JPS5825979B2 - ナイセリア・ゴノロエ抗体の存在を検出する血清学的方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ここに記載する方法は、１９７５年２月２１日出願の米
国特許出願第５５１，９８３号、−１９７５年２月２８
日出願の米国特許出願第５５４，０６１号、１９７５年
２月２８日出願の米国特許出願第５５４．０８７号、１
９７５年２月２８日出願の米国特許出願第５５４，０８
８号、１９７５年２月２８日出願の米国特許出願第５５
４，０８９号、１９７５年２月２８日出願の米国特許出
願第５５４，０９０号、１９７５年２月２８日出願の米
国特許出願第５５４．１０４号に記載した方法に関して
の改良法である。

淋病は合衆国において最も共通した報告価値のある疾病
であって、全世界を通じて大きな問題の一つでもある。

世界的流行病に対する責任あるものとして数個の要因が
示唆されてはいるが、疾病の制御が不首尾に終わるのは
大量予検に適した血液検査が不足していることが最も重
要な要因であると一般的に認められている。

上掲の出願には、熱的に不安定であって人間の血清中の
ナイセリア・ゴノロエ（Ｎｉ ５ｓｅｒｉａ ｇｏｎｏ
ｒｒｈｏｅａｅ （Ｎ 、 ｇ 、 ） 〕抗体と反応
し、それによって、現在又は過去における淋病（ｇｏｎ
ｏｒｒｈｅａ ）感染の存在を検出するナイセリア・ゴ
ノロエ（Ｎ６ｇ、）抗原の生成を発見したことに基く血
清学的試験操作が記載されている。

この操作は高い特異速度（５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｒ
ａｔｅ ）を有し、その方法を自主予検要目に使用する
補助的診断試験として容認せしめるものである。

しかしながら、要求される結婚前の試験における偽陽性
に対する社会心理的反応は非常に不都合であるのでより
一層高い特異性（５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ）を有する
方法が望まれている。

Ｎ、ｇ、抗体についての血清学的試験における偽陽性反
応の危険性は最初に、試験すべき血清をナイセリア・メ
ニンギティデス（Ｎ 、ｍ 、）収着（５ｏｒｂｅｎｔ
）組成物で収着することによって実質的に減少せしめ
ることができることを今回発見した。

この収着剤は血清から存在することのできる交叉反応抗
体のどれでも実質的に除去する。

約６０％の偽陽性反応は、Ｎ、ｇ、抗原組成物がＮ 、
ｍ 、と反応するＮ 、 ｍ 、抗体を含有する血清
との偽陽性結果を与えるかもしれないという事実に起因
することができることが発見された。

本願発明は前述した関連出願に記載し、かつ、特許を請
求した発明に照らして検討することによって最もよく理
解されるであろう。

その記載に従えば、Ｎ０ｇ、有機体、特にＡ、ＴＣＣ２
１８２３、２１８２４および２１８２５が熱的に不安定
であって、かつ、Ｎ、、ｇ、抗原に応じて生成した人間
の血清中の抗体と反応し、これによって現在における、
あるいは過去における淋病感染の存在を示すところの抗
原を生成することが発見された。

Ｎ、ｇ、抗体の存在についての試験に対して抗原を利用
するために、数多くの方法が考えられている。

好適な試験は微生物の懸濁液を利用する免疫蛍光試験法
（ｉｍｍｕｎ ｏｆ １ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔｅｓｔ
ｐｒ−ｏｃｅｂｕｒｅ ）である。

その試験においては、抗原を含有する懸濁液を調製し、
二つの別々の血清試料とともに培養し、抗原−抗体複合
体の生成について試験する。

血清の一方の試料は存在するかもしれない熱不安定な交
叉反応抗体を不活性化する目的で加熱する。

他方の試料は加熱しない。この試験の鍵は淋病感染によ
って生じた抗体が熱安定であって一方交叉反応抗体が熱
不安定であることである。

従って、両方の試験試料との陽性反応はＮ、ｇ、が作り
出した抗体の存在を明示する。

両試料における陰性反応はそのような抗体の存在しない
ことを明示する。

加熱試料との陰性反応と、非加熱試料との陽性反応とが
一緒になったときは自然抗体の存在を明示する。

陽性の抗原−抗体複合体の形成は、現在利用できるどの
方法によっても検出することができる。

一般に、その方法はその複合体を標識した。

（ｌ ａ−ｂｅｌｅｄ）抗人間イムノグロブリン好まし
くはイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ） と培養することで
ある。

重鎖ＩｇＧが好適である。

イムノグロブリンは、例えば検出できる放射性元素、酵
素又は紫外線あるいはその他の特殊光を当てたとき蛍光
を発する化学物質で標識できる。

−の方法では、抗原含有懸濁液の別々の試料をスライド
上に載せ、試験すべき血清（一方の試料は加熱し、他方
は加熱していない）とともに培養する。

このようにして調製した別々の試料を、フルオレスセイ
ン、ローダミン又はオーラミンなどのような蛍光物質で
標識した抗人間ＩｇＧとともに培養する。

この方法について、好適な検出材料はインチオシアネー
トによってフルオレスセインと結合された杭穴間ＩｇＧ
である。

この物質はよく知られており、商業的に入手できるもの
である。

基本的には、先の発明の試験方法は、Ｎ９ｇ。

の生産した熱不安定な抗原と対応する熱安定な抗体との
反応によって形成される結合体を検出することから成る
ものである。

検出は化学的又は物理的方法によって検出されうる元素
あるいは化学的物質によって標識された抗原又は杭穴間
ＩｇＧとの反応を利用することによって好適に行なわれ
る。

こうする代りに、抗原を担体に吸着せしめた後、反応を
起させることによって検出することもできる。

適当な担体としては、例えばポリスチレン・ラテックス
のような種々のポリマー樹脂、ベントナイト又は木炭、
コレステロール、レシチン又は赤血球が包含される。

吸着剤に吸着された抗原よりなる粒子を試験すべき血清
と混合し、凝結（ｆｌｏ−ｃｃｕｌａｔｉｏｎ ）又は
凝集の有無に留意する。

この方法の感度は粒子を洗浄して未反応蛋白質を除去し
、つづいて杭穴間Ｉ ｇＧ、を加えることによって向上
することができる。

陽性反応は凝集塊を与え、方、陰性反応においては抗原
被覆粒子は均一に分散したままである。

上述したように、懸濁液による好ましい検出方法は蛍光
法である。

しかしながら、杭穴間ＬｇＧも防射性元素または酵素で
標識することができる。

放射性標識は現在利用できるいずれの測定方法によって
も検出することができる。

好適な同位元素標識は１４Ｃ、１３１１、１２５■およ
び３５Ｓである。

酵素標識は現在使用されるどのような比色、分光光度、
蛍光分光光度あるいは気体定量技術によっても検出する
ことができる。

酵素はカルボジイミド、ジイソシアネート、ゲルタール
アルデヒドなどのような架橋分子との反応によって杭穴
間ＩｇＧと結合される。

これらの方法に使用することのできる多くの酵素が知ら
れており、利用することができる。

好ましいものとしては、パーオキシダーゼ、β−グルク
ロニターゼ、β−Ｄ−グルコシターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼプラ
ス・パーオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ・プ
ラス・パーオキシダーゼ、及び酸性ホスファターゼがあ
る。

ＡＴＣＣ２１８２３，２１８２４，２１８２５について
の分類学的記載（ＡＴＣＣＡはアメリカンタイプカルチ
ュアコレクションにおける寄託番号を示す。

）目：オイバクテリアレス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｌｅ
ｓ ）科：ナイセリセ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ ｃｅａｅ
）属：ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ）種：ゴノロ
エ（Ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ ）形態学：通常０．６Ｘ１
．０μであり、大きさがより均一である隣接面が平らな
りラム陰性の 現状又は桿状双球菌。

生化学的性質及び培養： 好気性、最大増殖には４−１０％ＣＯ２及び８６℃での
培養を要求される。

培養菌はチョコレート寒天上でゆっくりと増殖し２４時
間後小さなわずかに見えるコロニー（直径０．１ ｍｍ
）を作り、４８−７２時間培養では典型的な形態を示
す。

コロニーは小さく直径１．Ｏｎで、灰白色、透明、平滑
であり、丸い外周および光沢ある表面を有し酪酸様稠度
を備えている。

Ｂ−１０９４はやや大きなコロニーを作りより速く増殖
する。

オキシダーゼ＋、カタラーゼ＋；グルコースを発酵させ
るが、マルトース、ラクトース又はスクロースは発酵さ
せない。

抗原性：３つの分離物（１ｓｏｌａｔｅ ）の全ては熱
不安定なＬ″という共通の抗原を有する。

病原性：３つの菌株はいずれも初めから特徴的な淋病患
者から隔離した。

本発明の方法においては、試験すべき血清は生理的食塩
水に稀釈率約１＝２から１ ： １０００で稀釈し、懸
濁液を約５６℃から６５℃、好ましくは５９℃に、約１
５分から４０分、好ましくは約３０分間、熱不安定な自
然抗体を不活性化するため加熱し、その後加熱した血清
をＮ、ｇ、の培養菌が生産した抗原とともに培養する。

熱不安定な抗原は前もって検出あるいは報告されていな
い。

凝集試験にとって、好ましい比はその範囲の低い方の端
部にあり、あるいは一様に稀釈されない。

放射線免疫検定にとって好ましい比はスケールの高い方
の端にある。

蛍光試験にとって好ましい比は１：１０より１＝４０ま
でである。

前もって記載した発明の抗原スライドの調製のためには
、Ｎ、ｇ、細菌の新しい分離物を凍結乾燥するか、ある
いは液体窒素に氷結する。

それらは必要に応じてうさぎ血液培地（表出）を含むチ
ヨコレート寒天上で再生させ、必要に応じて植え継ぐ（
５ｕｂｃｕｌ ｔｕｒｅ ）０半固体培地（表■）中で
の維持培養は生存力を維持するために月に１度植え継ぐ
ことができる。

培養は必要に応じて適当な増殖培地、好ましくはチョコ
レート寒天（うさぎ血液）スラントに植え継ぎ、約３４
℃から３８℃、好ましくは３５℃から３７℃で約１８か
ら２４時間通常Ｃｏ２（４−１０％）大気中で培養する
。

菌は３５８Ｃより意義ある程度に低い温度では認めうる
ほと増殖せず、約３８℃以上では死んでしまう。

１８時間以内では増殖量は実用には少なすぎて実用的で
はなく、２４時間以後では利用できる抗原が序々に減少
する。

好ましくは懸濁液はダラム染色及び増殖培地上の線条（
ｓｔｒｅａｋｉｎｇ ）により純度及び典型的形態を検
討する。

増殖菌を生理的食塩水にｍｌ当り約１０５から１０９の
菌濃度で懸濁する。

蛍光テストにとって好ましい濃度は３ Ｘ １０６ない
し４Ｘ１０６である。

凝集と酵素試験にとって好ましい濃度はｍｌ当り１０８
オーダーの菌である。

標準の抗原スライドはＮ、ｇ、菌の生理的塩類の懸濁液
で１７７１１当り３−４Ｘ１０６菌の濃度のものの１滴
（約０．０５ｍ１）を置き乾燥し固定した場合のスライ
ド標本である。

懸濁液の小滴を清潔な蛍光抗体スライドの各端部にのせ
ループで塗り付ける。

スライドを空気乾燥し、固定し、蒸溜水で洗って標準抗
原スライドを作る。

スライドは、もし約−２０℃で維持されるのであれば、
１から３％ホルマリン固定の後、あるいは固定すること
なく、６週間までの間安定である。

それらは凍結乾燥でき、そうすれば室温２から３力月の
長い間有効性が保持される。

約１０℃の冷蔵庫温度に、好ましい固定剤はｐＨ７，６
のリン酸緩衝食塩水中１０％ホルマリン、９５％エタノ
ール、氷酢酸を１０：９０：５の割合で含むものである
。

この試薬で固定した懸濁液は、さらに長期間、３ケ月以
上も安定である。

冷凍温度においては、無水塩化カルシウムのような乾燥
剤の存在によりその安定性を増強することができる。

上述した蛍光法において使用する場合、抗原スライドに
試験すべき血清の稀釈試料を塗る。

血清は生理的食塩水で１：１０から１：４０に稀釈する
。

稀釈血清は、約０．５ｍｌの２試料に分け、一方の試料
を好ましくは５９℃で３０分間加熱する。

加熱稀釈血清の一滴をスライドの一端の懸濁液に加え、
非加熱稀釈血清の一滴をスライドの他端の懸濁液に加え
る。

それからスライドを湿潤箱、好ましくは約２２℃から３
７℃の水蒸気で飽和した箱の中で約１５から３０分培養
する。

箱からとり出し、試料を緩衝食塩水でよく洗い、抗原ま
たは細胞に結合しない血清蛋白質を除く。

適当な緩衝液はｐＨ７，５から７．７の標準リン酸緩衝
液である。

洗滌は、好ましくは、はじめ緩衝液に数回浸し、つきに
、新らしい緩衝液に約１０分浸し、最後に、洗滌水で洗
うことによって行なわれる。

それから、適当には、吸収口紙でしずかに吸い取ること
により、スライドを乾燥する。

乾燥した塗抹物を蛍光イソチオシアネートと結合した杭
人間ＩｇＧで約２０分開渠色する。

特殊結合体の稀釈率は各試料によって異なるので、既知
コントロールとの滴定によって最適に決定する。

それからスライドをｐＨが約８．５から９．５、好まし
くは９．０のグリセロール−炭酸塩−重炭酸塩緩衝液の
中に浸す。

多くの浸漬液組成物のどれもが使用できるが、それらは
最小の自動蛍光を有するように選択すべきである。

蛍光の強さは、蛍光顕微鏡、典型的にはＨＢＯ−２００
光源、３−關ＢＧ−１２励起フィルター、ＢＧ−３８赤
色吸収フィルター、ＯＧ−接眼フィルター、暗唱コンデ
ンサー、ｉｏｏ倍油浸対物レンズを備えたライフ（Ｌｅ
ｉｔｚ）蛍光顕微鏡で測定する。

加熱血清試料で染色した塗抹物の蛍光を非加熱血清で染
色した塗抹物のそれと比較する。

非加熱血清について１−２＋蛍光またはそれ以上を示し
加熱試料において全く、あるいはほとんど蛍光の減小が
ない試料は陽性と考える。

Ｎ、ｇ、増殖菌、特にＡＴＣＣ２１８２３゜２１８２４
、又は２１８２５の懸濁液の凍結乾燥物は抗原の特に
有用な源である。

それらは次のような方法で調製することができる。

Ａ 減菌ミルク中濃懸濁液を調製して〔脱脂粉乳ＩｏＯ
ｇ−ボルチモア・バイオロジカルラボラトリーズ（Ｂａ
ｌ ｔｉｍｏｒｅ Ｂ ｉｏｌｏｇｉ ｃａｌ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒ−ｉｅｓ ）−を５０℃に前加熱した水１
１に加える７１１３℃から１１５℃で２０分間減菌する
〕、５％うさぎ又は馬血液を加える。

Ｂ ミルク懸濁液を作るため、毛管ピペットを使って０
．５ ｍｌのミルクで培養スラントを洗い出す。

番号を記した試験管の底に２滴の培養懸濁液を分配する
。

ＣＯ，０５ｍ１以下の懸濁液を６−６−７Ｘ１００の綿
栓試験管の底に分配する。

Ｄ 綿栓を除き試験管を真空ポンプに接続するゴム管に
挿入し、つぎのことを確認する： （１）綿栓はすべて減菌容器へ直接捨てたかどうか。

（２）接続した試験管はすべて培養を含むかどうか。

Ｅ 試験管を傾けながらドライアイスおよび９５％エチ
ルアルコールの浴に入れ、幾分の懸濁液を乾燥すべき大
部分の物質の数ミリ上のガラス壁に付着させる。

Ｆ ポンプの多岐管に接続し、圧力が迅速な乾燥のため
に充分になるまで、融解が起きないように培養を凍結槽
の中または近くに置く。

凍結乾燥物は、患者の血清中の熱安定なＮ、ｇ。

抗体と反応し、抗原−抗体複合体を形成する熱不安定な
抗原の存在によって特徴づけられる。

それらは、これまで述べたどの種類の試験方法にも使で
きる故、特に有用である。

それらは、例えば、生理的食塩水に溶かすことができ、
懸濁液を上述した蛍光法において使用する。

当業者には容易に明らかになるように、それらは酵素法
および放射法においても有用である。

本発明の方法を細胞懸濁液で酵素試験法へ適用するには
杭穴間ＩｇＧを西洋わさびのバーオキシターゼのような
酵素で標識することにより行なわれる。

抗原−抗体結合体は、上述のような加熱血清試料及び抗
原懸濁液から調製する。

試料を標識した杭穴間ＩｇＧと培養し洗浄して可溶性蛋
白質を除く。

洗浄物をＯ−ジアニシジン及び過酸化水素のような物質
と混ぜる。

約３から５分後、数滴の６Ｎ硫酸を加えて反応を止める
。

光学的濃度（０ｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉ ｔｙ ）を４
００ｎｍで測定する。

活性のある血清は同様に処理した陰性コントロールより
も高い光学的濃度によって示される。

他の酸、例えば塩酸は反応を止めるのに用いることがで
きる。

この事実において、光学的濃度の好ましい読みは４００
ｎｍ以外であるかもしれない。

放射免疫検定法においては、杭穴間ＩｇＧ又は抗原を標
準法に従って、選択した同位元素で標識し、患者の血清
および抗原−抗体複合体と反応させ、標準的器具を使用
して測定する。

本発明の方法は、上述の通り、抗原細胞懸濁液にも応用
せられる。

細胞懸濁液においては、蛍光法が好ましい方法である。

この方法は、上述の通り利用するとき、細胞の形態によ
るもので、当業者によって認められるものである。

本発明のその他の更に好ましいことは、純粋化された抗
原または抗原組成物が用いられることである。

これらの材料によって上述のすべての一般方法がまた応
用される。

純粋化された抗原または抗原組成物を用いることは細胞
懸濁液の使用より好ましいことである。

それは、この結果が一般的に更に再生的であり、その方
法かより容易に自動化されるからである。

更に蛍光法は、これらの材料に応用される場合は、細胞
懸濁液の場合のように主観的でなく、むしろ客観的であ
る。

それはその結果が既知の濃度の抗原と抗体を含有するコ
ントロールと比較して測定されるからである。

現在抗原純化と抗原組成物の製造のための好ましい方法
では、選択されたＮ、ｇ、のストレーン（５ｔｒａｉｎ
）は適切な媒体上にて育成せられる。

媒体としてはラビット・チョコレート寒天培地が好まし
い。

育成された細胞は薬用塩の液中に懸濁され、無菌のガー
ゼを通して済過する。

この間および抗原または抗原を含有するフラクションに
関するすべての後の取扱い方の間において、特に記さな
い限りその液、懸濁液等は約５℃〜１０℃に冷却してお
かれる。

済崩上の残渣を生理学的塩にて洗滌し、約１０．００Ｏ
ｒｐｍにて約１５分間遠心分離器にかける。

遠心分離された物質はデカンテーションされ、上澄液は
捨てられる。

沈澱物は生理的塩中に再懸濁され、貯められそして遠心
分離により洗滌せられる。

抗原はラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコ
ール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、または類似物
質のような陽イオン性清浄剤にて抽出することができる
。

本発明の熱不安定性の種特異性抗原は、プロナーゼ、ト
リプシンまたはキモトリプシンのような蛋白質酵素にて
通常の方法で培養せられるとき不活性であるという事実
によって証明せられるように、天然の蛋白質である。

これらの抗原は、また水溶液媒体中に５までのｐＨにて
懸濁することにより不活性となる。

しかし、これらはｐＨ７あるいはそれ以上では水溶液媒
体中にて安定している。

抗原は精製の程度が増すにつれて一層熱安定化するが、
一般的には約５６℃にて約３０分間加熱することにより
不活性となる。

抗原はデオキシ核酸やリボ核酸を含まない。

それは相当するアシダーゼにて培養されるとき、その安
定性によって立証せられる。

これはリパーゼやデクストラナーゼによって影響を受け
ない。

これはノイラミニターゼに安定であるのでノイラミン酸
ではない。

これはリソチームによって不活性にならないので、細胞
壁ユニット（ｍｕｒｉｎｅ ）でもない０ 純粋化抗原は、上述の方法によってつくることができ、
また、本発明のプロセスにおいて使用し得るが、このこ
とが必ずしも必要でなく、また好ましいことではない。

その理由は比較的多量の、外部からの蛋白質のような不
純物を含んでいる抗原組成物でも用いることができるか
らである。

特別の組成物の抗原的活性は前に定義された標準抗原ス
ライドを参照することにより抗原ユニットの見地から定
義することができる。

抗原ユニットを測定する方法は少し説明することが必要
である。

細胞懸濁液に関し用いられ、かつ上記に詳述されている
好適な蛍光試験を妨げるのは特別な組成物の能力に基ず
く。

上述のごとく、細胞懸濁液による蛍光法は細胞の組成に
依存している。

更に、特に蛍光法は、もとのままの細胞に対する抗原の
形態学的局所限定に依存する。

試験の最適条件は完全な細胞が残るとき、効を奏する。

本発明による純粋化のすすむに従い、抗原は次第に細胞
から分れる。

そこで組成物は細胞組織に依存する蛍光試験のタイプに
は次第に適さなくなる。

純粋化の初期の段階においては、比較的多量の蛋白質、
例えば細胞の破片がある。

そして、それは組成物中において、事実上抗原的ではな
い。

この物質は抗原ユニット値に寄与しない。

純粋化がすすむにつれて、外部蛋白質が除かれ、抗原ユ
ニット値が急速に増加する。

注意深く純粋化をすすめることにより、抗原ユニット値
がｔｏ−２０，０００単位／ｍ９蛋白質またはそれ以上
である製品を得ることができる。

しかし、少なくとも１００の値をもつ生成物は蛍光試験
、酵素試験、放射線免疫検定法、凝集法において人間血
清中のＮ、ｇ、抗体の存在を決定するのに用うろことが
できる。

しかし、少なくとも１０００位の値が好ましい。

次の定義はこの観点における発明の理解を助長せしめる
であろう。

結合単位（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｕｎｉｔ ） （Ｃ，
Ｕ、 ）これは０．０５ｍ１のアリクォーツ（部分標本
）においてフルオレセイン結合抗人間ＩｇＧが過剰の特
殊抗体にて染色された標準抗原スライドに加えられたと
き、４＋蛍光を与えるようなフルオレセイン結合坑人間
ＩｇＧの最高の稀釈塵である。

抗体単位（Ａｎｔｉｂｏｂｙ Ｕｎｉｔ ） （Ａ ｂ
、 Ｕ、 ）これは熱不活性血清が標準抗原スライドを
染色するのに使用され、かつ ２ Ｃ，Ｕ、 ７０．０５ｍｌを含むように適当に稀釈
したフルオレセイン結合抗人間ＩｇＧにて対比染色され
るとき、４＋蛍光を与えるような熱不活性血清の最高稀
釈塵である。

抗原単位「（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｕｎｉｔ ） Ｊ （Ａ
ｇ、 Ｕ、 ）これは抗原標本をＩ Ａ ｂ、 Ｕ、
７０．０５ｍｌを含むように稀釈された熱不活性血清
と反応せしめるとき、この活性単位を吸着し、この吸着
された血清が標準抗原スライドを染色するのに使用され
、２ Ｃ，Ｕ、 ７０．０５ｍｌを含むように適当に稀
釈したフルオレセイン結合抗人間ＩｇＧにて対比染色さ
れるとき１＋に影の蛍光を与える全体の部分的に純粋化
した、またはμｇ蛋白質として表わされる純粋の前記抗
原標本の量と定義される。

抗原単位は抗体１単位を吸収する物質の最小量である、
抗原蛋白質標本の純度は直接には蛋白質の１ｍｇ当りの
抗原単位数に比例するものと認められる。

本発明の抗原組成物は、細胞または微生物懸濁液に関す
る上述の試験全部に用いることができる。

その方法は一般に同じである。

例えば、抗原組成物はスライド上の試験血清中のＮ、ｇ
、抗体と反応することができる。

そしてその結果上じた複合体は蛍光薬品で標識されたＩ
ｇＧにて培養せられる。

そうする代りに、ＩｇＧは上述の酵素または同位元素で
標識することができる。

上述の凝集反応試験の方法は懸濁液が純化抗原または抗
原組成物と置き替る以外は同じである。

本発明の抗原または抗原組成物は、微粒担体または基質
に結合または吸着されたとき、特に有効であるというこ
とが観察された。

かような物質は抗原−抗体反応に影響を与えない。

これらの物質は、分類された化合物との続いて起る反応
にも影響しない。

ポリスチレンのような重合物、ガラス、シリカ、ベント
ナイトまたは木炭のごとき無機物、セファローズ、セフ
ァデックスまたはセルローズのような繊維物質を含め、
非常に広範囲のどのような担体も使用できる。

赤血球細胞（Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓ ）のごと
き生物担体もまた用い得る。

特種のＮ、ｇ、抗原を非抗原担体に結合させるため部分
的に純粋化した、または純粋な、少なくとも蛋白質１１
００Ａ、Ｕ、／４を含む抗原標本と、例えばｐＨ８のｏ
、ｉモル燐酸緩衝液中のＤＥＡＥ−セルローズのごとき
選択された担体の同容積を混合し、一昼夜冷却する。

粒子を済過によって回収し、追加の緩衝液、例えばｐＨ
７，０の０．３モル燐酸緩衝液にて洗滌し、更に再び１
％アルブミンを含むｐＨ７の０．１モル燐酸緩衝液にて
洗滌する。

洗滌した結合物はもとの抗原液の容積に等しい容積で１
％アルブミンを含むｐＨ７の０．１モル燐酸緩衝液中に
再懸濁される。

抗原−担体結合物は上述の方法で酸素免疫検定法または
放射線免疫検定法に用いることができる。

これらの結合物が試験法に用いられるときは陽性試験と
陰性試験との間に明瞭な相違が生じ、試験機の読みに背
景子供がないということが認められた。

次の実施例は先の発明についての一観点の方法を例示の
ために示すものである。

間接免疫蛍光抗体試験 抗原の調製 ■ 適当な抗原プロフィルを有するＮ、ゴノロエ（Ｎ
、 ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ）、または標準菌株の凍
結乾燥サブカルチャーの新しい分離物を維持培地（表■
）で別に培養する。

培養菌を４−１０％ＣＯ２大気中３７℃に保ち、月に一
度新しい維持培地で培養する。

２ 菌株を必要に応じて新しく作ったチョコレート寒天
斜面培養（うさぎ血液）（表■）に培養する。

３ スラントを３６℃で１８−２４時間培養し、増殖菌
を生理的食塩水に懸濁し３−４×１０６菌数／７７１１
に調整する。

４ 懸濁液の小滴をアルコールで洗滌した蛍光体スライ
ドの各端部にのせループで塗りつける。

５ スライドを空気乾燥し、１％ホルマリン中で１０分
間固定する。

６ スライドを蒸溜水で１０回洗い、空気乾燥し、使用
するまで一２０℃に保存する。

患者血液の調製 １ 患者血液を生理的食塩水に１：ｌＯで稀釈する。

２ １：１０稀釈液０．５ ｒｕｌを５９℃温浴中で３
０分加熱する。

染色 ■ スライドを使用する１ｏ−１５分前に冷蔵庫から取
出し、患者の名前または番号を記す。

２ 加熱稀釈血清を一滴調製した抗原スライドの一端に
小せ、非加熱血清を一滴他端にのせる。

３ 湿潤相中室温で２０分間培養せしめる。

４ ０．１Ｍリン酸緩衝食塩水ｐＨ７，６で、すばやく
１０回洗う。

５ 同じ緩衝液の新鮮な浴で１０分間洗滌する。

６ 蒸溜水で１０回すすぎ、しずかに吸いとって乾燥す
る。

７ フルオレツセインインチオシアネートの結合した杭
穴間イムノグロブリンＧの稀釈液で２０分間開渠し、前
のような洗滌順序（工程４から６）を行う。

８ スライドをグリセロール−炭酸塩−重炭酸塩緩衝液
ｐＨ９，０の中に浸す。

読み取り スライドをＨＢＯ−２００光源、３ｍｍＢＧ−１２励起
フイルター、ＢＧ−３８赤色吸収フィルター、０Ｇ−１
接眼フイルター、暗唱コンデンサー、１００培油浸対物
レンズを備えた蛍光顕微鏡で調べる。

結果の判定 加熱血清試料で染色した塗抹物中の細菌細胞の周囲の蛍
光の程度を非加熱血清で染色した塗抹物のそれと比較す
る。

■−２＋蛍光またはそれ以上を示し、加熱後も全く減少
しないか、又はほとんど減少しない試料は陽性と考え、
現在又はつい最近までの感染を示していると判断する。

次の実施例は精製したＮ、ｇ、抗原組成物の調製を示す
ものである。

抗原組成物の製造 上述の例示的方法の工程２からの細胞増殖を生理的塩の
液中に取入れ懸濁する。

それから選別布を通して５−１０℃の温度にて流過する
。

この温度は次の段階を通して維持する。

済過器上の残渣は２回生理的塩液にて洗滌し、濾過液を
１０．００ Ｏｒ、ｐ、ｍにて１０分間遠心分離機にか
ける。

沈澱は生理的塩液中に再懸濁し、一回遠心分離によって
洗滌する。

抗原を含む沈澱を秤量し、湿潤重量を計算する。

生理的塩中の０．３％ＳＤＳの６．０ ｍｌの全量を遠
心分離よりの沈澱物にバクテリア沈澱の湿潤重量１ｇ毎
に加える。

そして、その混合物を室温にて１０分間培養する。

この混合物を１０．００Ｏｒ、 ｐ、 ｍにて１０分間
遠心分離機にかけ上澄みを集める。

沈澱物を生理的塩液中のｏ、ｉ％ＳＤＳの６．０ｍｌ／
ｇｍにて処理する。

混合物を室温にて１０分間培養し、前のように遠心分離
機にかけ、第２回目の上澄みを集める。

２つの表面に上澄みを再び遠心分離し、細胞や大きな断
片を除きプールする。

この点において抗原単位値は蛋白質１■あたり１００−
２００Ａｇ、、 Ｕ、である。

プールされた表面に浮んだものをアミコン・メンブレン
（Ａｍ１ｃｏｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ）ＸＭ １００を
使用して濃縮し、セファローズ４Ｂによるカラム・クロ
マトグラフににかけ、ｐＨ７，６の０．００２モル隣酸
緩衝液にて溶離（Ｅｌｕｔｅ）する。

適当な分別外（通常５−１５−１Ｏを集め、蛋白質濃度
をローリ−法（Ｌｏｗｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ）に
よって監視する○最良のＡｇ、Ｕ、値をもつ抗原組成物
は蛋白質の５−１０％にて作られた最初のピークの中に
発見される。

新鮮な標本で、値は１１０００−２０００Ａ、Ｕ、／■
である。

上記にて言及した表について次に掲げる。

寒天を半分の水にオートクレーブにかけて溶かし、残り
の水にゼラチン、塩、ペプトン、澱粉を加熱して溶かす
。

両方を合わせ、全重量とする。ｐＨを７．４−７．６に
調整する。

綿で濾過する。回収酒液の重量を計り、指示薬及び炭水
化物を加える。

２、５１１Ｌｌ量を１１Ｘ７５關試験管に分配し、１１
５°Ｃで１２分間オートクレーブにかける。

栓をしパラインフュージョンを含まず凝固血液を含むグ
ルコース寒天〔ナイセリア・ゴノロエ（Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａｇｏｎｏｒｒｈｐｅａｅ ）及びナイセリア・メニ
ンギテイデス用〕。

寒天を半分の水にオートクレーブにかけて溶かし、残り
に塩、ペプトン、グルコースを加熱して溶かす。

両方を合わせｌｋｙとし、ｐＩ（を７．４−７．６に調
整する。

１５００ｍｌ量を３１標準ロフラスコに分配する。

３０分オートクレーブにかけ保存する。

必要に応じて寒天ベースを融かす。

ガラス蓋付ペトリ皿中で１５−２０ＴＬｌ量に無菌的に
血液を混合する。

培養することなしに使用する。寒天をオートクレーブに
かけて水に溶かし、ペプトンおよび塩をインフュージョ
ンに溶かす。

両方を合わせる。

全重量までにする。ｌＮＮａＯＨでｐＨ７，５に調整す
る。

アスペレーションによって流過する。

普通４００ｍ１量を２１フラスコに分配し、３０分オー
トクレーブにかけ、保存する。

寒天ベースを融かし５０℃に冷却する。腹水を５０℃に
温め無菌的に合する。

よく混合し無菌的に４−７ＴＬｌ量を１５Ｘ１２５關試
験管に分配する。

培地を無菌的に約４７７１１の滅菌鉱油で被う。

真直ぐに立てて冷却する。３５°Ｃ−３７℃で４８時間
、及び２０°Ｃ−２７℃で９６時間培養する。

点検して保存する。本願明細書の大部分は先に記載した
発明についての完全な記載に割り合てられている。

この理由は、本願にて記載し、かつ特許を請求する発明
は全く新規な発明であるけれども、その発明は先の発明
の改良として有用だからである。

先の発明に適用されうる抗原−抗体複合物を検出するた
めに使用される種々の技術もまた本発明に適用されうる
。

先の発明のＮ、ｇ、抗原組成物は本発明についても用い
ることができる。

前述の通り定義した抗原スライドを用いることができ、
たたし本発明の方法では改良された感度があるが故に、
スライド当り二つの抗原組成物でもってスライドを調製
することは必須ではない。

上述したいろいろな試験における重要な工程は、試験す
る血清を５６℃ないし６５℃で加熱し、交叉反応熱不安
定抗体を不活性化することであることは判るであろう。

一つのクラスの交叉反応抗体は熱処理を受けても生存し
続けることを今回発見した。

このクラスのものはＮ、 ｍ、と交叉反応性の抗体であ
る。

これらは上述したＮ、ｇ、抗原組成物によって試験する
とき交叉反応するので、偽陽性反応を招来する。

実際のところ、先の試験方法に伴う偽陽性反応の数は自
主的検査プログラムにて十分許容されうる制限内にある
。

しかしながら、偽陽性反応に伴う心理的ショック、特に
個人が結婚のための法的に要求される検査を受けるとき
のショックはその検査の感度が幾分か落ちるとしても偽
陽性反応の数を最少限に減少することを要求する。

交叉反応の事実は、Ｎ、 ｇ、抗体、Ｎ、ｍ、抗体のい
ずれか、又はその両方を含むことが知られている血清を
、上述したＮ、 ｇ−抗原組成物又は上述のように一般
的に調製したＮ、 ｍ、抗原組成物との試験に用いて、
発見された。

Ｎ、ｍ、と反応するいくつかの抗体はＮ、 ｇ−抗原と
反応して、患者が淋病に感染しているか、あるいは細菌
学的試験および臨床的所見によって明らかにされるよう
な感染が全くなかったか否かに抱らず、陽性結果を示す
ということが観察された。

従って、Ｎ、 ｍ、収着組成物として記載するＮ、ｍ。

抗原組成物を試験すべき血清との初期反応用に調製した
。

この方法によって、血清中のどのような交叉反応抗体で
も収着組成物に結合され、あるいは収着されることであ
ろう。

収着剤と血清とで生ずる混合物を上述したようにして調
製したＮ、 ｇ−抗原組成物とともに培養して偽陽成反
応の危険性を最少限に減少せしめることができるであろ
う。

本発明の実施例に用いるＮ、 ｇ−抗原組成物はそれら
のどれでもよく、その調製法については上述した。

好ましくは、Ｎ、ｇ、抗原組成物は少なくとも１００
Ａｇ、 Ｕ、／■蛋白質のＮ、ｇ、抗原単位値を有する
。

理想的には、１０００またはそれ以上の値である。

そのような組成物は上述したように抗原スライド上であ
ることができ、細胞懸濁液又は凍結乾燥組成物であるこ
とができる。

同様に、Ｎｏ ｌＴｌ−収着組成物は細胞懸濁液である
ことができ、スライド上であることができ、凍結乾燥さ
れていることができ、あるいはポリスチレン、ガラス、
シリカ、ベントナイト、木炭、セファローズ、又はセフ
ァデックスのような上述したとの担体にも吸収された抗
原を含有することができる。

便宜上、組成物は収着単位の点において定義することが
できる。

蛋白質１ｍｇ当り５０ないし１０．０００収着単位を含
有する組成物が本発明の実施に有効である。

収着単位（ＳＵ）は、Ｎ−ｇ−およびＮ、 ｍ、の適当
な血清グループのそれぞれの１抗体単位を含有するよう
に稀釈された熱不活性血清と反応せしめるとき、Ｎ０ｇ
、ではなく、Ｎ、ｍ。

との反応性を有する抗体を吸収する、ｍｇ、蛋白質とし
て表わされる部分的に純化した、又は純粋なＮ、 ｍ、
抗原標本の全部の量として定義される。

この吸収された血清をＮ、 ｍ、スライドを染色するた
めに使用し、２結合単位７０．０５ｍを含むように適当
に稀釈された、フルオレスセイン結合抗人間ＩｇＧで対
比染色するとき、その血清は１十に蛍光陰影を与えるが
、同じ吸収された血清をＮ、ｇ、スライド染色に用いる
ときは、３−４＋の蛍光が観察される筈である。

収着剤の最適稀釈は採用する方法、例えば、放射線免疫
検定法、酵素検定法、凝集反応法又は免疫蛍光吸収テス
トによって変りうる。

その最後に述べた方法の場合には、０．２７７１１の熱
不活性な患者の血清と混合される０、５収着単位／ ０
．２ ｍｌを含む稀釈の場合に、最良の結果が得られた
。

収着組成物は血清グループの一つ又は全てからの抗原を
含むように調製することができる。

もし組成物が−のグループ以上からの抗原を含む場合に
は、一般的に上述したような方法によって別々に調製し
、適当な割合で混合して所望の実用収着剤を製造するの
が最適である。

知られているように、一つ又はそれ以上の特定血清グル
ープに起因する感染は特定の地理的地域において幾分流
行的である。

よって、北西部の合衆国においては、血清グループＡ、
ＢおよびＣに伴う感染はその他の血清グループに伴うも
のよりも一層普通である。

Ｎ、 ｍ、抗原収着組成物を特定地域の要求に対して仕
上げることができるのは本発明の特別な有利点である。

よって、組成物は別別のグループからの一つ又は複数の
抗原を含有することができる。

均一性のために、最終収着組成物における各血清グルー
プの濃度は約０．３ないし０．６ Ｓ Ｕｌｏ、 ２１
ｎｌの稀釈である。

臨床的および細菌的判定基準によって陽性および陰性と
された個人からの血清を含む５００以上の血清による免
疫蛍光技術によって得られる試験結果から、偽陽性反応
の数を５８％程の多くまで減少させる（２＋又はそれよ
り高いものを４２％減少させる）ことができ、ボーダー
ラインの反応を先に述べた方法に比して７５％減少させ
たことが判った。

このことは顕著な結果であって、前述の試験の感度は８
１％であり、特異性は無症候性女性の目標集団（１１，
８００人の女性を含む野外評価）において９３％（７％
の偽陽性反応、および９−１０％のボーダーライン反応
）であると考えられる。

次に、下記表■にナイセリア・ゴノロエ（Ｎｅ−１ｓｓ
ｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ）抗体の力価に関
する温度の影響を示す。

典型的な試験において患者から４血清及び非感染対照か
ら４血清が燐酸緩衝塩中で１：５乃至１：８０の２倍の
増加で順次に稀釈された。

稀釈血清は１０〜７０℃の温度で３０分までの時間培養
した。

７０℃で１０分またはより以上の時間培養すると活性が
完全に消失した。

（表Ｖｌ）Ｌかし５９℃で３０分の培養は患者血清と普
通血清との間で差異が生じた。

この処理は普通血清のあるものにおける１：１０稀釈で
みられた蛍光を消去した。

患者血清の同じ処理は力価の低減を生じなかった。

しかし蛍光度において最少限の減少がみられた。

然し乍らこれらの血清における抗体は６５℃に加熱する
ことにより顕著に減少し、７０℃で完全に不活性化した
。

これらの実験は加熱不活性化血清の１：１０稀釈におい
て２千蛍光より以上が感染の敏感な特定的表示であるこ
とを示した。

尚、この試験の培養時間は３０分であるが、培養時間が
１５分の場合にも実質的に同じ結果が得られるだろう。

次の実施例は非限定的なものであって、例示のためにの
み示す。

実施例 Ｉ Ｎ、 Ｍ、収着組成物 Ｉ Ｎ、メニンギテイジス血清グループＡのｆｉ収収
給組成 物 収着剤の調製 １ 標準参照菌株〔異なる血清グループ ＡＴＣＣ１３０７７，１３０９０，１３１０２゜１３１
１３）、並びに社会に流行するかもしれない新たに報告
された血清グループについて〕を代表するＮ、メニンギ
テイジス菌株を凍結状態の維持培地（表■）から、ある
いは液体窒素中に氷結された培養から適当な培地、好ま
しくはチョコレート寒天板（うさぎ血液）（表■）へ移
して培養する。

２ 代表的なコロニーを使用してチョコレート寒天斜面
培養する。

３ スラントを３６°Ｇで１８−２４時間培養し、増殖
をダラム染色によって純度について観察する。

４ 純粋な培養を交叉反応抗原の存在について次のよう
に試験する。

１ 細胞を生理的塩水中の２％スクロース（Ｗ／Ｖ）お
よび０．２％ゼラチン□□□／′Ｖ）を含有する媒質中
に懸濁し、凝集塊を穏 やかに破壊し、懸濁液の濃度を標準濃度 １×１０８細胞／ｒｎｌに等しい濃度に視覚によって調
整する。

１１ 懸濁液の小滴を清浄な懸微鏡スライド（１０ス
ポツトマスクしたスライド）上 に載せ、５間ループで拡げる。

１１１ スライドを空気乾燥し、２％緩衝剤ホルマリ
ン中に１０分間固定し、蒸留水中 に３回浸して洗浄し、４分間新しい水浴 中ですすぎ、排水し、吸い取って乾燥す る。

（■ 知られている陽性患者の血清をコントロールとし
て用いる。

実用の稀釈は良好なＮ、 ｍ、およびＮ、 ｇ−抗原ス
ライドにて３−４＋蛍光を与えるものである。

■ コントロール血清を適当な稀釈に稀釈し、３０分間
５９℃の水浴中で加熱する。

ｖｌ 加熱血清の一滴を各抗原スポットに適用し、ス
ライドを室温で２０分間湿潤室 で培養する。

Ｖｌ＋ スライドをｐＨ７，５の０．１ Ｍリン酸緩
衝剤塩水中で速やかに１０回洗浄し、１０ ０分間新いＰＢＳ中におき、蒸留水中で １０回すすぎ、穏やかに吸い取り乾燥す る。

ｖｉｉｉ フルオレスセイン・インチオシアネート結
合抗人間ＩｇＧの実用的稀釈の一滴 を各スポット上に２０分間おき、つづい て前（工程ｖ＊−ｖｒｒ）のように洗浄および乾燥する
。

ＩＸ スライドをグリセロール−炭酸塩−重炭酸塩緩
衝剤ｐＨ９，０中に固定し、蛍光顕微鏡にて検査する。

我々の研究に用いた顕微鏡はライフ紫外線顕微鏡（オル
トプ ラン）であり、プロエム反射光システム、ＨＢＯ−２０
０光源、３ｍｍＢＧ −４７０励起フイルター、ランプ
ハウス中に二つ のＢＧ−３８赤色排除フィルター、およ びプロエム・アタッチメントにに４９０ 励起フイルターおよび一つの５３０接眼 Ｂ フィルターを備えている。

スライドを１００倍油浸対物レンズ（１２５０Ｘ） のもとで試験した。

前述（第３７頁）した透過光システムおよびフィルター
組合 せを使用して、同様の結果を得ることが できた。

× ３−４均質、周囲蛍光を示す細胞は使用できるもの
と判断され、元の斜面培養 を別に培養する。

５ 交叉反応抗原を有す細胞を２９０Ｚ、組織培養瓶中
の木炭増殖培地（表Ｖ）上でサブ培養し、１８−２４時
間培養する。

６ 瓶から培養物を採集し、もし純粋ならダラム染色で
採集し、同じ木炭培地を含む大きい盆を密に培養するた
めに使用する。

７１８−２４時間培養の後、盆からの増殖を生理的塩水
に採集し滅菌ガーゼを通して口過し、５０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離する。

ペレットを生理的塩中の０．３％ナトリウム・ドデシル
・サルフート（ＳＤＳ）（４ｍｌ／ｇ湿潤重量）中に再
懸濁する。

懸濁液を穏やかにｉｏ分間室温にて均質化し、１５．０
０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離する。

上澄み分別分を集め、細胞ペレットを前のように０．５
％ＳＤＳにて再抽出する。

８ 集めた抽出物をアミコン・メンブランＸＭ１００Ａ
を使用するアミコンＸＭ−５０セルによって濃縮する。

９ 濃縮抽出物をセファローズ４Ｂカラムによるクロマ
トグラフにかけ、０．００２Ｍリン酸ナトリウム緩衝剤
ｐＨ７，６にて溶出する１０空隙容積をフイコル（Ｆｉ
ｃｏｌ ）にてその容積の１７１０に濃縮し、液体窒素
中に氷結し、溶かし、３時間室温にてＥＤＴＡおよびト
ライトンＸ−１００にて、最終濃度が１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡおよび１．５％トライトンｘ−ｉｏｏで培養する。

１１ 混合物をｉｏｏ、ｏｏｏｘｇｉ時間遠心分離する
。

１２上澄液を可溶性抗原として言及し、さらには精製し
ないで、蛋白質濃度を測定した後に、収着剤として使用
した。

収着単位および実用収着の決定 ｌ 収着剤の異なった稀釈物をｉｏないし０．１μｇ蛋
白質７０．２ ｍｌ塩水を含むように調製する。

２Ｎ、ｇ、１抗体単位、Ｎ、 ｍ、 （特定グループ）
■抗体単位１０．０５ｍ１！を含むように稀釈した０、
２ ｍｌの熱不活性コントロール血清を収着剤の適当
な稀釈物０．２ｍｌ！と混合する。

３ 室温にて１時間培養する。

４ 収着剤よりもむしろ、同様に処理された０、２ｍｌ
の塩水から調製されたコントロール（収着されていない
）と一諸にこの９収着された〃血清試料を使用して前の
ように（工程４ｖｉないし４１Ｘ）Ｎ、ｇ、およびＮ、
ｍ、スライドを染色する。

５ 非収着コントロールによる３−４＋蛍光に比較して
Ｎ、 ｍ、スライド上の１＋に蛍光陰影を減少するが、
Ｎ０ｇ、スライド上の蛍光をどのような意義ある程度に
も減少しない収着の一番低い濃度が１収着単位に等しい
と考えられ、μｇ蛋白質として表わす。

６ 実用の収着混合物は０．０５ ＳＵ／ Ｏ，０ｍ１
食塩に均等な調整された稀釈物である。

ＩＩ Ｎ、メニンギテイジス血清グループＢの収着組
成物 “ Ｉ やと同じであるが、Ｎ、メニンギテイジス菌株
が、Ｎ＊ｍ、血清グループＢ１参照菌株ＡＴＣＣ１３０
９０である。

ＩＩＩ Ｎ、メニンギテイジス血清グループＣの収着
組成物。

（Ｓ ｌ 、、と同じであるが、Ｎ、メニンギティジ
ス菌株がＮ、 ｍ、血清グループと、参照菌株ＡＴＣＣ
１３１０２である。

ＩＶ Ｎ、メニンギテイジス血清グループＤの収着組
成物。

ＳＳ （、、と同じであるが、Ｎ、メニンギテイジス
菌株がＮ、 ｍ、血清グループＤであり、参照菌株ＡＴ
ＣＣ１３１１３である。

Ｖ Ｎ、メニンギテイジス血清グループＸの収着組成
物。

ゝ Ｉ １と同じであるが、Ｎ、メニンギテイジス菌株
がＮ、 ｍ、スラテラス（５ｌａｔｅｒｕｓ ）血清グ
ループＸである。

ＶＩ Ｎ、メニンギテイジス血清グループＹの収着組
成物。

１ Ｉ １と同じであるが、Ｎ、メニンギテイジス菌株
がＮ、 ｍ、スラテラス血清グループＹである。

■ Ｎ、メニンギテイジス血清グループＺの収着組成物
。

■ Ｉ ９と同じであるが、Ｎ、メニンギテイジス菌株はＮ
、 ｍ、スラテラス血清グループＺである。

■ 実用の収着組成物。

■ 収着組成物を社会に広まったＮ、メニンギテイジス
に応じて調製する。

たたし、もし非常に活性な収着調製剤５０００−１０，
０００ＳＵ／■蛋白質が使用されるならば、万能の混合
物が可能ではある。

２ 実用の混合物は、０．５ＳＵを含むように各々計算
された所望の個々の収着剤の等量を混合することによっ
て調製する。

用いる容積は次のように計算される。

Ｖ：各収着剤の容積 Ｎ：個々の用いられる収着剤の数 実施例 Ｈ 蛍光淋病試験−吸収（ＦＧＴ−ＡＢＳ） 抗原の調製 １ 適当な抗原性を有するＮ、ｇ、の新しい分離物また
は標準菌株（ＡＴＣＣ２１８２３，２１８２４および２
１８２５）の凍結乾燥サブ培養物（ｓｕ−ｂｃｕｌ ｔ
ｕｒｅ ）を維持培地（表■）に培養するか、あるいは
１０％ＤＭＳＯとプロテオースーペブトン肉汁中に懸濁
し液体窒素（−１７６℃）中に氷結するか、又は凍結乾
燥する。

２ 菌株を必要に応じて新たに作ったチョコレート寒天
板（うさぎ血液）（表■）に植え継ぐ。

３ 板を２４時間３６℃で４−１０％ＣＯ２雰囲気中で
培養する。

４ 代表的コロニイを使用してチョコレート寒天スラン
トを培養する。

５ スラントを１８−２４時間培養し、純粋な培養を使
用する。

６ 細胞を生理的塩中の２％スクロース（Ｗ／Ｖ）およ
び０．２％ゼラチン（Ｗ／Ｖ）を含有する懸濁媒質中に
採集し、どの凝集塊も穏やかに破壊し、懸濁液の濃度を
視覚によって標準濃度１×１０８セルフ’ｍｌに等しい
濃度に調製する。

７ 懸濁液の水滴を清潔な顕微鏡スライド上の周囲の部
分にのせ、５ｍ１１ループを使用して拡げる。

（分散器を使用して自動的に適用することも可能である
。

）８ スライドを空気乾燥し、２％緩衝ホルマリン中に
ｉｏ分間定着し、蒸留水に３回浸すことによって洗浄し
、新しい水浴にて４分間すすぎ、排水し、吸い取って乾
燥する。

９ １：１０稀釈で４＋蛍光を与える知られた陽性コン
トロールにて各ロフトを検査し、良好なスライドにて１
〜２千蛍光を与えるように稀釈する。

陰性コントロールは包含されている。予想される陽性、
ボーク−ライン、および陰性反応を与えるロフトだけが
満足できるものと判され用いる。

１０ 満足されるロフトを一２０℃で塩化カルシウム結
晶を入れた密閉容器中にて保存する。

必要に応じてスライドを調製した。

貯蔵寿命を試験するために用いた一つのロフトは９ケ月
後でもなお満足されるものである。

患者血清の調製 １ 患者血清を生理的食塩水にｌ：５で稀釈する。

２ 稀釈液０．５ ｍｌを３０分間５９℃の水浴で加熱
する。

３ 熱不活性血清０．２１１Ｌｌを０．５ＳＵの収着Ａ
および０．５ＳＵの収着Ｃを含有する収着剤０．２ｍと
混合する。

４ 室温にて１時間培養する。

染色 ■ スライドを使用１０〜１５分前に冷蔵庫から取出し
患者の名前又は番号を標識する。

２ 吸収血清の一滴を多重斑点スライド上の適当にしる
しをつけた相当する斑点に適用する。

３ ＲＴで２０分間湿潤室中で培養する。

４ ０．１Ｍりん酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７，６中
で速やかに１０回洗浄し、１０分間新しいＰＢＳ浴中に
入れ、蒸留水で１０回すすぎ、しずかに吸い取って乾燥
する。

５ フルオレツセイン・イソチオシアネート結合抗人間
イムノグロブリンＧの実用稀釈液にて２０分間開渠し、
工程４に記載したように洗浄をくり返えす。

６ グリセロール−炭酸塩−重炭酸塩緩衝液ｐＨ９，０
中にスライドを固定する。

読み取り スライドを透過光又は反射光システムに適した蛍光顕微
鏡にて試験する。

１ 透過光 蛍光スコープには、フルオレツセイン・インチオシアネ
ート励起スペクトルを含む発光スペクトルを有するどの
ような光源も備えることができる。

良好な例は水銀バルクＨＢＯ−２００であ４顕微鏡には
３ｍｍＢＧ−１２励起フイルター、ＢＧ−３８赤色吸収
フィルター、ＯＧｌ接眼フィルター、暗唱コンデンサー
、および１００×油浸対物レンズ（ｉｏｏｏｘ＞が備え
られている。

２ 反射光 蛍光顕微鏡にはどのような適当な光源も備えつけられる
ことができる。

我々のスコープにはＨＢＯ−２００光源、３ｍｍＢＧ−
４７０励起フイルター、二つのＢＧ−３８赤色吸収フィ
ルター、Ｋ４９０励起フィルター、および５３０接眼フ
イルターが備えられている。

スライドを１００×油浸対物レンズ（１２５０Ｘ）によ
って調べる。

結果の判定 細菌細胞の周辺蛍光の程度を陰影Ｓから４＋までの等級
に分類した。

■−２＋蛍光又はそれ以上を示す試料は陽性と考え、現
在又は最近Ｎ、ゴノロエに感染していることを示すもの
と判断する。

実施例 ■ 酵素結合免疫検査 Ａ 不溶性蛋白質−バクチリヤゲル 抗原の調製 ■ 適当な抗原性を有するＮ、 ｇ 、の新しい単離菌
又は標準菌株（ＡＴＣＣＩ ３０７７ 。

１３１０２．１３１１３）からのサブ培養を維持培地（
果■）に維持し、凍結乾燥し、あるいはチョコレート寒
天スラント（うさぎ血液）（表■）に氷結する。

２１８−２４時間の増殖を生理食塩水に採集Ｌ、約３−
４Ｘ ｔ ｏ８コロニー・ファーミング単位（ＣＦ Ｕ
） ／ｒｒｔｌに調整する。

３’０．１Ｍりん酸緩衝剤ｐＨ７，０のうさぎＩｇＧを
細菌懸濁液に最終濃度５０ ｌｎ９７ｍ１となるまで加
える。

４２．５％ゲルタールアルデヒド水溶液を最終濃度が溶
液中１００ｍｇの蛋白質につきｌＯ■のゲルタールアル
デヒドとなるまで静かに攪判じながら滴加する。

５ 室温にて１時間放置する。

６ 不溶性蛋白質−細菌ゲルを０．２Ｍりん酸緩衝食塩
水ｐＨ７，２中に分散し、３０００ｒｐｍで１５分間遠
心分離する。

７ 工程６を２回繰り返す。

８ 工程３にて加えたうさぎ蛋白質の容量の４倍の０．
２ Ｍりん酸緩衝食塩水ｐＨ７，２の一容積中に、蛋白
質−細菌ゲルを再懸濁させる。

９ 懸濁液を０．２５７１１１部分標本中部分外し、使
用するまで冷蔵庫中で保存する。

患者血清の調製 １ 患者血清を０．２ Ｍりん酸緩衝食塩水ｐＨ７，２
（ＰＢＳ）中に１：５，１：５０，１：５００で稀釈す
る。

２ 別々の稀釈液を３０分間５９℃の水浴で加熱する。

３ ０．２ｍｌの熱不活性血清をＰＢＳ中の０．２ｍｌ
収着剤に加える。

４ 室温で培養する。

方法 １ 各々の収着され、かつ熱不活性の患者血清の稀釈液
０．２５ｒｕｌを抗原０．２５ ｖｔｌに加え混合する
。

２３７°Ｃにて１５分間水浴で培養する。

３ ３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を捨て
る。

４ ペレットを５容量のＰＢＳにて２回洗浄する。

５ ワサビ・パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗人間イ
ムノグロブリンＧの稀釈液０．１ ｒｕｌを加える。

６３７℃にて１５分間水浴にて培養する。

７ ５．０ｍ１ＰＢＳを加え、遠心分離し、工程４にて
述べたようにペレットを洗浄する。

８ 基質（表 ）３．０ｒｕｌを加え、振盪して混合す
るＯ ９５分後に、６Ｎ硫酸−滴を加えて反応を止める０ １００、Ｄ、を４００ｍｍにて測定する。

判定 活性ある血清は既知の陽性および陰性血清にて作製した
標準曲線と比較して示される。

コントロール（各試験ごとに加えられる） ａ 陽性コントロール ｂ 陰性コントロール Ｃ開隔性（ボーダーライン反応性コントロール） ｄ 抗原コントロール ｅ 基質コントロール ｆ 酵素コントロール Ｂ フィルター試験 抗原の調製 ＩＭＪ胞懸濁液をゝＡ１、工程１，２のように調製する
。

２ 懸濁液は使用するまで冷蔵庫にて保存する。

患者血清の調製 ％Ｓ Ａ 、、におけるようにする。

方法 １ 細胞懸濁液０．２１ｒＬｌをディスベンザプル管中
で収着された血清０．２ＴＬｌと混合する。

２３７℃にて１５分間培養する。

３ ＰＢ８５．０１′ｎｌで３回洗浄する。

４ 細胞懸濁液をＰＢＳｌ、０ｒｒＬｌ中に再懸濁し、
ディスベンザプル・フィルターにのせ、緩衝剤を吸引し
て除去する。

５ ワサビ・パーオキシダーゼ結合抗人間イムノグロブ
リンＧの稀釈液０．１ ｍｌ！を加える。

６３７℃にて１５分間培養する。

７ ＰＢＳ５．０ｍｌにて３回洗浄し、酵素活性につ
いての最後の洗浄をチェックする。

もし酵素が洗浄液中に検出されるならば、洗浄を繰返す
。

８ 基質１．０ｍｌを加える。

９ 反応性血液フィルターに赤褐色の着色を生ずる。

実施例 ■ 非抗原担体に対する結合 Ａ 収着−セルロース（Ｓ−Ｃ） １ 蛋白質１００ＳＵ／■の最小量を含有する収着Ａ溶
液とｐＨ３の０．１ Ｍりん酸緩衝剤中のＤＥＡＥ−セ
ルロースの等量を混合し、−昼夜冷凍器中に放置する。

混合物を口過し３回等量の０．３Ｍりん酸緩衝剤ｐＨ７
，Ｑで洗浄し、更に１％アルブミンを含む０．１ Ｍり
ん酸緩衝剤ｐＨ７，０の等容量にて３回洗浄する。

２ 洗浄した収着剤−セルロース（ＳＣ）結合体を１％
アルブミンを含む０．１Ｍりん酸緩衝剤ｐＨ７，０中に
、もとの容量と等しい容量で再懸濁する。

３ 結合体の収着活性を前に（実施例■Ｂ）にて記載し
たように決定し、１％アルブミンを含む０．１Ｍりん酸
緩衝剤ｐＨ７，Ｑ中に５ＳＵ／７Ｉｌｌを含むように稀
釈する。

４Ｓ−Ｃの０．５ ｍｌを患者血清の等容量と混合し、
室温にて１時間培養する。

５ ３０００ｒｑｍで１０分間遠心分離し、上澄液（収
着された血清）を使用する。

６ 収着された患者血清を種々の凝集反応放射線免疫検
査、免疫蛍光試験に使用することができる。

Ｂ 収着−セファローズ（Ｓ−Ｓ） １ シアノジエン・ブロマイド活性セファローズ■粒子
（活性ＣＮＢ−セファローズ、ファーマシア・ファイン
・ケミカル製）Ｉｇと１０−３ＭＨＣｌの５１ｒＬｌ部
分と混合する。

２ 少なくとも１００ Ｓ Ｕ／即即日白質含有する分
別外をセファローズ床に注ぎ、蛋白質が吸着されるまで
数回０液を５−１０°Ｃの温度に維持して再循環させる
。

３ セファローズ上の残存する活性部位を１Ｍグリセリ
ン緩衝剤ｐＨ８，２中の０．５％ボビン血清アルブミン
５−５−１Ｏを加えることにより保護し、連続流動純化
ポンプによって一昼夜０液を再循環する。

４０液を排出せしめ、１０ｒＩＬｌの食塩溶液中に粒子
を再懸濁する。

約１０．００Ｏｒｐｍにて１０分間遠心分離し、上澄液
を捨てる。

５ 工程４におけるように洗浄を繰り返し、沈澱物を回
収する。

６ 収着粒子（Ｓ−Ｓ）を約１０ＴＬｌの食塩溶液中に
懸濁する。

７ 結合体の収着活性を前述したように測定し、５、
ＯＳ Ｕ ／ｍｌを含むように稀釈する。

８０．５ＴｌｌのＳ−８を等容量の患者血清と混合し室
温にて１時間培養する。

９ 約５．ＯＯＯｒｐｍにて１０分間遠心分離し、上澄
液（すなわち収着された血清）を取る。

１０収着された血清は種々の凝集反応、放射線免疫検査
および／または免疫蛍光試験に使用することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試験血清を約５６℃ないし６５℃にて約３０分間加
   熱し、その血清は稀釈されていないか、又は約１ ：
   １０００までの稀釈率で生理的食塩で稀釈されており、
   その血清を０．１ないし１００収着単位のナイセリア・
   メニンギテイデス抗原を含有するナイセリア・メニンギ
   テイデス収着組成物の等容量に加え交叉反応抗体を除去
   し、その後、生成混合物をナイセリア・ゴノロエ抗原の
   培養物から生産された熱不安定ナイセリア・コソロエ抗
   原を含有する組成物と混合し、かつ培養して該ナイセリ
   ア・ゴノロエ抗体が存在する場合にはナイセリア・ゴノ
   ロエ抗原−抗体結合体を形成せしめ、人間血清中におけ
   るナイセリア・ゴノロエ抗体の存在を前記結合体の形成
   により検出することを特徴とする血清学的方法。 ２ ナイセリア・ゴノロエ抗原組成物が細胞懸濁液であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ナイセリア・ゴノロエ抗原組成物が蛋白質１■当り
   少くとも１００Ａ、！；’、Ｕ、の抗原単位価を有する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 抗原単位価が少なくとも１ｏｏｏであることを特徴
   とする特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ ナイセリア・ゴノロエ抗体が担体に結合され、凝集
   試験に使用されることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ６ ナイセリア・ゴノロエ抗原−抗体結合体を標識した
   抗人間ＩｇＧとの反応によって検出することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 抗六間ＩｇＧを、紫外光に当てるとき蛍光を発する
   化学物質で標識することを特徴とする特許請求の範囲第
   ６項記載の方法。 ８ 化学物質がフルオレツセイン、ローダミンおよびオ
   ーラミンから成る群から選択されることを特徴とする特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 抗人間ＩｇＧを放射性元素で標識することを特徴と
   する特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０放射性元素が１４Ｃ、１３１■、 １２５１および
   、３５Ｓから成る群から選択されることを特徴とする特
   許請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 抗原を放射性元素で標識することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 １２抗人間ＩｇＧを酵素で標識することを特徴とする特
   許請求の範囲第６項記載の方法。 １３抗原を酵素で標識することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １４酵素がパーオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、
   β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、
   ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ・プラス・パーオ
   キシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ・プラス・パー
   オキシダーゼおよび酸性ホスファダーゼであることを特
   徴とする特許請求の範囲第６項記載の方法。