NO159953B - Karmhylse. - Google Patents

Description

Immunologisk testeanordning.

Foreliggende oppfinnelse angår en testanordning for påvisning av nærvær av immunologiske materialer i væsker. I en av dens mere spesielle former angår oppfinnelsen en anordning for påvisningen av anti-legemer dannet som følge av antigen-dannelse i løpet av visse patologiske til-stander.

Ved de fleste virale, bakteriale, fungale

og auto-immune sykdommer opptrer det bevirkende middel som et fremmedlegeme og stimulerer produksjonen av materialer som er bestemt til å nøytralisere virknin-

gen av slike fremmedlegemer i verten. Fremmedlegemet kan betegnes som et anti-

gen. Antigenet bevirker dannelse av homo-

loge antilegemer. Mengden av antilegeme som dannes ved stimulering av antigenet,

og som sirkulerer gjennom vertens legeme i forskjellige legemsvæsker, såsom serum, varierer med hver sykdom eller patologisk tilstand, og med varigheten av slik syk-

dom eller tilstand. Opptreden av antilege-

mer i forskjellige legemsvæsker er en posi-

tiv indikasjon på nærvær av et homologt antigen. Antilegemet reagerer spesifikt med et homologt antigen i vertens organisme og nøytraliserer derved virkningen av et slikt antigen. Den vanligste opptreden av antilegemet er forbundet med y-globulin-fraksjonen i serum, men antilegemer kan opptre i forskjellige andre legemsvæsker innbefattende andre serumf raks joner, urin,

spytt og lignende. I tillegg til å reagere in vivo reagerer antilegemene også med ho-

mologe antigener in vitro.

Forskjellige immunologiske tester har

vært utviklet for å påvise nærvær av anti-legemer. Eksempelvis har hemagglutina-sjonstester utfyllende fikseringstester og gel-diffusjonstester vært anvendt for å på-

vise forskjellige anti-legemer. Hver av de tilgjengelige tester er imidlertid kompli-

sert og tidskrevende, og derfor vanskelig å

utføre.

Det er følgelig et mål for foreliggende oppfinnelse å skaffe en forbedret immuno-

logisk test.

Et annet mål ved oppfinnelsen er å

skaffe en immunologisk test som er istand til å gi en indikasjon på nærvær av immunologiske materialer og mengden av disse.

Nok et mål ved oppfinnelsen er å skaffe

en immunologisk testeanordning som er lett å anvende.

De forskjellige mål for oppfinnelsen tilfredsstilles av en immunologisk test ved hvilken der anvendes et farvet immunolo-

gisk materiale.

Det immunologiske materiale kan være

et hvilket som helst antigen som er istand til å stimulere antilegemeproduksjon i or-ganismen til en vert eller et anti-legeme som er homologt med et slik antigen. Eksempelvis kan smittsomme antigener så-

som Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Coccidioides immitis, C-reaktivt protein og gamma-globulin anvendes, såvel som et hvilket som helst anti-legeme som er homologt med disse antigener. I det etterfølgende vil der som eksempel på det immunologiske materiale bli angitt et anti-

gen. Det understrekes imidlertid at et hvilket som helst immunologisk materiale kan anvendes.

For farvning av antigener anvendes ifølge oppfinnelsen et hvilket som helst azin-farvestoff som med antigenet danner en forbindelse eller et kompleks som, i nærvær av et antilegeme som er homologt med antigenet, vil gi en visuell indikasjon på den ventede immunologiske reaksjon. Særlig kan farvestoffer av indulin- og nigrosin-klassen anvendes med gode resultater.

I noen tilfeller kan det være ønskelig å rense farvestoffet i dets kommersielt tilgjengelige form for å skaffe et materiale med hvilket farvningen kan utføres på let-teste måte. Eksempelvis kan kommersielt nigrosin renses ved behandling med «Sep-hadez» eller silicagel. «Sephadex» er et tverrbundet dextran produsert av Phar-macia i Uppsala for anvendelse ved gel-filtrering.

Det ønskede antigen og farvestoff kan blandes i en passende pufret oppløsning, vanligvis en nesten nøytral oppløsning, f. eks. en som har en pH i området fra ca. 7,1 til 7,4. Pufrede saltoppløsninger anvendes hyppig til dette formål. Reaksjonen mellom antigenet og farvestoffet inntrer i løpet av en kort tid, f. eks. fra ca. 30 minutter til 3 timer. Temperaturen ved reaksjonen er bekvemt den omgivende eller værel-setemperaturen, f. eks. en i området fra ca. 20 til 30°C. Andre temperaturer kan om ønskes anvendes. Når imidlertid protein-spaltning er mulig, er det tilrådelig i høy-den å oppvarme reaksjonsblandingen me-get forsiktig. Det farvede antigen kan dannes i vandig oppløsning som beskrevet ovenfor eller kan lyofiliseres og fremstilles i pulverform.

Ved en utførelsesform av oppfinnelsen skaffes det farvede antigen i et kapil-larrør ferdig til anvendelse. Det farvede antigen i et fysiologisk sterilt, vandig me-dium pufferet til ca. pH 7,1 til 7,4 innføres i den ønskede mengde i et glass kapillar-rør med en lengde på ca. 7,5 cm og en diameter på ca. 1—2 mm. Vanligvis bør ka-pillarrøret ikke være mere enn ca. % fullt for å sikre nøyaktige resultater. Det fylte kapillarrør kan anvendes straks, lagres i et kjøleskap for fremtidig bruk eller lyofiliseres før lagring. Det lyofiliserte, farvede antigen er tilstede som et belegg på kapil-larrøret. Det kan rekonstitueres ved å brin-ges i kontakt med vann eller med en prøve av væsken som skal undersøkes.

Ved bruk trekkes væsken som skal un-

dersøkes opp i kapillarrøret og blandes med det farvede antigen. Hvis prøven som un-dersøkes, inneholder et antilegeme som er homologt med antigenet, vil der ved inkubasjon dannes et bunnfall i kapillarrøret. Inkubasjon kan skje i et tidsrom fra ca. 2 timer til 24 timer. 18 timers inkubasjon har f. eks. vist seg å gi utmerkede resultater. Inkubasjonstemperaturen bør være en som er nær den omgivende temperatur, fortrinnsvis ca. 30—37°C. Intet bunnfall vil dannes hvis prøven som undersøkes ikke inneholder et homologt antilegeme.

Ved en annen utførelsesform av oppfinnelsen blandes det farvede antigen med væsken som skal undersøkes og reaksjonsblandingen overføres straks på celluloseacetatpapir som tjener som reaksjons-område.

Celluloseacetatpapiret fremstilles for den immunologiske test ved å fuktes med en fysiologisk steril, vandig oppløsning pufret til ca. pH 7,1 til 7,4. Overskudd av fuktighet bør fjernes fra papiret før bruk. Prøven som skal undersøkes på homologt antilegeme blandes med et like stort vo-lum farvet antigen og en liten mengde, ca. 0,005 ml av denne blanding anbringes på papiret. Hvis prøven inneholder et anti-legeme som er homologt med det farvede antigen, opptrer en mørk ring i løpet av ca.

10 til 30 minutter. I fravær av slik homo-loge antilegemer opptrer ingen ring. For å

lette den immunologiske reaksjon kan papiret, på hvilket prøven utføres, anbringes

i et fuktig kammer i et tidsrom som er tilstrekkelig til at reaksjon inntrer. Etter tørring utgjør papiret inneholdende den immunologiske felning en permanent registrering av prøven. Denne permanente registrering er en fordel som ligger i anvendelsen av celluloseacetatpapir som om-råde for den immunologiske reaksjon.

Skjønt oppfinnelsen er beskrevet med en stor rekke detaljer og utførelsesformer er beskrevet hvor et farvet antigen anvendes for å påvise et homologt anti-legeme, kan eventuelt et anti-legeme farves og anvendes i en prøve for å påvise et homologt antigen. Av praktiske grunner er det mest hyppig ønskelig at anti-legemet, som opptrer i langt større grad enn antigen ved begynnelsen av forskjellige patologiske til-stander, er det som bestemmes og at et farvet antigen anvendes til dette formål. Rekkefølgen kan imidlertid byttes om om ønskes.

Oppfinnelsen vil forstås bedre av føl-gende eksempler som er tatt med for å belyse oppfinnelsen.

Eksempel 1.

Test utført i kapillarrør.

0, 05 M fosfat- pufret saltoppløsning —

pH 7, 4.

Til 10,3 ml 0,5 M kaliumdihydrogen-fosfat pluss 30,0 ml 0,5 M dinatriumhydro-genfosfat ble tilsatt 8,7 g natriumklorid. Den dannede oppløsning ble fortynnet til 1 000 ml med destillert vann.

0, 05 M tris- pufret saltlake — pH 7, 1.

Til 50 ml 1 M saltsyre pluss 55,7 ml 1 M tris-(hydroxymethyl)'-aminomethan ble tilsatt 8,7 g natriumklorid. Den dannede oppløsning ble fortynnet til 1 000 ml med destillert vann.

3 pst.- ig vandig nigrosin.

3 g vannoppløselig nigrosin ble opp-løst i 100 ml destillert vann.

0, 3 pst.- ig vandig nigrosin.

En glasskolonne 30 cm høy og 1 cm i diameter ble pakket til en høyde av 22 cm med ren «Sephadex» og 1 ml 3 pst.-ig vandig nigrosin ble anbragt på kolonnen. Kolonnen ble eluert med destillert vann og de første 10 ml eluat ble oppsamlet. Disse 10 ml som inneholdt renset nigrosinopp-løsningen ble så lyofilisert. Det tørrede nigrosin ble resuspendert i destillert vann til en 0,3 pst.-ig konsentrasjon.

Nigrosin- farvet Mycobacterium Tuberculosis Antigen.

Seriefortynninger av Mycobacterium tuberculosis antigen (H37 Ra Difco No. 2252—62, eller Brook's Mycobacterium tuberculosis polyvalent antigen No. VX 25300) på 10-1, io-2, 10-3, io-4, 10-5, 10-c, 10-7 og IO—» ble gjort i tris-pufret saltlake av pH 7,1 og i fosfatpufret saltlake med pH 7,4. En del 0,3 pst.-ig vandig nigrosin ble tilsatt til 9 deler av antigenfortynningen og blandet omhyggelig. Farvestoffet og antigenet fikk lov til å virke på hverandre i 60 minutter ved 25°C.

Antigenbelagte kapillarrør.

Glasskapillarrør 7,5 cm lange og 1 mm i diameter ble fylt halvfulle med hver for-tynning av nigrosin-farvet M. tuberculosis antigen og lyofilisert inntil antigenet hadde tørret fullstendig.

Kanin- antiserum.

Tre kaniner ble injisert intravenøst med 1 ml Brook's M. tuberculosis polyvalent antigen på tre etter hverandre følgende dager. Inokulasjonen ble gjentatt på den 7., 8., 14., 15., 21. og 22. dag. Fem dager etter den siste injeksjon ble kaninene tappet for blod og serumet ble forenet.

Serumprøver.

En 10 pst.-ig oppløsning av serum ble fremstilt ved å blande en del serum i ni deler tris-pufret saltlake med pH 7,1 eller i fosfat-pufret saltlake med pH 7,4.

Utførelse av testen.

Serumprøver erholdt ved fingerpunk-tering ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Serumprøvene ble trukket opp i de antigenbelagte kapillarrør ved kapillarvirkning. Rørene ble vendt opp ned 20 til 30 ganger for å få omhyggelig blanding. Rørene ble så anbragt vertikalt i leire og inkubert ved 30°C i 18 timer. Positive reaksjoner viste seg ved nærvær av mørke felninger som kunne sees i hele røret eller ved den lavere menisk. Der var ingen felning ved negative reaksjoner.

Ovenstående fremgangsmåte ble gjentatt med det tilleggstrinn at rørene ble sentrifugert ved 500 omdr./min. i 3 minutter etter 6 timers inkubasjon. Etter sentri-fugering kunne bunnfall sees på bunnen av de rør i hvilke der var en positiv reaksjon.

Klinisk bedømmelse.

61 serumprøver fra ikke-tuberkuløse pasienter ble anvendt til denne undersø-kelse. De fleste av serumprøvene var fra pasienter som hadde forskjellige kroniske lidelser. Disse serumprøver var hemolyserte, lipemiske og i mange tilfeller forurenset. Prøvene ble testet som beskrevet ovenfor. Av disse 61 prøver ga bare 1 en positiv reaksjon. Resten var negative.

Ved en annen del av denne undersø-kelse fikk man 49 serumprøver fra et tu-berkulosesanatorium. Tilfellene varierte fra virksom tuberkulose til begynnelsesangrep av tuberkulose. Tilsammen 47 av de 49 prø-ver ga en positiv test og de gjenværende to ga en negativ test. Dette viser mindre enn 5 pst. falske negative resultater.

Eksempel 2.

Test utført på celluloseacetatpapir.

«Oxoid» celluloseacetatpapir (Colab Laboratories, Chicago Heights, Illinois, USA) ble skåret i 2,5 cm firkantede biter, merket og fuktet ved flytning på 0,05 M tris-pufret saltlake, med pH 7,1.

En dråpe av hver farvet antigenfortynning ble anbragt med en engangspipette på 8 forskjellige fordypninger i et plastbrett. En dråpe kanin-antiserum ble samtidig anbragt på hver antigenfortynning og blandet omhyggelig.

Celluloseacetatbitene ble derpå anbragt på glassplater og tørret med trekkpapir for å fjerne overskudd av fuktighet. Fem lambda antigen-antiserumblanding ble anbragt i midten av et celluloseacetatstykke. Disse stykker ble så anbragt i et fuktig kammer ved 25°C i 15 minutter.

Synlige felninger viste seg på celluloseacetatstykkene som mørkfarvede ringer som varierte i intensitet med fortynningen.

Celluloseacetatstykkene ble også inkubert i 2 minutter ved værelsetemperatur uten å anbringe dem i et fuktig kammer med sammenlignbare resultater.

Klinisk bedømmelse.

De samme 49 serumprøver som ble undersøkt i den annen del av eksempel 1, ble testet som beskrevet ovenfor. Tilsammen 47 av 49 ga en positiv test. De gjenværende 2 ga en negativ test. Dette viser mindre enn 5 pst. falske negative resultater.

Foreliggende oppfinnelse skaffer så-ledes en immunologisk test for påvisning av nærvær av immunologiske materialer. Testen avhenger av anvendelsen av et farvet immunologisk materiale, fortrinnsvis et farvet antigen, under betingelser som er egnet for utførelse av den passende immunologiske reaksjon.

Claims (2)

1. Immunologisk testeanordning nyt-tig for påvisning av nærvær av et utfellbart immunologisk materiale i en væske og om-fattende et med et farvestoff farvet, vann-oppløselig, immunologisk materiale, som er homologt med det immunologiske materiale som skal påvises, karakterisert ved at det vannoppløselige, immunologiske materiale er farvet med et azin-farvestoff.

2. Testanordning ifølge påstand 1, karakterisert ved at det immunologiske materiale er farvet med et idulin-eller nigrosin-farvestoff.