DE2344441C3 - Verfahren zur Herstellung eines Substrats für die Bestimmung von Desoxyribonuklease und deren Antikörper - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Substrats für die Bestimmung von Desoxyribonuklease und deren AntikörperInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur Bestimmung von
Desoxyribonuklease und deren Antikörpern.
Der Zeitraum zwischen einer bakteriellen Infektion und deren Manifestation, die Inkubationszeit, ist klinisch
stumm und auch Laboratoriumsuntersuchungen führen selten zu einer vorzeitigen Diagnose. Durch den
direkten Nachweis bakterieller Stoffwechselprodukte wäre eine frühzeitige Erkennung möglich, der nachfolgende
Titeranstieg eines gegen diese Stoffwechselprodukte gerichteten Antikörpers gibt eine zusätzliche
Bestätigung. Streptokokken der Gruppe A bilden eine Vielzahl solcher extrazellulärer Stoffwechselprodukte
mit Enzymcharakter, die zum Teil immunogen wirksam sind, z. B. Streptolysin O, N AD-glycohydrolase, Streptodcirnase,
Hyaluronidase und Streptokinase. Die Bestimmung des Amisu-eptolysintiters bei A-Streptokokkenerkrankungen
gehört zu den eingeführten Methoden; bei dem gleichzeitigen Vorliegen von anderen Erkrankungen
wie Hepatitis, Lupus erythematodes, Nephrose und anderen kann allerdings durch unspezifische Störungen
ein erhöhter Titer des Antistreptolysins vorgetäuscht wierden.
Züchtet man Α-Streptokokken in einem geeigneten Nlhrmedium, so kann man im bakterienfreien Kulturüberstand
Desoxyribonukleasen verschiedener elektrophoretischer Beweglichkeit nachweisen, die als Streptodornase
A, B, C und D (DN ase A, B, C und D) bezeichnet 6;, werden. Die Streptodornase B macht mengen- und
aktivitätsmäßig den größten Anteil aus, so daß dieses knenzvm bei StreDtokokkeninfektion durch Antikörperbildung
am deutlichsten in Erscheinung tritt.
In verschiedenen künisch-chemischen Untersuchungen
ist gezeigt, daß bei durch A-Streptokokken verursachten Hautinfektionen der Antistreptolysin-Titer
wenig oder gar nicht verändert, während der Serumspiegel der Antistreptodornase B deutlich erhöhi
gefunden wird.
Die steigende differenzialdiagnostische Bedeutung des Antistreptodornase-B-Titers machte einfach durchzuführende
Verfahren zur Bestimmung des Antistreptodornasespiegels
im Blutserum erforderlich. Es ist dementsprechend ein Verfahren bekannt geworden,
Antistreptodornase mit Hilfe von Methylgriin nachzuweisen,
das darauf beruht, daß eine bestimmte Menge Desoxyribonuklease mit dem auf Antikörper zu
untersuchenden Serum inkubiert wird. In Abhängigkeit von der vorhandenen Menge des Streptodornase-Antikörpers
wird Desoxyribonuklease in ihrer Aktivität verringert Wird nun zu diesem Gemisch ein Methylgriin-Desoxyibonukleinsäure-(DNS)-Komplex
zugesetzt, so wird in Abhängigkeit der noch vorhandenen Streptodornase-Aktivität der Methylgrün-DNS-Komplex
gespalten und dabei entfärbt. Die Ablesbarkeit der über eine Verdünnungsreihe des Serums durchzuführenden
Reaktion ist nicht ganz leicht und führt häufig zu irrigen Endpunktsbestimmungen. Die Herstellung dieses
Reagenses erfordert einen relativ hohen Einsatz an hochmolekularer DNS.
Es stellte sich daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung eines verbesserten Substrats für die
genannten Bestimmungen zu entwickeln, welches insbesondere eine genauere Ablesbarkeit der Reaktion
ermöglicht. Bei der Lösung dieser Aufgabe wurde davon ausgegangen, daß es bekannt ist (J. Bacteriol. 84 [1962]
77 bis 80), daß Toluidinblau O einen hochmolekulare DNS enthaltenden Agar blau zu färben vermag,
während die Stellen im Agar, die beispielsweise durch bakterielle Einwirkung eine abgebaute DNS enthalten,
durch Toluidinblau rosa gefärbt werden.
Die Lösung der genannten Aufgabe besteht darin, daß zu Wasser oder einer bei pH 4-9 gepufferten wäßrigen
Lösung hochmolekulare DNS und Toluidinblau O, vorteilhaft auch Erdalkali-Ionen, gegeben werden und
die Mischung bis zum Auftreten einer klaren homogenen blauen Lösung gekocht und homogenisiert wird.
Die Verwendung eines DNS-Komplexes mit dem metachromatischen Farbstoff 2-Amino-7-dimethylamino-3-methyldiphenazthioniumchlorid
(Toluidinblau O) bei der quantitativen Bestimmung namentlich der Streptodornase-Antikörper bietet gegenüber den bekannten
Verfahren Vorteile. Die Einwirkung von nicht antikörpergebundener DNase führt dabei zu einer
Abspaltung des Farbstoffes aus dem Komplex unter Ausbildung eines blauen Präzipitats. Die überstehende
Lösung wird farblos. Es kann somit bei der Bestimmung des Antistreptodornasetiters in Probandenseren mit
Hilfe einer Verdünnungsreihe diejenige Serumverdün nung durch einfache Ablesung ermittelt werden, bei der
der vorhandene Antikörper eine vorgelegte Menge DNase gerade noch bindet und somit eine blaue
Präzipitatsbildung gerade nicht mehr auftritt:
Bei der Bestimmung von Desoxyribonuklease gestattet die Verwendung des DNS-Toluidinblau-Komplexes
eine vergleichbare einfache Feststellung des Endprodukts der Reaktion. Die unbekannte DNase-Aktivität
kann dabei beispielsweise durch Vergleich mit der Aktivität eines festgelegten Enzymstandards gemessen
werden, wobei bis zum Grenzwert der Enzymaktivität
ein blaues Präzipitat auftritt, oder es kann eine bestimmte Menge an DNase-Antikörpern vorgelegt
und mit Hilfe des DNS-Toluidinblau-Komplexes diejenige
Konzentration an DNase nachgewiesen werden, die von der definierten Antikörpermenge nicht mehr
gebunden wird und zur Spaltung des Substrats unter Bildung eines blauen Präzipitats führt
Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens nach der Erfindung sind in den Patentansprüchen 2 bis 4
beschrieben.
Zur Pufferung der Lösung sind Puffersubstjnzen, wie sie für biologische und physiologische Arbeiten
verwendet werden, geeignet, vorzugsweise solche, wie sie von N. E. G ο ο d et ae. in Biochemistry 5,467 (1966),
vorgeschlagen werden. Für den neutralen pH Bereich ist beispielsweise Trishydroxymethylamincmethan geeignet
Vorteilhaft werden bei der Substratherstellung Erdalkali-Ionen, beispielsweise in Form von wasserlöslichen
Calcium- oder Magnesiumsalzen, eingesetzt, um beim Bestimmungsansatz die volle Aktivität des auf das
Substrat einwirkenden Enzyms, also der DNase, zu gewährleisten.
Wird eine Isotonie des Substrats beispielsweise mit Plasma angestrebt, so kann dies durch entsprechende
Salzzusätze erreicht werden. Ein dafür üblicherweise verwendetes Salz ist Natriumchlorid. Als DNS ist eine
handelsübliche Präparation mit einem hohen Molekulargewicht (> 1000 000) besonders geeignet vorteilhaft
eine DNS aus Fischsperma. Es sind jedcch auch DNS mit niedrigerem Molekulargewicht und anderen
Ursprungs brauchbar. Die Konzentration der DNS
beträgt in Lösung zweckmäßig 0,01 bis 0,03%, vorzugsweise 0,02%, diejenige des Toluidinblai O 0,005
bis 0,015%, vorzugsweise 0.01 %. Die Konzentration der
vorzugsweise als Erdalkaliionen-Lieferanten verwendeten Calcium- oder Magnesiumsalze beträgt vorteilhaft
0,1 bis 0,5%. Diese Salze dienen zur Aktiviemng der DNase. Das nach diesem Verfahren hergestellte
Substrat stellt eine klare homogene blaue Lösung dar.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Substrat für die Bestimmung von Desoxyribonuklease und deren
Antikörpern, welches gekennzeichnet ist durch Parameter eines Produkts, das erhalten wird nacli einem
Verfahren gemäß der Erfindung.
Das erfindungsgemäße Substrat eignet sich besonders in Mikroverfahren zur Bestimmung der Streptodornase-Antikörper
in der klinischen Diagnose, insbesondere für die in der Serologie üblichen Mikro jterplatten.
Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, das Substrat
unter Verwendung von größeren Volumina in Reagensröhrchen im Makrotest einzusetzen. Mit Hilfe des
Substrats lassen sich gleicherweise wie oben ausgeführt auch Bestimmungen der DNase ausführen.
Bei einer vergleichenden Untersuchung der Antistreptodornase-B-Titer
bei Gesunden und Patie nten, die eine Streptokokken-Infektion durchgemacht haben,
wird mit dem in den Beispielen angegebenen Testsystem ein deutlicher Anstieg der Antistreptodornase B
bei den Patienten gefunden.
Während bei Normalpersonen die Serum titer der Streptodornase-Antikörper unter 1 :200 liegen, kann
bei Titern über 1 :200 unter anderem das Vorli egen von
rheumatischem Fieber, Infektion der oberen Luftwege oder Glomerulonephritis diagnostisch geschlossen werden.
Die Erfindung soll nachstehend an Beispielen erläutert werden.
Beispiele
1. Herstellung des DNS-Substrates
1. Herstellung des DNS-Substrates
In 100 ml destilliertem Wasser werden 0,3 g Trishydroxymethylaminomethan,
0,5 g NaCI, 15 mg gereinigtes DNS gelöst und 0,05 ml einer 0,01-M Ca'ciumchloridlösung
und 03 ml einer 0,1 -M Toluidinblau-O-Lösung
zugesetzt Der pH-Wert der Lösung wird mit Hilfe von HCl auf pH 7,0 eingestellt, der Ansatz wird etwa 10
Sekunden gekocht und mit einem Laborhomogenisator gemischt, bis eine homogene klare blaue Lösung
entsteht.
2. Herstellung des Streptodornase-B-Antigens
Aus einer 16-Stundenkultur eines DNase B bildenden
A-Streptokokkenstammes gewonnene und nach bekannten Methoden gereinigte DNase wird auf 30
Einheiten pro ml (gemessen in einem Mikrorotationsviskosimeter) eingestellt (bezogen auf DNase ί aus
Pankreas). Unmittelbar vor dem Test wird die Antigenlösung 1 :30 verdünnt
3. Herstellung der Verdünnungsflüssigkeit
400 ml einer wäßrigen Lösung von Rinderalbumin, die 2,50 mg Rinderalbumin pro 100 ml enthält, wird mit
100 ml eines 0,25-M Imidazol-HCl-Puffers von pH 8,0,
der 1,47 g Calciumchloriddihydrat und 0,6 g Magnesiumsulfat pro Liter enthält gemischt.
Statt lmidazol-HCl-Puffer kann in der Verdünnungsflüssigkeit
auch ein anderes für biochemische Arbeiten brauchbares Puffersystem verwendet werden, beispielsweise
die von Good et al. 1966 vorgeschlagenen Puffersubstanzen, wobei es zweckmäßig ist, darauf zu
achten, daß das Puffersystem entsprechend dem pH-Optimum der zu bestimmenden DNase auszuwählen
ist Außer dem sogenannten Rinderalbumin, das zur Stabilisierung der enzymatischen Aktivität der Verdünnungsflüssigkeit
zugesetzt werden kann, sind für diesen Zweck auch andere Stoffe einzusetzen, von denen
bekannt ist, daß sie in verdünnten Enzymlösungen zur Stabilität der Enzyme beitragen. Dies sind Proteine wie
das bereits angeführte Albumin, Gelatine und deren Derivate; ferner Polyhydroxy-Verbindungen, beispielsweise
Dextrane und Zucker.
4. Bestimmung der Streptodornase-B-Antikörper in Seren
Die Bestimmung wird wie folgt durchgeführt: In Mikrotiterplatten werden in Cup 2 der ersten Reihe
25 μΙ der Verdünnungsflüssigkeit nach (3), in Cup 3 2 χ 25 μΐ der gleichen Verdünnungsflüssigkeit und in
die folgenden Cups jeweils 25 μΐ der Verdünnungsflüssigkeit
eingefüllt. Darauf werden in Cups 1, 2 und 3 jeweils 25 μΐ einer 1 :50-Verdünnung eines Serums von
Gesunden eingefüllt. Von Cup 2 ausgehend werden jeweils 25 μΐ der erhaltenen Serumverdünnung in Cup 4
und weiter in Cup 6 und jeweils in Cups 8, 10 und 12 überpipettiert Von Cup 3 ausgehend werden jeweils
25 μΐ der entsprechenden Serumverdünnung in Cup 5 und weiter auch in Cups 7,9 und 11 übergeführt. Aus den
Cups 3,11 und 12 werden anschließend jeweils 25 μΐ der
Serurnverdünnung verworfen. Damit entsteht von Cup 1 ausgehend eine Verdünnungsreihe von 1 :50, 100, 150,
200, 300, 400, 600, 800. 1200, 1600, 2500 und 3200. Die
gleichen Verdünnungsreihen werden für die zu bestimmenden Patientenseren in Reihe 2 und 3 der
Mikrotiterplatte angesetzt Nun werden zu jeder der 25 μΙ Serumverdünnung 25 μΐ der Antigenarbeitsver-
dünnung nach (2) hinzugegeben und 4 Minuten auf einem Schüttler belassen. Danach werden 50 μΐ der
i/ubstratlösung nach (1) zu jeder der Verdünnungen
hinzugegeben.
Daraufhin erfolgt eine Inkubation des Ansatzes bei 37° C für 3 Stunden. Die Bildung eines blauen Präzipitats
zeigt die Verdünnung der im Serum vorhandenen Antikörper an, die zugesetzte DNase nicht mehr zu
binden.vermochte. Im vorliegenden Beispiel wurde in der ersten Reihe eine durchgehende Präzipitatbhdung
gefunden. Der Titer ist somit kleiner als 1 :50. In der zweiten Reihe trat die Präzipitatbildung im 4. Cup auf.
Der Titer ist somit 1 :150. In der dritten Reihe bildete sich ein Präzipitat ab Cup 8 entsprechend einem Titer
von 1 :600.
5. Bestimmung von Desoxyribonuklease In der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte werden in
Cup 1 50 Mikroliter einer keimfrei filtrie. ten Kulturlösung von Streptokokken eingefüllt. Die folgenden Cups
werden mit 25 Mikroliter der Verdiinnungsflüssigkeit
Überführen von jeweils 25
Cine L«-»«»«. "-
mmmm
bis zum 8. Cup emsprschend emer
Sgeführ.e bekannte DNaSe führ,
:BBr
Standards beträgt.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung eines Substrates für
die Bestimmung von Desoxyribonuklease und deren Antikörpern, dadurch gekennzeichnet,
daß zu Wasser oder einer bei pH 4-9 gepufferten wäßrigen Lösung hochmolekulare DNS und Toluidinblau
O, vorteilhaft auch Erdalkali-Ionen, gegeben werden und die Mischung bis zum Auftreten einer
klaren homogenen blauen Lösung gekocht und homogenisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Gewichtsverhältnis von DNS zu Toluidinblau O etwa 2 :1 beträgt
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Lösung die Konzentration
der DNS 0,01 bis 0,03%, vorzugsweise 0,02%, die des Toluidinblau O 0,005 bis COI5%, vorzugsweise
0,01%, beträgt
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung Calcium- und/oder
Mag! esiumsalze in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5% enthält
5. Substrat für die Bestimmung von Desoxyribonuklease und deren Antikörpern, gekennzeichnet
durch Parameter eines Produktes, das erhalten wird nach einem Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 4.
6. Verwendung des Substrates nach Anspruch 5 zur diagnostischen Bestimmung von Desoxyribonuklease-B-Antikörpern
in Seren.
Priority Applications (18)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19732344441 DE2344441C3 (de) | 1973-09-04 | Verfahren zur Herstellung eines Substrats für die Bestimmung von Desoxyribonuklease und deren Antikörper | |
| NLAANVRAGE7411561,A NL179658C (nl) | 1973-09-04 | 1974-08-30 | Werkwijze voor het bepalen van de enzymactiviteit van desoxyribonuclease, desoxyribonuclease-antilichamen respectievelijk desoxyribonuclease-b-antilichamen. |
| AU72893/74A AU490593B2 (en) | 1973-09-04 | 1974-09-02 | Substrate forthe determination of desoxy-ribonuclease |
| IT26857/74A IT1020393B (it) | 1973-09-04 | 1974-09-02 | Substrato per la determinazione di desossiribonucleari |
| FI2571/74A FI56283C (fi) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | Vid bestaemning av desoxiribonukleas och dess motkroppar anvaendbart substrat och foerfarande foer dess framstaellning |
| LU70841A LU70841A1 (de) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | |
| AT711474A AT336781B (de) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | Fur die bestimmung von desoxyribonuklease und deren antikorpern geeignetes substrat |
| CH1195174A CH612008A5 (de) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | |
| GB3844974A GB1464038A (en) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | Complex compound comprising dna |
| NO743154A NO142579C (no) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | Substrat for bestemmelse av desoksyribonuklease og dets antistoff og fremgangsmaate for fremstilling av substratet |
| IE1821/74A IE39676B1 (en) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | Complex compound comprising dna |
| DK465874A DK134651C (da) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | Substrat til bestemmelse af desoxyribonuclease og dettes antistoffer indeholdende et kompleks af hojmolekyler desoxyribonucleinsyre og et farvestof samt fremgangsmade til fremstillingaf dette substrat |
| US05/502,500 US3990946A (en) | 1973-09-04 | 1974-09-03 | Substrate for the determination of desoxy-ribonuclease |
| FR7430023A FR2242685B1 (de) | 1973-09-04 | 1974-09-04 | |
| BE148191A BE819526A (fr) | 1973-09-04 | 1974-09-04 | Substrat pour la determination de la desoxyribonuclease et de ses anticorps |
| JP10098974A JPS5722000B2 (de) | 1973-09-04 | 1974-09-04 | |
| SE7411155A SE401272B (sv) | 1973-09-04 | 1974-09-04 | Substrat for bestemning av desoxiribonukleas eller dettas antikroppar jemte forfarande for framstellning av substratet |
| NO750272A NO141997C (no) | 1973-09-04 | 1975-01-29 | Anvendelse av substrat for bestemmelse av desoksyribonuklease eller dettes antistoff |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19732344441 DE2344441C3 (de) | 1973-09-04 | Verfahren zur Herstellung eines Substrats für die Bestimmung von Desoxyribonuklease und deren Antikörper |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2344441A1 DE2344441A1 (de) | 1975-03-27 |
| DE2344441B2 DE2344441B2 (de) | 1976-02-19 |
| DE2344441C3 true DE2344441C3 (de) | 1976-09-30 |
Family
ID=
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