DE2608733A1 - Reagens zur bestimmung von fibrinogen, fibrinspaltprodukten und fibrinogenspaltprodukten im blut und verfahren zur herstellung desselben - Google Patents
Reagens zur bestimmung von fibrinogen, fibrinspaltprodukten und fibrinogenspaltprodukten im blut und verfahren zur herstellung desselbenInfo
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Description
Reagens zur Bestimmung von Fibrinogen, Fibrinspaltprodukten und Fibrinogenspaltprodukten im Blut und Verfahren
zur Herstellung desselben
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Reagens und Verfahren zum Nachweis von Fibrinogen, Fibrinogenspaltprodukten
und/oder Fibrinspaltprodukten im Blut unter Verwendung einer Suspension von abgetöteten, gefärbten
Staphylococcus-areus-Zellen.
Die Bestimmung von Fibrinogen, Fibrinspaltprodukten und Fibrinogenspaltprodukten im Blut unter Verwendung von
Staphylococcus-aureus-Zellen ist bekannt.
Es hat sich gezeigt, daß Staphylococcen-Zellen zwei Arten von Koagulase enthalten, nämlich eine freie Koagulaseform
und eine gebundene Koagulaseform. Die freie Koagulase verursacht bei ihrer Freisetzung in ein Kulturmedium
eine Verklumpung bzw. Gerinnung von Fibrinogen. Obwohl jedoch die gebundene Koagulase bzw. der Klumpenbildungsfaktor
aus der Bakterienzelle nicht freigegeben
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ORIGINAL INSPECTED
-Z-
26Π8733
wird und folglich auch keine Verklumpung oder Gerinnung
hervorrufen kann, bedingt er in Gegenwart von Fibrinogen eine "Art von Verklumpung". Diese "Art von Verklumpung"
wurde bisher noch nicht endgültig charakterisiert, sie scheint jedoch durch eine Fällungsreaktion oder lokalisierte
Verklumpung von Fibrin an der Staphylococcus-aureus-Zellwand, die eine derartige "Verklumpungserscheinung" hervorruft,
bedingt zu sein (vgl. E.S. Duthrie in "J. Gen. Microbiol.", Band 10, Seiten 427 bis 436 (1954) und E.S.
Duthrie in "J. Gen. Microbiol.", Band 13, Seiten 383 bis 393 (1955)).
Von J. Hawiger und Mitarbeitern wurde in "J. Lab. Clin.
Med.», Band 75, Seiten 93 bis 108 (1970) beschrieben, daß von den beiden während einer Fibrinogenolyse gebildeten
Arten von Spaltprodukten lediglich die frühen Spaltprodukte mit Staphylococcus-aureus-Zellen eine Klumpen- oder
Pfropfenbildung hervorrufen. Die frühen Spaltprodukte enthalten Fibrinmonomere, Fibrinogenspaltprodukte und Fibrinspaltprodukte,
die als erste Hydrolyseprodukte aus der Einwirkung von Plasmin auf Fibrinogen oder Fibrin entstanden
sind. Die frühen Spaltprodukte stellen relativ große Peptide dar. Die spaten Spaltprodukte, die bei
fortgesetzter Hydrolyse der frühen Spaltprodukte anfallen, stellen dagegen kleinere Peptide dar. Späte Fibrinspaltprodukte
und späte Fibrinogenspaltprodukte rufen mit Staphylococcus-aureus-Zellen keine Klumpen- oder
Pfropfenbildung hervor. Von den genannten Autoren werden sowohl Objektträger als auch Reagensglastests zur
Ermittlung der Staphylococcen-Verklumpungseigenschaften der verschiedenen während der Fibrinogenolyse gebildeten
Spaltprodukte beschrieben.
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G89838/0861
Von D.E. Leavelle und Mitarbeitern wird in "Am. J. Clin.
Path.», Band 55, Seiten 452 bis 457 (April 1971) über eine Modifizierung des von Hawiger und· Mitarbeitern beschriebenen
Verfahrens berichtet. Bei dem modifizierten Verfahren werden Mikrotiterplatten verwendet, um eine
Verdünnungsreihe der Serumtestproben (sowie von Fibrinogenstandard)
zur Ermittlung von Fibrinogen, Fibrinmonomeren und Fibrinogenspaltprodukten im Blut über die Staphylococcen-Verklumpungseigenschaften
herzustellen.
Die Erfindung betrifft ein verbessertes Reagens und ein verbessertes Verfahren zum Nachweis von Fibrinogen, Fibrinspaltprodukten
und/oder Fibrinogenspaltprodukten im Blut unter Verwendung abgetöteter, angefärbter Staphylococcus-aureus-Zellen,
die nach einem von zwei verschiedenen Verfahren hergestellt wurden. Bei dem ersten Verfahren
werden Staphylococcus-aureus-Organismen in einem Nährmedium mit einem Polyalkylenglykol eines Molekulargewichts
von 1000 bis 5000 und einer ausreichenden Menge Triphenyltetrazoliumchlorid, das durch die wachsenden
Organismen unter Bildung von farbigem Triphenylformazan mit den Staphylococcus-aureus-Zellen reduziert werden
kann, inkubiert, dann die angefärbten Staphylococcusaureus-Zellen abgetötet und schließlich praktisch der
gesamte ungebundene Farbstoff entfernt. Bei dem zweiten Verfahren wird eine Suspension abgetöteter Staphylococcusaureus-Zellen
mit einer Suspension des Farbstoffs Fast Black Salt K versetzt, worauf die erhaltenen gefärbten
Zellen mehrmals zur praktisch vollständigen Entfernung von nicht-fixiertem Farbstoff wiederholt gewaschen werden.
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Die nach einem der beiden Verfahren erhaltenen gefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen werden zur Aufrechterhaltung
eines pH-Werts von etwa 7,4 in einem Imidazolpuffer suspendiert und gegebenenfalls lyophilisiert. Die Verwendung
von abgetöteten, angefärbten Staphylococcus-aureus· Zellen zum Nachweis von Fibrinogen, Fibrinogenspaltprodukten
und/oder Fibrinspaltprodukten liefert einen besser sichtbaren Endpunkt bei der Bewertung des Klumpungsphänomens
in einer Verdünnungsreihe der jeweiligen Serumtestprobe.
Es hat sich gezeigt, daß bei Verwendung abgetöteter, gefärbter Staphylococcus-aureus-Zellen zum Nachweis von
Fibrinogenspaltprodukten und/oder Fibrinspaltprodukten im Blut der Endpunkt, d.h. der Punkt, an welchem die am
schwächsten unterscheidbare Verklumpung von Zellen stattfindet, weit besser festzustellen ist.
Eine Art angefärbter Staphylococcus-aureus-Zellen läßt sich durch Inkubieren von Staphylococcus-aureus-Organismen
in einem ein geeignetes Mittel zur Schaumunterdrückung enthaltenden Nährmedium gewinnen. Grundsätzlich kann man
hierbei jedes wäßrige Medium, das ein Wachstum von Staphylococcus-aureus-Zellen unterhalt, verwenden. Vorzugsweise
wird jedoch eine Gehirn/Herz-Infusionsbrühe verwendet. Das Mittel zur Schaumunterdrückung wird dazu benötigt,
ein übermäßiges Schäumen der Fermentationsbrühe während des Einblasens von Luft bzw. während der Belüftung,
die zum Bakterienwachstum erforderlich ist, zu verhindern. Selbstverständlich muß ein die Schaumbildung unterdrückendes
Mittel gewählt werden, das die Klumpungs-
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eigenschaften der Staphylococcus-aureus-Zellen nicht beeinträchtigt.
Da darüber hinaus die wachsenden Bakterien in einer späteren Verfahrensstufe angefärbt werden, ist
es zwingend erforderlich, daß das gewählte Mittel zur Unterdrückung der Schaumbildung auch mit dem Farbstoff und
mit der Bildung des Verklumpungsfaktors verträglich ist. Es hat sich gezeigt, daß Polyalkylenglykole eines Molekulargewichts
von etwa 1000 bis etwa 5000, die in Wasser lediglich schwach löslich sind (weniger als 0,1 g in 100 g
Wasser), beiden Erfordernissen genügen. In typischer Weise können als Polyalkylenglykole mit Molekulargewichten von
1000 bis 5000 Polypropylenglykole, Polybutylenglykole und Triole von Propylenoxiden verwendet werden. Vorzugsweise
wird als schwach lösliches Polyalkylenglykol ein Polypropylenglykol und/oder Polybutylenglykol eines Molekulargewichts
von 1500 bis 4000, insbesondere ein Polypropylenglykol eines durchschnittlichen Molekulargewichts von
etwa 2000, verwendet. Ein in einer erfindungsgemäß verwendeten Fermentationsbrühe besonders gut geeignetes Handelsprodukt
ist das von der Firma Dow Chemical Company, Midland, Michigan, unter der Handelsbezeichnung DOW Polyglycol
P-2Ö00 vertriebene Produkt.
In einer typischen Fermentationsbrühe wird pro 1 Nährmedium
mit etwa 0,1 bis etwa 10 ml einer Subkultur von Staphylococcus aureus etwa 0,003 bis etwa 0,3 ml Polyalkylenglykol
verwendet. Die Inkubation der genannten Fermentationsbrühe erfolgt etwa 4 bis etwa 24 h unter
Einblasen von Luft bei einer Temperatur von etwa 30 bis etwa 37°C. Vorzugsweise wird erfindungsgemäß 1 1 eines
Bakto-Gehirn/Herz-Infusionsnährmediums mit 0,03 ml eines
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Polypropylenglykols eines durchschnittlichen Molekulargewichts von etwa 2000 mit 0,03 ml einer Staphylococcusaureus-Subkultur
beimpft, worauf etwa 21 h lang unter Durchblasen von Luft, jedoch ohne mechanisches Rühren,
bei einer Temperatur von etwa 35° bis etwa 37°C inkubiert wird.
Nachdem eine ausreichende Menge Staphylocoecus-aureus-Bakterien
gewachsen sind, sind die Zellen anfärbbereit. Es ist von wesentlicher Bedeutung, daß der gewählte Farbstoff
vollständig in die Zellen eingeschlossen oder an diese fixiert ist, so daß er durch Waschen oder in Form
der Suspension nicht entfernt werden kann. Weiterhin darf der fixierte oder eingeschlossene Farbstoff die Verklumpungseigenschaften
der abgetöteten Staphylococcus-aureus-Zellen nicht beeinträchtigen. Es hat sich gezeigt, daß
sich zum Anfärben der erfindungsgemäß verwendeten Staphylococcus-aureus-Bakterienzellen
Triphenyltetrazoliumchloridfarbstoffe,
wie 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid
oder 3,3'-(3,3t-Dimethoxy-4,4!-biphenylen)-bis~(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid),
vorzugsweise 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, eignen. Die wachsenden Staphylococcus-aureus-Bakterien
wandeln das farblose Triphenyltetrazoliumchlorid in der Tat um und reduzieren es
zu dem entsprechenden unlöslichen, farbigen Triphenylformazan. Bei diesem Vorgang werden die Staphylococcusaureus-Zellen
angefärbt. In typischer Weise wird eine physiologische Kochsalzlösung mit etwa OpI g bis etwa
1 g eines Triphenyltetrazoliumchlorids in 1 1 der das Polyalkylenglykol und Staphylococcus-aureus-Bakterien
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enthaltenden Fermentationsbrühe eingetragen. Vorzugsweise werden der Fermentationsbrühe etwa 5 ml einer physiologischen
Kochsalzsuspension mit etwa 0,3 g Triphenyltetrazoliumchlorid zugesetzt. Die Inkubation der farbstoffhaltigen
Fermentationsbrühe wird dann etwa 0,5 bis etwa 5 h bei einer Temperatur von etwa 30° bis etwa 37°C fortgesetzt.
Vorzugsweise reicht eine etwa 2-stündige Fortsetzung der Inkubation bei einer Temperatur von etwa 35 bis
etwa 37°C aus, um eine Reduktion des wasserunlöslichen Farbstoffs und eine Anfärbung der Staphylococcus-aureus-Zellen
zu ermöglichen.
Hierauf wird die die angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen enthaltende Fermentationsbrühe mindestens 3 h lang
auf eine Temperatur von mindestens 70°C erwärmt, um praktisch sämtliche angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen
abzutöten. Um sicherzustellen, daß auch sämtliche angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen abgetötet sind, kann
das Erhitzen auch auf höhere Temperaturen über längere Zeit hinweg durchgeführt werden. Ferner kann, um sicherzustellen,
daß praktisch sämtliche angefärbten Zellen abgetötet sind, eine geringe Menge der angefärbten, durch
Erhitzen abgetöteten Zellen auf einer Trypticase-Sojaöl-Agar-Platte
auswachsen gelassen werden.
Die in der geschilderten Weise durch Erhitzen abgetöteten
,-färbten Staphylococcus-aureus-Zellen werden schließlich
voü dem Nährmedium abzentrifugiert und solange mit destilliertem
Wasser gewaschen, bis praktisch sämtlicher i'iicht-eingeschlossener Farbstoff entfernt ist. Die gereinigten
gefärbten Zellen werden dann zur Verwendung
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bei dem verbesserten Testverfahren gemäß der Erfindung
in einer O,O17m«wäßrigen Imidazolpufferlösung resuspendiert.
Bei dem anderen Verfahren zur Herstellung der zur Verwendung
bei dem verbesserten Klumpungstest gemäß der Erfindung geeigneten gefärbten Zellen werden abgetötete
Staphylococcus-aureus-Zellen mit dem Farbstoff Fast Black Salt K angefärbt. Bei dem Farbstoff Fast Black Salt K handelt
es sich um ein Diazoniumsalz des 2,5~Dimethoxy-4«-<r(4-pnitrophenyl)azcT|benzolamins.
Dieser Farbstoff besitzt eine hohe Fixierbarkeit an den abgetöteten Zellen und läßt sich
weder während der Reinigung oder im Anschluß daran beim Stehen in Suspension vor Gebrauch beim Klumpungstest ohne
weiteres auswaschen. Von noch wesentlicherer Bedeutung ist, daß der fixierte Farbstoff die Klumpungseigenschaften
der Staphylococcus-aureus-Zellen nicht beeinträchtigt.
Mit dem Farbstoff Fast Black Salt K angefärbte abgetötete
Zellen behalten ihre Empfindlichkeit gegenüber Fibrinogen, Fibrinogenspaltprodukten und/oder Fibrinspaltprodukten
auch nach dem Anfärben. Zur Gewährleistung einer maximalen Farbstoffixierung wird eine wäßrige Imidazolpuffersuspension
von abgetöteten Staphylococcus-aureus-Zellen mit etwa 5
bis etwa 4 mg Zellen pro ml Suspension mit einer wäßrigen Imidazolpufferlösung des Farbstoffs Fast Black Salt K mit
etwa 3 bis etwa 4 mg Farbstoff pro ml Lösung in Berührung gebracht. Die hierbei erhaltenen abgetötenen angefärbten
Zellen werden einmal mit destilliertem Wasser und dann mit einer 4^-igen Rinderserumalbuminlösung gewaschen, um praktisch
den gesamten nichtfixierten Farbstoff zu entfernen. Nach
dem endgültigen Abzentrifugieren werden die gereinigten angefärbten Zellen in einer O,O17m-wäßrigen Imidazolpufferlösung
zum Gebrauch bei dem verbesserten Testverfahren gemäß der Erfindung resuspendiert.
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Hinsichtlich der Stabilität und Handelsfähigkeit wird die
lyophilisierte Form des neuen aus gefärbten Zellen und Puffer bestehenden Reagenses gemäß der Erfindung gegenüber
der beschriebenen Suspension bevorzugt. Lyophilisierungsverfahren eignen sich jedoch nicht bei in einem
0,Q17iH-Imidazolpuffer suspendierten Zellen, da das Gewicht
des in der O,017m-Suspension aus Zellen und Puffer
enthaltenen festen Materials für eine Lyophilisierung nicht ausreicht. Es hat sich gezeigt, daß man durch Erhöhen
der Konzentration an Zellen und Puffer, in der Suspension vor der Lyophilisierung einen lyophilisierten
Kuchen herstellen kann, der mit einem' zusätzlichen Volumen an destilliertem Wasser wieder aufbereitet und in
dieser Form die erforderliche Materialkonzentration zur Verwendung bei dem verbesserten Klumpungstest gemäß der
Erfindung liefern kann. So hat es sich beispielsweise gezeigt, daß die mindestens dreifache Konzentration an
Suspension aus Zellen und Puffer (gegenüber der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Staphylococcus-aureus-Klumpungstests
erforderlichen Konzentration) ohne weiteres lyophilisiert und mit dem dreifachen Anfangsvolumen
der Suspension an destilliertem Wasser wieder aufbereitet werden kann. Höhere Konzentrationen von aus Zellen
und Puffer bestehenden Suspensionen können ebenfalls lyophilisiert werden, sie liefern jedoch nach der Wiederaufbereitung
ein zu großes Volumen an Testreagens, um unter üblichen Labortestbedingungen gleichzeitig auf-
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AO
gebraucht werden zu können. Die Lagerung der aus gefärbten Zellen und Puffer bestehenden flüssigen Suspension
ist nicht ratsam.
In der Praxis werden konzentrierte Suspensionen aus gefärbten Zellen und Puffer zubereitet und in Masse oder
in Phiolen mit für den Test ausreichenden aliquoten Teilen lyophilisiert. Andererseits können die zubereiteten
Suspensionskonzentrate mit destilliertem Wasser verdünnt werden, um die erforderlichen Mengen an gefärbten Zellen
und Puffer zur direkten Verwendung bei dem verbesserten Klumpungstest gemäß der Erfindung zu liefern.
In typischer Weise werden die nach einem der beschriebenen Verfahren gewonnenen, gereinigten, abgetöteten und
angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen in einer O,O51mwäßrigen
Imidazolpufferlösung eines pH-Werts von etwa 7r4 im Verhältnis von etwa 7,5 bis etwa 12 mg angefärbte
Zellen pro ml Puffer suspendiert. Vorzugsweise werden in dem 0,051m-Puff er eines pH-Werts von etwa 7,4 9 mg/iä. an
angefärbten Zellen suspendiert. Das beschriebene Suspensionskonzentrat kann mit destilliertem Wasser derart verdünnt
werden, daß in dem 0,017m-Imidazolpuffer eines pH-Werts
von etwa 7,4 pro ml Suspension etwa 1,5 bis etwa 6 mg, vorzugsweise etwa 3 mg, angefärbte Staphylococcusaureus-Zellen
enthalten sind. Derartige Suspensionen werden zur direkten Durchführung des verbesserten Klumpungstests
gemäß der Erfindung bevorzugt. Wenn die 0,051m-Puffersuspension von angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen
gefroren und lyophilisiert wird, wird sie mit der dreifachen Menge, bezogen auf das Anfangsvolumen, der
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die angefärbten Zellen enthaltenden Suspension vor der
Lyophilisierung an destilliertem Wasser wieder aufbereitet.
Der verbesserte Staphylococcus-aureus-Klumpungstest gemäß der Erfindung zeigt die Anwesenheit von Fibrinogen,
Fibrinogenspaltprodukten und/oder Fibrinspaltprodukten in Blutplasma. In der Klinik wird dieser Test jedoch
dazu durchgeführt, die Gehalte an Fibrinogenspaltprodukten und/oder Fibrinspaltprodukten im Blutserum zu ermitteln
(bei der Serumzubereitung wird das Fibrinogen durch Plasmagerinnung entfernt). Das Vorliegen anormaler Gehalte
an Fibrinogenspaltprodukten und/oder Fibrinspaltprodukten im Blutserum ist ein Anzeichen für eine intravaskuläre
Koagulation und verwandte Krankheitsbilder.
Zur Bestimmung der Fibrinogenspaltprodukte oder Fibrinspaltprodukte
im Blutserum wird ein O,017m-Imidazolpuffer
eines pH-Werts von etwa 7,4 zur Herstellung einer Verdünnungsreihe der zu testenden Blutplasmaprobe verwendet.
Dieser Puffer wird durch Auflösen von etwa 0,69 g Imidazol in etwa 580 ml destilliertem Wasser zubereitet.
Der pH-Wert der Lösung wird mit 0,Im-HCl auf 7,4 ί 0,05
eingestellt, worauf die Lösung mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 600 ml aufgefüllt wird. Dann wird
der pH-Wert der Lösung erneut auf 7,4 eingestellt, wobei man den 0,017m-Puffer erhält. Der Pufferlösung kann
zur Verhinderung eines Mikroorganismenwachstums ein antibakteriell wirksames Mittel, z.B. Thimerosal, zugesetzt
werden. Bei der Durchführung des Tests wird eine bestimmte Menge, vorzugsweise 50ul, der O,017m-Imidazoipuf-
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Al
ferlösung in jede Ausnehmung einer sieben oder mehr Ausnehmungen aufweisenden Mikrοtüpfelplatte eingebracht.
In den einzelnen Ausnehmungen wird dann unter Verwendung eines Mikrotüpfelverdünners, vorzugsweise eines 50 ill
Mikrotüpfelverdünners, eine Verdünnungsreihe der zu testenden
Blutserumprobe hergestellt. Dann wird in jede Ausnehmung der Mikrotüpfelplatte eine der Anfangsmenge
an Imidazolpuffer (vorzugsweise 50 ία 1) entsprechende Menge
an der die angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen enthaltenden Suspension (mit entweder eingeschlossenem
reduzierten Tetrazoliumchlorid oder fixiertem Fast-Black-Salt-K-Farbstoff
in einem 0,017m-Imidazolpuffer) zugegeben,
worauf die Platte auf einen Rüttler gestellt oder von Zeit zu Zeit von Hand geschüttelt wird. Nach etwa
10 min wird die Mikrotüpfelplatte auf eine Klumpenbildung hin untersucht. Der Endpunkt entspricht der Ausnehmung
(in der Mikrotüpfelplatte), in der für das bloße Auge die letztmöglich unterscheidbare Zellklumpung stattgefunden
hat. Die Konzentration an Fibrinspaltprodukten und Fibrinogenspaltprodukten in der getesteten Blutserumprobe
wird durch Vergleich der Testergebnisse mit einer Standardlösung mit einer bekannten Menge Fibrinogen,
Fibrinspaltprodukten oder Fibrinogenspaltprodukten ermittelt. In der Praxis wird in der Regel der Fibrinogenstandard
verwendet. Die Menge an Spaltprodukten pro ml Blutserum wird als Fibrinogenäquivalente ( iig Fibrinogen/ml)
angegeben.
Die mit einem Tetrazoliumchlorid-Farbstoff angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen ermöglichen einen ebenso
empfindlichen Test, wie es der mit ungefärbten Staphy-
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lococcen-Zellen durchgeführte Klumpungstest ist (0,62
Ii g/ml Spaltprodukte lassen sich im Blutserum nachweisen). Die mit Fast Black Salt K angefärbten Staphylococcusaureus-Zellen ermöglichen den Nachweis von 1,25 Ά g
Spaltprodukten pro ml Blutserum. Die mit einem Tetrazoliumchloridfarbstoff angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen, insbesondere die mit dem Farbstoff 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen, werden bevorzugt, da sie empfindlichere Testergebnisse liefern. Sofern der normale Bereich an Spaltprodukten im Blutserum 0 bis 10 lig/ml beträgt, sind die mit
dem Farbstoff Fast Black Salt K angefärbten Zellen mehr als empfindlich genug, um anormale Gehalte an Spaltprodukten im Blutserum nachzuweisen.
Ii g/ml Spaltprodukte lassen sich im Blutserum nachweisen). Die mit Fast Black Salt K angefärbten Staphylococcusaureus-Zellen ermöglichen den Nachweis von 1,25 Ά g
Spaltprodukten pro ml Blutserum. Die mit einem Tetrazoliumchloridfarbstoff angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen, insbesondere die mit dem Farbstoff 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen, werden bevorzugt, da sie empfindlichere Testergebnisse liefern. Sofern der normale Bereich an Spaltprodukten im Blutserum 0 bis 10 lig/ml beträgt, sind die mit
dem Farbstoff Fast Black Salt K angefärbten Zellen mehr als empfindlich genug, um anormale Gehalte an Spaltprodukten im Blutserum nachzuweisen.
Der verbesserte mit gefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen
durchgeführte Klumpungstest gemäß der Erfindung ist
reproduzierbar, empfindlich und leicht durchzuführen.
Die Endpunkte lassen sich genau ablesen. Mehrere Proben können gleichzeitig in etwa 30 min analysiert werden.
Die Endpunkte lassen sich genau ablesen. Mehrere Proben können gleichzeitig in etwa 30 min analysiert werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen
.
Zubereitung von gefärbtem Staphylococcus aureus:
3 1 einer Fermentationseinheit aus einer Bakto-Gehirn/
Herz-Infusionsbrühe und Staphylococcus aureus wurden mit 0,1 ml Dow Polyglycol P-2000 versetzt, worauf das Ganze
Herz-Infusionsbrühe und Staphylococcus aureus wurden mit 0,1 ml Dow Polyglycol P-2000 versetzt, worauf das Ganze
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unter Durchblasen von Luft 21 h lang bei einer Temperatur von 35° bis 37°C inkubiert wurde. Nach Zugabe
einer Lösung von 0,9 g 2,3j5-Triphenyltetrazoliumchlorid
in 5 ml Natriumchlorid (US-Pharmakopoe) zu der Fermentationsbrühe wurde unter kräftigem Rühren weitere
2 h lang inkubiert. Dann wurde das Fermentat auf eine Temperatur von 70° i 10C erhitzt und zur Abtötung praktisch
sämtlicher angefärbter Staphylococcus-aureus-Zellen 3 h lang unter konstantem Rühren bei dieser Temperatur
belassen. Die durch Erhitzen abgetöteten gefärbten Zellen wurden abzentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit
wurde verworfen. Hierauf wurde das Sediment in 1,5 1 Natriumchloridlösung (US-Pharmakopoe) resuspendiert,
worauf die erhaltene Bakteriensuspension zentrifugiert wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde erneut
verworfen, worauf die erhaltenen gefärbten Zellen in 1,5 1 destillierten Wassers resuspendiert wurden.
Das Zentrifugieren und Resuspendieren wurde zur praktisch vollständigen Entfernung von nicht-eingeschlossenem
Farbstoff insgesamt viermal wiederholt.
Zubereitung des Puffers:
0,69 g Imidazol wurde in etwa 580 ml destillierten Wassers gelöst. Nach Einstellen des pH-Wertes mit 0,1m-HCl
auf 7,4 £ 0,05 wurde die Lösung mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 600 ml aufgefüllt. Dann wurde
der pH-Wert erforderlichenfalls erneut mit 0,Im-HCl auf 7,4 eingestellt, wobei letztlich ein 0,017m-Puffer
erhalten wurde.
,/-14-
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/Γ
Zubereitung von lyophilisierten angefärbten Staphylococcusaureus-Zellen:
1,8 g des gewaschenen Zellsediments vom Beispiel 1 wurden in 200 ml eines O,051m-Imidazolpuffers eines pH-Werts
von 7,4 resuspendiert. Jeweils 1 ml fassende aliquote
Teile dieser Suspension wurden in 3 ml fassende Phiolen überführt, worauf diese in einer Lyophilisiervorrichtung
gefroren und dann bis zur Trockene lyophilisiert wurdeni Die lyophilisierten gefärbten Staphylococcusaureus-Zellen
wurden bei einer Temperatur von 4 C gelagert.
Bestimmung von Fibrinspaltprodukten und/oder Fibrinogenspaltprοdukten
im Blutserum:
Eine Phiole von Beispiel 3 mit den lyophilisierten, angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen in dem Imidazolpuffer
wurden mit 3 nil destillierten Wassers wieder aufbereitet,
wobei in dem O,017m-Imidazolpuffer suspendierte
Zellen erhalten wurden. 50 η 1 des Imidazolpuffers vom Beispiel 2 wurden in jede Ausnehmung einer Mikrotüpfelplatte
mit sieben Ausnehmungen eingefüllt. Unter Verwendung eines 50 ul Mikrotüpfelverdünners wurden
sieben Verdünnungsstufen des zu testenden Blutserums zubereitet. Zu jeder Verdünnungsstufe in den einzelnen
Ausnehmungen der Mikrotüpfelplatte wurden jeweils 50ul
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der wiederaufbereiteten angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen hinzugegeben, worauf die Platte von Zeit zu Zeit
von Hand geschüttelt wurde. Nach 10 min wurde die Mikrotüpfelplatte auf das Vorhandensein einer Klumpenbildung
hin untersucht. Der Endpunkt entsprach der Ausnehmung, in der die mit bloßem Auge die geringst-unterscheidbare
Zellenklumpung festzustellen war. Die Konzentration an Fibrinogenspaltprodukten und/oder Fibrinspaltprodukten
in dem getesteten Blutserum wurde durch Vergleich der Versuchsergebnisse mit einer eine bekannte Menge Fibrinogen,
Fibrinogenspaltprodukte oder Fibrinspaltprodukte enthaltenden Standardlösung ermittelt. Das Testserum zeigte
einen Endpunkt in der sechsten Ausnehmung entsprechend einem Titer von 1 : 64. Der 10 iig/ml enthaltende Fibrinogenstandard
besaß einen Endpunkt entsprechend der vierten Ausnehmung. Die Konzentration an Spaltprodukten errechnet
sich wie folgt:
10 ug/ml
£ς-
= 0,625 Jig/ml
0,625 λΐg/ml χ 64 = 40 ng Spaltprodukte/ml (Fibrino-
genäquivalent)
Zubereitung von angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen:
18 mg des Farbstoffs Fast Black Salt K wurden in 18 ml
eines 0,017m-Imidazolpuffers eingetragen, worauf der
End-pH-Wert auf 7,4 eingestellt wurde. Die erhaltene Farb-
-16-
609838/0861
stoff/Puffer-Lösung wurde dann in 6 ml einer 0,017m-Imidazolpuffersuspension
mit 1S mg abgetöteter Staphylococcus aureus-Zellen eingetragen. Die erhaltenen gefärbten Zellen
wurden zentrifugiert, mit destilliertem Wasser einmal und dann dreimal mit einer 4%igen Rinderserumalbuminlösung
gewaschen. Nach dem endgültigen Zentrifugieren wurden die erhaltenen 18 mg gefärbter Zellen in 2 ml einer
0,051m-Imidazolpufferlösung suspendiert, worauf der·pH-Wert
auf 7,4 eingestellt wurde. 1 ml der erhaltenen Suspension wurde in 3 ml fassende Phiolen überführt, worauf
diese in einer Lyophilisiervorrichtung gefroren und bis zur Trockene lyophilisiert wurden. Die lyophilisierten
angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen wurden bei einer Temperatur von 4°C gelagert.
Bestimmung von Fibrinogen, Fibrin und Fibrinogenspaltprodukten im Blutserum:
Eine Phiole von Beispiel 5 mit mit dem Farbstoff Fast .Black Salt K angefärbten lyophilisierten Staphylococcusaureus-Zellen
in dem Imidazolpuffer wurde mit 3 ml destillierten Wassers wieder aufbereitet, wobei eine Zellsuspension
in einem 0,017m-Imidazolpuffer erhalten wurde.
50 ul des Imidazolpuffers von Beispiel 2 wurden
in die einzelnen Ausnehmungen einer sieben Ausnehmungen aufweisenden Mikrotüpfelplatte überführt. Unter Verwendung
eines 50 ul Mikrotüpfelverdünners wurde eine Verdünnungsreihe
einer zu testenden Blutprobe zubereitet. Zu jeder Verdünnungsstufe in den einzelnen Ausnehmungen
-17-
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der Mikrotüpfelplatte wurden dann 50 ill der wiederaufbereiteten
angefärbten Staphylocoecus-aureus-Zellen hinzugegeben,
worauf die Platte von Zeit zu Zeit von Hand geschüttelt wurde. Nach 10 min wurde die Mikrotüpfelplat
te auf die Anwesenheit eines Klumpens hin untersucht. Das getestete Serum zeigte einen Endpunkt in der sechsten
Ausnehmung entsprechend einem Titer von 1 : 64. Der 10 U. g/ml enthaltende Fibrinogenstandard besaß einen
Endpunkt in der dritten Ausnehmung. Die Konzentration an Spaltprodukten errechnet sich wie folgt:
B g/ml
■£ = 1,25 ^i g/ml
■£ = 1,25 ^i g/ml
(1,25 Ji g/ml) (64) = 30 ^i g/ml.
-18-
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Claims (28)
1.} Reagens zum Nachweis von Fibrinogen, Fibrinspaltprodukten
und Fibrinogenspaltprodukten im Blut, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer gepufferten Suspension
von angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen besteht, die durch
a) Beimpfen eines geeigneten Nährmediums mit einem
Polyalkylenglykol eines Molekulargewichts von etwa 1000 bis etwa 5000 mit einer Subkultur von Staphylococcus-aureus-Zellen;
Polyalkylenglykol eines Molekulargewichts von etwa 1000 bis etwa 5000 mit einer Subkultur von Staphylococcus-aureus-Zellen;
b) etwa 4-bis etwa 24-stündiges Inkubieren des beimpften
Nährmediums unter Durchblasen von Luft
bei einer Temperatur von etwa 30° bis etwa 37°C;
bei einer Temperatur von etwa 30° bis etwa 37°C;
c) Zugeben einer physiologischen Kochsalzsuspension
eines Triphenyltetrazoliumchlorid-Farbstoffs zu
dem in Stufe b) erhaltenen Inkubats und Fortsetzen der Inkubierung für etwa 0,5 bis etwa 5 h,
bis eine zum Anfärben der Staphylococcus-aureus-Zellen geeignete Menge des Triphenyltetrazoliumchlorids zu Triphenylformazan reduziert ist;
dem in Stufe b) erhaltenen Inkubats und Fortsetzen der Inkubierung für etwa 0,5 bis etwa 5 h,
bis eine zum Anfärben der Staphylococcus-aureus-Zellen geeignete Menge des Triphenyltetrazoliumchlorids zu Triphenylformazan reduziert ist;
d) mindestens 3-stündiges Erhitzen des Produkts aus Stufe c) auf eine Temperatur von mindestens 70 C
zur praktisch vollständigen Abtötung sämtlicher
gefärbter Staphylococcus-aureus-Zellen;
gefärbter Staphylococcus-aureus-Zellen;
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«Ο
e) Abtrennen der durch Erhitzen abgetöteten gefärbten Zellen aus Stufe d) vom Nährmediuni und praktisch
vollständiges Auswaschen sämtlichen nichteingeschlossenen Farbstoffs und
f) Suspendieren der abgetöteten gefärbten Zellen in
einer Pufferlösung eines pH-Werts von etwa 7,4,
hergestellt wurden.
2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Herstellung der darin enthaltenen gefärbten
Staphylococcus-aureus-Zellen in Stufe c) etwa 2 h lang inkubiert wurde.
Staphylococcus-aureus-Zellen in Stufe c) etwa 2 h lang inkubiert wurde.
3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das bei der Herstellung der darin enthaltenen angefärbten
Staphylococcus-aureus-Zellen in dem Nährmedium
enthaltene Polyalkylenglykol ein in Wasser schwach
lösliches Polypropylenglykol, Polybutylenglykol und/ oder ein Triol eines Propylenoxids mit jeweils einem Molekulargewicht von 1500 bis 4000 ist, - .
enthaltene Polyalkylenglykol ein in Wasser schwach
lösliches Polypropylenglykol, Polybutylenglykol und/ oder ein Triol eines Propylenoxids mit jeweils einem Molekulargewicht von 1500 bis 4000 ist, - .
4. Reagens nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das bei der Herstellung der darin enthaltenen angefärbten
Staphylococcus-aureus-Zellen in dem Nährmedium
enthaltene Polyalkylenglykol aus einem Polypropylenglykol eines durchschnittlichen-Molekulargewichts von
etwa 2000 besteht.
enthaltene Polyalkylenglykol aus einem Polypropylenglykol eines durchschnittlichen-Molekulargewichts von
etwa 2000 besteht.
-20-
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5. Reagens nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die bei der Herstellung der darin enthaltenen angefärb
ten Staphylococcus-aureus-Zellen verwendete Pufferlösung
aus einer O,017m-Imidazolpufferlösung besteht.
6. Reagens nach Anspruch 1 in lyophilisierter Form.
7. Reagens nach Anspruch 4 in lyophilisierter Form.·
8. Reagens nach Anspruch 5 in lyophilisierter Form.
9. Reagens zur Bestimmung von Fibrinogen, Fibrinspaltprodukten und Fibrinogenspaltprodukten im Blut, dadurch
gekennzeichnet, daß es aus einer wäßrigen Suspension angefärbter Staphylococcus-aureus-Zellen besteht, die
durch
a) Beimpfen von etwa 1 1 eines Gehirn/Herz-Infusionsnährmediums mit etwa 0,03 ml eines Polypropylenglykols
eines durchschnittlichen Molekulargewichts von etwa 2000 mit etwa 0,03 ml einer Subkultur von
Staphylococcus aureus;
b) etwa 21-stündiges Inkubieren des beimpften Nähr-.mediums
aus Stufe a) unter Durchblasen von Luft bei einer Temperatur von etwa 35° bis etwa 37°C;
c) Zusatz von 5 ml einer physiologischen Kochsalzsuspension
mit 0,3 g 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid
zu dem Inkubat von Stufe b) und Fortsetzen der Inkubation für etwa 2 h zur Reduktion von 2,3,5-
-21-
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Triphenyltetrazoliumchlorid zu 1,3,5-Triphenylforniazan
unter Anfärbung der Staphylococcus-aureus-Zellen;
d) etwa 3-stündiges Erhitzen des Produkts aus Stufe c) auf eine Temperatur von etwa 70 C zur praktisch
vollständigen Abtötung sämtlicher angefärbter Staphylococcus-aureus-Zellen;
e) Abtrennen der durch Erhitzen abgetöteten gefärbten Zellen aus Stufe d) von dem Nährmedium und praktisch
vollständiges Auswaschen sämtlichen nichteingeschlossenen Farbstoffs und
f) Suspendieren von etwa 9 mg der gewaschenen, abgetöteten
und angefärbten Zellen aus Stufe e) in etwa 1 ml eines O,051m-Imidazolpuffers eines pH-Werts
von etwa 7,4
hergestellt wurden.
10. Reagens nach Anspruch 9 in lyophilisierter Form.
11. Reagens zur Bestimmung von Fibrinogen, Fibrinspaltprodukten und Fibrinogenspaltprodukten im Blut, dadurch
gekennzeichnet, daß es aus einer Imidazolpuffersuspension von abgetöteten, mit einem Triphenylformazan oder
Fast Black Salt K angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen besteht.
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12. Reagens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Staphylococcus-aureus-Zellen mit 1,3,5-Triphenylformazan
oder Fast Black Salt K angefärbt sind.
13· Reagens nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Staphylococcus-aureus-Zellen mit 1,3,5-Triphenylformazan
angefärbt sind.
14. Reagens nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer O,017m-Imidazolpufferlösung mit etwa 1,5
bis etwa 6 mg gefärbter Staphylococcus-aureus-Zellen
pro ml Suspension besteht.
pro ml Suspension besteht.
15. Reagens nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß
es aus einer O,017m-Imidazolpuffersuspension mit 3 mg
angefärbten Staphylococcus-aureus-Zellen pro ml Suspension besteht.
16. Reagens nach Anspruch 13 in lyophilisierter Form, dadurch
gekennzeichnet, daß es aus einem 0,051m-Imidazolpuff
er mit etwa 7,5 mg bis etwa 12 mg angefärbter
Staphylococcus-aureus-Zellen. pro ml Suspension besteht.
Staphylococcus-aureus-Zellen. pro ml Suspension besteht.
17. Reagens nach Anspruch 13 in lyophilisierter Form, dadurch
gekennzeichnet, daß es aus einem 0,051m-Imidazolpuffer mit etwa 9 mg angefärbter Staphylococcusaureus-Zellen
pro ml Suspension besteht.
18. Verfahren zur Herstellung angefärbter Staphylococcusaureus-Zellen
zur Verwendung bei der Bestimmung der
-23-
609838/0861
Anwesenheit von Fibrinogen, Fibrinspaltprodukten und Fibrinogenspaltprodukten im Blut, dadurch gekennzeichnet,
daß man
a) ein geeignetes Nährmedium mit einem Polyalkylenglykol eines Molekulargewichts von etwa 1000 bis
etwa 5000 mit einer Subkultur von Staphylococcusaureus-Zellen beimpft;
b) das beimpfte Nährmedium aus Stufe a) unter Durchblasen von Luft etwa 4 bis etwa 24 h lang bei einer
Temperatur von etwa 30° bis etwa 570C inkubiertj
c) dem Inkubat aus Stufe b) eine physiologische Kochsalzsuspension
eines Triphenyltetrazoliumchlorid-Farbstoffs
zusetzt und die Inkubation für etwa 0,5 bis etwa 5 h lang fortsetzt, bis eine zum Anfärben
der Staphylococcus-aureus-Zellen ausreichende Menge des Triphenyltetrazoliumchlorids zu einem Triphenylformazan
reduziert ist,
d) das Produkt aus Stufe c) mindestens 3 h lang auf eine Temperatur von mindestens 70 C erhitzt, um
praktisch sämtliche angefärbten Staphylococcusaureus-Zellen abzutöten;
e) die durch Erhitzen abgetöteten angefärbten·Staphylococcus-aureus-Zellen
aus Stufe d) vom Nährmedium abtrennt und praktisch den gesamten nichteingeschlossenen
Farbstoff auswäscht und
-24-
609838/0861
as
f) die abgetöteten, angefärbten Zellen in einer Pufferlösung
eines pH-Werts von etwa 7,4 suspendiert.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe c) etwa 2 h lang inkubiert.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyalkylenglykol ein in Wasser schwach lösliches
Polypropylenglykol, Polybutylenglykol oder Triol eines Propylenoxids eines Molekulargewichts von jeweils
1500 bis 4000 verwendet.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyalkylenglykol ein Polypropylenglykol eines
durchschnittlichen Molekulargewichts von etwa 2000 verwendet .
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als Pufferlösung eine 0,051m-Imidazolpufferlosung
verwendet.
23. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß
man in einer weiteren Stufe die Suspension der abgetöteten gefärbten Zellen lyophilisiert.
24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer weiteren Stufe die Suspension der abgetöteten
angefärbten Zellen lyophilisiert.
25. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer zusätzlichen Stufe die Suspension der abgetöteten
angefärbten Zellen lyophilisiert.
-25-
609838/08G1
26. Verfahren zur Ermittlung der Fibrinspaltprodukte und Fibrinogenspaltprodukte im Blutserum, dadurch gekennzeichnet,
daß man
a) eine spezielle Menge eines Imidazolpuffers in jede
Ausnehmung einer Mikrotüpfelplatte einbringt;
b) unter Verwendung eines Mikrotüpfelverdünners in die erste Ausnehmung der Mikrotüpfelplatte aus Stufe
a) eine der Menge (des Imidazolpuffers) a) äquivalente Menge der zu testenden Blutserumprobe zusetzt
und eine Verdünnungsreihe herstellt;
c) in jede Ausnehmung der Mikrotüpfelplatte aus Stufe b) eine zur Menge des Imidazolpuffers in Stufe
a) äquivalente Menge an angefärbten Staphylococcusaureus-Zellen-Suspension
in dem in Stufe a) verwendeten Puffer zusetzt und
d) die Ausnehmung in der Mikrotüpfelplatte entsprechend Stufe c) auf eine sichtbare Verklumpung der
Staphylococcus-aureus-Zellen als positiver Hinweis auf das Vorhandensein von Fibrinspaltprodukten
und Fibrinogenspaltprodukten in dem getesteten Blutserum untersucht.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
daß man in den Stufen a) und c) einen O,017m-Imidazolpuffer
verwendet.
-26-
609838/0861
28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe b) sieben Verdünnungsstufen herstellt.
609838/0861
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