CH634924A5 - Serologisches verfahren zur bestimmung der gegenwart von neisseria gonorrhoeae-antikoerpern. - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein serologisches Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Neisseria gonorrhoeae-Antikörpern in menschlichem Serum, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Serum auf 56 bis 65 °C während 15 bis 30 Minuten erhitzt, wobei das Serum unverdünnt oder mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer Verdünnung bis zu 1:1000 verdünnt sein kann, das Serum zu einem gleichen Volumen Neisseria-meningitides-Sorbens-Zusammensetzung zusetzt, welches 0,1 bis 100 Sorbens-Einhei-ten Neisseria meningitides-Antigen enthält, um störende Antikörper zu entfernen und anschliessend das erhaltene Gemisch mit einer Zusammensetzung vermischt und inkubiert, welche ein wärmelabiles Neisseria gonorrhoeae-Antigen enthält, das aus einer Kultur von Neisseria gonorrhoeae-Antigen erhalten wurde, um Neisseria gonorrhoeae-Antigen-Antikörper-Konju-gat zu bilden, wenn diese Antikörper zugegen sind, und dieses Konjugat bestimmt wird.

Die vorliegende Erfindung ist am besten verständlich unter Berücksichtigung der bereits bekannten oben erwähnten Methoden.

So war es bekannt, dass N.g.-Organismen, insbesondere ATCC 21823,21824 und 21825, ein Antigen erzeugen, welches wärmelabil ist und mit Antikörpern in menschlichen Seren reagiert, welche infolge der Gegenwart von N.g.-Antigenen in menschlichen Seren erzeugt werden, wodurch eine gegenwärtige oder vergangene Gonorrhoe-Infektion angezeigt wird.

Es wurden verschiedene Methoden vorgeschlagen für die Verwendung des Antigens zum Nachweis der Gegenwart von N.g.-Antikörpern. Der bevorzugte Test ist ein Immunofluores-zenztest, welcher Suspensionen von Mikroorganismen verwendet. In diesem Test wird eine Suspension, welche das Antigen enthält, zubereitet, mit zwei getrennten Proben von Seren inkubiert und auf die Erzeugung eines Antigen-Antikörper-Komple-xes untersucht. Eine Probe des Serums wird erhitzt, um die gegebenenfalls vorhandenen wärmelabilen, eine Nebenreaktion hervorrufenden Antikörper zu inaktivieren. Die andere Probe wird nicht wärmebehandelt. Der Schlüssel zu dem Test besteht darin, dass Antikörper, welche durch eine Gonorrhoe-Infektion erzeugt wurden, wärmestabil sind, während Antikör-

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per, welche eine Nebenreaktion hervorrufen, wärmelabil sind. Taxonomische Beschreibung von ATCC 21823,21824 und

Eine positive Reaktion mit beiden Testproben ist daher ein kla- 21825

rer Hinweis auf die Gegenwart von Antikörpern, die durch N.g. Ordnung: Eubacteriales hervorgerufen wurden. Eine negative Reaktion in beiden Pro- Familie: Neissericeae ben ist ein klarer Hinweis auf die Abwesenheit derartiger Anti- 5 Gattung: Neisseria körper. Eine negative Reaktion bei der erhitzten Probe zusam- Art: Gonorrhoe men mit einer positiven Reaktion bei der nicht-erhitzten Probe ist ein Hinweis auf die Gegenwart natürlicher Antikörper. , Morphologie :

Die Bildung eines positiven Antigen-Antikörper-Komple- Gramnegative Kugeln oder bohnenförmige Diplococcen xes kann auf jede bekannte Methode nachgewiesen werden. Im io mit angrenzenden flachen Seiten, üblicherweise 0,6 x 1,0 |i und allgemeinen besteht das Verfahren darin, den Komplex mit mehr, gleichmässig in der Grösse.

einem markierten Anti-Menschenimmunoglobulin, vorzugsweise Immunoglobulin-G (IgG) zu inkubieren. Das IgG mit Biochemische und Züchtungseigenschaften:

schwerer Kette wird bevorzugt. Das Immunoglobulin kann z.B. Aerobes, optimales Wachstum erfordert 4 bis 10% CO2 und mit einem nachweisbaren radioaktiven Element, einem Enzym 15 Inkubation bei 36 °C.

oder einer chemischen Substanz, welche unter ultraviolettem Die Kulturen wachsen langsam auf Schokolade-Agar und oder anderem spezifischem Licht fluoresziert, markiert wer- erzeugen kleine, kaum sichtbare Kolonien nach 24 Stunden (0,1 den. mm Durchmesser) mit einer typischen Morphologie, welche

In einer Methode werden getrennte Proben der, das Anti- auf 48 bis 72 Stunden alten Kulturen sichtbar ist. Die Kolonien gen enthaltenden Suspension auf einen Objektträger gegeben 20 sind klein, 1,0 mm Durchmesser, grauweiss, durchsichtig, glatt, und mit den zu untersuchenden Seren inkubiert, wobei die eine mit runden ganzen Rändern, glänzender Oberfläche und butter-Probe erhitzt wird, die andere nicht. Die derart erhaltenen artiger Konsistenz. B-1094 erzeugt etwas grössere Kolonien getrennten Proben werden dann mit einem Anti-Menschen- und wächst schneller.

IgG, welches mit fluoreszierendem Material, wie z.B. Fluorés- Oxidase +, Katalasa + : fermentiert Glucose, aber nicht cein, Rhodamin oder Auramin, markiert ist, inkubiert. Das für 25 Maltose, Lactose und Sacharose.

diese Methode bevorzugte Nachweismaterial ist Anti-Men-

schen-IgG, welches über ein Isothiocyanat mit Fluorescein kon- Antigene:

jugiert ist. Das Produkt ist bekannt und im Handel erhältlich. Alle drei Isolate teilen sich in denselben Antigenen, welche

Die bekannte Testmethode besteht somit grundlegend auf wärmelabil « L» sind.

dem Nachweis eines Konjugates, welches durch Reaktion des 30 durch N.g. erzeugten wärmelabilen Antigens und dem komple- Virulenz:

mentären hitzestabilen Antikörper gebildet wird. Der Nach- Alle drei Stämme wurden ursprünglich von Patienten mit weis erfolgt vorzugsweise unter Verwendung der Reaktion mit symptomatischer Gonorrhoe isoliert.

einem Antigen oder Anti-Menschen-IgG, welches mit einem Das zu untersuchende Serum wird in physiologischer Koch-

Element oder einer chemischen Substanz markiert ist, welche 35 salzlösung zu einer Verdünnung von 1:2 bis 1:1000 verdünnt, auf chemischem oder physikalischem Weg nachweisbar ist. Die die Suspension auf 56 bis 65 °C, vorzugsweise 59 °C, während Reaktion kann jedoch auch dadurch nachgewiesen werden, 15 bis 40 Minuten, vorzugsweise 30 Minuten, erhitzt, um wär-dass man sie stattfinden lässt, nachdem das Antigen auf einem melabile natürliche Antikörper zu inaktivieren, und anschlies-Träger adsorbiert wurde. Geeignete Träger sind z.B. verschie- send wird das erhitzte Serum mit einem aus einer Kultur von dene Polymerlatices, wie ein Polystyrollatex, Bentonit oder 40 N.g. erzeugten Antigen inkubiert. Das wärmelabile Antigen Holzkohle, Cholesterin, Lecithin oder rote Blutzellen. Die Par- wurde nicht zuvor bestimmt oder beschrieben. Für den Aggluti-tikel, welche das Antigen auf einem Adsorbens enthalten, wer- nationstest ist das bevorzugte Verhältnis am unteren Ende des den sodann mit den zu untersuchenden Seren vermischt und Bereiches oder sogar unverdünnt. Für die Radioimmunome-auf die Gegenwart oder Abwesenheit einer Flockulierung oder thode ist das bevorzugte Verhältnis am oberen Ende des Berei-Klumpenbildung beobachtet. Die Empfindlichkeit dieses Ver- 45 ches und für den Fluoreszenztest liegt das bevorzugte Verhältfahrens kann erhöht werden durch Waschen der Partikel, um nis zwischen 1:10 und 1:40.

nicht umgesetztes Protein zu entfernen, gefolgt vom Zusatz des Für die Herstellung der Antikörper-Objektträger der oben Anti-Menschen-IgG. Positive Reaktionen ergeben Klumpen, erwähnten bekannten Methoden werden im allgemeinen fri-während bei negativen Reaktionen die mit Antigen überzöge- sehe Isolate der N.g.-Organismen lyophilisiert oder in flüssigem nen Partikel homogen dispergiert bleiben. 50 Stickstoff gefroren. Sie können nach Bedarf rekonstituiert und

Wie oben erwähnt, ist die bevorzugte Nachweismethode auf Schokolade-Agar mit Kaninchenblutmedium (Tabelle II) mit Suspensionen die Fluoreszenzmethode. Das Anti-Men- weitergezüchtet. Stammkulturen in halbfesten Medien (Tabelle schen-IgG kann jedoch auch mit einem radioaktiven Element III) können einmal monatlich übertragen werden, um die oder mit einem Enzym markiert werden. Die radioaktive Mar- Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten. Die Kulturen können nach kierung kann mit einem bekannten Zählverfahren nachgewie- 55 Bedarf in ein geeignetes Zuchtmedium, vorzugsweise Schoko-sen werden. Die bevorzugten isotopen Markierungen sind 14C, lade-(Kaninchenblut-)Schrägagar übertragen, und diese bei 1311,125I und 35S. Eine Enzymmarkierung kann auf kolorimetri- etwa 34 bis 38 °C, vorzugsweise 35 bis 37 °C während etwa 18 schem, spektrophotometrischem, fluorospektrophotometri- bis 24 Stunden, üblicherweise in einer C02-Atmosphäre (4 bis schem oder gasometrischem Wege nachgewiesen werden. Das 10%) inkubiert werden. Die Organismen wachsen nicht merk-Enzym kann durch Reaktion mit brückenbildenden Molekülen, 60 lieh bei Temperaturen, die wesentlich unter 35 °C liegen, und wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und derglei- sie sterben oberhalb etwa 38 °C ab. Bei einer Dauer von chen, an das Anti-Menschen-IgG konjugiert werden. Manche wesentlich unterhalb 18 Stunden ist die Menge des Wachstums Enzyme, welche in diesen Verfahren verwendet werden kön- zu gering, um von praktischer Bedeutung zu sein, und nach nen, sind bekannt. Die Bevorzugten sind Peroxidase, ß-Glucuro- etwa 24 Stunden wird ein allmählicher Abfall des vorhandenen nidase, ß-D-Glucosidase, ß-D-Galactosidase, Urease, Glucose- 65 Antigens beobachtet.

oxidase plus Peroxidase, Galactoseoxidase plus Peroxidase und Vorzugsweise wird die Suspension auf ihre Reinheit und Säurephosphatase. ihre typische Morphologie durch Gram-Färbung und Strichkul turen auf Nährmedium geprüft.

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Die Mikroorganismen werden im allgemeinen in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von etwa 10s bis 109 Organismen pro ml suspendiert. Für den Fluoreszenztest beträgt die bevorzugte Konzentration 3x IO6 bis 4x 106. Für den Agglutinations- und den Enzymtest liegen die bevorzugten Konzentrationen im Bereich von 108 Organismen pro ml.

Ein Standard-Antigenplättchen ist ein Plattenpräparat, bei welchem ein Tropfen (etwa 0,05 ml) einer Suspension von N.g.-Organismen in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 3 bis 4x 106 Organismen pro ml aufgetragen, getrocknet und fixiert wird.

Ein kleiner Tropfen der Suspension wird im allgemeinen auf jedes Ende einer gereinigten Fluoreszenz-Antikörper-Platte aufgebracht und mit einer Schlinge verstrichen. Die Platten können an der Luft getrocknet, fixiert und anschliessend in destilliertem Wasser gespült werden, um eine Standard-Anti-gen-Platte zu ergeben. Die Platte ist nach Fixierung mit 1 bis 3% Formalin oder auch ohne Fixierung bis zu 6 Wochen haltbar, wenn sie bei etwa -20 °C aufbewahrt wird. Die Organismen können lyophilisiert werden und behalten ihre Nützlichkeit während 2 bis 3 Monaten bei Zimmertemperatur. Das bevorzugte Fixiermittel für eine Eisschranktemperatur von etwa 10 °C ist ein Mittel, welches 10% Formalin in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung bei pH 7,6,95% Äthanol und Eisessig im Verhältnis 10:90:5 enthält. Mit diesem Mittel bleibt die fixierte Suspension während längerer Zeit stabil, meist länger als 3 Monate. Bei Eisschranktemperaturen kann die Stabilität durch Anwesenheit eines Trocknungsmittels, wie wasserfreies Calciumchlorid, erhöht werden.

Wenn sie im Fluoreszenzverfahren, wie es oben beschrieben wurde, verwendet werden, werden die Antikörperplatten mit verdünnten Proben des zu untersuchenden Serums versehen. Das Serum ist auf 1:10 bis 1 -.40 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Das verdünnte Serum wird in zwei aliquote Teile von je etwa 0,5 ml geteilt, und eine Probe wird erhitzt, vorzugsweise auf 59 °C während 30 Minuten.

Ein Tropfen des erhitzten verdünnten Serums wird im allgemeinen auf die Suspension an einem Ende der Platte aufgebracht und ein Tropfen des nicht erhitzten verdünnten Serums wird auf die Suspension am anderen Ende der Platte aufgebracht. Die Platte wird sodann während etwa 15 bis 30 Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert, vorzugsweise in einer Kammer, welche mit Wasserdampf bei etwa 22 °C bis 37 °C gesättigt ist.

Nach Entfernung aus der Kammer werden die Proben zweckmässig gut in gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, um Serumproteine zu entfernen, welche nicht an die Antigene oder Zellen gebunden sind. Ein geeigneter Puffer ist der Standard-Phosphatpuffer von pH von 7,5 bis 7,7. Das Waschen erfolgt vorzugsweise auf die Weise, dass die Platte zuerst mehrmals in die Pufferlösung eingetaucht wird, dann in einer frischen Pufferlösung während etwa 10 Minuten festgehalten wird und schliesslich in Millipor-Wasser gespült wird. Die Platte wird sodann getrocknet, z.B. durch vorsichtiges Abtupfen mit einem absorbierenden Papier.

Die getrockneten Präparate werden z.B. mit Fluorescein-Isothiocyanat konjugierten Anti-Menschen-IgG während etwa 20 Minuten behandelt. Die Arbeitsverdünnungen für besondere^ Konjugate variieren von einem Ansatz zum anderen und können am besten durch Titration mit bekannten Kontrollen bestimmt werden. Die Platten werden sodann montiert, vorzugsweise in einem Glycerin-Carbonat-Bicarbonat-Puffer bei einem pH von etwa 8,5 bis 9,5, vorzugsweise 9,0. Eine Vielzahl von Montierungsflüssigkeiten können verwendet werden, doch sollten sie derart gewählt werden, dass sie eine minimale Auto-fluoreszenz aufweisen.

Der Grad an Fluoreszenz kann mit einem Fluoreszenz-

Mikroskop, z.B. einem Leitz-Fluoreszenz-Mikroskop, welches mit einer HBO-200-Lichtquelle, einem 3-mm-BG-12-Exiter-Fil-ter, einem BG-38-rotausscheidenden Filter, einem OG-l-Ocu-Iar-Filter, einem Dunkelfeldkondensor und eine 100 x Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist, bestimmt werden.

Die Fluoreszenz des mit der erhitzten Serumprobe behandelten Präparates kann verglichen werden mit derjenigen des Präparates, welches mit der nicht-erhitzten Portion des Serums behandelt wurde. Proben, welche 1 bis 2+ Fluoreszenz im nicht-erhitzten Serum und keine oder eine unwesentliche Reduktion der erhitzten Probe aufweisen, werden als positiv betrachtet.

Lyophilisierte Produkte aus Suspensionen von N.g.-Wachs-tumskulturen, insbesondere ATCC 21823,21824 oder 21825,

sind besonders nützliche Quellen für Antigene. Sie können wie folgt zubereitet werden:

A) Man stellt konzentrierte Suspensionen in steriler Milch (100 g Magermilch - Baltimore Biological Laboratories -welche zu 1 Liter Wasser, das auf 50 °C vorgeheitzt wurde, zugesetzt, sterilisiert bei 113 bis 115 °C während 20 Minuten), worauf 5% Kaninchen- oder Pferdeblut zugesetzt werden.

B) Um die Milchsuspension herzustellen, wird eine Schrägkultur mit 0,5 ml Milch abgewaschen, unter Verwendung einer Kapillarpipette. Zwei Tropfen Kultursuspension werden auf den Boden der numerierten Glasröhrchen verbracht.

C) Nicht mehr als 0,05 ml Suspension werden auf den Boden von Röhrchen von 6 bis 7x 100 mm, welche mit einem Wattepfropfen verschlossen sind, verbracht.

D) Der Wattepfropfen wird entfernt und das Röhrchen in den Kautschukmantel einer Verbindung zur Vakuumpumpe eingesetzt, wobei darauf geachtet wird, dass

(1) jeder Pfropfen direkt in einem Behälter für die Sterilisation gelegt wird;

(2) jedes Röhrchen an jedem Anschluss etwas Kultur enthält.

E) Die Röhrchen werden in ein Bad aus Trockeneis und 95%igem Äthylalkohol mit einer Neigung eingesetzt, um etwas von der Suspension am Glas einige Millimeter oberhalb des Hauptteiles des zu trocknenden Materials abzusetzen.

F) Bis zum Anschluss an die Pumpe und bis der Druck befriedigend ist für ein rasches Trocknen sollen die Kulturen im Gefrierbad oder so nahe daran gehalten werden, dass kein Auftauen möglich ist.

Die lyophilisierten Produkte zeichnen sich durch die Gegenwart eines hitzelabilen Antigens aus, welches mit einem hitzestabilen N.g.-Antikörper im Serum des Patienten unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes reagiert. Sie sind besonders wertvoll, weil sie in jeder der verschiedenen oben erwähnten Testverfahren verwendet werden können. So können sie z.B. in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen werden und die Suspension kann für das oben beschriebene Fluoreszenzverfahren verwendet werden. Sie sind ferner nützlich in enzym- und radioaktiven Verfahren, wie dies für den Fachmann leicht verständlich ist.

Die Anpassung des erfindungsgemässen Verfahrens für einen Enzymtest in Zellsuspensionen wird erreicht durch Markieren des Anti-Menschen-IgG mit einem Enzym, z.B. Meerret-tich-Peroxidase. Das Antigen-Antikörper-Konjugat wird zweckmässig aus einer Probe des erhitzten Serums und der Antigensuspension, wie oben beschrieben, hergestellt. Die Probe kann mit dem markierten Anti-Menschen-IgG inkubiert und gewaschen werden, um fremdes Protein zu entfernen. Das gewaschene Produkt kann mit einem Substrat gemischt werden, z.B. o-Dianisidin und Wasserstoffperoxid. Nach etwa 3 bis 5 Minuten wird die Reaktion im allgemeinen durch Zusatz einiger Tropfen 6N Schwefelsäure unterbrochen. Die optische Dichte wird in diesem Fall bei 400 nm gemessen. Reaktives Serum wird angezeigt durch eine höhere optische Dichte als ähnlich behandelte negative Kontrollen.

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Andere Säuren können verwendet werden, um die Reak- noch bevorzugt. Der Grund dafür liegt darin, dass Antigen-

tion zu unterbrechen, z.B. Salzsäure. In diesem Fall kann die Zusammensetzungen, welche verhältnismässig hohe Mengen bevorzugte Ablesung der optischen Dichte bei einem anderen an Verunreinigungen, wie fremdes Protein, enthalten, verwen-

Wert als 400 nm erfolgen. det werden können. Die antigene Aktivität einer besonderen

Im Radioimmunoverfahren kann Anti-Menschen-IgG oder 5 Zusammensetzung kann in Antigeneinheiten bezogen auf die das Antigen mit dem ausgewählten Isotop nach Standard-Ver- oben definierte Standard-Antigenplatte ausgedrückt werden,

fahren markiert, mit Patientenserum zur Reaktion gebracht Die Methoden zur Bestimmung der Antigeneinheiten erfordert und der Antigen-Antikörper-Komplex abgetrennt und unter einige Erläuterungen. Sie ist aus der Fähigkeit einer besonde-

Verwendung eines Standard-Instrumentes gezählt werden. ren Zusammensetzung aufgebaut, den bevorzugten Fluores-

Die Ausführungsformen der Erfindung sind, wie oben 10 zenztest zu stören, welcher mit Zellsuspensionen verwendet erwähnt, auf antigene Zellsuspensionen anwendbar. Mit Zellsu- wird, wie ausführlich oben beschrieben wurde.

spensionen ist die bevorzugte Methode die Fluoreszenzme- Wie oben erwähnt, hängt der Fluoreszenztest mittels thode, welche, wenn sie wie oben beschrieben angewandt wird, Suspensionen von der Morphologie der Zellen ab. Insbeson-von der Morphologie der Zellen abhängt, wie dies für den dere hängt er von der morphologischen Lokalisierung des AntiFachmann erkennbar ist. 15 gens auf der intakten Zelle ab. Optimale Bedingungen für den In einer anderen und bevorzugteren Ausführungsform der Test herrschen vor, wenn die vollständige Zelle intakt ist. Im Erfindung werden gereinigte Antigene oder Antigenzusam- Laufe der Reinigung wird im allgemeinen mehr und mehr Anti-mensetzungen verwendet. Mit diesen Materialien sind eben- gen von den Zellen abgespalten. Die Zusammensetzungen wer-falls alle oben erwähnten allgemeinen Methoden anwendbar. den dadurch immer weniger geeignet für die Art von Fluores-Die Verwendung von gereinigten Antigenen oder Antigenzu- 20 zenzuntersuchungen, welche von der Zellenmorphologie sammensetzungen wird gegenüer der Verwendung von Zellsu- abhängen.

spensionen bevorzugt, weil die Resultate im allgemeinn besser In den ersten Stufen der Reinigung treten im allgemeinen reproduzierbar sind und die Verfahren leichter automatisiert verhältnismässig grosse Mengen an Protein auf, z.B. Bauchwerden können. Ausserdem ist das Fluoreszenzverfahren, stücke von Zellen, welches keine antigene Natur aufweist. Die-wenn es auf diese Materialien angewandt wird, nicht wie im 25 ses Material trägt nichts bei zu den Antigeneinheitswerten. Mit Fall der Zellsuspensionen subjektiv, sondern eher objektiv, da zunehmender Reinigung wird das fremde Protein entfernt und die Resultate durch Vergleich mit Kontrollen bestimmt wer- die Antigeneinheitswerte nehmen rasch zu.

den, welche bekannte Konzentrationen an Antigenen und Anti- Bei vorsichtiger Reinigung ist es möglich, Produkte mit körpern enthalten. Antigeneinheitswerten von 10 bis 20 000 Einheiten pro mg Pro-

Bei der gegenwärtig bevorzugten Methode zur Reinigung 30 tein oder sogar mehr zu erzielen. Produkte mit Werten von des Antigens und zur Herstellung von Antigenzusammenset- mindestens 100 können jedoch für den Fluoreszenztest, den zungen werden die gewählten N.g.-Stämme auf einem geeigne- Enzymtest, den Radioimmuntest und die Agglutinationsverfah-

ten Medium gezüchtet, vorzugsweise auf Kaninchenblut-Scho- ren zur Bestimmung der Gegenwart von N.g.-Antikörpern in kolade-Agar. Das Zellwachstum wird in physiologischer Koch- menschlichen Seren verwendet werden. Vorzugsweise betra-

salzlösung suspendiert und durch sterile Gaze filtriert. Wäh- 35 gen diese Werte jedoch mindestens 1000.

rend dieser und aller folgender Stufen, welche das Antigen Die folgenden Definitionen dienen dem besseren Verständoder antigenhaltige Fraktionen betreffen, werden die Lösun- nis dieses Aspektes der Erfindung:

gen, Suspensionen usw., soweit wie nichts anderes angegeben,

bei etwa 5 bis 10 °C gehalten. Konjugat-Einheit (C.U.)

Der Rückstand auf dem Filter wird mit physiologischer 40 Dies ist die höchste Verdünnung von fluoresceinkonjugier-

Kochsalzlösung gewaschen und mit etwa 16 000 Touren pro tem Anti-Menschen-IgG, welche, wenn sie in aliquoten Teilen

Minute während etwa 15 Minuten zentrifugiert. Das zentrifu- von 0,05 ml zu einem Standard-Antigenplättchen, welches mit gierte Material wird dekantiert und die überstehende Flüssig- einem Überschuss an spezifischen Antikörpern behandelt keit verworfen. Das Sediment wird wiederum in physiologi- wurde, zugesetzt werden, eine Fluoreszenz von 4+ ergibt.

scher Kochsalzlösung suspendiert, gesammelt und durch Zen- 45

trifugieren gewaschen. Antikörper-Einheit (Ab.U.)

Das Antigen kann mit kationischen Detergenzien, wie Dies ist die höchste Verdünnung von wärmeinaktiviertem

Natriumlaurylsulfat (SDS), Natriumdeoxycholat, Natriumcho- Serum, welche eine Fluoreszenz von 4+ ergibt, wenn sie ver-

lat oder ähnlichen Materialien extrahiert werden. wendet wird, um Standard-Antigenplättchen zu behandeln, die

Das wärmelabile, artspezifische Antigen ist von Natur ein 50 mit fluorescinkonjugiertem Anti-Menschen-IgG behandelt

Protein, was durch die Tatsache bewiesen ist, dass es inaktiviert sind, welches derart verdünnt ist, dass es 2 C.Uy0,05 ml enthält, wird, wenn es mit Proteaseenzymen, wie Pronase, Trypsin oder

Chymotrypsin auf übliche Weise inkubiert wird. Es wird ferner Antigen-Einheit (Ag.U.)

inaktiviert durch Suspension in einem wässrigen Medium bei Eine Antigen-Einheit (Ag.U.) ist als diejenige Menge eines pH-Werten bis zu 5, ist jedoch stabil in wässerigen Medien bei 55 ganzen, teilweise gereinigten oder reinen Antigenpräparates pH-Werten von 7 und mehr. Das Antigen wird besser wärme- definiert, ausgedrückt in ng Protein, welche, wenn man sie mit stabil mit zunehmender Reinigung, doch wird es allgemein wärmeinaktiviertem Serum, welches verdünnt ist zu einem inaktiviert durch Erhitzen auf etwa 56 °C während 30 Minuten Gehalt von einem Ab.Uy0,05 ml reagieren lässt, diese Aktivi-

in wässerigem Medium. Es enthält keine Deoxynucleinsäure tätseinheit adsorbiert, und wenn dieses adsorbierte Serum ver-

oder Ribonucleinsäure, wie durch seine Stabilität nachweisbar, 60 wendet wird, um die Standard-Antigenplatte zu behandeln, die wenn es mit den entsprechenden Acidasen inkubiert wird. Es mit fluorescinkonjugiertem Anti-Menschen-IgG, welches zu wird durch Lipase oder Dextranase nicht angegriffen. Es ist einem Gehalt von 2 C.U70.05 ml verdünnt ist, behandelt ist eine keine Neuraminsäure, da es stabil ist gegen Neuraminidase. Fluoreszenz von Schatten bis 1 + ergibt. Eine Antigen-Einheit

Auch ist es keine Zellwandeinheit (Murin), da es durch Lysosym ist die minimale Menge an Material, welches eine Antikörper-

nicht inaktiviert wird. 65 Einheit adsorbiert.

Obwohl die gereinigten Antigene nach dem oben beschrie- Es ist zu beachten, dass die Reinheit eines antigeneiweiss-

benen Verfahren hergestellt und im erfindungsgemässen Ver- haltigen Präparates direkt proportional ist zur Anzahl Antigen-

fahren verwendet werden können, ist dies weder notwendig einheiten pro mg Protein.

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Die Antigen-Zusammensetzungen können in allen oben im Zusammenhang mit Zellen oder Organismen-Suspensionen beschriebenen Tests verwendet werden. Die Verfahren sind im allgemeinen dieselben. Beispielsweise kann die Antigen-Zusam-mensetzung mit den N.g.-Antikörper in Testseren auf einer Platte verwendet werden und der entstehende Komplex mit IgG inkubiert werden, welches mit einem fluoreszierenden Material markiert ist. Das IgG kann aber auch mit einem der oben erwähnten Enzyme oder Isotopen markiert sein. Das Verfahren für den oben erwähnten Agglutinationstest ist derselbe, mit Ausnahme dass die Suspensionen durch gereinigte Antigene oder antigene Zusammensetzungen ersetzt werden.

Es wurde ferner beobachtet, dass die Antigene oder die antigenen Zusammensetzungen besonders nützlich sind, wenn sie an einem teilchenförmigen Träger oder Substrat gebunden oder adsorbiert sind. Derartige Materialien beeinträchtigen die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht. Auch beeinträchtigen sie die anschliessende Reaktion mit der markierten Verbindung nicht. Eine grosse Vielzahl von Trägern können hierzu verwendet werden, einschliesslich polymeren Materialien, wie Polystyrol, anorganische Materialien wie Glas, Siliciumoxid, Bentonit oder Holzkohle und celluloseartige Materialien, wie Sepha-rose, Sephadex oder Cellulose. Biologische Träger, wie rote Blutzellen können ebenfalls verwendet werden.

Für die Konjugierung eines spezifischen N.g.-Antigens an nicht-antigene Träger werden zweckmässig gleiche Volumina der partiell gereinigten oder reinen Antigenpräparate, welche mindestens 100 Ag.Wmg enthalten, und des gewählten Trägers, z.B. DEAE-Cellulose in 0,1 m Phosphatpuffer bei pH 8 vermischt und über Nacht kaltgestellt. Die Partikel können durch Filtration gewonnen und mit zusätzlicher Pufferlösung, z.B. 0,3 m Phosphatpuffer bei pH 7,0 und wiederum mit 0,1 m Phosphatpuffer bei pH 7 mit 1% Albumin gewaschen werden. Das gewaschene Konjugat kann in 0,1 m Phosphatpuffer bei pH 7 mit 1% Albumin in einem gleichen Volumen wie dasjenige der ursprünglichen Antigenlösung wieder suspendiert werden.

Das Antigen-Träger-Konjugat kann verwendet werden in Enzymimmunotests oder Radioimmunotests wie oben beschrieben. Es wurde beobachtet, dass wenn diese Konjugate verwendet werden für die Test verfahren, weniger Hintergrund-Interferenz beim Ablesen der Testinstrumente mit besserer Differenzierung zwischen positiven und negativen Tests auftreten.

Das folgende Beispiel illustriert das Verfahren gemäss einer Ausführungsform der früheren Erfindungen.

Indirekter Immunofluoreszenz-Antikörper-Test Herstellung des Antigens

1. Frische Isolate von N. gonorrhoeae mit geeignetem Anti-genprofil oder eine lyophilisierte Subkultur des Standard-Stam-mes (B-370, B-585 oder B-104) werden in einem Vorratsmedium (Tabelle III), subkultiviert. Die Kulturen werden in einer 4 bis

10% CO2 enthaltenden Atmosphäre bei 37 °C gehalten und einmal monatlich in frischem Vorratsmedium subkultiviert.

2. Die Stämme werden nach Bedarf auf frisch zubereitete Schokolade-Agar (Kaninchenblut) (Tabelle II) übertragen.

3. Die Schrägagar werden bei 36 °C während 18 bis 24 Stunden inkubiert und die Kolonie in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und auf 3 bis 4x 106 Organismen pro ml eingestellt.

4. Ein kleiner Tropfen der Suspension wird auf jedes Ende eines mit Alkohol gereinigten fluoreszierenden Antikörper-Plättchens verbracht und mit einer Öse verschmiert.

5. Die Plättchen werden an der Luft getrocknet und in 1% Formalin während 10 Minuten fixiert.

6. Die Plättchen werden zehnmal in destilliertem Wasser gespült, an der Luft getrocknet und bis zum Gebrauch bei -20 °C gelagert.

Herstellung des Patienten-Serums

1. Das Serum des Patienten wird im Verhältnis 1:10 in phy-. siologischer Kochsalzlösung verdünnt.

2.0,5 ml der 1:10 Verdünnung wird während 30 Minuten in einem Wasserbad von 59 °C erhitzt.

Behandlung

1. Die Plättchen werden 10 bis 15 Minuten vor Gebrauch aus dem Gefrierschrank genommen und mit dem Namen oder der Nummer des Patienten bezeichnet.

2. Ein Tropfen des erhitzten verdünnten Serums wird auf das eine Ende des präparierten Antigen-Plättchens verbracht und ein Tropfen des nicht-erhitzten Serums auf das andere Ende.

3. Man lässt bei Zimmertemperatur während 20 Minuten in einer feuchten Kammer inkubieren.

4. Man wäscht zehnmal rasch in 0,1 M mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung von pH 7,6.

5. Dann wird während 10 Minuten in einem frischen Bad desselben Puffers gewaschen.

6. Man spült zehnmal in destilliertem Wasser und trocknet durch vorsichtiges Betupfen mit Löschpapier.

7. Man behandelt mit der Arbeitsverdünnung des durch Iso-cyanat an Fluorescein gebundenen Anti-Menschen-Immuno-globulin-G während 20 Minuten, gefolgt von einem Waschzyklus wie oben (Stufen 4 bis 6).

8. Die Plättchen werden in einem Glycerin-Carbonat-Bicar-bonat-Puffer, pH 9,0, montiert.

Ablesungen

Die Plättchen werden unter einem Fluoreszenz-Mikroskop untersucht, welches mit einer HBO-200-Lichtquelle, 3 mm BG-12-Exciter-Filter, einem BG-38-rotausschliessenden Filter und einem OG-l-Okularfilter, einem Dunkelfeldkondenser und einem 100-X-Ölimmersionsobjektiv ausgestattet ist.

Interpretation der Resultate

Der Grad an peripherer Fluoreszenz der Bakterienzellen in der verschmierten Stelle, welche mit dem erhitzten Serum behandelt wurde, wird mit demjenigen der Stelle, welche mit nicht-erhitztem Serum behandelt wurde, verglichen. Die Proben zeigen, dass eine Fluoreszenz von 1 bis 2+ oder mehr mit keiner oder nur unbedeutender Herabsetzung nach dem Erhitzen als positiv betrachtet werden und derart ausgelegt werden, dass sie eine akute oder kürzlich durchgemachte Infektion anzeigen.

Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung von gereinigten N.g.-Antigen-Zusammensetzungen.

Herstellung von antigenen Zusammensetzungen

Die Zellkolonien aus Stufe 2 des oben beschriebenen Verfahrens werden gesammelt und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wird sodann durch Käseleinen bei einer Temperatur von 5 bis 10 °C filtriert, welche Temperatur während der folgenden Manipulationen aufrechterhalten wird. Der Rückstand auf dem Filter wird zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und das Filtrat mit 10 000 Touren pro Minute während 10 Minuten zentrifugiert. Das Sediment wird in physiologischer Kochsalzlösung wieder suspendiert und einmal durch Zentrifugieren gewaschen. Das Sediment, welches das Antigen enthält, wird gewogen, um das Nassgewicht zu bestimmen.

Ein Total von 6,0 ml 0,3% SDS in physiologischer Kochsalzlösung wird zu dem Niederschlag aus der Zentrifugation pro Gramm Nassgewicht des Bakteriensedimentes zugesetzt, und das Gemisch wird bei Zimmertemperatur von 10 Minuten inkubiert. Das Gemisch wird sodann mit 10 000 Touren pro Minute während 10 Minuten zentrifugiert und die überstehende Flüs5

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sigkeit gesammelt. Das Sediment wird mit 6,0 .ml/g 0,1% SDS in physiologischer Kochsalzlösung behandelt. Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur während 10 Minuten inkubiert, wie oben zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wiederum gesammelt. Die beiden überstehenden Flüssigkeiten werden nochmals zentrifugiert, um alle Zellen oder grösseren Fragmente zu entfernen, und vereint.

In diesem Punkt beträgt der Antigen-Einheitswert 100 bis 200 Ag.Uimg Protein.

Die vereinte überstehende Flüssigkeit wird konzentriert unter Verwendung von «Amicon Membrane XM100» und .dann über eine Säule von «Sepharos'e 4B» chromatographiert und mit 0,002molarem Phosphatpuffer vom pH 7,6 eluiert. Angemessene Fraktionen (üblicherweise 4 bis 10 ml) werden gesammelt und die Proteinkonzentration nach der Methode von Lowry überwacht. Die Antigen-Zusammensetzung mit dem besten Ag.U.-Wert wird in der ersten Spitze gefunden, welche aus 5 bis 10% des Proteins besteh. Bei frischen Präparaten beträgt der Wert 1000 bis 2000 Ag.U./mg.

Die oben erwähnten Tabellen sind im folgenden angeführt.

Tabelle I

Fermentationsmedium

Stärke-Gelatine-Agar, infusionsfrei, mit Indikator und Kohlehydrat (für Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis)

stellt. 1500-ml-Portionen werden in geeichte 3-Liter-Kolben eingefüllt, während 30 Minuten im Autoklaven erhitzt und gelagert.

Bei Bedarf wird die Agar-Base geschmolzen. Das Blut wird 5 aseptisch in Portionen von 15 bis 20 ml in glasbedeckten Petrischalen zugemischt und ohne Inkubation abgeliefert.

Tabelle III

Aufbewahrungsmedium Rinder-Infusion-Agar mit ascitischer Flüssigkeit

Rinder-Infusion, konzentriert 500 g

Agar 5 g

Natriumchlorid 5 g

15 Pepton 10 g

Wasser 500 g gleiches Volumen

Ascitische Flüssigkeit, steril

20

25

Agar 3 g

Gelatine 10 g

Natriumchlorid 5 g

Pepton («Difco-Proteose No. 3») 10 g

Stärke, löslich, gepulvert 5 g

Wasser bis zu 1000 g

Phenolrot, 0,02% 30 ml/kg

Kohlehydrat (Saccharose, Glucose oder 10 g/kg

Maltose)

Der Agar wird in der Hälfte des Wassers unter Erhitzen im Autoklaven aufgelöst; die Gelatine, das Salz, das Pepton und die Stärke werden im restlichen Wasser unter Erhitzen gelöst. Die beiden Lösungen werden vereint und der pH wird auf 7,4 bis 7,6 eingestellt. Dann wird die Lösung durch Watte filtriert. Das erhaltene Filtrat wird gewogen und mit dem Indikator und dem Kohlehydrat versetzt. 2,5-ml-Portionen werden in Röhrchen von 11 x 75 mm eingefüllt und bei 115 °C während 12 Minuten im Autoklaven erhitzt. Dann werden die Zapfen aufgesetzt und mit Paraffin versiegelt.

35

40

45

Der Agar wird durch Erhitzen im Autoklaven im Wasser gelöst, und das Pepton und das Salz werden in der Infusion gelöst. Die beiden Lösungen werden vereint und auf das Totalgewicht ergänzt. Der pH wird mit IN NaOH auf 7,5 eingestellt. Dann wird die Lösung unter Vakuum filtriert. Üblicherweise werden 400-ml-Portionen in 2-Liter-Kolben abgefüllt und während 30 Minuten im Autoklaven erhitzt. Dann werden sie gelagert. Die Agar-Base wird geschmolzen und auf 50 °C gekühlt.

Die ascitische Flüssigkeit wird auf 50 °C erwärmt und aseptisch zugemischt. Man mischt gut und füllt sodann 4- bis 7-ml-Portionen unter aseptischen Bedingungen in 15x 125-ml-Röhr-chen ab. Das Medium wird aseptisch mit etwa 4 ml sterilem Mineralöl bedeckt. Dann werden die Röhrchen in aufrechter Stellung gekühlt und anschliessend während 48 Stunden bei 35 bis 37 °C und dann 96 Stunden bei 20 bis 27 °C inkubiert. Die Präparate werden sodann kontrolliert und gelagert.

Tabelle IV Substrat für Peroxidase-Test a) 4%ige Wasserstoffperoxid-Lösung wird mit Wasser auf eine Verdünnung von 1:100 verdünnt.

b) Die Lösung wird mit Phosphatpuffer (0,01 molar bei pH 7) auf eine Verdünnung von 1:100 verdünnt.

c) Zu 24 ml des derart verdünnten Wasserstoffperoxides werden 0,2 ml einer l%igen Lösung von o-Anisidin in Methanol zugesetzt.

50

Tabelle II

Tabelle V

Kulturmedium

GIukose-Agar, infusionsfrei, mit koaguliertem Blut (für Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis)

Agar

Natriumchlorid Dinatriumphosphat, NaîHPCU Pepton («Proteose-Peptone 3») Glucose

Destilliertes Wasser bis zu Kaninchenblut, defibriert, steril

15 g 5g 5g

20 g 0,5 g 1000 g

10 ml/100 ml

55

60

Der Agar wird in der Hälfte des Wassers durch Erhitzen im 65 Autoklaven gelöst, die Salze, das Pepton und die Glucose im restlichen Wasser unter Erhitzen. Die beiden Lösungen werden vereint und auf 1 kg gebracht, und der pH auf 7,4 bis 7,6 einge-

-loIzkohle-Wachstumsmedium*

<Difco GC»-Medium-Base 36 g xlsovitalex» 10 ml

Aktivkohle (Fischer Scientific neutral 5 g activated decolorizing carbon)

Destilliertes Wasser 1000 ml

*Entwickelt von Dr. Hideo Kusamo von der Abteilung für Laboratorien und Forschung als Ersatz für den Kaninchen-blut-Schokolade-Agar.

Ein grosser Teil der bisherigen Beschreibung wurde einer vollständigen Beschreibung der bereits bekannten Verfahren gewidmet. Der Grund dafür besteht darin, dass, obwohl die vorliegende Erfindung eine vollständig neue Erfindung ist, sie als Verbesserung der früheren Verfahren angewendet werden kann. Die verschiedenen Techniken, welche zur Feststellung

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8

des Antigen-Antikörper-Komplexes für die bekannten Verfahren anwendbar sind, können auch für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Die N.g.-Antigen-Zusammensetzungen der früheren Verfahren können auch im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ebenso können die 5 bereits früher beschriebenen Antigen-Plättchen verwendet werden, obwohl es infolge der verbesserten Empfindlichkeit des Verfahrens gemäss der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich ist, dass das Plättchen mit zwei Antigen-Zusammen-setzungen pro Plätchen zubereitet wird. io

Es wird aus dem folgenden ersichtlich werden, dass ein wichtiger Schritt in den verschiedenen oben beschriebenen Tests darin besteht, dass die zu behandelnden Seren auf 56 bis 65 °C erwärmt werden, um störende wärmelabile Antikörper zu inaktivieren. Es wurde nun gefunden, dass eine Klasse von 15 störenden Antikörpern die Wärmebehandlung überlebt. Diese Klasse sind die Antikörper, welche mit N.m. eine Nebenreaktion eingehen, wodurch falsche positive Reaktionen erzielt werden, da diese Antikörper reagieren, wenn sie mit den oben beschriebenen N.g. Antigen-Zusammensetzungen getestet wer- 20 den.

Die Anzahl an falschen positiven Reaktionen, welche in den früheren Testverfahren erhalten wurden, liegt innerhalb der für eine freiwillige Massenuntersuchung annehmbaren Grenzen. Das mit falschen positiven Resultaten verbundene psychologi- 25 sehe Trauma, insbesondere wenn sich jemand dem Test als rechtliche Bedingung für die Verheiratung unterzieht, erfordert, dass die Anzahl an falschen positiven Resultaten auf ein Minimum reduziert wird, selbst wenn dadurch ein gewisser Verlust der Empfindlichkeit des Tests in Kauf genommen wer- 30 den muss.

Das Auftreten von Nebenreaktionen wurde festgestellt,

unter Verwendung von Seren, von welchen bekannt war, dass sie entweder N.g.-Antikörper, N.m.-Antikörper oder beide enthielten, in Tests mit N.g. antigenen Zusammensetzungen, 35 welche wie oben beschrieben hergestellt wurden, oder mit N.m. antigenen Zusammensetzungen, welche wie oben allgemein beschrieben zubereitet wurden. Es wurde beobachtet, dass einige der Antikörper, welche mit N.m. reagieren, mit N.g.-Anti-genen reagieren und ein positives Resultat ergeben, unabhän- 40 gig davon, ob der Patient mit Gonorrhoe infisziert war oder vollständig frei von einer derartigen Infektion war, wie sich durch bakteriologische Untersuchungen und klinische Befunde nachweisen Hess.

Es wurden daher N.m.-antigene Zusammensetzungen, 45 welche im folgenden als N.m.-Sorbens-Zusammensetzungen bezeichnet werden, für die ersten Reaktionen mit den zu untersuchenden Seren hergestellt. Durch dieses Verfahren können alle störenden Antikörper in den Seren durch die Sorbens-Zusammensetzung gebunden oder absorbiert werden. Das 50 resultierende Gemisch von Sorbens und Seren kann sodann mit einer N.g.-antigenen Zusammensetzung, welche wie oben beschrieben zubereitet wurde, inkubiert werden, wobei die Gefahr von falschen positiven Reaktionen auf ein Minimum herabgesetzt ist. 55

Die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendeten N.g.-antigenen Zusammensetzungen können alle jene sein, deren Herstellung oben beschrieben wurde. Vorzugsweise weisen die N.g.-antigenen Zusammensetzungen einen N.g.-Antigen-Einheitswert von mindestens 100 Ag.U./mg Pro- 60 tein auf. Der ideale Wert beträgt 1000 oder mehr. Derartige Zusammensetzungen können auf Antigen-Plättchen, wie oben beschrieben, vorliegen, oder als Zellsuspensionen oder es können lyophilisierte Präparate sein.

Auf ähnliche Weise können die N.m.-Sorbens-Zusammen- 65 Setzungen Zellsuspensionen sein oder sie können auf einem Plättchen vorliegen oder lyophilisiert sein, oder sie können das Antigen adsorbiert an einem der oben erwähnten Träger, z.B.

Polystyrol, Glas, Siliciumoxid, Bentonit, Aktivkohle, «Sepha-rose» oder «Sephadex», enthalten.

Zur Vereinfachung können die Zusammensetzungen durch Angabe der Sorbens-Einheiten bezeichnet werden. Zusammensetzungen, welche 50 bis 10 000 Sorbens-Einheiten pro Milligramm Protein enthalten, sind für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich. Die Sorbens-Einheit (SU) wird als diejenige Menge eines ganzen, teilweise gereinigten oder reinen N.m.-Antigen-Präparates, ausgedrückt als Milligramm Protein, definiert, welche, wenn man sie mit wärmeinaktiviertem Serum, welches derart verdünnt wurde, dass es je eine Antikör-per-Einheit pro N.g.-Einheit enthält und den geeigneten Sero-Gruppen von N.m. reagieren lässt, diejenigen Antikörper absorbiert, welche mit N.m. reagieren, nicht jedoch diejenigen, welche mit N.g. reagieren.

Wenn dieses absorbierte Serum verwendet wird, um N.m.-Plättchen zu behandeln, die mit Anti-Menschen-IgG, welches an Fluorescein gebunden ist und derart verdünnt ist, dass es zwei Konjugat-Einheiten/0,05 ml enthält, gegenbehandelt wurden, ergibt es eine Fluoreszenz von Schatten bis 1 +, aber wenn dasselbe absorbierte Serum verwendet wird um N.g.-Plättchen zu behandeln, sollte eine Fluoreszenz von 3 bis 4+ beobachtet werden.

Die optimale Verdünnung des Sorbens variiert je nach den verwendeten Test-Verfahren, z.B. Radioimmunotest, Enzymimmunotest, Agglutinations- oder Immunofluoreszenz-Absorptionstest. Im Fall des letztgenannten Verfahrens werden die besten Resultate mit einer Verdünnung erhalten, welche 0,5 Einheiten Sorbens/0,2 ml enthält, welche mit 0,2 ml wärmeinaktivierten Serums des Patienten vermischt wird.

Sorbens-Zusammensetzungen können derart hergestellt werden, dass sie Antigene aus einer oder allen Serumgruppen enthalten. Wenn die Zusammensetzung Antigene von mehr als einer Gruppe enthalten soll, ist es am besten, sie getrennt nach dem oben allgemein beschriebenen Verfahren herzustellen und sie dann im geeigneten Verhältnis zu mischen, um das gewünschte Arbeits-Sorbens zu erhalten.

Bekanntlich herrschen Infektionen, welche einer oder mehreren spezifischen Sero-Gruppen zugeschrieben werden, mehr oder weniger in einer spezifischen geographischen Gegend vor. So werden im Nordosten der Vereinigten Staaten mehr Infektionen beobachtet, welche mit Sero-Gruppen A, B und C verbunden sind, als solche, welche mit anderen Sero-Gruppen . zusammenhängen. Es ist ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass N.m.-antigene Sorbens-Zusammensetzun-gen den Bedürfnissen einer spezifischen Gegend angepasst werden können. So können die Zusammensetzungen ein oder mehrere Antigene aus verschiedenen Gruppen enthalten.

Zwecks Vereinheitlichung beträgt die Konzentration von jeder Sero-Gruppe in einer fertigen Sorbens-Zusammenset-zung mit Vorteil etwa 0,3 bis 0,6 SU/0,2 ml Verdünner.

Testresultate, welche durch das Immunofluoreszenz-Ver-fahren mit über 500 Seren, einschliesslich Seren von Menschen, die durch klinische und bakteriologische Untersuchungen als positiv bzw. negativ festgestellt wurden, haben ergeben, dass die Anzahl falscher positiver Resultate um 58% herabgesetzt werden können (2+ oder höhere wurden um 42% herabgesetzt) und die Grenzreaktionen wurden um 75% reduziert, verglichen mit den früher beschriebenen Verfahren. Dies stellt ein bemerkenswertes Resultat dar, wenn man berücksichtigt, dass die Empfindlichkeit der zuvor beschriebenen Tests 81% betrug und die Spezifität 93% (7% falsche positive Resultate und 9 bis 10% Grenzreaktionen) in der untersuchten Bevölkerung von asymptomatischen Frauen (Massenuntersuchung an 11 800 Frauen).

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher.

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Beispiel 1 : N.m.-Sorbens-Zusammensetzung reszenz aufweisen, werden als verwendbar betrachtet und auf

I) Sorbens-Zusammensetzung für N. menigitidis Serogruppe A. entsprechenden Original-Schrägagar subkultiviert. A) Herstellung des Sorbens: (5) Zellen mit störenden Antigenen werden auf einem

(1) Stämme von N. meningitides, welche die Standard-Refe- Aktivkohle enthaltenden Wachstumsmedium (Tabelle V) renzstämme darstellten [für die verschiedenen Sero-Gruppen 5 Gewebekulturflaschen von etwa 0,8 Liter Inhalt (29 oz.) subkul-(ATCC13077,13090,13102,13113) wie auch alle neu beschrie- tiviert und während 18 bis 24 Stunden inkubiert.

benen Sero-Gruppen, welche in der Gemeinschaft vorherr- (6) Das Wachstum aus den Flaschen wird geerntet und sehen können] werden aus dem Lagermedium (Tabelle III) in wird, sofern es sich bei der Gramfärbung als rein erweist, verlyophilisiertem Zustand, subkultiviert oder aus Kulturen, wendet, um grosse Bleche zu beimpfen, welche dasselbe Aktivweiche in flüssigem Stickstoff gefroren gehalten werden auf io kohlenmedium enthalten.

einem geeigneten Kulturmedium, vorzugsweise Schokoladen- (7) N ach 18 bis 24 Stunden Inkubation wird das. Wachstum

Agar-Platten (Kaninchenblut) (Tabelle II) gezüchtet. aus den Blechen in physiologische Kochsalzlösung verbracht,

(2) Typische Kolonien werden verwendet, um Schokolade-/ durch sterile Gase filtriert und mit 5000 Touren pro Minute Schrägagar-Platten zu impfen. während 10 Minuten zentrifugiert. Die Kugel wird in 0,3%igem

(3) Die Schrägagar werden während 18 bis 24 Stunden bei 15 Natriumdodecylsulfat (SDS) in physiologischer Kochsalzlö-36 °C inkubiert und das Wachstum durch Gramfärbung auf sung (4 ml/g Nassgewicht) wieder suspendiert. Die Suspension seine Reinheit geprüft. wird während 10 Minuten bei Zimmertemperatur leicht homo-

(4) Reine Kulturen werden auf die Gegenwart von stören- genisiert und anschliessend während 10 Minuten mit 15 000 den Antigenen wie folgt untersucht: Touren pro Minute zentrifugiert. Die überstehenden Fraktio-

(i) Zellen werden in einem Medium suspendiert, welches 2% 20 nen werden vereint und die Zellkugel mit 0,5% SDS wie zuvor (Gewicht/Volumen) Saccharose und 0,2% (Gewicht/Volumen) nochmals extrahiert.

Gelatine in physiologischer Kochsalzlösung enthält, die Klum- (8) Die vereinten Extrakte werden mit einer Amicon-XM-pen sorgfältig zerkleinert und die Dichte der Suspension so ein- 50-Zelle unter Verwendung einer Amikon-Membran-XMIOOA gestellt, so dass sie einer Standard-Dichte von 1 x 108 Zellen/ml konzentriert.

entspricht. 25 (9) Der konzentrierte Extrakt wird an einer Säule aus

(ii) Ein kleiner Tropfen der Suspension wird auf ein reines «Sepharose 4B» chromatographiert und mit 0,002 M Natrium-Mikroskopträgerglas (10 Flecken maskierte Gläser) verbracht phosphatpuffer, pH 7,6, eluiert.

und mit einer 5-mm-Öse verstrichen. ( 10) Das Poren-Volumen wird mit «Ficol» auf einen Zehntel

(iii) Die Plättchen werden an der Luft getrocknet und in 2% seines Volumens reduziert, in flüssigem Stickstoff gefroren, aufgepufferter Formalinlösung während 10 Minuten fixiert, gewa- 30 getaut und während 3 Stunden bei Zimmertemperatur mit sehen durch dreimaliges Eintauchen in destilliertes Wasser, in EDTA und «Triton X-100» während 3 Stunden inkubiert bei einem frischen Wasserbad während 4 Minuten gespült, abtrop- einer Endkonzentration von 10 mM EDTA und 1,5% «Triton fen gelassen und mit Fliesspapier getrocknet. X-l 00».

(iv) Ein bekanntes Serum eines positiven Patienten wird als (11) Das Gemisch wird mit 100 000 x g während 1 Stunde Kontrolle verwendet. Die Arbeitsverdünnung ist derart, dass 35 zentrifugiert.

eine Fluoreszenz von 3 bis 4+ mit einem guten N.m.- und N.g- (12) Die überstehende Flüssigkeit wird als das lösliche Anti-

Antigen-Plättchen erzielt wird. gen bezeichnet und als Sorbens ohne weitere Reinigung ver-

(v) Das Kontrollserum wird auf die geeignete Arbeitsver- wendet nach Bestimmung der Proteinkonzentration.

dünnung verdünnt und während 30 Minuten in einem Wasserbad von 59 °C erhitzt. 40 B) Bestimmung der Sorbens-Einheiten und Arbeits-Sorbens:

(vi) Ein Tropfen des erhitzten Serums wird auf jeden Anti- (1) Verschiedene Verdünnungen des Sorbens werden her-gen-Flecken aufgebracht und die Plättchen bei Zimmertempe- gestellt, um 10 bis 0,1 ng Protein/0,2 ml Kochsalzlösung zu ent-ratur während 20 Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert, halten.

(vii) Die Plättchen werden zehnmal rasch in 0,1 M. mit Phos- (2) 0,2 ml wärmeinaktiviertes Kontrollserum, welches der-phat gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,6, gewaschen, während 45 art verdünnt ist, dass es eine N.g.-Antikörper-Einheit, eine N.m. 10 Minuten in eine frische Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (spezifische Gruppe-)Antikörper-Einheit/0,05 ml enthält, wer-(PBS) eingelegt, 10 Minuten in destilliertem Wasser gespült und den mit 0,2 ml der geeigneten Verdünnung des Sorbens veranschliessend sorgfältig mit Fliesspapier getrocknet. mischt.

(viii) Ein Tropfen der Arbeitsverdünnung von Isothiocyanat (3) Das Gemisch wird während 1 Stunde bei Zimmertempe-mit Fluorescein konjugiertem Anti-Menschen-IgG wird auf 50 ratur inkubiert.

jeden Flecken aufgebracht und 20 Minuten einwirken gelassen, (4) Die «sorbierte» Serumprobe und eine (nicht-absor-worauf das Präparat, wie oben beschrieben, gewaschen und bierte) Kontrolle, welche aus ähnlich behandelter 0,2 ml Kochgetrocknet wird (Stufen vi bis vii). salzlösung anstelle des Sorbens besteht, werden verwendet, um

(ix) Plättchen werden in Glycerin-Carbonat-Bicarbonat-Puf- N.g.- und N.m.-Plättchen, wie oben beschrieben, zu behandeln fer pH 9,0, montiert (mounted) und unter einem Fluoreszenzmi- 55 (Stufen 4vi bis 4ix).

kroskop beobachtet. Das für die vorliegenden Untersuchungen (5) Die niedrigste Konzentration an Sorbens, welche die verwendete Mikroskop war ein Leitz-Ultraviolett-Mikroskop Fluoreszenz auf Schatten bis 1 + auf N.m.-Plättchen reduziert (orthoplan), welches mit einem reflektierten Lichtsystem nach im Vergleich mit einer Fluoreszenz von 3 bis 4+ bei der nicht-Ploem, einer HBO-200-Lichtquelle, einem 3-mm-BG-470-Exci- absorbierten Kontrolle, welche jedoch die Fluoreszenz auf der ter-Filter, zwei BG-38-rotausscheidenden Filtern im Lampenge- 60 N.g.-Platte nicht in beachtlichem Mass reduziert, wird als gleich häuse und einem K490-Exciter-Filter und einem 530-Okular-Fil- einer Sorbens-Einheit betrachtet und als |ig-Protein ausge-ter in der Ploem-Vorrichtung ausgestattet war. Die Plättchen drückt. Die Aktivität des Sorbens entspricht wurden unter dem lOOX-ölimmersionsobjektiv (1250X) beobachtet. Ähnliche Resultate konnten erhalten werden unter Ver- 1000

wendung des durchgehenden Lichtsystems (transmitted light 65 1 (SU) als jig-Protein system) und der oben beschriebenen Filterkombination (Seite

27). (6) Die Arbeits-Sorbens-Mischung wäre die angepasste Ver-

(x) Zellen, welche drei bis vier homogene, peripherale Fluo- dünnung, welche 0,05 SU/0,2 ml Kochsalzlösung äquivalent ist.

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IO

II. Sorbens-Zusammensetzung von N. menigitidis Sero-Gruppe B.

gleich wie «I», doch ist der N. menigitidis-Stamm N.m. Sero-Gruppe B, Referenzstamm ATCC13090.

III. Sorbens-Zusammensetzung von N. menigitidis Sero-Gruppe C.

Gleich wie «I», doch ist der N. menigitidis-Stamm N.m. Sero-Gruppe C, Referenzstamm ATCC 13102.

IV. Sorbens-Zusammensetzung von N. menigitidis Sero-Gruppe D.

Gleich wie «I», doch ist der N. menigitidis-Stamm N.m. Sero-Gruppe D, Referenzstamm ATCC 13113.

V. Sorbens-Zusammensetzung von N. menigitidis Sero-Gruppe X.

Gleich wie «I», doch ist der N. menigitidis-Stamm N.m. sla-terus Sero-Gruppe X.

VI. Sorbens-Zusammensetzung von N. menigitidis Sero-Gruppe Y.

Gleich wie «I», doch ist der N. menigitidis-Stamm N.m. sla-terus Sero-Gruppe Y.

VII. Sorbens-Zusammensetzung von N. menigitidis Sero-Gruppe Z.

Gleich wie «I», doch ist der N. menigitidis-Stamm N.m. sla-terus Sero-Gruppe Z.

VIII. Arbeits-Sorbens-Zusammensetzung:

(1 ) Das Sorbens-Gemisch wird hergestellt gemäss dem vorherrschenden N. menigitidis in der Gemeinschaft, obwohl ein Universalgemisch möglich ist, wenn hochaktive Sorbens-Prä-parate 5000 bis 10 000 SU/mg Protein verwendet werden.

(2) Das Arbeitsgemisch wird hergestellt durch Vermischen gleicher Volumina der einzelnen gewünschten Sorbentien, wobei jedes berechnet wird auf einen Gehalt von 0,5 SU. Das verwendete Volumen wird wie folgt berechnet:

V= M N

V = Volumen von jedem Sorbens N = Anzahl einzelner verwendeter Sorbenzien.

Beispiel 2: Fluoreszenz-Gonorrhoe-Test - asorbiert (FGT-ABS)

Herstellung des Antigens:

( 1 ) Frische Isolate von N.g. mit geeignetem Antigen-Profil oder eine lyophilisierte Subkultur der Standard-Stämme (ATCC 21823,21824 und 21825) werden auf ein Vorratsmedium (Tabelle III) subkultiviert oder in Proteose-Pepton-Brühe mit 10% DMSO suspendiert und in flüssigem Stickstoff (-176 °C) gefroren oder lyophilisiert.

(2) Die Stämme werden nach Bedarf auf frisch zubereiteten Schokolade-Agar-Platten (Kaninchenblut) (Tabelle II) subkultiviert.

(3) Die Platten werden während 24 Stunden bei 36 °C in einer 4 bis 10% CO2 enthaltenden Atmosphäre inkubiert.

(4) Typische Kolonien werden verwendet, um Schokolade-Schrägagar zu impfen.

(5) Die Schrägagar werden während 18 bis 24 Stunden inkubiert und reine Kulturen werden verwendet.

(6) Die Zellen werden in ein suspendierendes Medium verbracht, welches 2% (Gewicht/Volumen) Saccharose und 0,2% (Gewicht/Volumen) Gelatine in physiologischer Kochsalzlösung enthält, alle Klumpen sorgfältig zerkleinert und die Dichte der Suspension visuell derart eingestellt, dass sie einer

Standard-Dichte von 1 x 108 Zellen/ml entspricht.

(7) Ein kleiner Tropfen der Suspension wird auf einer vorgezeichneten Fläche auf sauberen mikroskopischen Plättchen aufgebracht und mit einer 5 mm Öse verstrichen. (Automatisches Aufbringen unter Verwendung eines Dispensers ist möglich).

(8) Die Plättchen werden an der Luft getrocknet und in 2%igem gepuffertem Formalin während 10 Minuten fixiert, durch dreimaliges Eintauchen in destilliertes Wasser gewaschen, in einem frischen Wasserbad während 4 Minuten gespült, abtropfen gelassen und mit Fliesspapier trockengetupft.

(9) Jeder Ansatz wird mit einer bekannten positiven Kontrolle verglichen, welche in einer Verdünnung von 1:10 eine Fluoreszenz von 4+ ergibt und verdünnt ist um eine Fluoreszenz vonl bis 2+ mit guten Plättchen zu ergeben. Eine negative Kontrolle wird ebenfalls verwendet. Nur Ansätze, welche die erwarteten positiven, an der Grenze liegenden und negativen Reaktionen ergeben, werden als genügend betrachtet und verwendet.

(10) Befriedigende Ansätze werden bei -20 °C in verschlossenen Behältern, welche Calciumchloridkristalle enthalten, aufbewahrt. Die Plättchen wurden nach Bedarf hergestellt, aber ein Ansatz, welcher zur Überprüfung der Lagerfähigkeit verwendet wurde, war nach 9 Monaten immer noch befriedigend.

Herstellung des Patienten-Serums:

(1) Das Serum des Patienten wird mit physiologischer Kochsalzlösung im Verhältnis 1:5 verdünnt.

(2) 0,5 ml der verdünnten Lösung wird während 30 Minuten in einem Wasserbad bei 59 °C erwärmt.

(3) 0,2 ml des wärmeinaktivierten Serums werden mit 0,2 ml des Sorbens vermischt, welches 0,5 SU Sorbens A und 0,5 SU Sorbens C enthält.

(4) Das Gemisch wird während 1 Stunde bei Zimmertempe-tigkeitskammer inkubiert.

Färben:

(1) Plättchen werden aus dem Freezer 10 bis 15 Minuten vor der Verwendung herausgenommen und mit dem Namen oder mit der Nummer des Patienten versehen.

(2) Ein Tropfen des sorbierten Serums wird auf den auf geeignete Weise markierten entsprechenden Fleck auf den Mehrfleck-Plättchen aufgebracht.

(3) Dann wird während 20 Minuten bei RT in einer Feuch-tigkeiskammer inkubiert.

(4) Das Präparat wird rasch zehnmal in einer 0,1 M phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) vom pH 7,6 gewaschen, während 10 Minuten in ein frisches PBS-Bad gelegt, zehnmal in destilliertem Wasser gespült und anschliessend vorsichtig trok-kengetupft.

(5) Man fährt mit einer Arbeitsverdünnung von durch Iso-thioçyanat an Fluorescein konjugiertes Anti-Menschen-Immu-nogfobulin-G während 20 Minuten, worauf ein Waschzyklus wie in Stufe 4 beschrieben angeschlossen wird.

(6) Die Plättchen werden in einen Glycerin-Carbonat-Bicar-bonat-Puffer vom pH 9,0 montiert.

Ablesung:

Die Plättchen werden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop untersucht, welches für durchgehende oder reflektierte Lichtsysteme ausgestattet ist.

(1) Durchgehendes Licht.

Das Fluoreszenzmikroskop kann mit jeder Lichtquelle mit einem Emissionsspektrum ausgerüstet sein, welches das Fluo-rescein-Isothiocyanat-Excitationsspektrum einschliesst. Ein gutes Beispiel ist eine Quecksilberlampe HBO-200. Das Mikroskop ist mit 3 mm BG-12-Exciter-Filter, einem GB-38-rotaus-

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schliessenden Filter, einem OG-l-Okular-Filter, einem Dunkel- (5) Dann werden 0,1 ml der Arbeitsverdünnung von Meer-feldkondenser und einem lOOX-Ölimmersions-Objektiv rettich-Peroxidase (HRP) konjugiert mit Anti-Menschen-Immu

( 1OOOX) ausgestattet. noglobulin-G zugesetzt.

(2) Reflektiertes Licht. (6) Das Gemisch wird bei 37 °C während 15 Minuten in

Ein Fluoreszenz-Mikroskop, ausgerüstet mit jeder geeigne- 5 einem Wasserbad inkubiert.

ten Lichtquelle. Das hier verwendete Mikroskop war mit einer (7) Man setzt 5,0 ml PBS zu, zentrifugiert und wäscht das H B0-200-Lichtquelle, 3 mm GB-470-Exciter-Filter, zwei BG-38- Kügelchen wie in Stufe 4 beschrieben.

rotausschliessenden Filtern, einem K490-Exciter-Filter und (8) Man setzt 3,0 ml Substrat (Tabelle) zu und vermischt einem 530-0kular-filter ausgestattet. Die Plättchen wurden durch Schütteln.

unter dem lOOX-Ölimmersions-Objektiv (1250X) untersucht, io (9) Nach 5 Minuten wird die Reaktion unterbrochen durch

Zusatz von einem Tropfen 6N Schwefelsäure.

Interpretation der Resultate: (10) Das O.D. wird bei 400 mm gemessen.

Der Grad an peripherer Fluoreszenz der bakteriellen Zellen wurde eingeteilt von Schatten (S) bis 4-K Proben, welche Interpretation:

eine Fluoreszenz von 1 bis 2+ oder mehr aufweisen werden als 15 Reaktive Seren werden angezeigt durch Vergleich mit positiv betrachtet und dahin interpretiert, dass sie eine gegen- einer Standard-Kurve, welche mit bekannten positiven und wärtige oder vor kurzem durchgemachte Infektion mit N. negativen Seren hergestellt wird.

gonorrhoeae anzeigen.

Kontrollen (sollten jedem Ansatz zugefügt werden)

Beispiel 3: Enzymgebundener Immunotest 20 a) Positive Kontrollen

A) Unlösliches Protein-Bakteriengel: b) Negative Kontrollen

Herstellung des Antigens c) Schwach positive Kontrollen (Grenzfälle)

(1 ) Frische Isolate von N.g. mit geeignetem antigenem Pro- d) Antigen-Kontrolle fil oder Subkulturen aus Standard-Stämmen (ATCC 13077, e) Substrat-Kontrolle

13102,13113) werden im Lagermedium (Tabelle III) aufbe- 25 f) Enzym-Kontrollen.

wahrt, lyophilisiert oder gefroren auf Schokoladen-Schrägagar-Platten (Kaninchenblut) (Tabelle II) gezüchtet. B) Filtertest:

(2) 18- bis 24stündiges Wachstum wird in physiologischer Herstellung des Antigens:

Kochsalzlösung verbracht und auf etwa 3 bis 4 x 10s Kolonie- (1) Die Zellsuspension wird zubereitet wie in «A», Stufe 1

einheiten (colony firming units) (CFU/ml) eingestellt. 30 und 2.

(3) Kaninchen-IgG in 0,1 m phosphatgepufferter Kochsalz- (2) Die Suspension wird bis zum Gebrauch in einem Kühllösung, pH 7,0, wird zu der Bakteriensuspension zu einer End- schrank aufbewahrt.

konzentration von 50 mg/ml zugesetzt.

(4) Eine wässerige Lösung von 2,5% Glutaraldehyd wird Herstellung des Patienten-Serums tropfenweise unter langsamem Rühren bis zu einer Endkonzen- 35 Wie in «A».

tration von 10 mg Glutaraldehyd pro 100 mg Protein in Lösung zugesetzt. Verfahren:

(5) Das Gemisch wird während 1 Stunde stehengelassen. (1) 0,2 ml der Bakteriensuspension werden mit 0,2 ml des

(6) Das unlösliche Protein-Bakteriengel wird in 0,2 M phos- sorbierten Serums in einem wegwerfbaren Röhrchen ver-phatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, dispergiert und wäh- 40 mischt.

rend 15 Minuten mit 3000 Touren pro Minute zentrifugiert. (2) Das Gemisch wird während 15 Minuten bei 37 °C inku-

(7) Stufe 6 wird zweimal wiederholt. biert.

(8) Das Protein-Bakteriengel wird in einem Volumen von (3) Dann wird dreimal mit 5,0 ml PBS gewaschen.

0,2 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, welches (4) Die Zellsuspension wird wiederum in 1,0 ml PBS suspen-

viermal dem Volumen des in Stufe 3 zugesetzten Kaninchen- 45 diert und auf einen wegwerfbaren Filter gegeben und die Puf-protein entspricht, wieder suspendiert. ferlösung durch Absaugen entfernt.

(9) Die Suspension wird in aliquote Teile von 0,25 ml geteilt (5) 0,1 ml der Arbeitsverdünnung von Meerrettichperoxi-und bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt. dase konjugiert mit Anti-Menschen-Immunoglobulin-G werden zugesetzt.

Herstellung des Patienten-Serums : 50 (6) Das Gemisch wird während 15 Minuten bei 37 °C inku-

( 1 ) Das Patienten-Serum wir din 0,2 M phosphat-gepufferter biert.

Kochsalzlösung, pH 7,2, (PBS) verdünnt auf 1:5,1:50,1:500. (7) Dann wird dreimal mit 5,0 ml PBS gewaschen und das

(2) Die verschiedenen Verdünnungen werden während 30 letzte Waschwasser auf Enzymaktivität geprüft. Das Waschen Minuten in einem Wasserbad von 59 °C erwärmt. sollte fortgesetzt werden, falls Enzym im Waschwasser festge-

(3) 0,2 ml erwärmtes, inaktiviertes Serum werden zu 0,2 ml 55 stellt wird.

Sorbens in PBS zugesetzt. (8) 1,0 ml Substrat werden zugesetzt.

(4) Das Gemisch wird bei Zimmertemperatur inkubiert. (9) Reaktive Seren ergeben rötlich-braune Pigmentierung des Filters.

Verfahren:

(1) Je 0,25 ml der sorbierten und der wärmeinaktivierten 60 Beispiel 4: Konjugation an nicht-antigenen Trägern Verdünnung des Patienten-Serums werden zu 0,25 ml Antigen A) Sorbens-Zellulose (S-C)

zugesetzt und vermischt. ( 1 ) Gleiche Volumina von Sorbens-A-Lösung, welche ein

(2) Das Gemisch wird während 15 Minuten in einem Was- Minimum von 100 SU/mg Protein enthält und von DEAE-Zellu-serbad bei 37 °C inkubiert. lose in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8 werden vermischt und

(3) Man zentrifugiert während 5 Minuten bei 3000 Touren 65 über Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Das pro Minute und verwirft die überstehende Flüssigkeit. Gemisch wird sodann filtriert und dreimal mit einem gleichen

(4) Das Kügelchen (pellet) wird zweimal mit 5 Volumina Volumen von 0,3 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 gewaschen, PBS gewaschen. gefolgt von weiteren drei Wäschen mit gleichem Volumina 0,1

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12

M Phosphatpuffer vom pH 7,0 mit 1% Albumin.

(2) Das gewaschene Sorbens-Zellulose-(S-C-)Konjugat wird in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 mit 1% Albumin auf ein gleiches Volumen wie dasjenige der ursprünglichen Lösung wiedei suspendiert.

(3) Die Sorbens-Aktivität des Konjugates wird wie oben beschrieben (Beispiel 1B) und in 0,1 M Phosphatpuffer vom pH 7,0 mit 1% Albumin verdünnt, so dass es 5 SU/ml enthält.

(4) 0,5 ml des S-C werden mit dem gleichen Volumen des Patienten-Serums vermischt und bei Zimmertemperatur während 1 Stunde inkubiert.

(5) Dann wird während 10 Minuten mit 3000 Touren pro Minute zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit (sortiertes Serum) verwendet.

(6) Das sorbierte Patienten-Serum kann in verschiedenen Agglutinations-, Radioimmuno- und Immunofluoreszenz-Tests verwendet werden.

B) Sorbens-«Sepharose» (S-S)

( 1 ) M an mischt 1 g von mit Cyanogenbromid aktivierten «Sepharose IV»-Partikel (CNB-Sepharose activated - Pharmacia Fine Chemicals) mit 5-ml-Portionen von 10-3 M HCl.

(2) Die Fraktionen, welche mindestens 100 SU/mg Protein enthalten, werden auf das «Sepharose»-Bett gegossen und das Filtrat mehrmals zurückgeführt, bis das Protein adsorbiert ist, wobei während der ganzen Dauer der Operation eine Temperatur von 5 bis 10 °C aufrechterhalten wird.

(3) Alle verbleibenden aktiven Stellen der «Sepharose» werden durch Zusatz von 5 bis 10 ml 0,5%igem Rinderserum-Albuminin 1M Glycerinpuffer vom pH 8,2 blockiert, und das Filtrat über Nacht mit Hilfe einer kontinuierlichen Fliesspuri-

5 staltikpumpe (flow puristaltic pump) umgewälzt.

(4) Das Filtrat wird sodann ablaufen gelassen und die Partikel in 10 ml Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wird während 10 Minuten mit etwa 10 000 Touren pro Minute zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit dekantiert und ver-

io worfen wird.

(5) Das Waschen wird wie in Stufe 4 wiederholt und der Niederschlag gewonnen.

(6) Die Sorbens-Partikel (S-S) werden in etwa 10 ml Kochsalzlösung suspendiert.

15 (7) Die Sorbens-Aktivität des Konjugates wird wie oben beschrieben bestimmt und verdünnt, um 5,0 SU/ml zu enthalten.

(8) 0,5 ml des S-S werden mit dem gleichen Volumen des Patienten-Serums vermischt und bei Zimmertemperatur während 1 Stunde inkubiert.

20 (9) Dann wird während 10 Minuten mit 5000 Touren pro Minute zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, d.h. sor- . bierte Serum, gewonnen.

( 10) Das sorbierte Serum kann in verschiedenen Agglutinations*, Radioimmuno- und/oder Immunofluoreszenz-Tests ver-

25 wendet werden;

Claims (14)

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   2

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Serologisches Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Neisseria gonorrhoeae-Antikörpern in menschlichem Serum, dadurch gekennzeichnet, dass man das Serum auf 56 bis 65 °C während 15 bis 30 Minuten erhitzt, wobei das Serum unverdünnt oder mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer Verdünnung bis zu 1:1000 verdünnt sein kann, das Serum zu einem gleichen Volumen Neisseria meningitides-Sorbens-Zusammensetzung zusetzt, welche 0,1 bis 100 Sorbens-Einhei-ten Neisseria meningitides-Antigen enthält, um störende Antikörper zu entfernen und anschliessend das erhaltene Gemisch mit einer Zusammensetzung vermischt und inkubiert, welche ein wärmelabiles Neisseria gonorrhoeae-Antigen enthält, das aus einer Kultur von Neisseria gonorrhoeae-Antigen erhalten wurde, um Neisseria gonorrhoeae-Antigen-Antikörper-Konju-gat zu bilden, wenn diese Antikörper zugegen sind, und dieses Konjugat bestimmt wird.
2. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Neisseria gonorrhoeae-Antigen-Zusammenset-zung eine Zellsuspension ist.
3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Neisseria gonorrhoeae-Antigen-Zusammenset-zung einen Antigen-Einheitswert von mindestens 1000

   Ag- U/mg Protein enthält.
4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Wert mindestens 1000 Ag- U/mg Protein beträgt.
5. 5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Neisseria gonorrhoeae-Antigen an einen Träger gebunden ist und in einem Agglutinationstest verwendet wird.
6. 6. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Neisseria gonorrhoeae-Antigen-Antikörper-Kon-jugat durch Reaktion mit einem markierten Anti-Men-schen-lgG festgestellt wird.
7. 7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Anti-Menschen-IgG mit einer chemischen Substanz markiert ist, welche fluoresziert, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt wird.
8. 8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Substanz aus der Gruppe bestehend aus Fluorescein, Rhodamin und Auramin ausgewählt ist.
9. 9. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Anti-Menschen-IgG mit einem radioaktiven Element markiert ist.
10. 10. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktive Element aus der Gruppe bestehend aus l4C, mI, ,25I und 35S ausgewählt ist.
11. 11. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das N eisseria gonorrhoeae-Antigen mit einem ' radioaktiven Element markiert ist.
12. 12. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Anti-Menschen IgG mit einem Enzym markiert ist.
13. 13. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Neisseria gonorrhoeae-Antigen mit einem Enzym markiert ist.
14. 14. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Peroxidase, ß-(B)-Glucuronidase, ß-(B)-D-GIucosidase, ß-(B)-D-galactosidase, Urase, Glukoseoxi-dase plus Peroxidase, Galactoseoxidase plus Peroxidase oder saure Phosphatase ist.

    Die Gonorrhoe ist gegenwärtig eine der verbreitetsten Krankheiten in den Vereinigten Staaten und sie stellt auf der ganzen Welt ein grosses Problem dar. Verschiedene Faktoren wurden als Grund für diese weite Verbreitung genannt, doch wird allgemein anerkannt, dass der Mangel an einem, für Massenuntersuchungen geeigneten Bluttest eine der wichtigsten Faktoren für das Misslingen einer Eindämmung dieser Krankheit darstellt. Es wurden bereits verschiedene serologische Testmethoden entwickelt, welche auf der Erzeugung eines Neisseria gonorrhoeae (N.g.)-Antigens beruhen, welches wärmelabil ist und mit N.g.-Antikörpern in menschlichen Seren reagiert, wodurch das Vorhandensein einer gegenwärtigen • oder vergangenen Gonorrhoe-Infektion nachgewiesen wird. Diese Verfahren weisen einen verhältnismässig hohen Grad an Spezifität auf, wodurch sie geeignet sind für einen zusätzlichen diagnostischen Test für die Verwendung in freiwilligen Untersuchungsprogrammen. Die soziale und psychologische Reaktion auf ein falsches positives Resultat bei einem vorgeschriebenen vorehelichen Test ist jedoch derart ungünstig, dass Methoden mit höherer Spezifität dringend erwünscht sind.

    Es wurde nun gefunden, dass das Risiko von falschen positiven Reaktionen bei serologischen Untersuchungen auf N.g-Antikörper wesentlich herabgesetzt werden kann, indem man zuerst die zu untersuchenden Seren mit einem Mittel absorbiert, welches Neisseria meningitides (N.m.) festhält. Dieses Mittel entfernt alle eine Nebenreaktion bewirkenden Antikörper, welche vorhanden sein können aus dem Serum. Es wurde gefunden, dass etwa 60% der falschen positiven Reaktionen auf die Tatsache zurückzuführen sind, dass N.g.-Antigenzusammen-setzungen falsche positive Resultate mit Seren ergeben können, welche Meningitides-Antikörper enthalten, die mit Neisseria meningitides reagieren.