DE2745279A1 - Immunologische bestimmung von antikoerpern - Google Patents

Description

• Immunologische Bestimmung von Antikörpern
• Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Antikörpern gegen Mikroorganismen, insbesondere auf die Verwendung von verdünntem Anti-IgG des Menschen zur Erzeugung eines unsichtbaren Agglutinats des mikrobiellen Antigen-Serumantikörper-Komplexes. Eine sclche I5ethode führt zu maximaler Narkierung und somit zu maximaler Empfindlichkeit der Bestimmung im Vergleich zu der bisher angewandten Kornplex-Fällungsmethode. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders bei einer Radioimmunbestimmung zum Nachweis von Antikörpern gegen Neisseria gonorrhoeae (N.g.) in Seren brauchbar.
• Bei einer der Techniken zur Bestimmung von Antikörpern gegen Ilikroorganismen wird ein Komplex zwischen dem Antikörper und einem Antigen, aus der Mikrobe, wie z.B. ihrer Zellwand, stammend, gebildet. Der Komplex wird aus der Probenlösung durch die Gegenwart eines Anti-Antikörpers ausgefällt, der aus einer anderen Säugetierart stammt.
• Durch Einführen einer geeigneten Markierung in den Komplex unter Anwendung entweder eines markierten Antigens oder eines markierten Anti-Antikörpers ist es möglich, die Konzentration des Antikörpers in der Probe unter Anwendung einer zuvor aufgestellten Standard- oder Eichkurve zu bestimmen.
• So ist z.B. die Bestimmung von Gonorrhoe-Antikörpern in menschlichem Serum in der US-PS 3 974 269 beschrieben.
• Die methode beruht auf der Verwendung eines Antigens, das vorn Neisseria gonorrhoeae-Organismus erzeugt wird, dessen Isolierung im einzelnen in der DT-Patentanmeldung 2 343 .'64 beschrieben ist.
• Bei einer speziellen Ausführungsform einer Radioimmunbestimmung, beschrieben in der US-PS 3 974 269, werden Nr.g.-Antikörper in Serum nach folgendem Verfahren nachgewiesen: A. Zusatz von Anti-Human-IgG zu dem zu testenden Serum in einem wässrigen Puffermedium, B. anschließende Zugabe eines wärmelabilen, mit einem radioaktiven Element markierten Antigens, C. Inkubieren des erhaltenen Gemischs bei etwa 4 bis 450C für etwa 24 bis 2 h bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 8,5 zur Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes, wenn in dem Serum Antikörper vorhanden sind, und D. Bestimmen der Höhe der Radioaktivität als Naß für das Vorliegen des Antigen-Antikörper-Komplexes.
• Der gefällte Komplex wird von der Lösung entweder abfiltriert oder zentrifugiert. Nach bisheriger Kenntnis und Praxis auf dem Gebiet wird die Menge an verwendetem Anti-Human-IgG in Beziehung zur enge des Serums in Stufe A eingestellt, um die Fällung zu maximieren. Dabei wurde stets angenommen, daß die maximale Fällung der maximal ermittelten Radioaktivität äquivalent ist. Zu diesem Zweck wird das Verhältnis von Anti-Human-IgG-Antikörper zu den Volumina der Serumprobe auf wesentlich mehr als 1/1 enngestellt, gewöhnlich wird ein Verhältnis von 6/1 angewandt.
• Bevor solche Techniken als Grundlage für Massentesterfassung angewandt werden können, verbleiben noch verschiedene Probleme. Ein größeres Problem ist die Tatsache, daß selbst bei maximaler Empfindlichkeit der positive Abschaltwert drei Normeinheiten über dem Mittelwert einer Gruppe von negativen Seren liegt. So würde der Test positive Seren mit verhältnismäßig hohen Antikörpergehalten erfassen, nicht aber Seren mit geringen oder Grenzkonzentrationen an Antikörper, die noch Personen mit positiven Infektionen der fraglichen Mikroben bedeuten.
• Weiter ist es, um diesen Empfindlichkeitswert zu erreichen, in kritischer Weise notwendig, die Reagentien in ganz bestimmter Folge zuzusetzen, d.h., das Anti-Human-IgG wird dein gepufferten Testserum zugesetzt, dann das markierte Antigen. Die Anwendung in der normalen Reihenfolge, bei der das Antigen dem Serum und dann das Anti-Human-IgG zugesetzt wird, führt zu einem Test, das unzureichend empfindlich sein soll, um zwischen positiven und negativen Seren mit brauchbarer Zuverlässigkeit zu unterscheiden.
• Die Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren für die immunologische Bestimmung von Antikörpern gegen Mikroorganismen in Serum von Säugetieren. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf immunologische Bestimmungen dieser Antikörper, wobei ein zweiter Antikörper dem Immunreaktionsgemisch zugesetzt wird, um die wirksame Fällung des Antigen-mikrobenspezifischen Antikörper-Komplexes aus dem Medium zu unterstützen. Dieser zweite Antikörper stammt aus einer anderen Säugetierart als dem Testkörper und ist; für die IgG-Fraktion der Testart spezifisch, d.h.
• ein Anti-IgG-Antikörper.
• Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine immunologische Bestimmung des Vorhandenseins mikrobieller Antikörper in Säugetierserum, wobei A. ein Reaktionsgemisch mit einem wässrigen Puffermedium, Serum für eine Probe, Antigen, das aus den Mikroben stammt, und Anti-Antikörper für das zu testende Serum bereitgestellt wird, wobei das Antigen oder der Anti-Antikörper eine nachweisbare Narkierung trägt, B. das Reaktionsgemisch bei etwa 4 bis 45 0C etwa 24 bis 2 h bei einem ph-Wert von etwa 6,5 bis 8,5 zur Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexen inkubiert wird, wenn der Mikroben-Antikörper in der Serumprobe vorhanden ist, und C. die Stärke der Markierung als r:laC für das Vorliegen des Antigen-Antikörper-Komplexes bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumenverhältnis von hnti-Antikörper zu Serumprobe auf einen Wert eingestellt wird, der zur Bildung eines Agglutinats ausreicht, aber kleiner ist, als zur Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes erforderlich ist.
• Wie oben angegeben, ist es auf dem Fachgebiet üblich, ein Überschuß-Volumenverhältnis von Anti-IgG-Serum zum Testserum beim Durchführen einer solchen Analyse anzuwenden.
• Dies beruht auf dem 3estreben, die Fällung maximal zu gestalten, wovon angenommen wird, daß dies der Maximierung der Menge markierten, gewonnenen Antigens oder Antikörpers äquivalent ist. Die Leistungsfähigkeit dieser Gewinnung ist es, die in hohem Maße die Empfindlichkeit des Verfahrens beeinflußt.
• Es wurde nun gefunden, daß entgegen der festen Annahme auf dem Gebiet maximale Ausbeute an Markierung nicht durch ttaximieren der Fällung des Antikörper-Antigen-Komplexes erzielt wird. Stattdessen wird überraschenderweise maximale Markierungsausbeute bei einem Verfahren beobachtet, bei dem das Volumenverhältnis von Anti-Antikörper zu Serumprobe so eingestellt wird, daß eine unsichtbare Agglutination des Komplexes eintritt. Das zur Bildung einer solchen Agglutination erforderliche Verhältnis liegt beträchtlich unter dem für die Fällung. Weim auch die genauen Volumenverhältnisbereiche, die für die Agglutination angewandt werden, in Abhängigkeit von der Art der für die Bestimmung eingesetzten speziellen Reagentien variiert, liegen sie gewöhnlich unter 1/1 und im allgemeinen zwischen 1/2 und 1/250. So ist beispielsweise bei einem Immuntest auf Gonorrhoe-Antikörper das Volumenverhältnis vorzugsweise 1/5 bis 1/250.
• Da Volumina von bei immunologischen Bestimmungen verwendeten Reagentien verhältnismäßig klein sind, z.B. können sie bei Radioimmunbestimmungen in der Größenordnung von etwa 5 pl für die Serumprobe liegen, ist es bequemer, den Anti-Antikörper zu verdünnen und gleiche Volumina dieses verdünnten Reagens dem Testserum zuzusetzen. Das Verdünnen kann unter Verwendung entweder von Serum aus der Säugetierart, in der der Anti-Antikörper erzeugt wurde, oder sonst von phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) als Verdünnungsmittel geschehen.
• Das erfindungsgemäß verbesserte Verfahren kann bei immunologischen Bestimmungen angewandt werden, die sich auf den Nachweis von Antikörpern richten, die in Säugetierblutserum vorhanden sind und sich gegen Idikroorganismen richten. So kann das erfindungsgemäße Verfahren als Diagnosemittel zum Nachweis von Infektionen durch solche Mikroorganismen angewandt werden. Zu den Hikroorganismen, auf die das Verfahren angewandt werden kann, gehören - ohne Beschränkung hierauf - Bakterien, wie Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningiditis, Treponema pallidum und Streptococcus pyogenes, Fungi, wie z.B.
• Histoplasma capsalatum, Hefen, wie z.B. Candida albicans, und Parasiten, wie Trichomonas vaginalis.
• Die Bildung des Ilikrobenantikörper-Antigen-Komplex-Agglutinats kann nach einer Reihe von auf dem Fachgebiet zur Verfügung stehenden Methoden nachgewiesen werden. Entweder kann das Antigen, das aus der jeweiligen Mikrobe stammt, oder der Anti-Antikörper in an sich bekannter Weise markiert werden. Solche Markierungen können ein nachweisbares radioaktives Element umfassen, wie z.B. 3H, 14C, 125I und dergleichen, ein Enzym, wie z.B. in der US-PS 3 817 837 beschrieben, eine Elektronenspinresonanzgruppe, wie in der US-PS 3 453 288, 3 481 952, 3 507 876 und 3 690 834 beschrieben, einen Fluorophor, wie z.B. Fluorescamin, TOPF, Fluorescein, Rhodamin, Auramin und dergleichen oder Chromophore.
• Der bei der praktischen Durchführung der Erfindung verwendete Anti-Antikörper stammt aus einer anderen Säugetierart als der, deren Serum auf mikrobielle Antikörper getestet werden soll. So kann beispielsweise, wenn menschliches Blutserum als Testserum verwendet wird, Anti-Human-IgG verwendet werden, das aus Schaf- oder Ziegenserum stammt. Solche Materialien sind im Handel erhältlich.
• Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt der Nachweis des Agglutinats unter Verwendung eines markierten Antigens, vorzugsweise eines mit 125I-markiertem Antigen. Eine solche Markierung kann unter Anwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Arbeitsweisen eingeführt werden, beschrieben z.B. von Syvanen et al., J. Biol. Chem. 248, 3762 (1973), oder nach dem modifizierten Verfahren, wie es in der US-PS 3974 269 beschrieben ist.
• Der hier betroffene Komplex bildet sich nach einer Reaktion, die in einem wässrigen Medium bei einem pH von etwa 6,5 bis 8,5 in etwa 2 bis 24 h bei einer Temperatur von etwa 4 - 450C stattfindet. Sie erfolgt durch Mischen des zu testenden Serums mit wässrigem Puffer, markiertem Antigen und Anti-Antikörper. Die Reihenfolge der Zugabe ist unkritisch.
• Bei einer typischen Arbeitsweise zum Nachweis von mikrobiellen Antikörpern durch Radioimmuntest wird ein Reaktionsgemisch mit 0,1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,2), 5 pl Testserum, 5 pl Anti-Antikörper, verdünnt auf 1/2 bis 1/200 mit Puffer oder normalem Serum, und 50 pl mit 125I-markierten Antigens (8 000 Zählimpulse/min bei 70 % Zählleistung) hergestellt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht (etwa 16 h) bei 40C inkubiert, und dann werden 0,5 ml PBS zugesetzt. Das erhaltene agglutinierte Material wird durch ein 2,4 cm-Whatman GF/C-Filter unter Verwendung einer Milliporenverteiler-Filtriereinrichtung filtriert. Obgleich der aggutinierte Komplex unsichtbar ist, wird er bei der obigen Arbeitsweise vom Filter zurückgehalten.- Dieser wird dann gut mit destilliertem Wasser gewaschen und die Markierung durch Zählen der Radioaktivität nachgewiesen.
• Um die nicht-spezifische Bindung von Antigen minimal zu halten, ist es wünschenswert, die Filter vorzuwaschen.
• Das bevorzugte Vorwaschmedium ist Rinderserumalbumin, obgleich andere Reagentien, wie Menschenserum-Immunoglobulin, Ovalbumin und Hämoglobin auch verwendet werden können. Vorzugsweise wird mit 0,5 ml einer Lösung vorgewaschen, die 2 Gewichtsprozent der Fraktion V BSA zusammen mit einem Chelatbildungsmittel, wie 0,01 m Äthylen-<fiamin-tetraessigsäure (ÄDTA) enthält.
• Beispiel a) Arbeitsweise Bei einer typischen Arbeitsweise zur Bestimmung von Gc-Antikörpern werden die folgenden Reagentien zugesetzt und gut gemischt: 0,1 ml phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,2; 5 ul watientenserum, 5 ul einer 1/16-Verdünnung von Ziegen-hntihuman-IgG in normalem Ziegenserum und 50 pl eines 125I-markierten Gc-Antigens (8 000 Zählimpulse/min).
• Die Reihenfolge der Zugabe der Reagentien ist nicht wichtig. Nach Inkubation bei 4 0C über Nacht werden 0,50 ml PBS zugesetzt, um ein Volumen zu liefern, das groß genug ist, um seine Handhabung zu ermöglichen oder zu erleichtern. Das Antigen-Antikörper-hgglutirat wird durch ein 2,4 cm-Whatman-GF/C-Filter unter Verwendung eines Milliporenverteilers filtriert (die Filter müssen mit einer Rinderserumalbuminlösung vorher durchtränkt sein). Nach gründlicher Filterwäsche wird in leichtem Vakuum getrocknet und in einem γ-Szintillationszähler gezählt.
• b) Vergleich der erfindungsgemäßen Arbeitsweise mit der der US-PS 3 974 269.
• Eine Serie von 5 Gc-Kultur-Negativseren (1 - 5) und 12 Gc-Kultur-Positivseren (6 - 17) wurde unter Anwendung der erfindungsgemäßen Arbeitsweise und auch der der US-PS 3 974 269 durchgezogen. Wie der Tabelle I zu entnehmen ist, werden durch die erfindungsgemäße Bestimmung alle positiven Seren erfaßt, dagegen 4 von 12 Seren oder 33 5; nach der Arbeitsweise der US-PS 3 974 269 nicht. Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher der des Veröffentlichten überlegen. Von Bedeutung ist auch die Feststellung, daß auch die Bindung der Markierung viel größer ist. Das Verhältnis der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Zählimpulse zu den nach der US-PS 3 974 269 erhaltenen Zählimpulsen liegt durchschnittlich bei 3,25 (Bereich 1,15 bis 5,59). Tabelle I Probe Kultur- US-PS 3 974 269 erfindungs- erfindungs- Imp./min erf.
• Ergebnisse (Impulse/min) (Ergebnisse) gemäß gemäße Er- Imp./min USPS (Imp./min) gebnisse 1 -- 165 -- 123-2 -- 137 -- 98-3 -- 129 -- 120-4 -- 97 -- 204-5 -- 154 -- 207-6 + 204 -- 1000 + 4,90 7 + 97 -- 524 + 5,40 8 + 225 -- 788 + 3,50 9 + 111 -- 817 + 3,60 10 + 575 + 662 + 1,15 11 + 444 + 915 + 2,06 12 + 534 + 789 + 1,47 13 + 1783 + 2319 + 1,30 14 + 698 + 2266 + 3,20 15 + 394 + 2206 + 5,59 16 + 571 + 2052 + 3,59 17 + 1333 + 2542 + 1,90

Claims (8)

1. Patentansprüche 0 Verfahren zur immunologischen Bestimmung des Vorliegens mikrobieller Antikörper in Säugetierserum, bei dem A. ein Reaktionsgemisch mit einem gepufferten wässrigen Medium, Serum für Proben, aus den mikroben stammendes Antigen und Anti-Antikörper zu dem zu untersuchenden Serum bereitgestellt wcrden, wobei das Antigen oder der Anti-Antikörper eine nachweisbare Markierung aufweisen, 3. das Reaktionsgemisch bei etwa 4 - 45°C etwa 24 - 2 h bei einem pH von etwa 6,5 bis 8,5 zur Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes, wenn der mikrobielle Antikörper in der Serumprobe vorliegt, inkubiert wird und C. der Gehalt an Markierung als Naß des Vorhandenseins des Antigen-Antikörper-Komplexes bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumenverhältnis von Anti-Antikörper zu Serumprobe auf einen zur Bildung eines Agglutinats ausreichenden, aber auf einen kleineren als zur Fällung des Antigen-Antikörper-Komplexes erforderlichen Wert eingestellt wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumenverhältnis von Anti-Antikörper zu Serumprobe aui einen Wert im Bereich zwischen 1/2 und 1/250 eingestellt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Markierung ein radioaktives Element verwendet und die immunologische Bestimmung als Radioimmuntest vorgenommen wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es für Neisseria gonorrhoeae mit Menschlichem Serum als Säugetierserum, mit Antigen aus Neisseria gonorrhoeae, markiert mit 1251, als nachweisbarer Markierung, mit Anti-Human-IgG als Anti-Antikörper und einem Volumenverhältnis von Anti-Antikörper zu Serumprobe im Bereich von etwa 1/5 bis etwa 1/250 durchgeführt wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation bei etwa 4OC etwa 16 h bei einem pH von etwa 7,2 erfolgt.
6. 6, Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß gleiche Volumina Anti-Antikörper und Serumprobe verwendet werden, wobei das gewünschte Volumenverhältnis durch Verdünnen des Anti-Antikörpers eingestellt wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Verdünnungsmittel ein wässriger Puffer oder normales Säugetierserum verwendet wira.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der agglutinierte Komplex aus dem Reaktionsgemisch durch Filtrieren abgetrennt, der Filter dann gewaschen und zur Bestimmung der Menge des gesammelten Komplexes auf Radioaktivität ausgezählt wird, die dem Gehalt an mikrobiellem Antikörper in der Serumprobe proportional ist.