DE2530621A1

DE2530621A1 - Verfahren zum bestimmen der anwesenheit von antigenen oder ihren antikoerpern in unbekannten proben

Info

Publication number: DE2530621A1
Application number: DE19752530621
Authority: DE
Inventors: Richard Henry Decker; Chung-Mei Ling; Lacy Rasco Overby
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1974-07-10
Filing date: 1975-07-09
Publication date: 1976-01-29
Also published as: NL7508259A; SE7507847L; ZA754347B; FR2277564A1; BE831145A; FR2277564B3

Description

Es gibt zwar schon Methoden zum Bestimmen der Anwesenheit von immunologisch aktiven Molekülen, wie intakten Viren, Bakterien, Proteinen, Kohlehydraten, Hormonen und dergleichen; seit einiger Zeit besteht aber ein Mangel an einer einfachen und trotzdem empfindlichen Prüfmethode und -vorrichtung zum Bestimmen der Anwesenheit dieser Stoffe. Bisher hat man markierte Antikörper zum Identifizieren verschiedener Antigene verwendet. Es ist bekannt, dass jeder Antikörper ein Gegenstück in irgendeinem Antigen hat, und dass ein für ein Antigen spezifischer Antikörper sich immer dann an das Antigen bindet, wenn dieses den Antikörper trifft. Wenn ein als spezifisch für ein bestimmtes Antigen bekannter Antikörper von dem Globulinanteil des Serums oder Plasmas eines Wirtstieres, welches für die Erzeugung dieses Antikörpers stimuliert worden ist, isoliert wird, kann er auf bekannte Weise markiert werden, indem man ihn mit dem Markierungsmittel paart. Zu diesen Markie-

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rungsmitteln gehören physikalisch nachweisbare Stoffe, wie fluoreszierende Chemikalien, radioaktive Isotope und dergleichen.

Bis vor kurzer Zeit Hessen sich die Erreger der Virushepatitis, einer verbreiteten Krankheit, nicht leicht durch einen empfindlichen Test nachweisen, der sowohl spezifisch als auch reproduzierbar genug war, um schnell festzustellen, ob das Serum eines Patienten oder Spenders Hepatitis-Antigen oder -Antikörper enthält. Es sind bereits radioimmunologische Analysenmethoden für verschiedene Antigen-Antikörpersysteme entwickelt worden; diese Methoden, wie sie in Arbeiten von Kevin Gatt und Mitarbeitern in "Journal of Biochemistry", 1966, Band 100, Seite 31c und 33c, und in "Science", Band 158, Seite 1570, 1967, beschrieben sind, sind jedoch indirekte radio immunologische Analysenmethoden, bei denen die Menge des vorhandenen Antigens grob umgekehrt proportional der Menge der von dem Leitisötopmaterial ausgesandten Strahlung ist. Diese Verfahren erfordern die Verwendung von Korrelationstabellen, wodurch die Ergebnisse weniger reproduzierbar und genau werden. Wide beschreibt in "Karolinska Symposia, 1st Simposia", 23.-25. September 1969, University Hospital, Upsala, Schweden, auf Seite 207 bis 214 eine radioimmunologische Analyse, bei der ein Allergen an ein plastisches Polymeres adsorbiert und Reagin immunochemisch an das in fester Phase vorliegende Allergen gebunden wird, worauf markiertes oder unmarkiertes Antireagin an das Reagin gebunden wird. Ebenso beschreiben CM. Ling und L.R. Overby in "Journal of Immunology", Band 109, Oktober 1972, eine diagnostische Methode für die radioimmunologische Analyse von Antigenen und ihren Antikörpern, die eine direkte Messung ermöglicht. Nach dieser Methode, angewandt auf ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von Hepatitis-Antigen, wird eine Serumprobe in ein zuvor mit Hepatitis-Antikörper beschichtetes Reagenzglas eingebracht undbei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubation bindet

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sich das Hepatitis-Antigen, wenn es in der untersuchten Serumprobe enthalten ist, an den auf den Wandungen des Reagenzglases befindlichen Antikörper. Dann wird das Reagenzglas entleert und gewaschen, so dass nur das gebundene Antikörper-Antigen auf den Wandungen hinterbleibt. Dann setzt man mit 3 markierten Antikörper zu dem Reagenzglas zu und inkubiert

125 das Ganze. Während der Inkubation bindet sich der mit J markierte Antikörper an das vorher gebundene Antigen. Nachdem das Reagenzglas wieder entleert und gewaschen worden ist, wird die darin verbleibende Radioaktivität bestimmt. Ein Vergleich mit Kontrollproben ermöglicht es, festzustellen, ob die untersuchte Serumprobe Hepatitis-Antigen enthält. Bei dieser Methode wurde ein homologes System verwendet, bei dem beide Antikörper-Reagenzien aus einem Meerschweinchen gewonnen wurden.

Immunologische Verfahren, wie sie oft beschrieben worden sind, leiden an Spezifitätsproblemen, weil rohes Antiserum mit Antigenen reagieren kann, die nicht bestimmt werden sollen. Dies liegt an der Unreinheit des Antiserums oder Antigens in Fällen, in denen die zu untersuchende Probe nicht für den Antikörper selbst, sondern für die Spezies des Antikörpers sensibilisiert wird, und es kann zu Kreuzreaktionen kommen, die zu falschen Ergebnissen führen. Diese Schwierigkeiten können bei immunologischen Verfahren von hoher Empfindlichkeit grosse Bedeutung erlangen, und es werden viele Maßnahmen ergriffen, um das Ausmaß solcher Kreuzreaktionen zu vermindern. Beispiele für solche Maßnahmen sind die Neutralisation der an der Kreuzreaktion beteiligten Stoffe oder ihre Absorption oder die Durchführung geeigneter Kontrollversuche. Trotz aller dieser Bemühungen spielen sich bei derartigen Verfahren doch Kreuzreaktionen ab, und im Falle der Analyse auf Hepatitis können falsche positive Werte erhalten werden. ;

Die Erfindung betrifft eine Methode, bei der Kreuzreaktionen bei immunologischen Verfahren fast vollständig ausgeschaltet •werden. Das Verfahren macht von einem heterologen System von

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Antikörpern und Antigenen anstelle des bisher angewandten homologen Systems Gebrauch. Die Erfindung wird nachstehend unter besonderer Bezugnahme auf eine radioimmunologisehe, in fester Phase durchgeführte Analysenmethode zum Messen der Hepatitis-Antigenkonzentrationen in Serum beschrieben; sie ist jedoch auch auf andere Systeme anwendbar, die von einem zweiphasigen Antikörper- ©der Antigensystem Gebrauch machen können. Einfach ausgedrückt, wird in der ersten Verfahrensstufe ein von einer Lebewesen^Spezies, wie Meerschweinchen, gewonnenes Antiserum von Hgpatitis^Antigen zum Beschichten der festen Phase und mithin zum Fixieren von Antigen verwendet, und in der zweiten Phase wird dann von einer zweiten Lebewesen-Spezies, wie vom Menschen, stammender, markierter Antikörper verwendet. Ein solches heterologisches System wird durch zwei Faktoren hochgradig spezifisch: a) Es ist nicht wahrscheinlich, dass ein Stoff, der mit Proteinen einer Spezies, nämlich Meerschweinchen-Antikörper, eine Kreuzreaktion eingeht, auch mit Proteinen einer anderen Spezies, nämlich menschlichem Antikörper, eine Kreuzreaktion eingeht; ausserdem b) ist jede ■ Spezies von Lebewesen während ihrer Lebenszeit durch Infektion usw. fremden und unerwünschten Antigenen ausgesetzt, aber die Wahrscheinlichkeit, dass ein einzelner Kreuzreaktionspartner mit zwei Proteinen verschiedener Lebewesenspezies reagiert, ist sehr beschränkt, CM. Ling und L.R. Overby beschreiben in "Journal of Immunology", Band 109, Nr. 4, Oktober 1972, in einer Arbeit, betitelt "Prevalence of Hepatitis B Virus

Antigen as revealed by Direct Radioimmune Assay With

-Ί-Antibody¹·, ein homologes System. Die Arbeit beschreibt

einen zweistufigen, direkten radioimmunologischen Test in seiner Anwendung zum Nachweis von Hepatitis-B-Virus-Antigen in menschlichem Serum oder Plasma. Bei dem Verfahren werden Reagenzgläser aus Polypropylen, die mit Serum von hyperimmunen Meerschweinchen beschichtet sind,und mit -\J markiertes, spezifisches Hepatitis-B-Virus-Antigen-Immunglobulin vom Meer-, schweinchen, also ein homologes System, verwendet, nämlich

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Meerschweinchen und Meerschweinchen. Die Ergebnisse dieser Testmethode haben gezeigt, dass es verhältnismässig häufig zu Kreuzreaktionen kommt, wenn ein homologes System verwendet wird, um Hepatitis-Antigen nachzuweisen; aber bei Anwendung des heterologen Systems, bei dem ein Rohr, eine Perle, eine Scheibe oder eine sonstige feste Phase aus Kunststoff mit einem vom Meerschweinchen stammenden Antikörper beschichtet wird, während ein vom Menschen stammender Antikörper in der zweiten Verfahrensstufe anstelle eines vom Meerschweinchen stammenden Antikörpers verwendet wird, wurde unter 75 000 bei klinischen Versuchen analysierten Proben nicht eine kreuzreagierende, unbestätigte positive Probe gefunden.

Es ist offensichtlich, dass eine heterologe Kombination von an eine feste Phase gebundenen, radioaktiv markierten Antikörpern Kreuzreaktionen verhindert, und dies gilt z.B. für heterologe Systeme, wie Mensch-Meerschweinchen, Kaninchen-Mensch, Ziege-Kaninchen usw.

Obwohl die Erfindung hier in ihrer Anwendung auf den Nachweis von Hepatitis-Antigen durch radioimmunologische Analyse beschrieben wird, ist das Prinzip der Erfindung auch auf andere Systeme anwendbar, die von einem zweiphasigen Antikörperoder Antigensystem Gebrauch machen können, z.B. auf Antigene mit zwei oder mehr reaktionsfähigen Stellen, wie Proteine, Peptide, Enzyme, Hormone, Viren, Bakterien und dergleichen, oder Systeme, die von einer zweiphasigen Antikörperreaktion Gebrauch machen, wie fluoreszierende Antikörper, Immunoenzym, Antikörper mit freien Radikalen und radioaktive oder nichtradioaktive Nuklide. Durch Verwendung geeigneter Markierungsmittel, zu denen physikalisch nachweisbare Stoffe, wie die oben genannten, d.h. fluoreszierende Chemikalien, radioaktive Isotope usw., gehören, gelingt der Nachweis von immunologisch aktiven Molekülen. Wenn ein radioaktives Isotop als Markie-

125 rungsmittel verwendet wird, wird Jod ^J wegen seiner vorteil-

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haften Halbwertszeit bevorzugt; man kann jedoch auch andere

131 3' Radionuklide, wie Jod. , Phosphor ren der Reaktionspartner verwenden.

A ^I 3?

Radionuklide, wie Jod. , Phosphor und Tritium, zum Markie-

Das heterologe System gemäss der Erfindung wird in Verbindung mit einer radioimmunologischen Festphasen-Analysenmethode zur Bestimmung der Hepatitis-Antigenkonzentrationen im Serum unter Verwendung im.wesentlichen der gleichen Verfahren und Methoden beschrieben, wie sie von Ling und Overby in der oben genannten Arbeit beschrieben worden sind. Bei allen nachfolgenden Untersuchungen werden Kunststoffperlen verwendet, die mit Meerschweinchen-Antikörper beschichtet sind. Das Serum des Patienten wird zugesetzt, und während der Inkubation bindet sich alles Antigen, das etwa in dem Serum enthalten ist,

an den Antikörper. Wenn dann mit Jod ^ markierter menschlicher Antikörper zugesetzt wird, bindet er sich an das Antigen auf der Perle, wodurch eine Kombination aus Meerschweinchen-Antikörper, Antigen und markiertem menschlichem Antikörper entsteht. Nach dem Waschen wird die restliche Radioaktivität gemessen, und innerhalb gewisser Grenzen ist dann die Zählrate um so höher, je grosser die Menge des Antigens in der Serumprobe war. Die folgende Beschreibung erläutert eine Methode zur Durchführung dieser Untersuchungen, wobei die folgenden Reagenzien verwendet werden:

1. Negative menschliche Kontrolle (recalcifiziertes menschliches Plasma, das mit Hepatitis-Antigen und Hepatitis-Antikörper nicht reagiert). Als Konservierungsmittel dient 0,1-prozentiges Natriumazid.

2. Positive menschliche Kontrolle (menschliches Plasma, das mit Hepatitis-Antigen reagiert). Als Verdünnungsmittel zur Einstellung der Stärke dient 0,01-molarer TRIS-Puffer, der

■4 %.Rinderserumalbumin enthält, und als Konservierungsmit-' tel dient 0,1-prozentiges Natriumazid.

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3. Durch ein Radioisotop markierter Hepatitis-Antikörper (menschliches Anti-Australia-Antigen, markiert mit J ). Als Verdünnungsmittel zur Einstellung der Stärke dient 0,005-molarer Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan)-Puffer, der 50 % Kälberserum, 2 % normales menschliches Serum und 0,5 % Rinderserumalbumin enthält, und als Konservierungsmittel

,dient 0,1-prozentiges Natriumazid.

4. Mit Hepatitis-Antikörper (vom Meerschweinchen) beschichtete Perlen (Polystyrolperlen, die mit vom Meerschweinchen stammendem Hepatitis-Antikörper beschichtet sind),

Aus diesen Reagenzien und Materialien kann eine Testausrüstung hergestellt werden; eine Ausrüstung zur Durchführung von 100 Bestimmungen enthält:

100 mit Hepatitis-Antikörper (Anti-Australia-Antigen) (vom Meerschweinchen) beschichtete Perlen;

zwei Ampullen (zu je 10 ml) mit Hepatitis-Antikörper (mit J markiertes menschliches Anti-Australia-Antigen), etwa 7 Mikrocurie je Ampulle;

eine Ampulle (5 ml) mit negativer Kontrolle (mit Hepatitis-Antigen nicht reagierend);

eine Ampulle (3 ml) positive Kontrolle (mit Hepatitis-Antigen positiv reagierend);

zwei Teller mit je 20 Vertiefungen und Zählrohre.

Das Prüfverfahren wird folgendermassen durchgeführt:

Für jede zu untersuchende Probe wird eine mit Meerschweinchen-Antikörper beschichtete Perle in eine Vertiefung des Tellers gelegt. Unter Verwendung einer Präzisionspipette werden 0,2 ml

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Serum (oder recalcifiziertes Plasma) sowie positive und negative Kontrollen zu den entsprechenden Vertiefungen zugesetzt. Die mit Antikörper beschichtete Perle soll vollständig von Serum umgeben sein. Auf den Teller wird ein Deckel aufgesetzt, und alle Teller werden 2 Stunden bei 45° C inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums werden die Teller entfernt und die Deckel verworfen. Dann wird jede Vertiefung und jede Perle mit insgesamt 5 ml destilliertem oder entmineralisiertem Wasser gespült. Dieses Waschverfahren wird noch einmal wiederholt. Mit einer Präzisionspipette werden zu jeder Inkubationsvertiefung 0,2 ml mit J markierter (menschlicher) Hepatitis-Antikörper zugesetzt, wobei man dafür sorgt, dass die mit Antikörper beschichtete Perle vollständig von der Lösung des markierten Antikörpers umgeben ist. Dann wird der Teller mit einem Deckel versehen, und die Teller werden 1 Stunde bei 45° C inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums wird der Deckel abgenommen und die Antikörperlösung aus jeder Vertiefung herausgesaugt, nachdem die Vertiefungen zusammen mit den sich* darin befindenden, mit Antikörper beschichteten Perlen mit insgesamt 5 ml destilliertem oder entmineralisiertem Wasser, wie oben beschrieben, gewaschen worden sind. Dann werden die Perlen aus den Reaktionsvertiefungen in entsprechend identifizierte Zählrohre überführt, die in γ-Szintillationszähler eingesetzt werden, worauf man die Zählrate bestimmt.

Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Hepatitis-Antigen wird bestimmt, indem man die Nettozählungen je Minute, die mit der unbekannten Probe erhalten werden, zu dem 2,1-fachen der Nettozählungen je Minute in Beziehung setzt, die mit der negativen Kontrolle erhalten werden. Unbekannte Proben, deren Nettozählrate höher ist als der mit der negativen Kontrolle festgestellte mittlere Grenzwert, werden als positiv in bezug auf Hepatitis-Antigen angesehen. Der mittlere Wert für.die positiven Kontrollproben soll mindestens das Fünffache des Mittelwertes der negativen Proben betragen. Wenn dies nicht

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der Pall ist, kann die Methode ungenau sein, und der Versuch soll wiederholt werden.

Berechnung für die Bestimmung des Grenzwertes 1. Berechnung des Mittelwertes für die negative Kontrolle a. Beispiel:

b.

Negative Kontrollprobe Nr.

1 2 3 4 5 6 7

.Nettozahlrate je Minute (Zpm)

380 400 410 375 350 390 400

Insgesamt

2705

Gesamte Netto-Zpm 2705 ,_o,~ „ .. „ /-,,.j.^. -, = *— = ——^- = 386 Netto-Zpm (Mittel-

' " ' wert)

Ausschaltung von Irrwerten.

Methode:

Man vernachlässigt einzelne Werte in den negativen Kontrollproben, die ausserhalb des Bereichs von dem 0,5fachen bis zum 1,5fachen des Mittelwertes liegen.

Beispiel:* -

0,5 x 386 = 193 und 1,5 x 386 = 579

Bereich: 193 Zpm bis 579 Zpm

* In diesem Beispiel wird keine negative Kontrollprobe als irrig vernachlässigt.

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c. Daher braucht der Mittelwert für die negative Kontrollprobe nicht berichtigt zu werden. In typische)* Weise sollen alle negativen Kontrollwerte in den Rereich von dem 0,5fachen bis zum 1,5fachen des Mittelwertes der Kontrollprobe fallen. Wenn gefunden wird, dass mehr als ein Wert immer ausserhalb dieses Bereichs liegt, sollen technische Schwierigkeiten untersucht werden. ·

2. Berechnung des Grenzwertes (siehe Anmerkung)

a. Man multipliziert den negativen Nettokontrollwert 386 Zpm mit dem Faktor 2,1.

b. Der berechnete Grenzwert ist dann 811 Zpm.

c. Unbekannte, deren Nettozählrate höher ist als der Grenzwert, sollen als in bezug auf Hepatitis-Antigen positiv angesehen werden.

Anmerkung: Viele Gammazähler bieten nicht die Möglichkeit, den Hintergrund automatisch zu subtrahieren. In diesem Falle kann man, statt den Instrumentenhintergrund für jede Probe von Hand zu subtrahieren, unkorrigierte Probenzählungen je Minute mit einem folgendermassen abgeänderten Grenzwert vergleichen:

(Mittelwert der negativen Kontrollprobe - Hintergrund) χ 2,1 + Hintergrund = Grenzwert

Beispiel:

Bruttomittelwert für die negative Kontrollprobe

= 436 Zpm

Instrumentenhintergrund = 50 ZpM Grenzwert = (436 - 50) χ 2,1 + 50 = 861 Zpm

Proben mit Bruttozählraten von mehr als 861 Zpm werden als mit Hepatitis-Antigeri reagierend angesehen.

" ■ - * - 10 509885/0928

3148 'M^%

3. Berechnung des Verhältnisses von positivem Kontrollwert zu negativem Kontrollwert

a. Man dividiert den Mittelwert für die positive Kontrolle durch den Mittelwert für die negative Kontrolle nach Korrektur für den Hintergrund:

Nettomittelwert

für positive Kontrolle _, ....... „ „

TTTZ— τ - Verhältnis P:N

Nettomittelwert

für negative Kontrolle

b. Dieses Verhältnis soll mindestens 5 betragen; sonst kann die Methode ungenau sein, und der Versuch soll wiederholt werden.

Beispiel:

Nettomittelwert der positiven Kontrolle = 5906 Zpm Nettomittelwert der negativen Kontrolle = 386 Zpm Verhältnis P:N » 5906 : 386 = 15,3»

Diese Methode ist brauchbar und die Ergebnisse sollten als gültig angesehen werden.

Die folgenden Daten und Ergebnisse zeigen die Empfindlichkeit des heterologen Systems sowie seine Fähigkeit, das Ausmaß von Kreuzreaktionen auf ein Minimum zu beschränken.

Tabelle I zeigt die Fähigkeit eines Zwei-Spezies-Antikörpersystems oder eines heterologen Systems, Hepatitis-B-Antigen von falschen positiven Reaktionen zu unterscheiden. 18 Proben werden aufs Geratewohl aus Hepatitis-B-reaktionsfähigem Serum ausgewählt, das zuvor in verschiedenen Laboratorien durch spezifische Neutralisationsverfahren als falscher Reaktionspartner mit homologen Meerschweinchen-Meerschweinchen-Reagenzien ermittelt worden war. Die Daten umfassten 5 bestätigte positive und zum Vergleich 5 negative Werte.

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Eine positive Reaktion ist als eine solche definiert, "bei der die an der unbekannten Probe in Zählungen je Minute (Zpm) bestimmte Radioaktivität grosser als das 2,1-fache des Mittelwertes der an negativen Kontrollproben gemessenen Radioaktivität ist. Bei der direkten radioimmunologischen Analyse mit homologen Antikörpern (z.B_e Meerschweinchen-Meerschweinchen) reagieren sowohl die richtigen als auch die falschen positiven Proben und lassen sich daher nicht voneinander unterscheiden. Daher werden mit dem heterologen System (z.B. Schimpansen-Meerschweinchen-Antikörper) alle richtigen positiven Reaktionen festgestellt, es reagieren.jedoch keine falschen positiven Proben.

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Tabelle I

co ro ο

Probe Nr.	s-RIA mit einer Antikörper-Spezies (homolog) Zpm/NCx**
Richtige posi tive Proben
1	18,9*
2	20,3
3	18,9
4	9,1
5	22,3
Negative Proben 1	1,0
2	0,9
3	.1,0
4-	1,1
5	0,8

s-RIA. mit zwei Antikörper-Spezies (heterolog) Zpm/NCx**

51,7*

43,5

50,8

14,4

55_fl

0,9 0,9 1,0 0,8 0,8

,Tabelle I (Fortsetzung)

cn ο co co co cn

ο co ro cn

probe Nr.	*	s-RIA mit einer Antikörper-Spezies (homolog) Zpm/NCx**	s-RIA mit zwei Ant ikör per-Spe ζ ies (heterolog) Zpm/NCx*
Falsche posi tive· Proben
1 , '■ . .	18,2	0,7
2	18,6	1,1
3	11,9	1,1
4	7,4	1,0
5	10,4	1,1
6	14,4	0,9
7	13,8	. ·· 0,9
8	18,9	0,9
9	17,0	0,9
10	10,2	0,9
11	4,4	1,0
12	3,4	1,1
13	5,3	1,1
14	5,4	1,1

Ol OJ O CD K)

Probe Nr.	•s-RIA mit einer , Antikörper-Spezies (homolog) Zpm/NCx**
_m
Falsche posi tive Proben	11,9
15	6,8
16	7,5
17	10,6
18

Tabelle I (Fortsetzung) · co

s-RIA mit zwei Ant ikörper-Spe ζ ie s (heterolog) Zpm/NCx**

0,9 0,9 0,9 1,1

* Verhältnisse der Zählrate zu derjenigen der negativen Probe

von mehr als 2,1 werden als positiv angesehen (richtig oder falsch). .

** Zpm/NCx β Probenzählungen je Minute, dividiert durch die Zählungen

für die negative Probe je Minute.

.to

RIA » Radioimmunologische Analyse. £"

Tabelle II gibt ein Beispiel für die Wirksamkeit eines heterologen Antikörpersystems in seiner Anwendung bei der direkten radioimmunologischen Analysenmethode zur diagnostischen Untersuchung auf Hepatitis-B-Virus-Antigen. 9782 aufeinanderfolgende Einheiten von Spenderblut wurden nach einer direkten radioimmunologischen Analysenmethode, wie sie von Ling und Overby beschrieben wurde, unter Verwendung eines homologen Antikörpersystems (Meerschweinchen-Meerschweinchen) und eines heterologen Antikörpersystems (Mensch-Meerschweinchen), wie hier beschrieben, auf Hepatitis-B-Antigen analysiert. Durch die homologe radioimmunologische Analysenmethode wurden 65 positive Spender nachgewiesen, aber durch weitere Neutralisationsversuche wurde gezeigt, dass 10 von ihnen falsche positive Proben waren. Andererseits wurden mit Hilfe des hier beschriebenen radioimmunologischen Analysensystems 63 positive Proben festgestellt, nämlich die 55 positiven Proben, die auch nach der homologen Methode ermittelt wurden, und 8 weitere Proben, die alle durch Neutralisationsverfahren als positiv " bestätigt wurden.

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Tabelle II

In 9782 Spenderblutproben festgestellte positive Hepatitisreaktionen

Durch direkte RIA Durch direkte RIA (homologe Anti- (heterologe Antikörper) körper)

Gesamtes HBAg

Durch Analyse nachgewiesene positive
Ergebnisse · 65 63

Bestätigte positive

HBAg-Ergebnisse* ... 55 63

Falsche Ergebnisse 10 0

* Bestätigt durch spezifische Neutralisation mit menschlichem Anti-HBAg.

RIA =s Radioimmunologische Analyse. HBAg j= Hepatitis-B-Antigen.

Die relative Empfindlichkeit der hier beschriebenen heterologen radioimmunologischen Analysenmethode im Vergleich mit anderen Testsystemen für Hepatitis-Antigen wurde in einer Blindauswertung durch Analysieren von serienweise aufeinanderfolgenden doppelten Verdünnungen von Hepatitis-Antigen-positiven menschlichen Sera und gereinigten Antigenen (Subtypen ad und ay), hergestellt aus Pools von antigen-positiven Sera, in normalem menschlichem Serum bestimmt. Zum Vergleich der Empfindlichkeit der Prüfsysteme wurden die Mittelwerte der stärksten Verdünnung verwendet, die von vier einzelnen Untersuchungslaboratorien noch als positiv nachgewiesen wurden.

Die maximalen, serxenmässig durchgeführten Verdünnungen auf jeweils das Doppelte, bei denen durch das heterologe radio-

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3148 .If. 253Ό621

immunologische Analysensystem (heterologe RIA) gemäss der Erfindung, ein homologes radioimmunologisches Analysensystem
(homologe RIA) gemäss Ling und Overby, ein umgekehrtes passives Hämagglutinationstestsystem (RPHA), Gegenelektrophorese
(CEP) und Rheophorese (RHEO) noch ein positiver Nachweis möglich war, sind in den Tabellen III, IV und V angegeben.

- 18 509885/0926

Tabelle III £

Maximale Verdünnung von Sera, in der eine positive Hepatitis*·Antigen-Reaktion
nach den einzelnen Analysenmethoden noch nachgewiesen wird

• Kennzeichnung ' ,

von Serum '
und Subtype Heterologe RIA

1 (ad) 1:65 536

οι ' 2 (ad) . 1:16 384

S ·' 3 (ad) 1:32 768

oo 4 (ay) ' 1:16 384

cn ' 5 (ay) 1:4 096

5 ^ 6 (ay) 1:2 048 ·

Ni . ■ '

Homologe RIA	RPHA	CEP	RHEO
1:32 768	1:16 384	1:256	1:256
1:4 096	1:2 048	1:32	1:32
1:8 192	1:8 192	1:128	1:128
1:1 024	1:1 024	1:64	1:64
•1:512	1:512	1:8	1:8
1:512	1:256	1:16	1:16

cn co O

*ift*	I.
O	ro
co	O
co	I
09
cn
>»·
O
(0
ro
cn

Tabelle IV

Mit den einzelnen Analysenmethoden nachgewiesenes gereinigtes Hepatitis-Antigen (y/ml) (Subtype ad)

Konzentration, y/ml	Heterologe RIA, Zpm/NCx	-
5,120		* 103,8,
2,56JO	•	79,7
1,280	49,1
0,640	46,1
0,320	23,9
0,160	11,3
0,080	7,2
0,040	3,7
0,020	2,2'
0,010
. 0,005
. 0,0025

Homologe

RIA, Zpm/NCx

15,3

12,2

14,1

11,3

13,6

15,6

11,3

6,2

4,2

3,2

0,0013

1,7

1,7 1,6 0,9

RPHA

Kehrwert

des Titers

>128
> 128

CEP

0
0
0
0

RHEO (+/0)

> 128	0	0
> 128	0	0
> 128	0	0
64	0	0
64	0	0
32	0	0
16	0	0

0 0 0 0

CD CO O

	•	Tabelle V	•	Homologe RIA,. Zpm/NCx	RPHA Kehrwert des Titers	CEP (+/0)	RHEO (+/0)	OJ	1	ff
	Konzentration, v/ml		16,3	> 128	₊		^· 00		φ
	5,120	Mit den einzelnen Analysenmethoden nachgewiesenes gereinigtes Hepatitis-Antigen (y/ml) (Subtype ay)	14,8	> 128 '	+ ■	- +
	2,560	Heterologe - ' RIA, Zpm/NCx	15,2	> 128	0	0
cn	1,280	_—	14,5	> 128	0	0
ο co	0,640		7,7	64	0	0	·. "'Ni
⁰⁰ ι cn	0,320		8,9 ⁴'²	32 16	0 0	0 6	CO Ό
-ν ro ο -*	0,160 0,080	61,1	2,5		0	0	CD
co ι M CD	0,040	68,6	1,9.	<16	0	0
	0,020	39,9 28,7	V⁷	< 16	0	0
	0,010	15,6	1,5	^w JLo	0	0
	0,005	11,2	1,2	^v Ιο	0	0
	0,0025	5,0	0,8	<16	0	0
	0,0013	3,0
		2,7	<16
	1,8

3148 ·oH» ·

Diese Daten zeigen, dass das hier beschriebene heteroIoge radiöimmunologische Analysensystem 250- bis lOOOmäl empfindlicher als CEP und RHEO und 2- bis 16mal empfindlicher ist als ein ähnliches homologes Analysensystem oder das umgekehrte passive Hämagglutinatxonssystem.

Die Fähigkeit des heterologen radioimmunologischen Analysensystems, im Vergleich zu einem ähnlichen homologen System, zu dem umgekehrten passiven Hämagglutinationstestsystem und zu der CEP-Methode Hepatitis-Antigen in Blutbank-Spenderproben festzustellen, ergibt sich aus Tabelle VI. Die Daten umfassen 5344 Plasmaeinheiten von aufeinanderfolgenden Blutspendern und 13 896 aufeinanderfolgende Blutspendersera aus vier Blutbanken. Alle für Hepatitis-Antigen positiven Proben, die durch die CEP-Methode nachgewiesen wurden, wurden auch durch die übrigen Testmethoden nachgewiesen.

. - 22 509885/0926

tabelle VI ,'£

■ . co

Nachweis von Hepatitis-Antigen bei aufeinanderfolgenden Blutspendern ¹ durch heterologe RIA, homologe RIA, RPHA und CEP

Untersuchte Heterologe Ursprung der Proben

Plasmaeinheiten ¹(von freiwilligen · Spendern und aus

dem Handel)

σι . ■

° Blutbank 1 ^ (freiwillige Spender}

tn ι Blutbank 2

*·«. ro (freiwillige Spender)

«° ι Blutbank 3

£5 .' (freiwillige Spender)

Blutbank 4 (freiwillige Spender und aus dem Handel)

Insgesamt

Anzahl	RIA	Homologe RIA	RPHA	CEP	•	•	cn CO O CD KJ
5344	34(0,64%)	34(0,64 %)	34(0,64%)	25(0,47%)
1019	4(0,39%)	3(0,29%)	3(0,29%)	3(0,29%)
1471	0	0	0 ' .	0
1017	3(0,29%)	3(0,29%)	3(0,29%)	3(0,29%)
10 389	• 65(0,63%)	58(0,56%)	57(0,55%)	42(0,40%)
19 240	106(0,55%)	98(0,51%)	97(0,50%)	73(0,38%)
			•

3148 -^

Diese Daten zeigen, dass mit dem heterologen radioimmunologischen Analysensystem sieben Hepatitis-Antigen-positive Proben mehr als mit dem homologen RIA-System, acht positive Proben mehr als mit dem umgekehrten passiven Hämagglutinationstestverfahren und 32 positive Proben mehr als nach der CEP-Methode ermittelt wurden. Das heterologe RIA-Testsystem-weist um 44 % mehr Hepatitis-Antigen-positive Proben nach als die CEP-Methode.

Im folgenden wird die Spezifität der hier beschriebenen heterologen radioimmunologischen Analysenmethode aufgezeigt. Der Prozentsatz der bei der heterologen RIA-Analysenmethode als reaktionsfähig ermittelten Proben und der Prozentsatz dieser reaktionsfähigen Proben, von denen nach dem Neutralisations-Bestätigungsverfahren ein Gehalt an Hepatitis-Antigen ermittelt wurde, wurde durch Bestimmung an 31 319 Sera bei klinischen Untersuchungen an sieben Blutbanken· ermittelt. Die Ergebnisse dieser Versuche finden sich in Tabelle VII.

Tabelle VII

Prozentsatz der heterolog reaktionsfähigen Proben, die als positiv für Hepatitis-Antigen bestätigt wurden

Positive Analyse Wiederholbar positiv Bestätigt positiv 169(0,54%) 127(0,41%) . ' 127(0,41%)

Negative Analyse , .

31 150(99,46%) .

Die Daten von Tabelle VII zeigen, dass bei dem hier beschriebenen heterologen radioimmunologischen Analysensystem eine durch immunologische Kreuzreaktionen verursachte Nichtspezifität nicht existiert. Gemäss den Daten erwiesen sich etwa 0,1 % oder 1,3 von 1000 Proben als nicht-wiederholbar positiv infolge eines Manipulierfehlers bei einer einzigen anfängli-

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chen Analyse. Die Wiederholung der Untersuchung der bei der anfänglichen Analyse als positiv befundenen Proben mit nachfolgender bestätigender Neutralisation zeigt, dass alle wiederholbar positiven Proben erfolgreich neutralisiert worden sind, woraus sich ergibt, dass mit der heterologen radioimmunologischen Analysenmethode keine falschen positiven Ergebnisse erhalten werden.

Die Inkubation kann bei dem Verfahren gemäss der Erfindung bei Raumtemperatur durchgeführt werden; jedoch kann man das Material etwas, bis etwa 35° C, erwärmen, um die Inkubationszeit zu verkürzen. Wenn eine kürzere Inkubationszeit erwünscht ist, um die Gesamtzeitspanne zu verkürzen, die erforderlich ist, um das Testverfahren durchzuführen, lässt sich- die Inkubationszeit stark verkürzen, indem man die Reaktionstemperatur von etwa 35 auf 55 C, insbesondere von 38 auf 50 C, erhöht, wobei- eine Temperatur von etwa 45 C besonders bevorzugt wird. Durch Anwendung dieser höheren Temperaturen gelingt es, die Inkubationszeit auf etwa 10 Minuten bis 3 Stunden abzukürzen, wohingegen für die erste Inkubation im allgemeinen 12 bis 18 Stunden erforderlich sind, wenn sie bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Die zweite Inkubation, bei der das Prüfgerät mit dem markierten Antigen oder Antikörper behandelt wird, kann gewöhnlich in einer kürzeren Zeitspanne durchgeführt werden als die erste Inkubation. Kurze Inkubationszeiten werden normalerweise angestrebt, weil dadurch eine schnelle Vervollständigung des Prüfverfahrens ermöglicht wird. Bei der Sammlung und Verwendung von menschlichem Blut zum Beispiel gelingt es bei Inkubationszeiten von 2 bis 3 Stunden, die Sammlung, Untersuchung und Verwendung des Blutes innerhalb eines einzigen Tages durchzuführen.

Das Verfahren gemäss der Erfindung ist zwar durch die obigen speziellen Beispiele erläutert worden, kann jedoch, wie oben angegeben, angewandt werden. Auch die Untersuchungsbedingungen,

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wie Inkubationszeiten, sind nicht kritisch und können innerhalb von Bereichen variiert werden, die ausreichen, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erhalten.

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Claims

Patentansprüche

1.) Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von Antigenen oder ihren Antikörpern in unbekannten Proben unter Anwendung eines hetero logen Systems der Antigene bzw. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) die unbekannte Probe mit einem von einer ersten Lebewesen-Spezies stammenden, in Form einer Schicht an ein Prüfgerät gebundenen Antigen oder Antikörper dieses Antigens in Berührung bringt, .

(b) die unbekannte Probe während einer ersten Zeitspanne in Berührung mit dieser Schicht inkubiert,

(c) das Prüfgerät mit der daran gebundenen Antigen- oder Antikörperschicht von der unbekannten Probe entfernt,

(d) die Schicht mit einem durch ein Markierungsmittel markierten Material in Berührung bringt, welches ein Antigen oder dessen Antikörper ist, mit der Maßgabe, dass dieses Material ein markiertes Antigen ist, wenn die Schicht aus Antigen besteht, und dass dieses Material ein markierter Antikörper ist, wenn die Schicht aus Antikörper besteht, und dass das markierte Material von einer zweiten Lebewesen-Spezies stammt,

(e) die Schicht innerhalb einer zweiten Zeitspanne in Berührung mit dem markierten Material inkubiert und

(f) durch Untersuchung des Prüfgeräts auf die Anwesenheit des markierten Materials die Anwesenheit des Antigens bzw. des Antikörpers desselben in der unbekannten Probe

bestimmt.

■ . - - ZJ -

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3148 * <s»C · ■ .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Bestimmung durch direkte radioimmunologische Analyse durchführt, indem man in Stufe (d) ein radioaktiv markiertes Material verwendet und in Stufe (f) die Anwesenheit des Antigens bzw. seines Antikörpers in der unbekannten Probe durch Messung der von dem Prüfgerät ausgesandten Strahlung bestimmt.

3. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines Antikörpers, der befähigt ist, sich an zwei dazugehörige Antigene zu binden, in einer unbekannten Probe unter Anwendung eines heterologen Systems -von Antigenen durch direkte radioimmunologische Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) die unbekannte Probe mit einem von einer ersten Lebewesen-Spezies stammenden, in Form.einer Schicht an ein •Prüfgerät gebundenen Antigen des betreffenden Antikörpers in Berührung bringt,

(b) durch Inkubieren der unbekannten Probe innerhalb einer ersten Zeitspanne in Berührung mit der Schicht allen etwa in der unbekannten Probe enthaltenen Antikörper an das Antigen bindet,

(c) durch Waschen der inkubierten Schicht die unbekannte Probe entfernt, so dass der an das Antigen gebundene Antikörper hinterbleibt,

(d) die gewaschene Schicht mit einem von einer zweiten Lebewesen-Spezies stammenden, durch ein radioaktives

- .Isotop markierten, gereinigten Antigen in Berührung bringt,

(e) durch Inkubieren der gewaschenen Schicht innerhalb einer zweiten Zeitspanne in Berührung mit dem durch das radioaktive Isotop markierten gereinigten Antigen das gereinigte Antigen an den an das Antigen gebundenen Antikörper bindet und so eine radioaktiv markierte, inkubierte Schicht erzeugt,

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(f) durch Waschen der radioaktiv markierten, inkubierten Schicht alles etwa ungebundene, gereinigte Antigen entfernt und

(g) durch Messen der von der radioaktiv markierten, inkubierten Schicht ausgesandten Strahlung die Anwesenheit des Antikörpers in der unbekannten Probe bestimmt.

4. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines Antigens, das befähigt ist, sich an. zwei zugehörige Antikörper zu binden, in einer unbekannten Probe unter Anwendung eines •heterologen Systems von Antikörpern durch direkte radioimmunologische Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass man

(a) die unbekannte Probe mit einem von einer ersten Lebewesen-Spezies stammenden, in Form e^ier Schicht an ein Prüfgerät gebundenen Antikörper des betreffenden Antigens in Berührung bringt,

(b) durch Inkubieren der unbekannten Probe innerhalb einer ersten Zeitspanne in Berührung mit der'Schicht alles etwa in der unbekannten Probe enthaltene Antigen an den Antikörper bindet,

• (c) durch Waschen der inkubierten Schicht die unbekannte Probe entfernt, so dass das an den Antikörper gebundene Antigen hinterbleibt,

(d) die gewaschene Schicht mit einem von einer zweiten Lebewesen-Spezies stammenden, durch ein radioaktives Isotop markierten, gereinigten Antikörper in Berührung bringt,

(e) durch Inkubieren des gewaschenen Überzuges innerhalb einer zweiten Zeitspanne in Berührung mit dem durch das radioaktive Isotop markierten gereinigten Antikörper den gereinigten Antikörper an das an den Antikörper gebundene Antigen bindet" und.so eine radioaktiv markierte, inkubierte Schicht erzeugt,

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(f) durch Vaschen der radioaktiv markierten, inkubierten Schicht allen etwa ungebundenen gereinigten Antikörper entfernt und

(g) durch Messen der von der radioaktiv markierten, inkubierten Schicht ausgesandten Strahlung die Anwesenheit des Antigens in der unbekannten Probe bestimmt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Antigen und Antikörper Hepatitis-Antigen und Hepatitis-Antikörper verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die von der radioaktiv markierten, inkubierten Schicht ausgesandte Strahlung in Stufe (g) mit der Strahlung vergleicht, die von einer nach den Stufen (a) bis (g) hergestellten negativen Probe ausgesandt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper der Stufe (a) aus Meerschweinchen und der Antikörper der Stufe (e) aus dem menschlichen Körper gewonnen wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man

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als radioaktives Isotop J ^ verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation in Stufe (b) für eine Zeitspanne von 10 Minuten bis.3 Stunden bei etwa 35 bis 55° C durchgeführt wird,

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei etwa 38 bis 50° C durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation für einen Zeitraum von etwa 2 Stunden bei etwa 45° C durchgeführt wird.

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3148. .31. ²⁵³⁰⁶²'

12. Diagnostische Testausrüstung zum Bestimmen der Anwesenheit von Hepatitis-Antigen in unbekannten Proben, gekennzeichnet durch

(a) ein Prüfgerät, an das ein von einer ersten Lebewesen-Spezies stammender ,Antikörper des Antigens in Form einer Schicht gebunden ist,

(b) eine Lösung eines von einer zweiten Lebewesen-Spezies stammenden, mit einem radioaktiven Isotop markierten Antikörpers des Antigens,

(c) eine Lösung einer mit Hepatitis-Antigen nicht reagierenden negativen Kontrollprobe,

(d) eine Lösung einer mit Hepatitis-Antigen positiv reagierenden positiven Kontrollprobe und

(e) einen Behälter zur Aufnahme des Prüfgerätes und der Lösungen.

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