CN110806477A - 一种病原菌检测试纸条、传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种病原菌检测试纸条，所述病原菌检测试纸条沿层析方向依次包括设置于PVC塑料底板表面的样品垫、复合物纳米金垫、检验线、质控线和吸收垫；本发明还提供了一种病原菌实时检测试纸式生物传感器及其应用；本发明所提供的试纸条和生物传感器，将纳米技术与生物技术相结合，使得在进行病原菌检测时，检出率高、检测时间短、检测灵敏度高，检测谱更加广泛，以期实现载人航天器微生物检测技术继续朝着精准化、效率化、便捷化的方向发展，对保障空间站和载人登月、火星探测等航天计划的顺利进行，保障航天员健康安全具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，涉及一种病原菌检测试纸条、传感器及其应用。
背景技术
空间站等载人航天器为支持乘员在轨驻留，通过载人环境控制系统在密封舱内创造出与地面类似的良好环境，这种环境也为微生物滋生提供了有利条件。病原微生物的存在会影响人体微生态平衡，引起体内菌群失调，直接或间接引发各种疾病。微生物的滋生会产生毒素，污染舱内空气、水源和食物，病原微生物会导致航天员生病或造成感染。在空间飞行条件下，某些病原微生物的感染毒性可能会增强。为控制载人航天器内的微生物水平，必须首先对密封舱内的空气、结构表面、水系统的微生物水平进行监测，充分掌握密封舱内微生物动态，为制定合理有效的控制措施提供依据。当前，国际空间站上美国舱段与俄罗斯使用空气采样器、培养基接触碟、表面采样拭子、快速采样装置和水收集器对密封舱内空气、结构表面和水系统的微生物进行监测。培养基接触片可实现在轨采样与培养计数，经培养后的菌再下行到地面进行分析；采样拭子的样品只能通过下行到地面进行培养计数与菌种鉴定；而快速检测法，只是通过LOCAD-PTS装置通过鲎试剂反应检测出内毒素方法确定革兰氏阴性细菌的含量。国际空间站已经应用的2种方法存在着一定缺陷：在轨培养方法检测病原菌虽结果可靠，但耗时久，而且存在加重航天器环境污染的风险；基于鲎试剂法快速检测无法确定病原菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的具体数量，而且操作繁琐面向我国载人航天工程的微生物监测的技术需求，基于航天员在轨环境卫生安全考虑，如何实现如何在轨高效、快速、简便地对病原菌进行检测，成为当今空间站建设重要的课题之一。
WO2017050571A1公开了一种用于检测细菌的生物传感器和方法，所述生物传感器以横向流动测试条10的形式被构型，其中，所述横向流动测试条10具有细菌特定的抗体40。所述抗体40的移动特性变化，当所述抗体40与待检测的细菌50复合时，其中，移动特性的变化被用于检测细菌50。此方法公开了使用测试条检测细菌，但是精准度不能够达到要求，并且无法应用于航天条件下的检测。
CN103278647A公开了一种用于检测样品中抗原的非离心方法，包括：a)将样品定位到固体表面上；b)使用非离心方法将包含样品的固体表面与发射体细胞接触，其中所述发射体细胞包含受体和响应于样品中的目标抗原与所述受体的结合而发射光子的发射体分子；c)检测光子发射，其中光子发射为样品中抗原的指示。此方法公开的检测方案，设备与条件非常复杂，无法应用于航空航天中。
CN104634968A公开了一种用于检测细菌的磁致伸缩材料生物传感器系统，包括：磁致伸缩微粒子以及表面绑定的抗体；工作线圈，赫尔姆霍茨线圈，电源连接线，并有提供直流电源；信息分析系统，所述的信息分析系统中包括锁定放大器、网络分析仪(AV3620)或阻抗分析仪(Agilent-4294A)。此系统中所使用的设备较为复杂，检测时操作繁琐，同样不能够应用于航空航天领域中的微生物检测。
因此，如何开发出一种新的检测工具，能够实现在航天器中高效、快速、简便的检测，对于载人航空航天的安全性提高以及空间站的建设具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种病原菌检测试纸条、传感器及其应用，以用来在航空航天领域实现病原菌的快速实时监测。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种病原菌检测试纸条，所述病原菌检测试纸条沿层析方向依次包括设置于PVC塑料底板表面的样品垫、复合物纳米金垫、检验线、质控线和吸收垫。
本发明提供的病原菌测试纸条，将纳米技术与生物技术相结合，引入金纳米材料，利用其独特性质，基于适配体识别技术与免疫层析技术，通过建立纳米金-靶标菌抗体的复合体系与纳米金-靶标菌适配体的复合体系，使得在进行病原菌检测时，检出率高、检测时间短、检测灵敏度高，检测谱更加广泛，以期实现载人航天器微生物检测技术继续朝着精准化、效率化、便捷化的方向发展。对保障空间站和载人登月、火星探测等航天计划的顺利进行，保障航天员健康安全具有重大意义。
在本发明中，样品垫和吸收垫为普通的硝酸纤维素膜，仅用作样品的上样、收集使用。
在本发明中，选择不同的靶标菌抗体，可以实现对不同病原菌的检测，检测范围非常广泛。
优选地，所述复合物纳米金垫的制备方法为：在纳米金溶液中加入复合物，反应后加入牛血清白蛋白，经过封闭、离心去除上清液后再加入纳米金稀释液，涂抹在玻璃纤维膜表面，干燥后得到复合物纳米金垫。
在本发明中，纳米金溶液采用柠檬酸三钠还原法进行制备得到，粒径一般为20nm左右。
优选地，所述复合物为靶标菌抗体I或靶标菌适配体I。
在本发明中，使用抗体或者适配体与纳米金形成复合物，能够实现对靶标菌的可视化检测；靶标菌抗体与靶标菌适配体为与待测病原菌相对应的抗体或适配体。
优选地，所述反应的时间为10～20min，例如可以是10min、13min、15min、18min、19min或20min等。
优选地，相对于1mL的纳米金溶液，所述牛血清白蛋白的用量为40～60μL，例如可以是40μL、42μL、45μL、46μL、47μL、50μL、55μL、58μL、59μL或60μL等。
优选地，所述封闭的时间为0.5～1h，例如可以是0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h或1h等。
优选地，所述离心的时间为10～30min，例如可以是10min、12min、15min、16min、18min、19min、20min、25min、23min、26min、28min、29min或30min等。
优选地，所述离心的转速为12000～13000r/min，例如可以是12000r/min、12500r/min、12630r/min、12800r/min、12900r/min或13000r/min等。
优选地，所述离心去除上清液后，还包括将溶液进行重悬。
优选地，所述重悬使用的重悬液为血红蛋白(HB)与牛血清白蛋白(BSA)的混合溶液。
优选地，所述血红蛋白与牛血清白蛋白的体积比为9:1。
优选地，所述重悬液的加入量为80～150μL，例如可以是80μL、90μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL或150μL等。
在本发明中，纳米金稀释液为上述纳米金溶液，经过PBS溶液稀释过后形成的稀释液，其中PBS溶液的pH值为7.4，并且含有5％的蔗糖和1％的BSA。
在本发明中，重悬过后的溶液，可再次进行离心，吸取上清液，留下剩余液体再加入纳米金稀释液，制得复合物纳米金溶液，进一步经过涂抹于玻璃纤维膜上、干燥后得到复合物纳米金垫。
优选地，所述检测线为靶标菌抗体II或靶标菌适配体II喷涂在PVC塑料底板表面构成的线。
优选地，将所述靶标菌抗体II或靶标菌适配体II喷涂于硝酸纤维素膜表面后贴于PVC塑料底板上。
优选地，所述质控线为羊抗鼠IgG或生物素化DNA喷涂在PVC塑料底板表面构成的线。
优选地，将所述羊抗鼠IgG或生物素化DNA喷涂于硝酸纤维素膜表面后贴于PVC塑料底板上。
在本发明中，生物素化DNA指的是DNA被生物素标记后得到的产物。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的病原菌检测试纸条的制备方法，所述制备方法为：依次将样品垫、复合物纳米金垫、检验线、质控线和吸收垫粘贴于PVC塑料底板上，使用斩切机沿纵向剪切成为宽度2～10mm的条状，得到所述病原菌检测试纸条。
第三方面，本发明提供了一种如第一方面所述的病原菌检测试纸条在航天器中病原体检测、航天器中微生物监测预警或家用器具细菌检测中的应用。
在本发明中，在使用病原菌试纸条检测时(检测复合体系如图1所示)，当病原菌经过复合物纳米金垫时，病原菌与靶标菌抗体I结合(或与靶标菌适配体I反应)，继续进行层析，当层析达到检测线时，纳米金复合物结合的病原菌被靶标菌抗体II捕获(或与靶标菌适配体II反应)，形成有色条带；未参与反应的纳米金复合物继续层析，达到质控线时，羊抗鼠IgG与纳米金复合物中的靶标菌抗体I结合，同样形成红色条带(显色原理如图2所示)，实现对于病原菌的检测。
在本发明中，测试结果通过有色反应或者颜色转变而能够对用户可见，一般为红色。
第四方面，本发明提供了一种病原菌实时检测试纸式生物传感器，所述生物传感器包括如第一方面所述病原菌检测试纸条。
在本发明中，病原菌实时检测试纸式生物传感器不仅仅可以单独使用病原菌检测试纸条，也可同时包括信号接收器具、光学器具、电子分析器件等，将试纸条检测出的结果进行储存或者分析。
第五方面，本发明提供了一种如第四方面所述的病原菌实时检测试纸式生物传感器在航天器中病原体检测、航天器中微生物监测预警或家用器具细菌检测中的应用。
在本发明中，生物传感器的检测原理与试纸条的检测原理相同。
例如，在检测家用器具中的细菌，如可以用来洗衣机或者咖啡机中的细菌，并且一般为器具持续潮湿的位置。
又如，在航天器中，可直接将传感器置于适宜位置，直接进行检测，无需复杂操作，快速便捷。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的病原菌测试纸条，将纳米技术与生物技术相结合，引入金纳米材料，利用其独特性质，基于适配体识别技术与免疫层析技术，通过建立纳米金-靶标菌抗体的复合体系与纳米金-靶标菌适配体的复合体系，使得在进行病原菌检测时，检出率高、检测时间短、检测灵敏度高，检测谱更加广泛，以期实现载人航天器微生物检测技术继续朝着精准化、效率化、便捷化的方向发展。对保障空间站和载人登月、火星探测等航天计划的顺利进行，保障航天员健康安全具有重大意义。
附图说明
图1是本发明提供的病原菌试纸条检测体系示意图。
图2是本发明提供的病原菌试纸条检测显色原理示意图。
图3是本发明实施例5提供的病原菌检测试纸条结构图，其中1-样品垫，2-靶标菌抗体I复合物纳米金垫，3-检验线，4-质控线，5-吸收垫，6-PVC塑料底板。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
纳米金溶液制备
采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20nm左右的胶体金，即将锥形瓶泡酸24h后，取出用双蒸水冲洗20次左右，然后加入100mL 0.01％的氯金酸溶液(浅黄色溶液)于锥形瓶中，在磁力搅拌器上以1000r/min的速率搅拌加热至沸腾，加入2毫升1％的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌15min，在上述搅拌过程中，锥形瓶中溶液颜色呈现由浅黄色-紫色-酒红色的变化过程，取下锥形瓶冷却至室温，制备成酒红色的胶体纳米金溶液，经滤膜过滤后，于4℃保存备用。
实施例2
靶标菌抗体I纳米金复合物制备的最佳工艺条件确定
(1)最佳pH值的确定
取5只1.5mL的离心管，均加入1mL实施例1制备的纳米金溶液，分别标号1、2、3、4、5号管，用0.1M的K2CO3溶液将胶体金的pH值(用精密pH试纸测试)分别调至6、7、8、9、10；各管均加入25μL(过量)浓度为2.3mg/mL的各个靶标菌抗体，混匀，室温下放置15min；各管再分别加入10％的NaCl溶液40μL，混匀，静置2h后观察结果，通过颜色的变化判定胶体金是否有聚沉现象，进而来确定胶体金标记的最佳pH值。
(2)抗体I最适添加量的确定
将纳米金溶液的pH调至上步骤中得到的最佳pH值，取9只0.5mL的离心管，各管均加入上述胶体金200μL，然后各管分别加入0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4μL的浓度为2.3mg/mL靶标菌抗体I，摇晃使其混匀，室温下放置15min使其充分反应，然后再加入40μL 10％的NaCl溶液，静置两小时后观察颜色变化同时测各管胶体金复合物的紫外吸收，确定最佳的靶标菌抗体I添加量。
采用SEM与TEM成像、粒径与电位分析、吸收光谱图对纳米金-靶标菌抗I的复合体系进行表征，并与纳米金溶液表征进行对比，确认抗体I与纳米金颗粒因静电吸附而牢牢的结合在了一起，制得了性能良好的纳米金-靶标菌抗体I复合体系。
实施例3
靶标菌抗体I复合物纳米金垫的制备
取1mL纳米金溶液，依据实施例2确定的最佳工艺，加入靶标菌抗体I，反应15min，再加入10％的BSA 50μL封闭0.5h，13000r/min离心20min，吸取上清液，再加入100μL重悬液(900μL的HB，100μL的10％BSA)，再次离心20min，吸取上清液，留下约20μL，再加入380μL的纳米金稀释液(0.01M的PBS(PH＝7.4，含5％的蔗糖，1％的BSA)，制成400μL纳米金-靶标菌抗体I复合物。取一条长10cm，宽约0.5cm的玻璃纤维膜，将上述400μL免疫胶体金均匀地涂在该玻璃纤维膜上，于37℃干燥，塑封袋密封后，于4℃保存备用，得到靶标菌抗体I复合物纳米金垫。
实施例4
靶标菌适配体I复合物纳米金垫的制备
取1mL纳米金溶液，依据实施例2确定的最佳工艺，加入靶标菌适配体I，反应20min，再加入10％的BSA 40μL封闭1h，12000r/min离心30min，吸取上清液，再加入80μL重悬液(900μL的HB，100μL的10％BSA)，再次离心20min，吸取上清液，留下约20μL，再加入380μL的纳米金稀释液(0.01M的PBS(PH＝7.4，含5％的蔗糖，1％的BSA)，制成400μL纳米金-靶标菌适配体I复合物。取一条长10cm，宽约0.5cm的玻璃纤维膜，将上述400μL免疫胶体金均匀地涂在该玻璃纤维膜上，于37℃干燥，塑封袋密封后，于4℃保存备用，得到靶标菌适配体I复合物纳米金垫。
实施例5
本实施例通过以下方法制备病原菌检测试纸条
依次将样品垫1、靶标菌抗体I复合物纳米金垫2、检验线3、质控线4和吸收垫5粘贴于PVC塑料底板6上，使用斩切机沿纵向剪切成为宽度5mm的条状，得到病原菌检测试纸条，如图3所示。
其中，检验线为用pH＝7.2、0.01M的PB溶液稀释靶标菌抗体II组成的混合溶液，然后使用单维往复式划膜仪将二者均匀喷涂到硝酸纤维素膜上，贴于PVC塑料底板上。
质控线为用pH＝7.2、0.01M的PB溶液稀释羊抗鼠IgG组成的混合溶液，然后使用单维往复式划膜仪将二者均匀喷涂到硝酸纤维素膜上，贴于PVC塑料底板上。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的病原菌检测试纸条、传感器及其应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种病原菌检测试纸条，其特征在于，所述病原菌检测试纸条沿层析方向依次包括设置于PVC塑料底板表面的样品垫、复合物纳米金垫、检验线、质控线和吸收垫。
2.根据权利要求1所述的病原菌检测试纸条，其特征在于，所述复合物纳米金垫的制备方法为：在纳米金溶液中加入复合物，反应后加入牛血清白蛋白，经过封闭、离心去除上清液后再加入纳米金稀释液，涂抹在玻璃纤维膜表面，干燥后得到复合物纳米金垫。
3.根据权利要求2所述的病原菌检测试纸条，其特征在于，所述复合物为靶标菌抗体I或靶标菌适配体I。
4.根据权利要求2或3所述的病原菌检测试纸条，其特征在于，所述反应的时间为10～20min；
优选地，相对于1mL的纳米金溶液，所述牛血清白蛋白的用量为40～60μL；
优选地，所述封闭的时间为0.5～1h；
优选地，所述离心的时间为10～30min；
优选地，所述离心的转速为12000～13000r/min；
优选地，所述离心去除上清液后，还包括将溶液进行重悬；
优选地，所述重悬使用的重悬液为血红蛋白与牛血清白蛋白的混合溶液；
优选地，所述血红蛋白与牛血清白蛋白的体积比为9:1；
优选地，所述重悬液的加入量为80～150μL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的病原菌检测试纸条，其特征在于，所述检测线为靶标菌抗体II或靶标菌适配体II喷涂在PVC塑料底板表面构成的线；
优选地，将所述靶标菌抗体II或靶标菌适配体II喷涂于硝酸纤维素膜表面后贴于PVC塑料底板上。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的病原菌检测试纸条，其特征在于，所述质控线为羊抗鼠IgG或生物素化DNA喷涂在PVC塑料底板表面构成的线；
优选地，将所述羊抗鼠IgG或生物素化DNA喷涂于硝酸纤维素膜表面后贴于PVC塑料底板上。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的病原菌检测试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：依次将样品垫、复合物纳米金垫、检验线、质控线和吸收垫粘贴于PVC塑料底板上，使用斩切机沿纵向剪切成为宽度2～10mm的条状，得到所述病原菌检测试纸条。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的病原菌检测试纸条在航天器中病原体检测、航天器中微生物监测预警或家用器具中细菌检测中的应用。
9.一种病原菌实时检测试纸式生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括如权利要求1所述病原菌检测试纸条。
10.根据权利要求9所述的病原菌实时检测试纸式生物传感器在航天器中病原体检测、航天器中微生物监测预警或家用器具细菌检测中的应用。
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