DE2334061A1 - Verfahren zum identifizieren von streptokokken - Google Patents

Verfahren zum identifizieren von streptokokken

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Description

DR.-ING. WALTER ABITZ Mun c;,en> 4. Juli 1973
DR. DIETER F. MORF Fpostanschrift / Postal Address
DR. HANS-A. BRAUNS 8 München 86, Postfach 860109
Patentanwälte Pienzenauerstraße 28
Telefon 483225 und 486415 Telegramme: Chemindus München 2334061 Telex: (0) 523992
2915
Abbott Laboratories
North Chicago, Illinois, V.St.A.
Verfahren zum Identifizieren von
Streptokokken
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren der Verwendung gekennzeichneter Antikörper insbesondere zur Auffindung von Streptokokken der Gruppe A beispielsweise in einem Abstrich.
Die serologische Gruppierung von Infektionen des Menschen mit ß-hämolytisehen Streptokokken ist von großer Bedeutung, da insbesondere die Anwesenheit von Streptokokken der Gruppe A eine Therapie erfordert. Aus der Annahme, daß alle ß-hämolytisehen Streptokokken von der menschlichen Nasopharynx der Gruppe A angehören, können sich beträchtliche Irrtümer ergeben.
Eine genaue und rasche Identifizierung ß-hämolytischer Streptokokken der Gruppe A als Ursciche einer Nasopharyngitis ist eine wesentliche Voraussetzung für eine erfolgreiche Behandlung und
gegebenenfalls Verhütung möglicher Folgen dieser Infektion, d.h. Scharlach, rheumatischem Fieber, Glomerulonephritis. Eine solche Identifizierung einer durch Streptokokken der Gruppe A hervorgerufenen Pharyngitis erfordert die direkte Identifizierung der Streptokokken im Laboratorium.
Zur Identifizierung von Streptokokken der Gruppe A sind eine Anzahl Verfahren bekannt. Eines dieser Verfahren bedient sich eines fluoreszierenden Antikörpers für eine spezifische Identifizierung infektiöser Organismen. Dieses Laboratoriumsverfahren erfordert aber die Verwendung eines teuren Fluoreszenzmikroskops. Gemäß einem anderen Verfahren zur Auffindung von Streptokokken wird eine Bakterienkultur gezüchtet. Die positive Identifizierung von Streptokokken der Gruppe A erfordert jedoch 48 Stunden, was für Diagnose und Behandlung eine unerwünschte Verzögerung bedeutet.
Das Verfahren gemäß der Erfindung hat den Vorteil, daß es empfindlich und rasch ist und die Verwendung nur eines gewöhnlichen Lichtmikroskops zur Identifizierung statt eines teuren Fluoreszenzmikroskops erfordert.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von Streptokokken der Gruppe A in Anwesenheit anderer Streptokokken und Staphylokokken in einer unbekannten Probe. Bei diesem Verfahren wird zunächst eine Reihe von wenigstens drei Ausstrichen auf trockenen Objektträgern hergestellt. Eine der Abstriche dient als Negativkontrolle und ist eine Suspension von nur Streptokokki der Gruppe G und Staphylokokki aureus. Ein zweiter positiver Kontrollausstrich ist eine Suspension von nur Streptokokki der Gruppe A. Ein dritter Ausstrich schließlich ist eine Suspension unbekannter Organismen, die auf die Anwesenheit von Streptokokki der Gruppe A untersucht werden sollen. Außerdem wird ein Antikörperkonjugat hergestellt, indem man einen Antikörper mit Peroxydase an Streptokokkus bindet. Dieses Konjugat v wird jedem Ausstrich zugesetzt, und die Ausstriche v/erden dann
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inkubiert. Danach wird jedem Ausstrich Wasserstoffperoxid so- , wie ein"Elektronendonatorfarbstoff zugesetzt. Die drei so erhaltenen Ausstriche werden unter dem Mikroskop geprüft, wobei der Ausstrich der unbekannten Probe mit der positiven Kontrolle verglichen wird, um die Anwesenheit von Streptokokki der Gruppe A festzustellen. Normalerweise werden die Ausstriche vor der Zugabe von Wasserstoffperoxid und Elektronendonator mit einer Pufferlösung gespült und erneut getrocknet.
Die erste Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht also in der Entwicklung eines Antikörpers in üblicher Weise, wobei ein Testtier, wie ein Kaninchen, verwendet wird. Dann wird ein Konjugat des Antikörpers mit Streptokokkus der Gruppe A hergestellt, indem man die beiden unter Zuhilfenahme eines Kupplungsmittels, wie Glutaldehyd oder Diisocyanat, miteinander verbindet. Typische Peroxydasen, die hierfür verwendet werden können, sind Meerrettich- und Lactoperoxydase.
Bekanntlich entspricht jedem Antikörper ein Antigen, beispielsweise ein Streptokokkus der Gruppe A. Ein für ein Antigen spezifischer Antikörper wird an dieses Antigen gebunden, sobald es mit dem Antikörper zusammentrifft. Wenn ein als spezifisch für ein bestimmtes Antigen bekannter Antikörper einer Gruppe von Antikörpern von dem Globulinanteil des Serums oder Plasmas eines Wirtstieres, das zur Erzeugung dieses Antikörpers stimuliert ist, isoliert wird, so werden das Antigen und der für dieses Antigen spezifische Antikörper aneinander gebunden. Bei einer anschließenden Untersuchung unter dem Mikroskop kann man jedoch den Anti gen/Antikörper-Organismus nicht sehen. Im vorliegenden Fall wirkt die Peroxydase äLs eine Art Verstärker, der die anschließende Beobachtung des Organismus unter dem I-Iikroskop unter Zuhilfenahme eines Farbstoffs ermöglicht.
Eine bevorzugte Methode zur Herstellung des Reagens besteht darin, daß man ein Konjugat von Antikörper und Peroxydase bildet und das Konjugat dann dem Streptokokkus der Gruppe» A zusetzt. Ein Ausstrich
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und eine positive und eine negative Vergleichsprobe werden in üblicher Weise hergestellt. Die die untere Grenze liefernden Vergleichsorganismen (negative Vergleichsprobe) werden von einer NCDC-Kultur von Streptokokki der Gruppe G und Staphylokokkus aureus, die koagulase-positiv und nicht lebensfähig sind und von einem lyophilisierten Vorrat rekonstituiert sind, erhalten. In gleicher Weise werden die die obere Grenze bildenden Organismen aus einer NCDC-Kultur von Streptokokki der Gruppe A, die nicht lebensfähig sind und von einem lyophilisierten Vorrat rekonstituiert sind, erhalten. Die die obere Grenze bildenden Organismen bilden natürlich die positive VergLeichsprobe. Die drei luftgetrockneten Ausstriche werden gewöhnlich für einige Minuten in einem Puffer, wie einem Tris-salin-puffer, pH 7,5, gespült und dann entfeuchtet, gewöhnlich mit einem Filterpapier. Natürlich können auch alle drei Ausstriche auf getrennten Gebieten eines einzigen Objektträgers gemacht werden.
Ein Tropfen des wie oben beschrieben hergestellten Konjugatreagens wird auf jeden trockenen Ausstrich aufgebracht, und die Ausstriche werden dann inkubiert. Die Inkubation kann beispielsweise in einer feuchten Kammer 20 Minuten bei Raumtemperatur erfolgen. Die Objektträger werden dann erneut mit Pufferlösung gespült und entfeuchtet. Die Eintauchzeit der Objektträger in die Pufferlösung kann beispielsweise etwa 5 Minuten betragen.
Dann wird den Objektträgern ein Farbstoff, gewöhnlich ein Elektronendonator farbstoff , zugesetzt. Ein gut geeigneter Farbstoff ist 3~Amino-9-äthylcarbazol. Andere geeignete Farbstoffe sind 3,3'-Diaminobenzidin, p-Chloranilin und ein Gemisch von σ-Naphthol und p-Phenylendiamin-dihydrochlorid. Zusammen mit dem Farbstoff wird ein Oxidationsmittel, wie Wasserstoffperoxid", zugesetzt. Andere verwendbare Oxidierungsmittel sind Methylperojcid und Xthylperoxid (CH3OOHi C2H5OOH).
Beispielsweise werden jedem Ausstrich zwei Tropfen 0,1%-iges 3-Amino-9-äthylcarbazol in einem Puffer, der 0,3% Wasserstoffper-
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oxid enthält, zugesetzt. Nach einer geeigneten Wartezeit, beispielsweise 15 Minuten, werden die Objektträger erneut mit Leitungswasser gewaschen, und jeder wird unter dem Mikroskop untersucht. Die Streptokokkenstämme erscheinen leuchtend rot gefärbt.
Vermutlich wird in dem Verfahren gemäß der Erfindung das Wasserstoffperoxid von dem Peroxydaseenzym abgebaut. Das Wasserstoffperoxidabbauprodukt verursacht seinerseits, daß der Farbstoff seine Farbe entwickelt, und dieses gefärbte Material wird an die Streptokokken gebunden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel I Herstellung und Fixierung von Organismen von Rachenabstrichen
Der Rachenschleimhautabstrich wird etwa 3Q Sekunden kräftig in 0,5 ml Kochsalzlösung in einem Kahn-Reagenzglas oder einem anderen Reagenzglas gespült. Die Kochsalzlösung wird von dem Abstrich entfernt. Gewünschtenfalls kann der gleiche Abstrich zum Beimpfen einer Blutagarplatte für die Isolierung von ß-hämolytischen Streptokokken verwendet werden. Unmittelbar danach wird eine wegwerfbare Pasteur-Pipette verwendet, um einen Tropfen (etwa 25 μΐ) der Suspension von Bakterien in der Kochsalzlösung auf das hierfür bestimmte Gebiet eines Objektträgers aufzubringen. Proben (0,01 ml, 0,0001 ml) der gleichen Kochsalzlösung (Bakteriensuspension) können mittels einer kalibrierten öse aufgenommen und auf Blutagarplatten aufgebracht werden, um die Kochsalzwaschlösung zuütrieren. Dann wird das Testgebiet auf dem Objektträger an Luft trocknen gelassen. Die Ausstriche werden fixiert, indem man sie 5 Minuten in absolutes Methanol taucht und abtropfen läßt.
Einfärben unter Verwendung von mit Antikörper gekuppeltem Enzym (Enzym !covalent an Antikörper gebunden) .
Streptokokkus-Antikörper wurden zunächst an Meerrettichperoxydase gebunden. Jedem trockenen Abstrich werden mittels einer Pasteur-
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Pipette zwei Tropfen (etwa 50 μΐ) des gebundenen Antikörpers zugesetzt. Das Reagens v/ird unter Verwendung getrennter Spatel oder Zahnstocher sorgfältig über jedes Testgebiet ausgebreitet. Der Ausstreichstab kann horizontal gehalten werden, so daß er am Meniskus der Flüssigkeit angreift und damit das Abkratzen von Zellen von dem Objektträger vermieden v/ird.
Der Objektträger wird für etwa 20 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert, wofür beispielsweise ein Objektträgerkasten oder eine umgekehrte Petrischale verwendet werden kann und die so gebildete Kammer nasse Papiertücher enthält oder damit umwickelt ist. Dann wird der Objektträger mit 10 ml Tris-salinpuffer, die man aus einer Pipette auftropfen läßt, gespült und dann gewaschen, indem man ihn 5 Minuten in einen Tris-salin-puffer in einer Schale taucht. Der Objektträger wird getrocknet, indem man ihn um einen Winkel kippt und ein Stück absorbierendes Papier (Papierhandtuch) an die Kante des Ausstrxchgebiets legt.
Dann werden jedem Abstrich zwei Tropfen (etwa 50 μΐ) Färbelösung zugesetzt und 15 Minuten einwirken gelassen. Der Objektträger wird mit 10 ml destilliertem Wasser, das aus einer Pipette aufgetropft wird, gespült und durch Eintauchen in eine mit destilliertem Wasser gefüllte Schale gewaschen. Dann werden die Objektträger auf die Anwesenheit einer Färbung geprüft. Zu diesem Zeitpunkt können die Objektträger einige Monate in einem Objektträgerkasten bei Raumtemperatur aufbewahrt v/erden, ohne daß es zu einer merklichen Abnahme der Färbeintensität kommt.
Die Objektträger werden unter einem Lichtmikroskop mit einem 40x-0bjektiv und 12,5x-0kularen (letztliche Vergrößerung 50Ox) untersucht. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, daß es rasch und ohne die Verwendung eines kostspieligen Fluoreszenzmikroskops durchgeführt werden kann. Die verhältnismäßig geringe Vergrößerung ermöglicht die Untersuchung eines größeren Gebiets beim Abtasten des Kreises von 1 cm Durchmesser auf dem Objektträger, so daß die Erkennungsgrenzen weiter v/erden.
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Die Gebiete auf den Objektträgern v/erden unter einem Lichtmikroskon mit einer "Letztvergrößerung von 50Ox untersucht. Wenn bei diesem Verfahren andere Objektive und/oder andere Vergrößerungsbereiche · angewandt werden, so sind die angegebenen Auffindungsgrenzen nicht mehr direkt anwendbar.
Die positive Vergleichsgruppe (Streptokokken der Gruppe A) unterscheidet sich von der negativen Vergleichsgruppe (Streptokokken der Gruppe G und Staphylokokkus aureus) durch eine leuchtend rote Farbe. Streptokokken der Gruppe A, die direkt von dem Rachenabstrich erhalten sind, werden mit der gleichen Intensität eingefärbt und besitzen die gleiche Exnzelzellmorphologie wie die positive Vergleichsprobe. Die Prüfung richtet sich hauptsächlich auf die Farbintensität und Anwesenheit und Ausmaß gefärbter (chained) Organismen.
Beispiel II
Gemäß einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung, die eine Variation der in Beispiel I beschriebenen ist, wird der Rachenschleimhautabstrich in 1 ml Todd-Hewitt-Brühe eingebracht und 2 bis 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wird die Brühe 5 Minuten mit etwa 2000 Upm zentrifugiert, um die Organismen abzutrennen.Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert, und die Zellen werden erneut in 1 ml Kochsalzlösung suspendiert und zentrifugiert .
Die Kochsalzlösung wird dekantiert und das Rohr wird 2 bis 3 Minuten in einem Ständer stehen gelassen, damit die Organismen sich am Boden des Rohrs sammeln können. Die Organismen werden gründlich mit der restlichen Kochsalzlösung vermischt. Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette wird ein Teil des gewaschenen Sediments entnommen und auf das vorbestimmte Gebiet eines einzelnen Objektträgers aufgebracht.
Dann v/erden die Testgebiete an Luft trocknen gelassen. Der Objektträger wird 5 Minuten in absolutem Methanol fixiert und durch Ab-
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tropfenlassen getrocknet. Dann v/erden die Abstriche veiter verarbeitet, wie wenn die Zellen direkt von dem Abstrich erhalten x^orden waren. Vergleichsproben und zahlenmäßige Bewertungen sind die gleichen.
Es kann auch so verfahren werden, daß man mit einer Inokuliernadel einige Organismen einer auf einer Blutagarplatte gezüchteten Kolonie aufnimmt, die Kolonie in einer Kochsalzlösung emulgiert und dann einen Tropfen auf ein bestimmtes Gebiet eines Objektträgers aufbringt und wie oben weiter verarbeitet»
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Claims (2)

".. Juli 1973 Patentansprüche
1. Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von Streptokokken .der Gruppe A in Anwesenheit anderer Streptokokken und Staphylokokken in einer Probe unbekannter Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptokokkusantikörper an einen Streptokokkus der Gruppe A bindet, indem man mittels eines Peroxydaseenzyms als Kupplungsmittel einen Komplex aus dem Antikörper und dem Streptokokkus der Gruppe A bildet, wenigstens drei Ausstäche auf Objektträgern herstellt, von denen der eine als negative Vergleichsprobe dient und aus einer Suspension von Streptokokken der Gruppe G und Staphylokokkus aüreus besteht, eine zweite, positive Vergleichsprobe aus einer Suspension von nur Streptokokken der Gruppe A besteht, und ein dritter Ausstrich aus einer Suspension eines unbekannten Organismus besteht? jedem Ausstrich Konjugat aus Streptokokkusantikörper und Streptokokkus der Gruppe A zusetzt, die so behandelten Ausstriche inkubiert, den inkubierten Ausstrichen Wasserstoffperoxid und einen Elektronendonatorfarbstoff zusetzt und die so behandelten Ausstriche auf dem Objektträger unter einem Mikroskop untersucht, wobei der dritte, unbekannte Organismus mit der positiven Vergleichsprobe verglichen wird, um die Anwesenheit von Streptokokken der Gruppe A festzustellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstriche vor der Zugabe von Konjugat mit einer Pufferlösung gespült werden.
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DE2334061A 1972-07-05 1973-07-04 Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit von Streptokokken der Gruppe A in Anwesenheit anderer Streptokokken und Staphylokokken in einer Probe unbekannter Zusammensetzung Abbott Laboratories, North Chicago, 111. (V.StA.) Pending DE2334061B2 (de)

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