JPH07503543A - 乾燥試薬を用いる細菌抗原の簡易化抽出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乾燥試薬を用いる細菌抗原の簡易化抽出法技術分野 本発明は、生物からの多糖抗原を抽出する方法に関する。

さらに詳細には、本発明は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ＞　Ａ群およ び連鎖球菌Ｂ群を包含する、ストレプトコッカス科の生物に特徴的な糖抗原の抽 出に関する。

発明の背景 連鎖球菌Ａ群（ＧＡＳ）に特徴的な糖抗原の抽出に対する従来の方法は、全ての 溶液試薬の使用を包含する。例えば、■ｎｕａ　１ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａ上Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌｏ　、第４版（１９８５）、１７１ヘ−’）参照。

この方法は周知であり、そして免疫アッセイと組み合わせて行えば、連鎖球菌感 染の診断に用いられ得る。典型的に、抽出は、３種の液体試薬を包含する：それ は、酸（通常は酢酸、塩酸、またはクエン酸）、亜硝酸ナトリウム、および中和 塩基または緩衝液（トリス、水酸化ナトリウムなど）である。これらの試薬は、 ＧＡＳ糖抗原の最適放出を生じる、ｐＨおよびモル濃度の範囲に適合する。典型 的な抽出は、２Ｍ亜硝酸ナトリウムを１５０μＬ　２Ｍ酢酸を１５０μ１１　お よび０．４４Ｍト１／ス１０．６６Ｎ水酸化ナトリウムを３５０μ■使用するこ とを包含する。最初の２種の試薬（亜硝酸ナトリウムおよび酢酸）を、チューブ 内で−緒に混合し、そして試料を含ませたスワブを、溶液中に入れた。反応物を 、１〜３分間インキュベートし、そして３番目の（中和）溶液を添加し、そして 混合した。スワブを取す出し、チップをチューブの中に挿入し、そしてチューブ の内容物を試験デバイス上に絞り出す。

上記手順は、３種の試薬が正確な量で分配されることを必要とする。それは、免 疫診断アッセイにおいて放出された抗原の捕獲および検出を可能にするためには 、最終溶液のｐＨが約７〜８でなければならないからである。

発明の開示 本発明は、前述の抽出方法を簡易化する。そしてそれによって試験の結果が変動 する可能性が減少する。この簡易化の成果は、２種の乾燥した成分および１種の 液体試薬を用いる抽出方法の開発である。

本発明の１つの実施態様は、臨床試料から多糖分析物を抽出する方法である。臨 床試料を、亜硝酸塩をしみ込ませた第１吸収性物質とインキュベートし、酸溶液 を添加し、そして続いて中和塩基または緩衝液をしみ込ませた第２吸収性物質を 添加する。

本発明の第２の局面は、臨床試料から多糖抗原を抽出する方法である。亜硝酸す ）　ＩＪウムを、第１吸収性物質上に吸収させ、そして中和緩衝液を、第２吸収 性物質上に吸収させる。

これらの物質を乾燥し、そしてその後、臨床試料および酸溶液とインキュベート する。生成溶液を、多糖抗原の存在を示す試験デバイスの上に置（。

さらに、本発明の別の局面は、臨床試料から連鎖球菌Ａ群に特徴的な多糖抗原を 抽出する方法である。亜硝酸ナトリウムをＳ＆Ｓ　＄９０３ペーパーの直径７■ デイスクに吸収させ、そしてトリスを、綿プラグおよびＳ＆Ｓ　＄３００ペーパ ーの直径６１Ｉ１１デイスクを含む分注チューブチップ上に吸収させる。これら の物質を乾燥し、そして臨床試料をこの乾燥させた亜硝酸ナトリウムおよび酢酸 溶液とインキュベートする。生成溶液をトリス含有分注チューブチップを通して 絞り出し、そして、連鎖球菌Ａ群に特徴的な多糖抗原の存在を示す試験デバイス の上に置（。

本発明の第２の実施態様は、臨床試料から多糖分析物を抽出する方法で使用する キットに関する。このキットは、予め測定した量の亜硝酸塩をしみ込ませた第１ 吸収性物質、予め測定した量の中和緩衝液をしみ込ませた第２吸収性物質、およ び予め測定した量の酸を含む容器を包含する。

発明の詳細な説明 本発明の方法は、臨床試料からの多糖分析物の抽出に有用である。より詳細には 、この方法は臨床試料から多糖抗原の抽出に有用であり、ここで、抗原の抽出は 臨床試料中において特定の生物の存在を示す。初期の方法では、抽出のために３ 種の試薬を正確に測定することが必要とされた。本発明の簡易化抽出法では、２ 種の乾燥した試薬および１種の液体試薬が使用される。

本発明は、特定の生物に特徴的な多糖抗原を抽出するのに有用である。本発明は 、ストレプトコッカス科の生物に特徴的な多糖抗原、特に連鎖球菌Ａ群およびＢ 群に特徴的な多糖抗原の抽出に有用であることが例示されている。従って、本発 明は、連鎖球ＩＩＡ群に特徴的な多糖抗原の抽出に関して記載され、以下に実施 されているが、これらの技術を、連鎖球菌Ｂ群または０群、およびカンジダ種の ような、他の型の症状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に特徴的な多糖分析物にも拡張 され得ることが理解される。

２配−Ｉ団」炙料 本発明の方法を用いて試験される臨床試料は、典型的に連鎖球菌感染症を患って いると考えられる患者から採取されたスワブ試料であり得る。生物が連鎖球菌Ａ 群の場合は、スワブで掻き取った咽頭の試料が採取されるが、連鎖球菌Ｂ群の疑 いがある場合は、スワブで掻き取った腟の試料が採取される。

採取後・　スワブは、抽出２４時間前までは保存され得る。本発明に従って抽出 した後、抽出物は１時間以内に連鎖球菌特有抗原の存在について分析されなけれ ばならない。

（以下余白） 旦−」を科 連鎖球菌コロニーの抽出の元来の方法では、１５０ｕ１の２Ｍ亜硝酸ナトリウム 溶液を１５０μｌの２Ｍ酢酸と混合して溶液を形成し、臨床試料の中へ入れた。

０．４４Ｍ　トリスおよび０．６６Ｎ水酸化ナトリウムの溶液を３５０μｌ含宵 する中和緩衝液を、最終溶液のｐＨが７〜８の範囲となるように、亜硝酸ナトリ ウム／酸溶液に添加した。よって、免疫診断アッセイにおいて、連鎖球菌に特徴 的な多糖抗原を捕獲および検出し得た。

本発明は、フィルター物質上に吸収されて、そして乾燥される亜硝酸塩溶液の使 用を包含する。好ましい実施態様では、この溶液は亜硝酸ナトリウムであり、こ こで、亜硝酸ナトリウムの濃度は、３００〜３７．５μｌの範囲の体積で１〜８ Ｍの範囲であり得、最も好ましくは６Ｍでの５０μｍである。

亜硝酸ナトリウムの溶液は、綿、ガラスファイバー、濾紙、およびそれらの組合 せであるフィルター物質上に吸収される。

好ましい物質は、直径約７ｍｍのＳ＆Ｓ　＃９０３ペーパーディスクと分かった 。亜硝酸ナトリウムを含んだディスクは、１５〜１００　’Ｃで、好ましくは４ ５℃で一晩（少なくとも１８時間）乾燥させる。

本発明の中和塩基または緩衝液は、所望のｐＨを得るおよび／または維持するの に適切な標準塩基または緩衝液系から構成される。例えば、トリス、水酸化ナト リウム、炭酸水素ナトリウム、アミノメチルプロパツール、３−［シクロへキシ ルアミノコ−１−プロパン−スルホン酸（ＣＡＰＳ）およびＮ−トリス−［ヒド ロキシメチルコメチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）が挙げられ る。本発明の好ましい中和緩衝液はトリスペースである。その濃度は、７００μ ｌと８７．５μｌとの間の体積での０．５Ｍと４Ｍとの間であり、最も好ましく は、３．５Ｍでの１００μｌである。

中和塩基または緩衝液を、ガラスファイバー、綿、濾紙、およびそれらの組合せ といったフィルター物質上に吸収させる。好ましい形態は、綿プラグおよび直径 約６ｍｍのＳ＆Ｓ　＃３００ペーパーディスクの付いた分注チューブチップと分 かった。次いで、物質を含有している緩衝液を、１５〜１００°Ｃで、好ましく は４５℃で乾燥する。

本発明の酸としては、酢酸、クエン酸、シュウ酸、または塩酸、その他が挙げら れる。本発明の好ましい酸は、酢酸である。その濃度は、０．１１１１と５ｍｌ との間の範囲の体積で、０．０５Ｍと２Ｍとの間の濃度であるが、最も好ましく は０．５Ｍでの０．６ｍｌである。

Ｌ−皿１１ユ 亜硝酸ナトリウムおよびトリスを含有するフィルター物質を、上記のように調製 する。亜硝酸ナトリウム含有ディスクを、分注チューブの中に入れる。酢酸溶液 を添加し、次いで試料を含ませたスワブを分注チューブに挿入し、３０分までイ ンキュベートさせる。トリスをしみ込ませた綿プラグおよびＳ＆Ｓ　１ｔ３００ ペーパーデイスクを備える分注チューブチップを、分注チューブに挿入する。分 注チューブを逆さまにし、そして溶液を、ＱＴＥＳＴ　５ｔｒｅｐ”（Ｂｅｃｔ ｏｎ　Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）およびＡＬＥＲＴ　５ｔｒｅｐ”（Ｑｕｉｄｅｌ） のような、連鎖球菌に特徴的な抗原の存在または非存在を示す試験デバイスの上 に絞り出す。

本発明は、以下の実施例によりさらに説明される。これらの実施例は、いかなる 方法においても本発明を制限することを意図していない。

１血史 ｆの 広（用いられている３種類〜液体試薬プロトフールに取って代わって開発された 本方法は、亜硝酸ナトリウム、トリスおよび酢酸の体積および濃度を最適化する 工程を包含した。亜硝酸ナトリウムおよびトリスを、濾紙物質上に吸収させ、乾 燥させるのに最適化した。酢酸試薬は、抽出において依然液体として使用してい る唯一の液体試薬であるので、その濃度を変えた。

元の中和試薬（元来の方法におけるトリス／Ｎａ０Ｈ）を、より高濃度のトリス を含み、ＮａＯＨを含まないものに改変した。約１００〜１５０μｌの３．５Ｍ 　トリスペースで、充分に中和される。炭酸水素ナトリウム、アミノメチルプロ パツール、ＣＡＩ’Ｓ、およびＴＡＰＳもまた評価した。しかし、種々の物質上 に吸収させて４５°Ｃで一晩乾燥させる場合、トリス緩衝液が最もよ（働くこと が分かった。中和試薬を吸収量について評価した物質は以下を包含したニガラス ファイバー、綿、Ｓ＆Ｓ　＄３００ペーパーおよびそれらの組合せ。直径約６Ｉ ｉｍのＳ＆Ｓ　＄３００ペーパーディスクおよび綿プラグを備える分注チューブ チップで最高の効果を得た。この構成は、機能試験で用いられた場合に、１００ μｌの３．５Ｍのトリスペースを保持すること、容易に乾燥すること、および試 験溶液のｐｌを中和することが分かった。

亜硝酸ナトリウムを、溶液のモル濃度を増加することにより改変した。分注チュ ーブ中に置いたＳ＆Ｓ　＃９０３ペーパーディスクに完全に含有されるのは、５ ０μｍの体積と分かった。数種の物質（綿、ガラスファイバー）を評価したが、 Ｓ＆Ｓ　＃９０３の直径約７ｍｍのディスクが最高の効果を示すと分かった。５ ０μｌが目標体積だったので、このためには６Ｍの亜硝酸ナトリウム溶液を用い 名ことが必要であった。

酢酸試薬は、１５０〜６００μｌの抽出当りで用いられる体積を増加することに より、そして２Ｍ〜０．５Ｍ酢酸のモル濃度を低下することにより最適化した。

″″　ＩＩ−：の　および ６Ｍの亜硝酸ナトリウム５０μｌをＳ＆Ｓ　＄９０３ペーパーの７ｍｍ直径ディ スク上に吸収させ、そして４５℃で少なくとも１８時間乾燥させた。３．５Ｍの トリスペース１００μｌを、分注チューブチップ中に置いた綿プラグおよびＳ＆ Ｓ　＃３００ペーパーの６ｍｍディスク上に吸収させた。この組立部品を４５″ Ｃで少なくとも１８時間乾燥させた。亜硝酸ナトリウム含有ディスクおよび０． ５Ｍの酢酸溶液６００μｌを、分注チューブの中に入れた。この手順を２回行う ことにより、２つの分注チューブは、酢酸、および乾燥した亜硝酸ナトリウム含 有濾紙を含んだ。連鎖球菌Ａ群を含む溶液を、分注チューブの１つに入れた。乾 燥したトリスペースを含む分注チューブチップを各分注チューブに挿入し、モし て分注チューブからの溶液をチ／プを通してＱＴＥＳＴ　５ｔｒｅｐ”（Ｂｅｃ ｔｏｎ　Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）上に絞りだした。表■は、試験結果を記載してい る。

コントロール試料について、前述の方法を用いて抽出を行った。この抽出は、こ こで、２Ｍ亜硝酸ナトリウム１５０μｌおよび２Ｍ酢酸１５０μｌを分注チュー ブ中で一緒に混合した。この工程を２回行い、この２つの分注チコープは、亜硝 酸ナトリウムおよび酢酸を含んでいた。連鎖法ｍＡ群を含む溶液を、分注チュー ブの１つの中に入れた。反応物を１分間インキュベートした。次いで、０．４４ Ｍ　Ｉ−リス１０．６６Ｎ水酸化ナトリウム溶液３５０μｌを各分注チューブに 添加し、そして各チューブ中の溶液を混合した。次いで、分注チューブチップを 分注チューブに挿入し、モして分注チューブの内容物をＱＴＥＳＴ　５ｔｒｅｐ ”（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）上に絞りだした。結果を表■にまとめ る。

（以下余白） 表土 視覚的結果 １目　・ｉ佐 コントロール抽出方法 （全ての液体試薬）−十 乾燥成分抽出方法　−＋ 生化学、有機化学、臨床診断、および関連分野の当業者にとって明白である上記 の本発明を実施するための形態の改変は、以下の請求の範囲の範囲内であること が意図される。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年８月４日 φ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．多糖分析物を有する臨床試料から該分析物を抽出する方法であって、該臨床 試料を第１吸収性物質および酸の水溶液および第２吸収性物質とインキュベート して、生成溶液を得る工程を包含し、ここで、該第１吸収性物質は予め測定した 量の亜硝酸塩をしみ込ませてあり、そして該第２吸収性物質は予め測定した量の 中和塩基または緩衝液をしみ込ませている、方法。
2. ２．前記多糖分析物が、ストレプトコッカス科の生物に特徴的な多糖抗原である 、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記多糖抗原が、連鎖球菌Ａ群またはＢ群に特徴的である、請求項２に記載 の方法。
4. ４．前記中和塩基または緩衝液が、トリス、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリ ウム、アミノメチルプロパノール、３−［シクロヘキシルアミノ］−１−プロバ ン−スルホン酸（ＣＡＰＳ）、およびＮ−トリス−［ヒドロキシメチル］メチル −３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）からなる群より選択される、請求 項１に記載の方法。
5. ５．前記酸が、酢酸、クエン酸、シュウ酸、および塩酸からなる群より選択され る、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記第１吸収性物質が、綿、ガラスファイバー、および濾紙からなる群より 選択される、少なくとも１つの物質である、請求項１に記載の方法。
7. ７．前記第２吸収性物質が、綿、ガラスファイバー、および濾紙からなる群より 選択される、少なくとも１つの物質である、請求項１に記載の方法。
8. ８．多糖分析物を有する臨床試料から該分析物を抽出する方法であって、以下を 包含する、方法：ａ）予め測定した量の亜硝酸塩を、第１吸収性物質上に吸収さ せる工程； ｂ）中和塩基または緩衝液を、第２吸収性物質上に吸収させる工程； ｃ）該第１および第２の吸収性物質を乾燥する工程；ｄ）該臨床試料を、該第１ の乾燥した吸収性物質、および酸の水溶液とインキュベートし、生成溶液を得、 その後該第２の乾燥した吸収性物質と接触させる工程；およびｅ）該多糖分析物 の存在を示す試験デバイスキに、該生成溶液を置く工程。
9. ９．連鎖球菌Ａ群に特徴的な多糖抗原を有する臨床試料から核抗原を抽出する方 法であって、以下を包含する、方法：ａ）亜硝酸ナトリウムを濾紙上に吸収させ る工程；ｂ）綿プラグおよび濾紙を含む分注チユーブチップにトリスベースを吸 収させる工程； ｃ）該亜硝酸ナトリウムを含有する濾紙、および該トリスを含有する綿プラグお よび濾紙を乾燥させる工程；ｄ）該臨床試料を、該乾燥した亜硝酸ナトリウム、 および酢酸溶液と分注チューブ中でインキュベートし、そして第１の生成溶液を 得る工程； ｅ）該分注チューブチップを該分注チユーブに挿入し、そして核第１の生成溶液 を該チップを通して絞り、第２の生成溶液を得る工程；および ｆ）該多糖抗原の存在を示す試験デバイス上に、該第２生成溶液を置く工程。
10. １０．多糖分析物を有する臨床試料から該分析物を抽出する方法で用いられるキ ットであって、該キットがひとまとめの以下の組合せを含む、キット： ａ）予め測定した量の亜硝酸塩がしみ込ませてある、第１吸収性物質； ｂ）予め測定した量の中和塩基および緩衝液をしみ込ませてある、第２吸収性物 質；および ｃ）予め測定した量の酸の水溶液。