DE2531176C3 - Verfahren zum Nachweis von Gonorrhoe-Antikörpern - Google Patents

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach der Inkubation der Stufe C) erhaltene Mischung durch ein zuvor mit Rinderserumalbumin, Humanserum-Immunglobulin, Ovalbumin ι der Hämoglobin gewaschenes Filter führt und den Grad der Radioaktivität des als Filterrückstand erhaltenen Antigen-Antikörper-Konjugats bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das zu untersuchende Serum der Stufe A) mit einem wäßrigen Puffer mischt, der außerdem Rinderserumalbumin, Humanserum-Immunglobulin, Ovalbumin oder Hämoglobin enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe B) das hitzeempfindliche Antigen zusammen mit Rinderserumalbis · min der in Stufe A) erhaltenen Mischung zusetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach der Inkubation der Stufe C) erhaltene Mischung mit einem wäßrigen Puffer verdünnt, zentrifugiert und den Grad der Radioaktivität des erhaltenen Niederschlags bestimmt.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Puffer eine mit Phosphat gepufferte Salzlösung verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man zur radioaktiven Markierung des wärmeempfindlichen Antigens der Stufe B) ¹¹⁵J verwendet.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum radioimmunologischen Nachweis von Neisseria gonorrhoae-Antikörpern in Humanseren, durch Überführen der Antikörper mit Hilfe von hitzeempfindlichen, durch eine Wachstumskultur von Neisseria gonorrhoae gebildeten Antigenen und Antihuman-IgG in ein radioaktiv markiertes Anligen-Antikörper-Konjugat.

Gonorrhoe ist eine am häufigsten verbreitete Bakterienerkrankung beim Menschen, und ihre Hartnäckigkeit als größeres Gesundheitsproblcm hat die Suche nach neueren und besseren Nachweismethoden intensiviert

Ein bekanntes Reihenuntersuchungsverfahren ist ein bakteriologisches Verfahren, das insgesamt zwei bis sieben Tage dauert Darüber hinaus ist es notwendig, das eine Probe des durch die Gonorrhoe verursachten Ausflusses das Testlabor mit den empfindlichen noch lebensfähigen Gonokokkus-Organismus erreicht, wobei

ίο eine natürliche Zeitgrenze von nur zwei Tagen gesetzt ist

Ein serologisches Verfahren zum Nachweis von Antikörpern in Seren, das sich im allgemeinen auf das Finden und Isolieren eines durch Neisseria gonorrhoae

(N. g.) Organismen erzeugten wärmeempfindlichen Antigens stützt, ist bekannt (siehe DE-OS 23 43 264). Dieses Antigen reagiert nicht mit Kreuzreaktionsantikörpern, die auch in den Seren vorhanden sein können, mit dem Erfolg, daß die Anzahl der falschen positiven Reaktionen, die den Wert der bisher angewendeten serologischen Verfahren geschmälert haben, beträchtlich reduziert wird. In diesem bekannten Verfahren wird eine Reaktion der Antigene mit dem Antikörper herbeigeführt und die Gegenwart des entstandenen Komplexes bestimmt Bei den hauptsächlichen Verfahren wird der Komplex mit einem markierten Antihuman-lmmunoglobulin G reagieren gelassen. Das Immunoglobulin wird mit einer fluoreszierenden Verbindung, einem radioaktiven Element oder einem Enzym

jo markiert Die Markierung wird dann durch geeignete Verfahren, wie z. B. radioaktive Zählung, nachgewiesen.

Es wurde jedoch festgestellt, daß dieser Test nicht

ausreichend genug sensitiv ist, um genügend verläßlich zwischen positiven und negativen Seren zu unterscheiden.

Aus einer Veröffentlichung in »Acta Endocrinologica (Suppl. 142, Seite 247—256) ist ein Nachweis-Verfahren bekannt, bei dem von einem mit Immun-präzipitierenden Antiserum gefällter Ar,tikörperkomplex für ein spezifisches Hormon und Antisera für die Spezies, in denen der Hormon-Antikörper gebildet worden ist, ausgegangen wird. Die Bestimmung des Hormon-Antigens in dem von dem Patienten stammenden Serum bzw. Urin wird durch die indirekte Isotopen-Verdünnungsmethode vorgenommen. Nach diesem Hormontest ist ferner nach erfolgter Ausfällung mit präzipitierendem Antiserum eine Inkubation von 16 bis 24 Stunden notwendig, worauf eine weitere Inkubation von 22 Stunden folgt. Somit erfordert dieser Hormontest

5n etwa 2 bis 3 Tage, was in vielen Fällen der Praxis unbefriedigend ist.

Aufgabe der Erfindung ist ein Nachweis von Gonorrhoe-Antikörpern mittels radioimmunologischer Testmethoden, welches einerseits empfindlicher als der geschilderte bekannte Nachweis ist und andererseits nur mit einem für die Praxis akzeptablen Zeitaufwand verbunden ist

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß man

A) das zu untersuchende Serum mit einem wäßrigen Puffer mischt und mit Antihuman-IgG versetzt,

B) der in Stufe A) erhaltenen Mischung das hitzeempfindliche, von Neisseria gonorrhoae gebildete und radioaktiv markierte Antigen zusetzt,

C) die in Stufe B) erhaltene Mischung etwa 2 bis 24 Stunden bei etwa 4 bis 45°C und einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 inkubierl und

D) den Grad der Radioaktivität des von dem in Stufe C) bei Anwesenheit von Antikörpern erhaltenen Antigen- Antikörper-Konjugat bestimmt.

Die optimalen Quellen für Antigen sind Wachstumskulturen von Neisseria gonorrhöae ATCC 21823 (B-585), 21 824 (B-370) und 21 825 (B-1094), obgleich auch eine Anzahl von N. g. Mikroorganismen als Antigenquelkn dienen können.

Das anmeldungsgemäQ verwendete Antigen ist das in dem Verfahren nach dem Stand der Technik, auf das Bezug genommen wurde, verwendete und in den oben angegebenen Veröffentlichungen beschriebene wärmeempfindliche Antigen. Zum Zwecke des hier beschriebenen und beanspruchten Testveriahrens wird das Antigen mit einem radioaktiven Element, dessen Anwesenheit durch herkömmliche Hilfsmittel, wie z. B. einem Zähler, nachgewiesen werden kann, markiert

Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein radioimmunologischer Nachweis mit verbesserter Empfindlichkeit, es ermöglicht eine äußerst zuverlässige Feststellung von Gonorrhoe-Infektionen.

Das Antigen-Antikörper-Konjugat wird durch eine Reaktion hergestellt, die in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 8,5 während eines Zeitraums von etwa 24 bis 2 Stunden bei einer Temperatur von etwa 4 bis 45° C stattfindet. Die Reaktion erfolgt, indem das zu untersuchende Serum mit einem wäßrigen Puffer gemischt und Antihuman-IgG hinzugefügt wird, wonach markiertes Antigen zugegeben wird. Die Reihenfolge der Zugabe ist äußerst wichtig und völlig überraschend. Bei der normalen Arbeitsweise zur Herstellung der !Conjugate wird das Antigen zu dem Serum gegeben und dann das Antihuman-IgG hinzugefügt Es ist überraschenderweise gefunden worden, daß mit dem wärmeempfindlichen erfindungsgemäßen Antigen das herkömmliche Verfahren nicht anwendbar ist, da der Test nicht ausreichend genug sensitiv ist, um genügend verläßlich zwischen positiven und negativen Seren zu unterscheiden. Nach der ungewöhnlichen erfindungsgemäßen Reihenfolge der Zugabe jedoch ist der Test außergewöhnlich sensitiv, reproduzierbar und geeignet zum Nachweis von positiven Ergebnissen bei männlichen und weiblichen Individuen von 85% oder darüber.

Der bevorzugte Puffer ist eine mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PPS), da sie relativ preiswert und zuverlässig ist, obgleich eine Anzahl anderer Puffer verwendet werden kann. Typische gut bekannte Puffer, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Borat-, Glyzin-, Pyrophosphat- und Imidazolpuffer.

Beispielsweise werden 0,1 ml mit Phosphat gepufferte Salzlösung (pH-Wert 7,2), 5 μΙ Serum, 30 μΐ Schaf-Antihuman-IgG (Meloy Labs., 6,4 mg Antikörper/ml), 10 bis 20 μ '»J-markiertes GC-Antigen (3000 bis 5000), gemischt Es können sogar weniger als 5 μΙ Serum verwendet werden, vorausgesetzt, daß die zugegebene Menge an Antihuman-IgG so gewählt wird, daß eine maximale Ausfällung der Radioaktivität erhalten wird. Die Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung wird bei 45° C während 2 Stunden inkubiert, und am Ende dieser Periode werden 0,50 ml PPS zugegeben. Die PPS kann weggelassen werden, sie wird aber verwendet, um ein größeres Volumen an Material zu erhalten, um die Handhabung zu vereinfachen. Die Suspension wird durch einen Whatman GF/C-Filter (2,4 cm) unter Anwendung einer Pyrex.nikroanalyse-Filtervorrichtung filtriert.

Der Filter wird vorgewaschen, um eine unspezifische Bindung des Antigens auf ein Minimum herabzusetzen. Das bevorzugte Vorwaschmedium ist Rinderserumalbumin, obgleich auch andere Behandlungsstoffe, wie beispielsweise menschliches Serum Immunoglobulin, Ovalbumin und Hämoglobin, auch verwendet werden können. Bevorzugt wird die Vorwäsche mit 0,5 ml einer Lösung, die 2 Gew.-% der Fraktion V BSA enthält, zusammen mit einem Chelierungsmittel, wie z. B. 0,01 M

ίο Äthylendiamin-tetraessigsäure (EDTA), durchgeführt

Nach dem Filtrieren wird der Niederschlag gründlich mit Wasser gewaschen. Die Radioaktivität des Niederschlags wird dann durch eine beliebige Methode, z. B. einem Gammaspektrometer, bestimmt Bei Blindreaktionen, die sämtliche Bestandteile der Reaktionsmedien, mit Ausnahme des Serums, enthalten, werden ebenfalls Zählungen durchgeführt Diese werden bei den mit den positiven und negativen Seren erhaltenen Ergebnissen berücksichtigt. Dieses Verfahren dient zur proportionalen Reduzierung des niedrigen R/.jioaktivitätswertes, der durch die negativen Seren erhalten wird, da die Blindwerte oft die Hälfte der durch die negativen Seren bewirkten »Counts« beträgt

Das soeben beschriebene Filtrierverfahren — wenn es auci: für viele Zwecke vollkommen adäquat ist — wird für eine Untersuchung der Bevölkerung in großem Maßstab nicht bevorzugt Zu diesem Zweck bevorzugt man das Zentrifugationsverfahren. Das angewendete Inkubationsverfahren ist dem Verfahren ähnlich, das bei dem Filtrierverfahren angewendet wird, mit der Ausnahme, daß der Puffer ein Reagenz zur Eliminierung einer nicht spezifischen Bindung des Antigens enthält Das Reagenz erfüllt in dem Inkubaticnsmedium dieselbe Funktion wie beim Filtrierverfahren zum Waschen des Filters. Dieselben Reagenzien können verwendet werden, und BSA wird wieder bevorzugt

Ein typisches Inkubationsmedium enthält 0,2 ml PBS, das 2 Gew.-°/o BSA enthält, 0,02 M EDTA oder ein anderes Chelierungsmittel, 5 μΐ Serum, 30 μΐ Antihuman-IgG (Schaf) und 10 bis 20 μ! '²⁵J markiertes Antigen.

Nach der Inkubation des typischen Inkubationsmediums werden 3 ml PPS zu der Reaktiunsmischung gegeben, welche dann bei etwa 2000 bis 3000 zentrifugiert wird. Die obenstehenden Fraktionen werden verworfen, und das Zentrifugenröhrchen wird wieder mit 3 ml PPS gewaschen und erneut zentrifugiert Der obenstehende Teil wird verworfen und der Niederschlag, beispielsweise mit einem Gammazähler,

so untersucht.

Natürlich können wie bei dem Filtrierverfahren andere Puffer in dem Zentrifugierungsverfahren verwendet werden. In beiden Verfahren kann das Chelierungsmittel weggelassen werden. Während das Verfahren mit "⁵J als dem nachweisbaren Element beschrieben worden ist, können auch andere, wie z. B. ^l4C-Essigsäureanhydrid, Maleinsäureanhydrid, Fluor-dinitrobenzol, Fluorescein und Isothiocyanat; «P-Diiso propyl-fluor-Phoiphat; und ^3SS-Phenylisothiocyanat, verwendet werden, Das bevorzugte nachweisbare Element ist ¹²⁵J, da eine Scintillationslösurg nicht erforderlich ist, wenn es in einem Gammastrahlenspek· trometer verwendet wird, und es sich um einen genügend schwachen Gammastrahler mit ausreichend

b^ry kurzer Halbwertszeit handelt, um die vielen Gefahren, die beim Arbeiten damit verbunden sind, zu vermeiden.

Ein Vergleich der Radioaktivität der bekannten Dositiven und neeativen Seren unter Anwendung des

Filtrierunterriuchungsverfahrens wird in der Abbildung dargestellt, und die Reaktion ist — wie angegeben — zu der Menge des hinzugefügten Antigens direkt proportional. In Abhängigkeit der Aminherstellung und der in den Seren verwendeten Gonokokken-Antikörper kann das Verhältnis des durch die positiven Seren festgesetzten markierten Antitrens zu dem der negativen Seren von 10/1 bis 30/1 variieren.

Es ist wichtig, wenn auch nicht entscheidend, daß das GC-Antigen zu jeder Probe etwa zur selben Zeit, und zwar innerhalb von etwa 2 Minuten nach dem Antihuman-lgG (Schaf) hinzugefügt wird, da das Ausmaß des Antigen-Niederschlags mit seiner Zugabezeit in Beziehung steht. Wenn es z. B. 60 Minuten nach dem Antihuman-lgG hinzugefüp' wird, wird die Antigen-Fixierung um fast die Hälfte reduziert. Wenn dagegen das Antigen zu den negativen Seren gerade vor dem Antihuman-lgG zugegeben wird, werden sehr hohe Werte erhalten, was tatsächlich das positive zu dem negativen Verhältnis auf etwa 3 : I reduziert. Diese Faktoren können jedoch kompensiert werden, wenn es aus einigen Gründen erwünscht oder notwendig ist, die Zugabe des GC-Antigens zu verzögern.

Gewöhnlich sind Wiederholungsreaktionen, die nicht mehr als 3000 bis 6500 cpm des markierten GC-Antigens enthalten, zur Unterscheidung zwischen positiven und negativen Seren zweckmäßig. Vergleichsversuche werden mit Blindproben oder mit negativen Pools oder Seren gemacht. Bei dem optimalen Verfahren wird cm der Abbildung ähnliche Titrationskurve hergestellt Gewöhnlich kann ein Serum für positiv gehaltei werden, wenn es den dreifachen AntiEenwerl. der mi einem negativen Pool festgestellt is', zeigt.

Zum Nachweis der Sensitivität und Spezifität diese Verfahrens wurden 152 Seren (57 Männer und 4 Frauen) in einem Doppel-Blindversuch untersucht. Nu die Seren der Patienten mit einer bakteriologisch bestätigten Diagnose für Gonorrhoe galten als positiv während die negativen Verglcichsscren von Individuei mit negativen bakteriologischen und klinischen F.rgeb nissen erhalten wurden.

Wie in der Tabelle angegeben wird, schafft da erfindungsgemäße Verfahren einen hohen Grad ai Zuverlässigkeit beim Nachweis der Gonorrhöe be Männern und Frauen. Es war daher möglich, 97% de infizierten Männer und 88% der infizierten Frauei genau zu identifizieren. Falsche positive Ergebnissi wurden in nur drei Fällen erhalten. In dem Test waren 21 zweifache und 2 dreifache Versuche enthalten, und ii keinem Fall bestand eine Diskrepanz unter diese: Ergebnissen. Die Unmöglichkeit, in einigen Beispiele! positive Fälle nachzuweisen, ist nicht überraschend, di die Antikörpertiter, zu der Zeit, zu welcher dii Serumproben entnommen wurden, noch nicht nach weisbare Mengen erreicht zu haben brauchen.

Tabelle

Vergleich von Kulturen und Fallgeschichtsdiagnosen für Gonorrhöe mit der Radioimmun-Untersuchung

Geschlecht	Positiv	Rl
	Kultur	33
Männlich	38	53
Weiblich	60

Negativ

Fallgeschichte
und Kultur

19
35

RIA

17
34

90
97

Hierzu 1 Blatt Zeichnuneen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum radioimmunologischen Nachweis von Neisseria gonorrhoae-Antikörpern in Humanseren durch Überführen der Antikörper mit Hilfe von hitzeempfindlichen, durch eine Wachstumskultur von Neisseria gonorrhoae gebildeten Antigenen und Antihuman-IgG in ein radioaktiv markiertes Antigen-Antikörper-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) das zu untersuchende Serum mit einem wäßrigen Puffer mischt und mit Antihuman-IgG versetzt,

B) der in Stufe A) erhaltenen Mischung das hitzeempfindliche, von Neisseria gonorrhoae gebildete und radioaktiv markierte Antigen zusetzt,

C) die in Stufe B) erhaltene Mischung etwa 2 bis 24 Stunde» bei etwa 4 bis 45" C und einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 inkubiert und

D) den Grad der Radioaktivität des von dem in Stufe C) bei Anwesenheit von Antikörpern erhaltenen Antigen-Antikörper-Konjugat bestimmt