analytmarkierung, enthaltend monoklonalen Anti-Chlamydia-Marker-Antikörper, wurden auf ähnliche Weise hergestellt. Dunkelblaue carboxylierte Beads (Bangs Laboratory) wurden auf 1,25% Feststoff mit 25 Mm Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, enthaltend Anti-Chlamydia-monoklonalen Antikörper mit 0,5 mg/ml, Endkonzentration, verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur rotiert. Die Beadpräparation wurde dann für 3 min zentrifugiert und der Überstand wurde durch Saugen entfernt. Das Beadpellet wurde dann in 0,5 ml des 10 mg/ml methylierten BSA in 50 Mm Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, resuspendiert. Diese Mischung wurde alles in allem für 4 h bei Raumtemperatur rotiert und die Beadpräparation wurde zentrifugiert, um das Pellet zu gewinnen. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet wurde in 10 mg/ml methyliertem BSA mit 1% Feststoff suspendiert.
Schließlich wurden die Test- und Kontroll-Beads, um die Markierungszone mit sowohl Test- als auch Kontroll-Beads herzustellen, mit methyliertem BSA in 100 Mm Tricinpuffer, pH 8,0, auf eine Konzentration von 0,04% verdünnt. Die resultierende Mischung wurde auf ein Sontara 0-100 DuPont gesponnenes Gewebe mit 39 μl/cm² gegossen und wie oben für die Probenzone beschrieben lyophilisiert.
Herstellung einer Einfangzonenmembran
Sartorius-Nitrocellulose mit einer Porengröße von 8 μm wurde an einer X-Y-Registriervorrichtung befestigt, und es wurden Chlamydia-Einfangbänder als parallele Linien mit 2 cm-Abständen gebildet, indem 1 mg/ml monoklonaler Anti-Chlamydia-Einfangantikörper unter Verwendung eines manuell betriebenen Plotterstifts verteilt wurde. Diese Linien reagierten mit in einer Probe enthaltener Chlamydia. Die Membran wurde dann in parallele Linien 0,3 cm oberhalb der zuvor getupften Anti-Chlamydia-Einfanglinie mit einer 2 mg/ml Kaninchen-Anti-Glucoseoxidase in PBS-Puffer getupft. Dies sind Linien, die mit der Glucoseoxidase auf den Kontrollbeads reagieren. Nach 10-minütigem Lufttrocknen bei Raumtemperatur wurde die Nitrocellulosemembran blockiert, indem für 10 min bei Raumtemperatur in 10 mg/ml methyliertem BSA in dem 100 mM Tricinpuffer, pH 8,0, eingeweicht wurde. Die blockierte Membran wurde dann betupft, an Luft trocknen gelassen und in einem Exsikkator bei Raumtemperatur bis zum Zusammenbau der Vorrichtung aufbewahrt.
Zusammenbau der Vorrichtung
Es wurde ein 20 × 9 mm Streifen auf der Einfangzonenmembran 100 zentral auf einem adhäsiven Transparenzstreifen 102, wie es in 6a gezeigt ist, fixiert. Der Transparenzstreifen ist ein 700 × 17 mm Streifen aus P 2200-Adhäsiv (3M) mit doppelseitigem Adhäsivband 444 (3M). Das Markierungspad 104 wurde dann auf den Adhäsivstreifen 102 neben das Einfangzonenpad mit einer Überlappung 106 von 1 mm fixiert. Das Probenaufnahmepad 108 wurde dann neben das Markierungspad 104 mit einer Überlappung 110 von 1 mm angebracht. Die Vorrichtung wird dann mit einem Absorptivpad 112 (20 × 9 mm Rechteck aus ED Nr. 939-Absorbens) versehen, welches am anderen Ende der Einfangzonenmembran 100 mit einer Überlappung 114 von 1 mm fixiert wurde. Der resultierende Teststreifen auf dem Transparenzträger wird dann mit einer Plastikoberschicht bedeckt, wobei die Länge des Streifens zentral innerhalb einer Rille in der Unterfläche der Plastikoberschicht vorliegt. Die Einfanglinien liegen im Sichtfenster, und direkt oberhalb des Probenaufnahmepads befindet sich eine Probenaufbringvertiefung. Schließlich wurde eine Unterseite der Vorrichtung, welche ein 700 × 17 mm Unterseitenstreifen eines 1 mm dicken opak weißen, aus Kunststoff hergestellten Adhäsivs mit einem doppelseitigen Adhäsivband (3M) ist, an die andere Seite des Transparenzstreifens 102 angebracht.
Beispiel 2
Herstellung einer vorgefärbten Markierungskomplex-basierenden Vorrichtung
Auf analoge Weise wie in Beispiel 1 beschrieben wurde eine zweite Vorrichtung mit einem vorgefärbten Marker hergestellt. Die Herstellungsweise des Probenaufnahmepads, der Einfangzonenmembran und der Zusammenbau der Komponenten auf dem Träger war genauso wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Das Markierungszonenpad enthält das gleiche "Kontroll"-Bead, doch der Chlamydia-spezifische "Test"-Marker wurde wie unten beschrieben hergestellt.
Herstellung eines Anti-Chlamydia-HRP-Konjugats
Um Antikörper-Enzym-Konjugate herzustellen, wurde Meerrettichperoxidase (HRP) mit 10 mg/ml in 0,1 M Natriumphosphat (pH 8,0), enthaltend 0,5 mM 2-Mercaptoethanol, gelöst und bei 25°C für 45 min mit 2-Iminothiolan bei einer Endkonzentration von 1,23 mg/ml inkubiert, bevor auf einer G25-Säule in 0,1 M Natriumphosphat (pH 7,3) Puffer-ausgetauscht wurde.
Es wurden Maleimidgruppen in den monoklonalen Anti-Chlamydia-Marker-Antikörper mit 5 mg/ml in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) eingeführt, indem N-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (Pierce) mit 8 mg/ml in wässerfreiem DMF zu einer Endkonzentration von 400 μg/ml zugegeben wurde, die Reaktionsmischung für 45 min bei 25°C inkubiert wurde und auf einer G25F-Säule in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) Puffer-ausgetauscht wurde.
Den Maleimid-enthaltenden Anti-Chlamydia-Marker-Antikörper und SH-derivatisiertes Enzym ließ man für 2 h bei 25°C reagieren, gefolgt von einer Auftrennung des Enzym-Antikörper-Konjugats auf einem Sephacryl®-S300-HR-Harz (Pharmacia Biotech, Inc.) in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,0. Die Fraktionierung wird bei 280 mm überprüft und die Antikörper-Enzym-Konjugat-Fraktion wurde gesammelt. Alternativ wurde unkonjugierte HRP von dem Antikörper-Enzym-Konjugat unter Verwendung von QAE-Harz separiert. Darauf folgend wurden die Antikörper-Enzym-Konjugate auf einer G25-Säule in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, Puffer-ausgetauscht.
Herstellung des vorgefärbten Chlamydia-Markierungskomplexes
Direkt vor der Herstellung des gefärbten Markerkomplexes wurde das HRP-Anti-Chlamydia-Konjugat auf 0,3 bis 0,6 mg/ml verdünnt und Natriumazid und Tween-20 wurden zu 0,1% bzw. 0,4% zugegeben. Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 36,8 μl des Konjugats zu 863 μl Reaktionsmischung zugegeben, die bei 15°C vorinkubiert wurde und aus 4-Chlor-1-naphthol mit 0,55 mg/ml, Wasserstoffperoxid mit 0,016%, EDTA mit 0,08 mM, MBTH mit 1 mM, NaCl mit 8 mM, Gentamycin mit 40 μl/ml und 18,6% in 40 mM Tris-Puffer, pH 7,5, zusammengesetzt war. Die Akkumulierung der roten Farbe entwickelte sich mit der Reaktionszeit.
Um die Reaktion zu stoppen, wurden 100 μl methyliertes BSA mit 100 mg/ml pro Reaktion bei 10, 20 oder 30 min zugegeben, die Mischung wurde weiter mit methyliertem BSA mit 10 mg/ml in 100 mM Tricinpuffer, pH 8,0, versetzt mit dem blauen "Kontroll"-Bead mit 0,04% verdünnt. Die Mischung wurde mit 39 μl/cm² auf ein Sontara gesponnenes Gewebe gegossen und wie in Beispiel 1 beschrieben lyophilisiert.
Beispiel 3
Durchführung eines Chlamydia-Assays
Suspensionen der mit C. trachomatis Sevovar D/UW₃ infizierten McCoy-Zellen wurden mit PBS/BSA-Puffer auf verschiedene Infektionslevel verdünnt und 100 μl der Verdünnungen wurden auf Dacron®-Abstriche aufgebracht (auf 100–1000 IFU/Abstrich). Es wurden Negativproben hergestellt, indem 100 μl des Puffers selbst aufgebracht wurden. Das Chlamydia-Antigen wurde durch 1- bis 5-minütige Inkubation mit 5 Tropfen (ungefähr 300 μl) einer 0,05 bis 0,3 N NaOH, enthaltend 0,05 bis 0,3 M NaCl, extrahiert. Das Extrakt wurde dann mit einem Tropfer (ungefähr 600 μl) einer 0,025 bis 0,15 N HCl, enthaltend 10 bis 30 mg/ml BSA, 0,25 bis 0,4% des CHAPS-Detergenz und 0,05 bis 0,3% M Tricin, pH 9,0, neutralisiert. Der Abstrich wurde nach dem Ausdrücken von eingesogenem Extrakt entfernt und das Extraktionsröhrchen wurde mit einer Tropferspitze versehen.
Die Vorrichtung von Beispiel 1 oder von Beispiel 2 wurde flach auf einer Tischfläche platziert und es wurden 3 Tropfen der extrahierten flüssigen Probe mit ungefähr 40 μl pro Tropfen durch die Probenöffnung 124 auf das Probenaufnahmepad 108 (6a–6d) aufgebracht. Man ließ die flüssige Probe durch die drei Zonen (in der Reihenfolge 108, 104 und 100) in nicht-absorptivem lateralem Fließkontakt zur Absorbenszone 112 fließen. Innerhalb weniger als 1 min erschien am anderen Teil des Sichtfensters 36 eine hellblaue Kontrollbande 24 (4), wenn sowohl die negativen als auch die Chlamydia-positiven Proben getestet wurden. Wenn Chlamydia zu mindestens 100 IFU/ml in der Probe vorhanden ist, war eine zusätzliche dunkelblaue Bande 22 (5) in der Analyteinfangregion in der Vorrichtung von Beispiel 1 sichtbar, oder innerhalb von maxim4al 10 min. erschien in der Vorrichtung von Beispiel 2 eine zusätzliche rote Bande. Bei höheren Antigenlevels in der Probe war die Testbande intensiver und erschien früher. Chlamydia-Negativproben erzeugten nur die hellblaue Kontrollbande 24.
Beispiel 4
Analytische Sensitivität des Chlamydia-Assays
Es wurden achtzehn Stämme von 15 Serovars von C. trachomatis, TWAR-Stamm von C. pneumoniae und drei Stämme von C. psittaci von dem ATCC erhalten, wobei die Kulturtiter darauffolgend auf IFU/ml normalisiert wurden (Anzahl inklusionsbildender Einheiten pro 1 ml unverdünnter Vorratslösung). Es wurden Serienverdünnungen der Vorratslösung in PBS/BSA-Puffer hergestellt und dreifach als 100 μl auf Dacron® aufgebrachten Abstrich in der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, getestet. Zum Vergleich wurde ein auf Dacron® aufgebrachter Abstrich in einer Kodak SureCell^TM gemäß der Packungsbeilage getestet. Die Detektionsgrenze wurde als IFU/Abstrich der niedrigsten Verdünnung, die positiv ausfiel, definiert.
In den 7A bzw. 7B sind logarithmische Darstellungen der Detektionsgrenzen für Chlamydia-Mittel der SureCell^TM-Vorrichtung und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung dargestellt. In beiden Immunoassays werden gattungsspezifische LPS-monoklonale Antikörper verwendet und dabei alle drei Spezies von Chlamydia detektiert, und es werden ähnliche Verteilungsmuster ihrer Sensitivitäten unter verschiedenen Chlamydia-Mitteln wiedergegeben. Mit der Ausnahme von Serovar J war die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung 2- bis 10-mal sensitiver als der SureCell^TM-Test. Eine Mehrheit (77%) der klinisch relevanten C. trachomatis-Serovare wurde bei niedrigen, weniger als 1000 IFU/Test-Levels entsprechend einer 1+/2+-Kultur positiv getestet. Nur Serovar J erforderte mehr als 10000 IFU (4+-Kultur), um ein positives Testergebnis zu ergeben. Diese stammabhängige Variation der Sensitivität kann von einer unterschiedlichen Kulturanpassungsfähigkeit des Stammes, seiner Expression des LPS-Antigens und der tatsächlichen Menge des Mikroorganismus bei verschiedenen Infektiositätslevels (IFU) herrühren.
Beispiel 5
Spezifität des Chlamydia-Assays
Von ATCC erhaltene Mikroorganismusstämme wurden in Kulturbrühe oder auf angereichertem Agar vermehrt. Die Infektiosität (CFU/ml) wurde bestimmt, indem Serienverdünnungen lebensfähiger Organismen in einer Plattenkultur angelegt und die Kolonien ausgezählt wurden. Die Gesamtkonzentration von Organismen (lebensfähige und nicht lebensfähige) in Zellen/ml wurde durch die McFarland-Methode auf hitzeinaktivierten Kulturen etabliert. Vermehrte Vorratskulturen wurden dreifach als 100 μl Aliquots, aufgebracht auf sterile Abstriche mit Dacron®-Spitze, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, getestet. Außerdem wurde das Testergebnis jedes Tests bei 10, 30, 60 min und über Nacht beobachtet.
In Tabelle 1 sind die Konzentrationen der Mikroorganismen, die in der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ein negatives Testergebnis ergeben haben, aufgelistet. Zusätzlich zur Infektiosität (CFU/ml) wird die tatsächliche Konzentration der Organismen (Zellen/ml) angegeben, um die in der Kultur vorhandenen nicht lebensfähigen Organismen zu erklären. Nur 5 von 48 Vorratslösungen (in Tabelle 1 mit Sternchen versehen) erforderten eine Verdünnung, um ein negatives Testergebnis zu ergeben, die verbleibenden Organismen ergaben bei der höchsten erhältlichen Konzentration als unverdünnte Vorratslösungen ein negatives Ergebnis.
Mit der Ausnahme von Bacteroides oralis und Staphylococcus aureus betrugen die nicht reaktiven Konzentrationen mindestens 10⁸ Zellen/ml oder 10⁷ Zellen/Test. Keiner der Mikroorganismen, die bei den angegebenen Levels getestet wurden, wiesen Anzeichen für eine Kreuzreaktivität im Assay über eine Zeitdauer von 60 min ausgehend von dessen Ende auf.
Tabelle 1 Konzentrationen der bei 100 μl pro Abstrich negativ getesteten Mikroorganismen.
Beispiel 6
Klinische Durchführung des Chlamydia-Assays
Diese Studie wurde an drei Klinikorten durchgeführt, die verschiedene Patientenpopulationscharakteristiken wie klinische Präsentation, Risikofaktor, Vorgeschichte und Prävalenz von sexuell übertragbaren Krankheiten und Alter repräsentieren. Diese Information wurde von der die Proben erhaltenen Klinik aufgenommen und zur Einteilung in asymptomatische und symptomatische Patientenkategorien verwendet. Die untersuchte Gruppe mit niedrigem Risiko bestand aus 38 Patienten einer Geburts/Gynäkologieklinik und aus 320 Patienten einer Familienplanungsklinik in Galveston, Texas. Studien von Gruppen mit hohem Risiko wurden an zwei verschiedenen Klinikorten durchgeführt: Indiana University Medical Center, Indianapolis, IN (126 Patienten einer STD-Klinik) und National University Hospital, Reykjavik, Island (240 Patienten einer STD-Klinik).
Es wurden aufeinanderfolgend drei endozervikale Abstrichproben von Patienten, die ihr Einverständnis erklärt haben, erhalten, nachdem die Exocervix mit einem Abstrichtupfer/Wattebausch gereinigt wurde. Das Chlamydia-Transportmedium, das den ersten Abstrich enthielt, wurde auf Monolayer aus McCoy-Zellen inokuliert und für 48 bis 72 h inkubiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit. Methanol-fixierte Kulturen wurden mit Fluorescein-konjugiertem Anti-Chlamydia-Antikörper angefärbt und unter dem Fluoreszenzmikroskop für Chlamydia-Inklusionen gescannt. Positive Kulturen, durch IFU/ml quantifiziert, wurden wie folgt klassifiziert:
Von dem technischen Laborangestellten wurden die zweiten bzw. dritten Abstriche für den Assay der vorliegenden Erfindung und den SureCell^TM-Test verwendet. Die McCoy-Zellkultur diente als ein Referenzverfahren für beide Testdurchführungsbewertungen. Diskrepanzen zwischen den Testergebnissen wurden durch PCR gelöst (Amplicor^TM, Roche Diagnostic Systems PCR) oder Cytospin DFA (Syva MicroTrak® Chlamydia trachomatis Direct Specimen Test).
Insgesamt wurden 724 Paare endozervikaler Dacron®-Abstriche bewertet, wobei 73 davon von Patienten mit positiver Kultur waren (Gesamtprävalenz 10,1%). Die Daten für die Gruppe niedrigen und hohen Risikos asymptomatischer und symptomatischer Patienten sind in Tabelle 2 und für die kombinierten Gruppen in Tabelle 3 zusammengefasst. Wie es der Tabelle 2 entnommen werden kann, war die Mehrheit der Patienten (81% in der Niedrigrisiko- und 59% in der Hochrisikogruppe) asymptomatisch. Die Prävalenz für die Infektion unter asymptomatischen und symptomatischen Patienten der betreffenden Klinikstelle war ähnlich. Es wurde angenommen, dass die Sensitivität von Nicht-Kulturtests in asymptomatischen Patienten aufgrund der marginalen Mengen an Chlamydia-Partikeln, die in infizierten asymptomatischen Frauen vorhanden sind, beeinträchtigt werden kann. In dieser Studie war jedoch die Sensitivität des SureCell^TM-Tests in beiden Populationen (90%) gleich, während die Sensitivität der Vorrichtung der Erfindung in der asymptomatischen Population (94%) höher war. Die Gesamtleistung der zwei Tests (Tabelle 3) ist vergleichbar, wobei die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung bei Indiana University beträchtlich sensitiver war (IU, 85% v. 69%). Proben mit einer niedrigen Kulturinfektiosität wurden durch beide Tests mit verringerter Sensitivität (Tabelle 4) detektiert und wieder war die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung effektiver als SureCell^TM in der 1+-Kulturkategorie (81% v. 75% Sensitivität).
Tabelle 2 Vergleich des lateralen Fließtests der vorliegenden Erfindung (LFT) und der Kodak SureCell^TM Chlamydia Testkit-Kulturmethode in verschiedenen Patientenpopulationen.
Tabelle 3 Vergleich des lateralen Fließtests der vorliegenden Erfindung (LFT) und des Kodak SureCell^TM Chlamydia Testkits in primärem und korrigiertem Kulturverfahren in Patientenpopulationen mit niedrigem und hohem Risiko (Gesamt: asymptomatisch und symptomatisch).
Tabelle 4 Klinische Sensitivität des LFT Chlamydia-Tests und des SureCell^TM Chlamydia Testkits bezogen auf die Quantifizierung der Primärkultur. Niedrig- und Hochrisiko, asymptomatische und symptomatische Populationen kombiniert.
Obwohl die vorangehende Erfindung anhand von Erläuterungen und Beispielen zu Zwecken der Klarheit und des Verständnisses detailliert beschrieben wurde, ist es offensichtlich, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb der anhängenden Ansprüche durchgeführt werden können.

Claims

Assay zur Detektion von Chlamydia in einer solubilisierten Patientenprobe, wobei der Assay umfasst: Extrahieren von Chlamydia aus einer endozervikalen Abstrichprobe, indem die Abstrichprobe einer starken Base ausgesetzt wird; Neutralisieren des Extrakts durch Kontaktieren mit einem zwitterionischen Detergens und einem Blockierungsprotein in einem zwitterionischen Puffer; Aufbringen der solubilisierten Patientenprobe auf eine Matrix, die einen Fließweg definiert, der mindestens eine Markierungszone und eine Einfangzone einschließt, wobei die Markierungszone nicht gebundenen Markierungskomplex enthält, umfassend einen sichtbaren Marker, der an eine für ein Epitop des Chlamydia-Lipopolysaccharid-Antigens spezifische Analyt-bindende Substanz gebunden ist, und wobei die Einfangzone immobilisierte, für ein Epitop des Chlamydia-Lipopolysaccharid-Antigens spezifische Markierungsbindesubstanz enthält; und Verfolgen der Akkumulation des sichtbaren Markers innerhalb der Einfangzone als Folge einer Bindung von Chlamydia-Antigen an den Markierungskomplex in der Markierungszone, Fließen des Markierungskomplex-gebundenen Antigens zu der Einfangzone und Einfangen des Markierungskomplex-gebundenen Antigens durch die Bindesubstanz in der Einfangzone.
Assay nach Anspruch 1, wobei die Einfangbindesubstanz und die Markierungsbindesubstanz jeweils Antikörper sind, die für das gleiche oder für unterschiedliche Epitope auf der KDO-Einheit des Chlamydia-Lipopolysaccharids spezifisch sind.
Assay nach Anspruch 1, wobei der Extraktionsschritt eine Inkubation in NaOH, gefolgt von einer Behandlung mit CHAPS-Detergens und BSA als Blockierungsprotein in Gegenwart von Tricin-Puffer umfasst.
Vorrichtung zur Detektion von Chlamydia, wobei die Vorrichtung umfasst: einen Extraktionspuffer, der eine starke Base zur Extraktion von Chlamydia-Lipopolysaccharid-Antigen enthält; einen Neutralisationspuffer, der ein zwitterionisches Detergens und ein Blockierungsprotein enthält; eine Matrix, die einen Fließweg definiert, der mindestens eine Markierungszone und eine Einfangzone einschließt; einen Markierungskomplex, der innerhalb der Markierungszone vorliegt, wobei der Markierungskomplex einen sichtbaren Marker umfasst, der an eine für ein Epitop des Chlamydia-Lipopolysaccharid-Antigens spezifische Bindesubstanz gebunden ist, und wobei die Markierungszone ferner einen zwitterionischen Puffer umfasst; und eine Bindesubstanz, die innerhalb der Einfangzone immobilisiert ist, wobei die immobilisierte Bindesubstanz für ein Epitop des Chlamydia-Lipopolysaccharid-Antigens spezifisch ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Einfangbindesubstanz und die Markierungsbindesubstanz jeweils Antikörper sind, die für das gleiche oder für unterschiedliche Epitope auf der KDO-Einheit des Chlamydia-Lipopolysaccharids spezifisch sind.
Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei der Fließweg ferner eine Probenaufnahmezone stromaufwärts von der Markierungszone und eine Absorptivzone stromabwärts von der Einfangzone einschließt.
Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Matrix zumindest teilweise aus nicht absorbierendem Material besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei das nicht absorbierende Material mit methyliertem Rinderserumalbumin behandeltes Polyethylen ist.
Kit zur Detektion von Chlamydia in einer Patienten-Abstrichprobe, wobei der Kit umfasst: eine Vorrichtung nach Anspruch 4, einen Abstrichbehälter; ein erstes Reagenzgefäß, das eine basische Lösung für eine anfängliche Inkubation des Abstriches in dem Behälter enthält; ein zweites Reagenzgefäß, das eine Lösung aus einem zwitterionischen Detergens und einem Albumin zur Neutralisation des Probenextrakts in dem Abstrichbehälter vor dem Aufbringen auf die Vorrichtung enthält; und Verpackung, um die Vorrichtung, den Abstrichbehälter, das erste Reagenzgefäß und das zweite Reagenzgefäß zu halten.
Kit nach Anspruch 9, ferner umfassend schriftliche Instruktionen.
Verfahren zur Verwendung des Kits nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, umfassend die folgenden Schritte: Einbringen des Abstriches in den Behälter; Einbringen des Reagenzes vom ersten Gefäß in den Behälter und Inkubierenlassen; Einbringen des Reagenzes vom zweiten Gefäß in den Behälter; Zurückdrücken von flüssigem Inhalt des Abstriches in den Behälter; Aufbringen des Inhalts des Behälters auf die Matrix der Vorrichtung; und Verfolgen der Akkumulation des Markers innerhalb der Einfangzone der Vorrichtung.