-
Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Testverfahren zum Nachweis eines Antigens oder Antikörpers in einer
Testprobe und die Ausrüstung
zur Durchführung
des Tests.
-
Insbesondere betrifft die Erfindung
ein Sandwich-Verfahren, in dem die Testprobe, von der vermutet wird,
dass sie bestimmte Antigene oder Antikörper enthält, mit einem festen Substrat
in Kontakt gebracht wird, an dessen Oberfläche ein Antikörper oder
Antigen gebunden ist, das mit dem Antigen oder Antikörper in
der Testprobe einen Immunkomplex bilden kann, und bei dem der Immunkomplex,
der gebildet wurde, unter Verwendung eines markierten Antikörpers/Antigens
als Nachweisreagens bestimmt wird.
-
EP-A-0 296 398 beschreibt ein einstufiges
Immunoassay-Verfahren zum Nachweis von vorhandenen Antikörpern (oder
Antigenen), bei dem die Antigene auf ein festes Substrat getupft
werden, ein Nachweisreagens und ein Serum als Anti körperquelle
zugegeben werden, und alle diese drei Komponenten zusammen inkubiert
werden.
-
EP-A-0 498 124 beschreibt insbesondere
einen Immunoassay zum Nachweis von DERF II, das das Hauptallergen
der Hausstaubmilbe ist, bei dem eine Probe in Form eines Extrakts
mit einem monoklonalen Antikörper
inkubiert wird, der selektiv DERF II erkennt.
-
WO-A-92 01051 beschreibt ein in vitro-Diagnoseverfahren
für menschliche
oder tierische Hydatidose, das das Inkontaktbringen von biologischem
Material mit Immunogenpeptidsequenzen, die gegen monoklonale Antikörper gerichtet
sind, umfasst.
-
Die Erfindung stellt insbesondere
ein schnelles Testverfahren zur Verfügung, das sogar von Nichtexperten
leicht durchgeführt
werden kann, und ermöglicht
es, dass die Reaktion direkt angezeigt wird, während es gleichzeitig einen
hohen Empfindlichkeitsgrad hat.
-
Schließlich ist Gegenstand der Erfindung
ein Testverfahren vom oben gekennzeichneten Typ, dadurch gekennzeichnet,
dass das feste Substrat gleichzeitig mit der Testprobe und dem markierten
Antikörper
oder Antigen in Kontakt gebracht wird.
-
Der Begriff "gleichzeitig", wie im obigen Absatz verwendet, soll
die folgenden Verfahren beeinhalten:
-
- – vorheriges
Mischen der Testprobe und des markierten Antikörpers oder des markierten Antigens,
Inkontaktbringen des vorgemischten Produkts mit dem Substrat;
- – Zugabe
der Testprobe zum Substrat und sofortige Zugabe des markierten Antikörpers oder
Antigens ohne zwischenzeitliche Waschschritte.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
besteht der Nachweisantikörper
oder das Nachweisantigen aus einem Antikörper oder einem Antigen, das
mit einem kolloidalen Farbstoff konjugiert ist.
-
Obgleich das Verfahren der Erfindung
generell anwendbar ist, ist es im Hinblick auf die Ziele, die damit erreicht
werden sollen, besonders geeignet und vorteilhaft zum Nachweis von
Umweltallergien und zum Nachweis von Antikörpern, die aus infektiösen und
parasitischen Krankheiten resultieren.
-
In einer Ausführungsform betrifft der Test
der Erfindung insbesondere den Nachweis von in der häuslichen
Umgebung vorhandenen Allergenen.
-
Das erste Anzeichen für die mögliche Rolle
von Milben bei der Verursachung von Allergien stammt aus den zwanziger
Jahren des vorigen Jahrhunderts; später, um 1960, zeigte eine weitere
Reihe von Experimenten eindeutig, dass Milben der Gattung Dermatophagoides
(Pteronyssinus und Farinae) und insbesondere ihre Exkremente eine
erhebliche Menge eines Allergens, Der p I genannt, enthalten, und
die Hauptursache von Allergien durch Hausstaub sind.
-
Seitdem nahmen die Bestätigungen
bis zu einem Ausmaß zu,
das zu der Überzeugung
geführt
hat, dass Allergien durch Milben im Hausstaub ein weltweites Problem
darstellen, welche eine Reihe von klinischen Symptomen verursachen,
die von Asthma über
Rhino-Konjunktivitis bis zur atopischen Dermatitis reichen, bei Erwachsenen
genauso wie bei Kindern. Es wird davon ausgegangen, dass 5 bis 10
% der europäischen
Bevölkerung
durch Formen von Allergien, die durch Gegenwart von Milben hervorgerufen
werden, beeinträchtigt werden,
und bei einer weiteren Prozentzahl, obgleich noch nicht sensibilisiert,
könnte
dies als Ergebnis auftreten, wenn sie weiterhin Milben und ihren
Fäkalien
länger
ausgesetzt bleiben. Neuere epidemiologische Untersuchungen haben
gezeigt, dass ständige
Gehalte des Allergens Der p I von 0,5–2 μg/g Staub, entsprechend 25–100 Milben/g
Staub, von einem erhöhten
Risiko der Allergiebildung begleitet sind. Aus diesem Grund fällt die
Kontrolle der Umgebungskonzentrationen von Milben in das Gebiet
der präventiven
Medizin.
-
Die "Verteilung" von Milben kann je nach den Lebensräumen varueren
und ist ein wichtiger Faktor bei Veränderungen von Symptomen der
Atmung. Die Identifizierung von "Orten", die im Haus von
Milben befallen sind, ist somit äußerst wichtig,
da sie es ermöglicht,
dass Verfahren zur Dekontaminierung der Umgebung angewendet werden
können
(beispielsweise die Verwendung von Acariziden), was die Entfernung
von Milbenkolonien und das Entfernen der Fäkalien, welche eine wichtige
Quelle der Allergene sind, ermöglicht.
Von diesen präventiven
Maßnahmen
ist bekannt, dass sie zusammen mit einer geeigneten immuntherapeutischen
Behandlung mit Desensibilisierungsextrakten beim Patienten zu einer
klinischen Verbesserung führen.
Ein besonderer Beitrag zur Bereitstellung einer effektiven Milbenkontrolle
im Hausstaub ist die Entwicklung von Nachweisverfahren, die anders
sind als die mikroskopischen Bestimmungen, und welche schnell, einfach
und ausreichend empfindlich sind.
-
Obgleich die mikroskopische Technik
erstmals zeigen konnte, das Milben im Hausstaub vorhanden sind,
und somit ihre potentielle Rolle als Ursache von Allergien gezeigt
hat, ist sie nicht unbedingt das beste Verfahren für die Routineanalyse.
Sie bleibt ein unentbehrliches Instrument für den Wissenschaftler, der
die vorherrschende Spezies in den verschiedenen geographischen Regionen
aufzeigen will, oder der die biologischen Eigenschaften der verschiedenen
Milben untersuchen will, hat aber bei Anwendung in Routineanalysen von
Staubproben eine Reihe von Nachteilen:
-
- – die
Herstellung der Probe, die untersucht werden soll, und die mikroskopische
Untersuchung selbst sind sehr mühselige,
zeitintensive Vorgänge
und benötigen
geeignetes, trainiertes Personal;
- – sie
identifiziert die Exkremente nicht, welche erhebliche Mengen an
Allergenen enthalten.
-
In den letzten Jahren wurden neue
Techniken zur Identifizierung von Allergenen, die in der häuslichen Umgebung
vorhanden sind, verfügbar
gemacht. Eine dieser Techniken basiert auf der Verwendung von monoklonalen
Antikörpern,
die für
das Allergen (Der p I) von Milbenfäkalien im Hausstaub spezifisch
sind.
-
Das Verfahren besteht aus dem Fixieren
einer geeigneten Menge an Anti-Der p I-monoklonalem Antikörper in
der Vertiefung einer Mikrotiterplatte, gefolgt von der Inkubation
mit der Staubprobe und einem zweiten Antikörper (monoklonal oder polyklonal),
der spezifisch für
Der p I ist und mit Biotin konjugiert ist. Die Reaktion zeigt sich
kolorimetrisch unter Verwendung des Enzyms Peroxydase, das mit Streptavidin
konjugiert ist, und dann eines geeigneten Substrats.
-
Die Methode ist sehr empfindlich
und spezifisch, benötigt
aber wie die Untersuchung mit dem Mikroskop eingearbeitetes Personal
und eine spezielle Laborausrustung (eine Anzeige für die kolorimetrische
Reaktion).
-
Trotz der Komplexität dieses
Verfahrens ist das Verfahren sogar für Routinetests geeignet.
-
Dieses Verfahren hat eine Reihe von
Einschränkungen:
die Länge
des Tests (nicht weniger als 3 Stunden), eine Vielzahl von Schritten
in dem Verfahren und das Erkennen eines einzelnen Allergens, obgleich
dies wichtig ist.
-
Einen technologischen und konzeptionellen
Sprung hat die Entwicklung eines Kits ermöglicht, das auf der Identifizierung
eines Markers, Guanin, beruht, welcher im Allgemeinen der endgültige Katabolit
des Stickstoffkatabolismus von Spinnentieren ist. Guanin ist somit
auch in Milbenfäkalien
vorhanden, da Milben zur gleichen Familie gehören. Das Auffinden von Guanin
im Hausstaub könnte
somit die Gegenwart von Milben in der Umgebung anzeigen.
-
Das Verfahren ist semiquantitativ,
leicht anzuwenden, schnell und in Routinetests anwendbar. Die Ergebnisse
werden auf der Basis eines Tests ausgedrückt, der auf einem festen Substrat
(Stäbchen)
durch Entwicklung einer kolorimetrischen Reaktion durchgeführt wird,
wobei deren Intensität
auf einer Farbskala angezeigt wird.
-
Aufgrund seiner Vereinfachungen hat
es den Vorteil, dass es von Nichtexperten durchgeführt werden kann.
-
Die Nachteile sind:
-
- – Mangel
an Spezifität,
insbesondere bei Fällen
mit schwach positiven Ergebnissen. Das Verfahren basiert auf der
Annahme, dass das meiste Guanin, das im Hausstaub nachgewiesen wird,
nur von Milbenfäkalien stammt,
was nicht immer richtig ist. Beispielsweise kann die Gegenwart von
Spinnen den Test stören;
- – das
Allergen in Milbenfäkalien
ist nur eines der zahlreichen Allergene, die in Milben vorkommen.
Ein wichtiges Allergen (Der p II genannt) ist im Gegensatz dazu
nicht in den Fäkalien
vorhanden, da es vom Milbenkörper
abstammt; der Test ist nicht in der Lage, dieses zu identifizieren.
-
Der Mangel an Spezifität und mangelndes
Erkennen von anderen wichtigen Milbenallergien sind zwei negative
Aspekte dieses Tests, was zu einiger Verwirrung bei dem Personal
führt,
das den Test ausführt.
-
Das Verfahren, das vom Anmelder entwickelt
wurde und nachstehend beschrieben wird, ermöglicht es, die Nachteile der
bekannten Tests zu überwinden,
während
die gleichen Eigenschaften hinsichtlich einer vereinfachten Verwendung,
einer direkten Anzeige der Reaktion (keine Abhängigkeit von spezifischen Ableseapparaturen),
und ausreichender Durchführungsgeschwindigkeit
beibehalten werden, wenn es insbesondere zum Nachweis von Milbenallergenen
in Hausstaub verwendet wird.
-
Das Verfahren wird unter Verwendung
von Antikörpern,
vorzugsweise polyklonalen Antikörpern
(erhalten beispielsweise aus Kaninchen), in einem "Sandwich" durchgeführt, und
ist in der Lage, alle verschiedenen Allergene, die in Milben vorhanden
sind, und nicht nur Der p I, zu erkennen. Experimente mit Natriumdodecylsulfatgel-Elektrophorese
auf Polyacrylamidgel (SDS – PAGE)
mit der Übertragung
der abgetrennten Allergene auf Nitrocellulose-(Blotting)-Papier und nachfolgendes
Inkontaktbringen mit Milbenantiserum hat ganz klar diese Tatsache
aufgezeigt.
-
Der polyklonale Antikörper, der
für Milben
spezifisch ist, wird auf ein festes Substrat, vorzugsweise Nitrocellulose,
das den sogenannten "reaktiven
Streifen" darstellt,
aufgebracht. Anschließend
wird dieser reaktive Streifen in ein Testrohr eingebracht, zu dem
dann gleichzeitig die zu untersuchende Staubprobe und der Nachweisantikörper (Antimilbenantikörper, konjugiert
mit einem kolloidalen Farbstoff) zugegeben wird.
-
Die Entwicklung eines farbigen Flecks
zeigt die Anwesenheit von Milben im Hausstaub an.
-
Es wurde festgestellt, dass die Kombination
der Schritte der Zugabe der Probe und der Zugabe des Detektorreagens,
die normalerweise durch Waschen getrennt und auseinandergehalten
werden, zu einem Einzelschritt unerwarteterweise zu einer Verbesserung
in der Empfindlichkeit des Verfahrens und zu einer größeren Vereinfachung
und Schnelligkeit der Durchführung
führt,
was ein stärker
ausgeprägtes
Signal liefert. Wenn das gleiche Verfahren so durchgeführt wird,
dass der Schritt der Zugabe der Probe von dem Schritt der Zugabe
des Nachweisreagens getrennt ist, ist es deutlich weniger zur Analyse
von Hausstaubproben geeignet, was durch das Fehlen des Erkennens
mehrerer positiver Ergebnisse ersichtlich ist, welche im Gegensatz
dazu durch die "Einstufen"-Version des Verfahrens,
das gemäß der Erfindung
durchgeführt
wird, und durch Untersuchung unter dem Mikroskop nachgewiesen werden.
Eine mögliche
Theorie zur Erklärung
dieses Phänomens
ist, dass die "Einstufen"-Version die Bildung
eines Immunkomplexes, (Milben-) Antigen/Antikörper, induziert, welcher beim
Ausfällen
das Einfangen der Milbenallergene durch die Milbenantikörper, die
auf dem Nitrocellulosepapier fixiert sind, erleichtert.
-
Durch Einfügen einer Reihe von Waschvorgängen mit
einem geeigneten Puffer zwischen der Zugabe der Probe (Milben) und
der Zugabe des Nachweisreagens können
einige Allergene, die aus der Probe extrahiert werden, durch die
Waschvorgänge
selbst verloren gehen, was die Zugabe des Nachweisreagens uneffektiv
macht. Die wässrige
Lösung,
in der die Antikörper
dispergiert sind, würde
zur gleichen Zeit dahingehend wirken, die Allergenproteine aus den
vorhandenen Milben zu extrahieren, wodurch ermöglicht wird, dass die Analyse
auch mit Hausstaubproben durchgeführt werden kann, und nicht
notwendigerweise mit wässrigen
Extrakten, die vorher aus dem Staub hergestellt wurden.
-
Das Verfahren, das vom Anmelder entwickelt
wurde, könnte
potentiell auf die quantitative Bestimmung von verschiedenen Antigenen
oder alternativ Antikörpern
mit besonderer Spezifität
angewendet werden, was es somit äußerst nützlich in
all diesen Situationen macht, sowohl bei Menschen als auch auf dem
veterinären Gebiet,
wo Tests benötigt
werden, welche einfach, aber ausreichend schnell und empfindlich
sind für
die Diagnose von bestimmten pathologischen Zuständen. Die Beispiele, die folgen,
stellen eine genaue Beschreibung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Testmethode,
die vorher beschrieben wurde, dar.
-
Beispiel 1:
-
VERFAHREN ZUM NACHWEIS
VON MILBEN
-
1a Herstellung des spezifischen
Antikörpers
-
Ein Antimilbenserum aus Kaninchen,
das durch Immunisierung durch subkutane Verabreichungen in dreiwöchigen Intervallen
mit einem Milbenextrakt (Proteingehalt von 3 mg), der in einem kompletten Freund-Adjtivans (die ersten
beiden Immunisierungen) oder im inkompletten Freund-Adjuvans (die folgenden Immunisierungen – mindestens
vier) dispergiert war, erhalten wurde, wird mittels Affinitätschromatographie
gereinigt.
-
Die mit 0,1 M Glycin-HCl-Puffer,
pH 2,7, eluierten Fraktionen werden mit 1 M Phosphatpuffer, pH 7,2 (PBS-Zusammensetzung)
neutralisiert, in einem Pool vereinigt, und dann der Poll gegen
10 mM Natriumphosphatpuffer und 2,7 mM NaCl, pH 7,4, dialysiert.
-
1bA Herstellung des Farbstoffs
-
Einige Textilfarbstoffe sind in der
Lage, gefärbte
kolloidale Partikel zu bilden, welche von potentiellem Interesse
für diagnostische
Anwendungen sind, wenn sie mit Proteinen (Antikörpern, Antigenen...) kombiniert werden.
Insbesondere auf dem Gebiet der Erfindung ist es bevorzugt, Textilfarbstoffe
der Arten Brilliant Pink 5B, FBLN Blue und Red SamaronTM-Farbstoffe
(Hoechst) zu verwenden. Alternativ ist die Verwendung von kolloidalem
Gold als Farbstoff auf dem Gebiet der Erfindung vorstellbar. Im
Falle des Farbstoffs Brilliant Pink 5BTM wird
beispielsweise eine 5%-ige Lösung
des Farbstoffs in Wasser hergestellt, um eine kolloidale Dispersion
zu erhalten, welche dann 4 mal bei 20 000 g 20 Minuten lang zentrifugiert
wird, und das Sediment dann in einem Volumen, das dem Anfangsvolumen
entspricht, wieder suspendiert wird. Danach wird ein letztes Zentrifugieren bei
125 g 30 Minuten lang durchgeführt,
um irgendwelche sehr großen
Aggregate zu entfernen. Die überstehende
Flüssigkeit
in Form einer kol loidalen Dispersion wird dann spektrophotometrisch
analysiert, um die Verwendungskonzentration zu untersuchen.
-
Zu diesem Zweck wird ein Aliquot
aufgelöst
und mit Ethanol verdünnt,
um eine optische Dichte von 1000 zu ergeben, was spektrophotometrisch
bei der geeigneten Wellenlänge
(540 für
Brilliant Pink) bestimmt wird.
-
Dieser Wert wird durch den Buchstaben
A angezeigt.
-
Die kolloidale Dispersion ist einige
Monate stabil, wenn sie in Gegenwart von Thiomersal (0,01%) bei 4°C aufbewahrt
wird.
-
1bB Herstellung des Antikörper-Farbstoff-Konjugats
-
Verschiedene Konzentrationen an Farbstoff
(von A = 5 bis A = 50) wurden verwendet, um diesen an Antikörper (Proteinkonzentrationen,
die von 5 bis 100 μg/ml
varueren) unter Verwendung von 10 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert, der im variablen
Bereich von 6 bis 8,5 liegt, und mit NaCl-Konzentrationen von 2,7 mM bis 150 mM,
zu binden.
-
Die experimentellen Bedingungen,
die die größte Farbintensität des Flecks
und somit das beste Signal ergeben, waren wie folgt: Phosphatpuffer
10 mM, pH 7,4, NaCl 5 mM, A = 30 und eine Antikörperkonzentration von 20 μg/ml.
-
Bei der Herstellung des Konjugats
wurden geeignete Volumina an Farbstoff und Antikörper bis zu einer Endkonzentration
des Farbstoffs von A = 30 und des Antikörpers von 20 μg/ml 14 Stunden
lang in Kontakt gebracht, um es dem Antikörper zu ermöglichen, auf den gefärbten, kolloidalen
Partikeln adsorbiert zu werden.
-
Das Konjugat wurde durch Zugabe eines
1/5 Volumens 5 mM NaCl, pH 7,4, 30% BSA, einstündige Inkubation und anschließendes Zentrifugieren
bei 12 000 g über
20 Minuten bei 4°C
stabilisiert.
-
Das Sediment wurde in einem dem Ausgangsvolumen
entsprechenden Volumen an Pufferlösung aufgenommen, die aus 10
mM PBS, 5 mM NaCl, 5% BSA, 0,04% Thiomersal, pH 7,4, bestand.
-
Das so hergestellte Konjugat kann
bei 4°C
(es ist über
einen kurzen Zeitraum stabil) oder gefriergetrocknet mit verbesserter
Stabilität
bis zu mindestens sechs Monaten aufbewahrt werden.
-
1c Herstellung des reaktiven
Streifens
-
Streifen (1 × 8 cm), zusammengesetzt aus
einem transparenten Substrat, auf das ein kleines Quadrat (1 × 1 cm)
Nitrocellulosepapier mit einer Porosität von 0,45 μm (bio-MAP, Agate Brianza, Mailand)
befestigt war (bevorzugter nutzlicher Porositätsbereich 0,2–5 μm), wurden
5 Minuten lang in Wasser getaucht und dann getrocknet. Anschließend wurden
5 μg (bezogen
auf den Proteingehalt) Antimilbenantikörper, durch Affinitätschromatographie
gereinigt, auf jeden Streifen in einem 10 μl-Volumen Phosphatpuffer (10
mM, 2,7 M NaCl), pH 7,4, gegeben.
-
Bei diesem Verfahren bilden die Antikörper (Proteine)
bei der Reaktion mit Nitrocellulose chemische Bindungen damit und
bleiben darauf fixiert.
-
Die Verteilung der Lösung, die
Antimilbenantikörper
enthält,
kann manuell mittels einer Mikropipette oder automatisch mit einem
Verteilungsgerät
durchgeführt
werden.
-
Nachdem der Streifen 10 Minuten lang
trocknengelassen wurde, um unspezifische Reaktionen zu vermeiden,
wurden die reaktiven Stellen auf der Nitrocellulose mit 1,5% Casein
in PBS, pH 7,4, als blockierendes Protein blockiert.
-
Nach 2-stündigem Inkubieren bei Umgebungstemperatur
und unter Rühren
wurde mehrere Male mit PBS-Tween 20 gewaschen; der so hergestellte
reaktive Streifen wurde dann gefriergetrocknet. Der reaktive Streifen
bleibt mindestens 6 Monate lang stabil.
-
Der wie oben beschrieben hergestellte
reaktive Streifen wurde in ein geeignetes Polyvinyl- oder Polystyrolteströhrchen eingebracht;
eine Hausstaubmenge, üblicherweise
60 bis 80 mg, wurde dann mit Hilfe eines Messlöffels dazugegeben. Der Hausstaub
war vorher vom Schlafzimmerfußboden,
aus Betten, aus Teppichen oder von anderen Haushaltsgegenständen gesammelt
worden. Sofort danach wurde das Nachweisreagens (1–1,5 ml),
bestehend aus einer Lösung,
die die Anti-Acari-Antikörper,
gereinigt durch Affinitätschromatographie
und mit dem Farbstoff Brilliant Pink konjugiert (wie vorher beschrieben),
enthielt, zugegeben.
-
Die Anwesenheit von Milben wurde
durch die Entwicklung eines gefärbten
Flecks nach einem geeigneten Inkubationszeitraum (nicht weniger
als 30 Minuten) angezeigt. Der gefärbte Fleck wurde unter Waschen des
reaktiven Streifens einfach unter fließendem Wasser sichtbar gemacht.
Die Zugabe von Hausstaub, der eindeutig negativ war, zum Teströhrchen (keine
Milben, festgestellt durch mikroskopische Untersuchung) lieferte
keinen farbigen Fleck, was die Spezifität des Verfahrens zeigt.
-
Die Empfindlichkeit des "Einstufen"-Fixierverfahrens
der Erfindung wurde durch Vergleich mit einem "Zweistufen"-Testverfahren gezeigt, bei dem die
Schritte der Zugabe der Probe unter Prüfung und der Schritt der Zugabe
des Nachweisreagens durch mehrere Waschschritte, sowohl unter Verwendung eines
Milbenextrakts, als auch unter Verwendung eines Serums aus Patienten,
von denen bekannt ist, dass sie an Echinococcosis leiden, getrennt
waren.
-
Die Vergleichsdaten sind in Tabelle
1 dargestellt, aus der die größere Empfindlichkeit
des "Einstufen'-Verfahrens zum Nachweis
von Milbenallergenen ersichtlich ist.
-
Eine weitere Bestätigung der Effektivität und der
Empfindlichkeit des Verfahrens wurde erhalten, indem 5 Hausstaubproben
durch das erfindungsgemäße Verfahren,
wie in Beispiel 1 beschrieben, und durch das bekannte quantitative
Laborverfahren, das als ELISA-Test bekannt ist, getestet wurden.
-
Die Ergebnisse des Vergleichs sind
in Tabelle 2 dargestellt, aus der ersichtlich ist, dass die gezeigten Mengen
sich sehr gut den Daten annähern,
die mit denen des quantitativen Verfahrens nachweisbar sind.
-
TABELLE
1
VERGLEICH DES "EINSTUFIGEN" VERFAHRENS MIT DEM "ZWEISTUFIGEN"-VERFAHREN UNTER VERWENDUNG EINES MILBENEXTRAKTS
-
TABELLE
2
VERGLEICH DES "EINSTUFIGEN" VERFAHRENS MIT DEM
ELISA-TEST MIT HAUSSTAUBPROBEN
