DE69434406T2

DE69434406T2 - Extraktionsverfahren für Mikroorganismenantigene

Info

Publication number: DE69434406T2
Application number: DE69434406T
Authority: DE
Inventors: Gregory R. Berthoud Bogart; Robert J. Arvada Bilodeau; Rachael M. Westminster Ostroff; Jeffrey W. Louisville Steaffens
Original assignee: Thermo Biostar Inc
Current assignee: Inverness Medical Biostar Inc
Priority date: 1993-12-03
Filing date: 1994-12-02
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2014-12-03
Also published as: CA2137034A1; ES2243923T3; EP0659437A2; ATE297756T1; US5494801A; HK1001885A1; EP0659437A3; EP0659437B1; DE69434406D1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien und Verfahren zum Extrahieren von Antigenen aus Mikroorganismen.
Hintergrund der Erfindung
Mehrere Techniken zur Extraktion von Antigenen aus Mikroorganismen sind dem Fachmann des Gebiets wohlbekannt. Zelluläre Antigene wie Kohlehydrate, Proteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, mit Proteinen komplexierte Kohlehydrate, Lipide und andere sind mit einer Reihe von chemischen oder mechanischen Mitteln extrahiert worden. Derartige Extraktionstechniken umfassen Erhitzen, Autoklavieren, Detergensextraktion, Säureextraktion, Verdau mit heißem Formamid, Extraktion mit salpetriger Säure, Beschallung oder mechanisches Zerreißen, Phenol/Chloroform-Extraktion oder Verdau mit Enzymen. Falls ein Antigen in einem immunologischen Assay verwendet werden soll, ist es wichtig, dass das Extraktionsprotokoll die Bindungscharakteristika dieses Antigens konserviert.
Die Extraktion mit salpetriger Säure ist eine chemische Extraktionstechnik (Manual of Clinical Micobiology, Dritte Auflage, Edwin H. Lenette, Albert Balows, William J. Havsler, Jr., und Joseph P. Traunt, Herausgeber, American Society for Microbiology, Washington, DC (1980)). Das Verfahren beinhaltet herkömmlicherweise das Mischen zweier flüssiger Reagenzien, nämlich einer Säure und einer Nitritsalz-Lösung. Dieses Gemisch erzeugt ein salpetrige Säure-Intermediat in Lösung. Diese salpetrige Lösung wird im Allgemeinen vor den nachfolgenden Schritten neutralisiert. Auf diesem Verfahren basierende Assay-Kits umfassen drei separate Reagenzfläschchen, die zur Abgabe eines vorbestimmten Volumens, d.h. eine Anzahl an Tropfen, von jedem Reagenz in ein Probenröhrchen konstruiert sind.
Variationen dieser Technik sind beschrieben worden. Zum Beispiel beschreibt Sand et al. (Patentanmeldung WO93/15217) eine Extraktion von Gruppe A- oder B-Streptococci mit zwei Trockenreagenzien und einem Flüssigreagenz. Das Natriumnitrit und die Tris-Base sind auf separaten Filterpads getrocknet, und ein Überschussvolumen an Essigsäure wird zugegeben, um zunächst NaNO₂ und dann (nach einer Extraktionszeit) Tris-Base zu lösen, die die Lösung neutralisiert.
U.S. Patent 4.851.337 beschreibt eine andere Modifikation des salpetrige Säure-Extraktionsprotokolls, bei dem ein Gefäß eine polymere Säure enthält und ein Gefäß eine Nitrit-Lösung enthält. Wenn auch die Anzahl an Reagenzien nicht verringert ist, liefert dieses Verfahren doch vorgemessene Lösungen, die schnell gemischt werden können, um eine Antigenextraktion zu ermöglichen. Der Endverbraucher muss nicht eine bestimmte Anzahl an Reagenzientropfen abzählen, die zu einem Probenröhrchen gegeben werden. Bei diesem Verfahren wird die Nitritlösung in ein die getrocknete polymere Säure enthaltendes Röhrchen überführt, gemischt und ein Probenabstrich zugegeben. Nach einer Inkubationszeit wird die Lösung durch Zugabe von einem Reagenz aus einem anderen Röhrchen neutralisiert.
U.S. Patent 4.673.639 beschreibt eine weitere Modifikation des salpetrige Säure-Extraktionsprotokolls unter Verwendung von Mikroröhrchen, die zwei getrocknete Reagenzien in verschiedenen Zonen des Röhrchens enthalten. Die Reagenzien werden durch Zugabe von Wasser und des die Probe enthaltenden Abstrichstäbchen gelöst und aktiviert. Die Reagenzien sind in dem Röhrchen mit Hilfe inerter Bindemittel oder Träger wie Dextran, Polyacrylamid, Polyacrylsäure, Polyvinylalkohol, PEG, PEO, PVP, Guargummi, Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Methylcellulose, Algin, Karrageen und Xanthan gebunden.
Die Extraktion von Antigenen ist ein wichtiger Schritt bei der Identifizierung von Mikroorganismen, die mit verschiedenen Krankheitsstadien verbunden sind, wie Gruppe A-Streptococcus und Gruppe B-Streptococcus (GBS). Sobald die Antigene des Organismus extrahiert sind, können sie für die Isolierung und Reinigung eines spezi fischen Materials für eine nachfolgende Produktion von Antikörpern oder Impfstoffen oder eine Reihe weiterer Anwendungen verwendet sein. Die extrahierten Antigene, die für einen bestimmten Organismus spezifisch sind, können zur Identifizierung dieses Organismus aus einer Testprobe verwendet sein. Die Testprobe kann jede klinisch relevante Probe wie Serum, Blut, Urin, Plasma, Sputum, Samen, Kehlkopfabstriche, Vaginalabstriche und verschiedene Sekrete oder andere Flüssigkeiten sein. Von besonderem Interesse ist die Anwendung einer Immunoassay-Technik zur Identifizierung eines spezifischen Antigens für die Diagnose einer bestimmten Infektion.
Es gibt eine Reihe verfügbarer Immunoassay-Techniken. Alle beruhen auf der Fähigkeit eines Antikörpers und seines entsprechenden Antigens, spezifisch miteinander wechselzuwirken. Die Latex-Agglutination beruht auf einer Partikelaggregation, farbig oder weiß, für den Nachweis einer spezifischen Wechselwirkung. Antikörper können mit radioaktiven, enzymatischen, metallischen Partikeln, fluoreszierenden, chemilumineszierenden oder einer Reihe anderer Markierungen markiert sein, um ein auswertbares Signal zu erzeugen. In einer klassischen Form eines Immunoassays wird ein Enzym-markierter Antikörper verwendet, um ein farbloses Substrat in ein farbiges Produkt umzuwandeln, das spektrophotometrisch gemessen werden kann. Eine andere Immunoassay-Technik beinhaltet optische Immunoassays. Diese Techniken beruhen auf einzigartigen Wechselwirkungen von Dünnfilmen mit Licht, um eine Massenänderung auf diesen Dünnfilmen zu messen, und sind in US Patenten Nrn. 5.541.057 und 5.869.272 beschrieben.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt Verfahren und Kits für die Extraktion und Detektion von Antigenen aus Mikroorganismen unter Anwendung eines verbesserten Extraktionsverfahrens bereit, das salpetrige Säure mit einer Base oder Hypochlorit kombiniert, oder das auf Hypochlorit allein beruht. Zelluläre Antigene wie Kohlehydrate, Proteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, mit Proteinen komplexierte Kohlehydrate, Lipide und andere sind Beispiele für die Arten von Materialien, die extrahiert werden können. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung konzentrieren sich auf eine Verbesserung der Probenextraktion, um die Antigenverfügbar keit zu erhöhen. Die vorliegende Erfindung umfasst schnelle, einfache Extraktionsprotokolle, die die Notwendigkeit der Entfernung von Extraktionsreagenzien vor Identifizierung überflüssig machen, das zu identifizierende Material nicht beschädigen und den Zugang zu einer größeren Menge an Antigen für bindende Reagenzien wie Antikörper ermöglichen. Diese Verfahren erreichen eine derartig effiziente Extraktion von Antigenen, dass die Identifizierung der Mikroorganismen in einer Probe möglich wird, selbst wenn die Mikroorganismen in geringen Konzentrationen vorliegen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren für den Nachweis von extrahierten Antigenen bereit. Der Nachweis erfolgt bevorzugt mit einer Immunoassay-Technik und am bevorzugtesten mit optischen Immunoassays, die eine schnelle, empfindliche und genaue Diagnose von krankheitsverursachenden Mikroorganismen erlauben. Insbesondere sind die Verfahren für die Extraktion und Identifizierung von Streptococci aus Probenabstrichen zweckdienlich, und spezifischer für die Extraktion und Identifizierung von Gruppe B Streptococci.
GBS ist die führende Ursache neonataler und maternaler Morbidität und Mortalität. Das Neugeborene kann früh ausbrechende Krankheit zwischen Geburt und der ersten Lebenswoche entwickeln. Die Krankheit ist durch Atemnot, Sepsis und Schock gekennzeichnet. Es kommen zwischen 1,9 und 3,7 Fälle pro 1.000 Lebendgeburten allein in den USA vor, mit einer Mortalitätsrate von 26% bis 50%; und 30% der infizierten Kinder entwickeln eine Meningitis. Von der letzteren Gruppe leiden 50% an permanenten neurologischen Schäden. Geschätzt wird, dass in den USA allein Infektionen mit GBS Gesundheitskosten von mehr als 500 Mio. Dollar pro Jahr verursachen.
GBS löst ebenfalls einen späten Ausbruch der Krankheit aus, der innerhalb der ersten 3 Monate nach der Geburt erfolgt. Die Krankheiten in diesem Fall sind durch Störungen des Zentralnervensystems, Meningitis und Bakteriämie gekennzeichnet. Die Mortalitätsrate für Kinder mit diesen Krankheiten beträgt ungefähr 20%. Eine direkte Korrelation von maternaler zervikaler/vaginaler Übertragung von GBS und kindlicher Infektion ist gezeigt worden. Eine Behandlung der Mutter, vor der Niederkunft, verbessert die neonatalen Folgen und kann die vertikale Übertragung von GBS ver hindern.
Eine Erhöhung der Antigenextraktions-Effizienz von Gruppe B-Streptococcus (GBS), Streptococcus agalactiae, ist für die Identifizierung dieses Organismus mit der erforderlichen klinischen Empfindlichkeit entscheidend. GBS Gruppen-spezifisches Antigen ist an das Zellwand-Peptidoglycan kovalent gebunden und durchdringt tatsächlich die gesamte Zellwand, was die Extraktion dieses Antigens schwieriger macht als die Extraktion ähnlicher Antigene aus anderen Organismen (J. Med. Micro., 18, 139–166, 1984). Antigene von Gruppe G-, Gruppe F- und Gruppe A-Streptococcus werden ebenfalls mit diesen Verfahren extrahiert.
Die Erfindung stellt Extraktionsreagenzien bereit, die außerdem wirksame mucolytische Agentien sind. Diese Extraktionsreagenzien erleichtern die Antigen-extraktion durch einen direkten Mechanismus der Zellwandzerstörung und durch Lyse des Probenschleims. Die Lyse des Schleims exponiert die Zelle dem Extraktionsreagenz und vermindert das unspezifische Binden.
Bei einem Verfahren hat der Anmelder festgestellt, dass ein Inkubationsschritt mit einer Base unmittelbar nach der Extraktion mit salpetriger Säure für eine Immunoassay-Technik verfügbares Antigen vermehrt. Bei einem zweiten Verfahren wird Natriumhypochlorit für die Extraktion verwendet, und dies erleichtert wiederum die Freisetzung von Antigen für Immunoassay-Techniken. Dem Hypochlorit-Schritt kann ein Extraktionsschritt mit salpetriger Säure folgen.
Die Extraktionsverfahren dieser Erfindung sind für die Präparation von Proben für die Verwendung in optischen Immunoassays gut geeignet. Die Erfindung stellt auch Verfahren und Kits für die Detektion von aus diesen Mikroorganismen extrahierten Antigenen bereit, die auf einer Kombination dieser Extraktionsverfahren und optischen Immunoassays beruhen. Drei Techniken sind bevorzugt. Eine Technik beruht auf der Wechselwirkung von weißem Licht mit Dünnfilmen, um einen sichtbaren Interferenzeffekt zu erzeugen, eine auf der Wechselwirkung von ellipsometrisch polarisiertem Licht, um ein quantifizierbares Signal zu erzeugen und eine auf der Wechselwirkung von linear polarisiertem Licht mit den Dünnfilmen, um eine Änderung der Lichtintensi tät zu erzeugen.
Folglich kennzeichnet ein erster Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Extraktion eines Antigens aus einem Mikroorganismus, der in einer Probe enthalten ist, umfassend die Schritte:

(a) Kontaktieren der Probe mit Hypochlorit für einen ausreichenden Zeitraum, um das Antigen zu extrahieren, wobei besagtes Hypochlorit als ein festes Hypochloritsalz oder als ein ungepuffertes wässriges Hypochlorit-Reagenz bereitgestellt wird; und
(b) nachfolgendes Neutralisieren besagter Probe.

In einer Anwendungsform wird die Probe mit Natriumnitrit vor Schritt (b) kontaktiert. In einem Beispiel dieser Anwendungsform wird im Anschluss an Schritt (a) und vor Schritt (b) die Probe mit salpetrige Säure erzeugendem/n Reagenz(ien) für einen ausreichenden Zeitraum in Kontakt gebracht, um die Exposition des Antigens zu erhöhen.
Mit „Reagenzien, die salpetrige Säure erzeugen" ist die Kombination von Natriumnitrit und Essigsäure oder anderer äquivalenter Chemikalien gemeint. Salpetrige Säure kann unter Verwendung anderer Nitritsalze erzeugt sein. Ein flüssiges Reagenz kann ebenfalls für die Bereitstellung von Natriumnitrit eingesetzt sein. Eine Reihe anderer Säuren können die Essigsäure ersetzen, um mit dem Nitritsalz zur Bildung von einem salpetrigen Reagenz zu reagieren. Beispiele für andere Säuren, die verwendet sein können, sind: Zitronensäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder schwache organische Säuren.
Mit „ausreichendem Zeitraum, um der salpetrigen Säure eine Extraktion des Antigens zu erlauben" ist die Inkubationszeit gemeint, die erforderlich ist, um ausreichend Antigen aus dem Mikroorganismus freizusetzen, um es für einen nachfolgenden Nachweis verfügbar zu machen. Dieser liegt typischerweise im Bereich von einem Moment bis 10 Minuten.
Mit „Base" ist ein Reagenz gemeint, das in der Lage ist, eine Lösung mit pH 12–14 zu erzeugen. Ein bevorzugtes Reagenz ist Natriumhydroxid, allerdings können auch andere Reagenzien wie Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid oder andere starke Basen verwendet sein.
Mit „ausreichendem Zeitraum, um die Exposition des Antigens zu erhöhen" ist eine Zeit gemeint, in der das Antigen in einem größeren Ausmaß weiter exponiert wird als durch die Extraktion mit salpetriger Säure allein, so dass das Antigen exponierter und für eine Reaktion mit Reagenzien, die für einen Nachweis verwendet werden, verfügbarer ist, was folglich einen verbesserten Nachweis erlaubt. Ein derartig verbesserter Nachweis erlaubt den Nachweis entweder von geringeren Antigen-Mengen oder liefert ein niedrigeres Signal zu Rauschen Verhältnis. Dieser Zeitraum liegt im Bereich von 0,5 bis 10 Minuten.
Mit „Neutralisierung" ist die Zugabe eines Puffersystems gemeint, das einen endgültigen pH im Bereich von 6,0 bis 8,0 ergibt. Beispiele für geeignete Puffersysteme sind MOPSO (0,2% TWEEN20^TM Detergens, 15% Rinderserum, 0,5% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel und 20 mM EGTA), TRIS, MOPS und HEPES.
In einer bevorzugten Anwendungsform bestehen die Reagenzien, die die salpetrige Säure erzeugen, aus zwischen 0,25 M bis 1,0 M Essigsäure und zwischen 0,5 bis 2,5 Natriumnitrit, erfolgt erstes Kontaktieren für einen Zeitraum von 0,5 bis 10 Minuten, erfolgt zweites Kontaktieren für einen Zeitraum von 2 bis 10 Minuten, besteht die Base aus zwischen 2 N bis 6 N NaOH und erfolgt die Neutralisierung mit einem Puffer, der zwischen 1,0 bis 2,5 M MOPSO bei einem pH von 6,0 enthält.
Das Natriumnitrit wird vorzugsweise als ein Reagenz, das zuvor getrocknet wird, in dem Reaktionsröhrchen bereitgestellt.
In einer Anwendungsform kennzeichnet die Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren eines Antigens aus einem in einer Probe enthaltenen Mikroorganismus und zum Lysieren von Schleim in der Probe.
Mit „Lysieren von Schleim" ist das effektive Befreien des Mikroorganismus von der umgebenden Probenmatrix und das gleichzeitige Vermindern des unspezifischen Bindens gemeint, das mit dem Schleim in einer Probe verbunden sein kann.
In einer Anwendungsform wird die Probe mit Reagenzien umgesetzt, die salpetrige Säure in Gegenwart eines Komplexbildners und eines Disulfidbrücken-Reduktionsmittels erzeugen. In einer bevorzugten Anwendungsform ist der Komplexbildner Ethylendiamintetraacetat (EDTA) oder EGTA und ist das Disulfidbrücken-Reduktions-mittel Dithiothreitol. Die Konzentration von EDTA oder EGTA liegt vorzugsweise zwischen 0,1 bis 100 mM, und die Konzentration von Dithiothreitol (DTT) liegt vorzugsweise zwischen 0,1 bis 100 mM. EDTA oder EGTA und DTT sind optional, liefern aber ein verbessertes Ergebnis mit schleimhaltigen Proben.
Folglich stellt die Erfindung ein Verfahren zur Extraktion von Antigen aus einem in einer Probe enthaltenem Mikroorganismus durch Kontaktieren der Probe mit Hypochlorit und Natriumnitrit für einen ausreichenden Zeitraum, um ausreichend Antigen zu extrahieren, um es für einen nachfolgenden Nachweis verfügbar zu machen und Neutralisieren der Probe bereit. Das Verfahren ist genauso effektiv, wenn Hypochlorit allein ohne Natriumnitrit verwendet ist.
Mit „Hypochlorit" ist ein Reagenz gemeint, das in Form einer wässrigen Lösung von Natriumhypochlorit bereitgestellt ist, obwohl andere Hypochloritsalze dieses substituieren können. Lösungen von Natriumhypochlorit, die bis zu 10% verfügbares Hypochlorit enthalten, sind im Handel erhältlich. Festes Hypochlorit (das 40% verfügbares Hypochlorit enthält) kann die im Handel erhältlichen Lösungen ersetzen. Eine höhere Hypochlorit-Endkonzentration könnte mit dem festen Material bereitgestellt werden, das für die Herstellung des flüssigen Reagenz mittels Lösen des Feststoffes in entionisiertem Wasser verwendet wird. Es wäre ebenfalls möglich, das Hypochlorit-Reagenz als ein getrocknetes Reagenz in einem Extraktionsröhrchen bereitzustellen, falls dies erwünscht ist. Dieses Verfahren ist optimal durchzuführen, wenn mehr als 6% wässrige Hypochlorit-Lösung eingesetzt wird.
Ein zweckdienlicher Zeitraum für diesen Aspekt beträgt allgemein bis zu 30 Minuten.
In einer bevorzugten Anwendungsform liegt das Hypochlorit zwischen 0,1% bis 10% vor, das Natriumnitrit liegt zwischen 0,5 bis 2,5 M vor, das Kontaktieren erfolgt für einen Zeitraum von 2 bis 30 Minuten und das Neutralisieren erfolgt mit einem Puffer, der 1,0 bis 2,5 M MOPSO bei einem pH von 7,0 enthält.
In einer Anwendungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren eines Antigens aus einem in einer Probe enthaltenen Mikroorganismus durch ein erstes Kontaktieren der Probe mit Hypochlorit und Natriumnitrit für einen ausreichenden Zeitraum, um dem Hypochlorit die Extraktion des Antigens zu erlauben, ein zweites Kontaktieren der Probe mit Reagenzien, die salpetrige Säure für einen ausreichenden Zeitraum erzeugen, um die Exposition des Antigens, wie oben beschrieben, zu erhöhen, und das Neutralisieren der Probe bereit.
Mit „ausreichendem Zeitraum, um dem Hypochlorit ein Extrahieren des Antigens zu erlauben" ist die Inkubationszeit gemeint, die erforderlich ist, um das Antigen aus dem Mikroorganismus freizusetzen und es für einen nachfolgenden Nachweis verfügbar zu machen.
Mit „Reagenzien, die salpetrige Säure erzeugen" ist die Inkubation mit Essigsäure oder einer vergleichbaren Säure und Natriumnitrit, wie oben spezifiziert, gemeint.
Mit „ausreichendem Zeitraum, um die Exposition des Antigens zu erhöhen" ist ein Zeitraum gemeint, der das Antigen weiter in einem größeren Ausmaß exponiert als mit einer Extraktion mit Hypochlorit und Natriumnitrit erreichbar, so dass das Antigen für eine Reaktion mit Reagenzien, die für einen Nachweis verwendet werden, exponierter und verfügbarer ist, was folglich einen verbesserten Nachweis erlaubt. Das Hypochlorit/salpetrige Säure-Protokoll erlaubt eine erhöhte Exposition des Antigens, da die Menge an verfügbarem Hypochlorit sinken kann (obwohl die Stabilität der Hypochlorit-Lösung bei oder unter Raumtemperatur hervorragend ist, zersetzt sich Hypochlorit bei hohen Temperaturen langsam). Die Exposition an salpetriger Säure nach diesem potenziellen Abfall der Hypochlorit-Mengen stellt sicher, dass der Ex traktionsprozess weiter geht. Die Reihenfolge der Zugabe von Hypochlorit und Essigsäure (zur Erzeugung der salpetrigen Säure eingesetzt) kann umgekehrt sein, während die gleichartige verbesserte Exposition des Antigens aufrechterhalten wird.
Bei einer bevorzugten Anwendungsform liegt Hypochlorit zwischen 0,1 % bis 10% vor, das Natriumnitrit liegt zwischen 0,5 bis 2,5 M vor, erstes Kontaktieren erfolgt im Zeitraum zwischen 2 bis 30 Minuten und die Neutralisierung erfolgt mit einem Puffer, der 1,5 M MOPSO bei einem pH von 7,0 enthält; die Reagenzien, die salpetrige Säure erzeugen, umfassen Essigsäure zwischen 0,25 bis 2,0 M, und das zweite Kontaktieren erfolgt in einem Zeitraum von 0,5 bis 30 Minuten.
Ein Verfahren ist beschrieben, umfassend:
Das Lysieren des Schleims in einer Probe durch Kontaktieren der Probe mit Hypochlorit und Natriumnitrit für einen ausreichenden Zeitraum, um den Schleim in der Probe zu lysieren und das Neutralisieren der Probe. Das Verfahren ist genauso effektiv, wenn Hypochlorit allein ohne Natriumnitrit verwendet ist.
Dieser mucolytische Effekt des Hypochlorits ist überraschend. Die mucolytische Wirkung des Hypochlorits setzt den Mikroorganismus aus der umgebenden Probenmatrix frei und extrahiert dann ebenfalls die erwünschten Antigene und vermindert gleichzeitig die unspezifische Bindung, die mit dem Schleim in einer Probe verbunden sein kann. Die Beschreibung eines Kits, das diese Reagenzien enthält, ist in Beispiel 4 gegeben. Der mucolytische Effekt von Hypochlorit wird ebenfalls bei dem Hypochlorit/salpetrige Säure-Verfahren beobachtet.
In einer bevorzugten Anwendungsform wird die Probe mit Hypochlorit und Natriumnitrit in Gegenwart eines Komplexbildners und eines Disulfidbrücken-Reduktionsmittels umgesetzt. Hypochlorit kann auch allein verwendet werden.
In bevorzugten Anwendungsformen der Extraktionsverfahren und Verfahren zum Lysieren von Schleim in einer Probe ist das Antigen aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus Kohlehydraten, Proteinen, Lipoproteinen, Lipopolysacchariden, Poly sacchariden, Nukleinsäuren, mit Proteinen komplexierten Kohlehydraten, Lipiden, DNA und RNA; der Organismus ist eine Streptococcus-Spezies, am bevorzugtesten Gruppe B-Streptococcus, Gruppe G-Streptococcus, Gruppe A-Streptococcus oder Gruppe F-Streptococcus.
Die Erfindung stellt ein Kit für die Extraktion von Antigenen aus Mikroorganismen gemäß dem Verfahren der Erfindung bereit, wobei der Kit Extraktionsröhrchen enthält, die getrocknetes Natriumnitrit, ein Aliquot Hypochloritlösung, festes Hypochloritsalz, ein Aliquot Neutralisierungespuffer, ein Aliquot Essigsäure und ein Aliquot EDTA und Dithiothreitol umfassen.
Ein Verfahren für den Nachweis eines Antigens, das aus einem in einer Probe enthaltenem Mikroorganismus extrahiert ist, wird beschrieben, wobei dieses Verfahren das Kontaktieren der Probe mit Reagenzien, die salpetrige Säure für einen Zeitraum erzeugen, der für die salpetrige Säure ausreichend ist, um das Antigen zu extrahieren, und darüber hinaus das Umsetzen der Probe mit einer Base für einen ausreichenden Zeitraum, um die Exposition des Antigens zu erhöhen, das Neutralisieren der Probe, das Kontaktieren der Probe mit einer Testoberfläche, die das Antigen spezifisch bindet und das Nachweisen der Bindung des Antigens an die Testoberfläche mit einem geeigneten Analyseverfahren beinhaltet.
Mit „Testoberfläche, die das Antigen spezifisch bindet" ist eine Oberfläche gemeint, die in einem optischen Immunoassay-Nachweisverfahren verwendet werden kann oder eine Oberfläche, die für ein anderes Analysenverfahren geeignet ist, wie: Antikörper-, Nukleinsäure- oder Antigen-beschichtete Mikrotitervertiefungen, Teströhrchen, Polystyrolkügelchen, Mikropartikel-Kügelchen, Membranen oder andere Oberflächen, die dem Fachmann bekannt sind.
Mit „geeignetem Analyseverfahren" ist ein optisches Detektionsverfahren; Enzymimmunoassays in Mikrotitervertiefungen, Teströhrchen, Membranen oder auf Kügelchen; Radioimmunoassays; Chemilumineszenz-Assays; Fluoreszenz-Assays; Agglutinationsassays; und andere Techniken gemeint, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Geeignete Analyseverfahren beinhalten: Diffraktionsverfahren, SPR, Ellipsome trie, Dünnfilm-Interferenzeffekte, Spektrophotometrie, Reflektometrie, Änderungen der Polarisationsintensität oder des Polarisationsgrades; Rastertunnelmikroskopie (STM), Atomkraftmikroskopie (AFM), interne Totalreflexion, Interferometrie, piezoelektrische Sensoren und andere verwandte optische und elektrochemische Verfahren.
Vorzugsweise wird die Probe mit einer Sekundärmarkierung oder signalerzeugenden Komponente im Anschluss an den Neutralisierungsschritt kontaktiert.
Eine „Sekundärmarkierung" in einem optischen Immunoassay erzeugt eine Massenzunahme. Dies könnte einen Enzym-markierter Antikörper zusammen mit einem Substrat für das Enzym beinhalten, das ein unlösliches oder präzipitierendes Produkt bildet. Oder sie könnte Materialien beinhalten, die das geeignete Analyt über ein spezifisches zweites bindendes Reagenz bindet, das an einem filmbildenden Latex anhaftet. Für andere Verfahren ist die Markierung so ausgewählt, dass sie zum Analysenverfahren passt. Zum Beispiel wird eine Radiomarkierung in einem RIA, ein Enzym zusammen mit einem chromogenen Substrat in einem EIA, eine fluoreszierende Markierung in einem FIA oder IFA oder andere Markierungen verwendet, wie sie dem Fachmann bekannt sind. Die Sekundärmarkierung ist direkt oder indirekt für die Signalerzeugung verantwortlich. Im Allgemeinen ist die Sekundärmarkierung an das bindende Agens angeheftet, das für das Analyt von Interesse spezifisch ist.
Mit „signalerzeugende Komponente" ist eine Komponente gemeint, die die Bildung eines Signals erlaubt, das mit einem geeigneten Analyseverfahren detektierbar ist. Die Sekundärmarkierung kann das Signal wie in einem RIA intrinsisch erzeugen, oder die Sekundärmarkierung kann auf einen anderen Stoff einwirken, um ein Signal zu erzeugen wie in einem EIA, wo ein Enzym ein Substrat (kein Signal) in ein Produkt umwandelt (Signal). Das Enzym wandelt ein Chromophor in eine Form mit einem höheren Extinktionskoeffizienten bei einer spezifischen Wellenlänge um. In diesem Beispiel ist ein Signal eine sichtbare Farbänderung oder ist eine spektrophotometrische Messung. Das gemessene Signal ist eine Funktion des angewandten Nachweisverfahrens und sollte für den Fachmann eindeutig sein.
Ein Verfahren für den Nachweis von Antigenen wird beschrieben, die aus in einer Probe enthaltenen Mikroorganismen extrahiert sind, umfassend die Schritte des Umsetzens der Probe mit Hypochlorit für einen ausreichenden Zeitraum, um das Antigen zu extrahieren, des Neutralisierens der Probe, des Kontaktierens der Probe mit einer Testoberfläche, die das Antigen spezifisch bindet, und des Nachweisens der Bindung des Antigens mit einem geeigneten Analyseverfahren.
Die Probe ist vorzugsweise mit Reagenzien umgesetzt, die salpetrige Säure im Anschluss an den Hypochlorit-Kontaktschritt erzeugen.
Vorzugsweise ist das Analyseverfahren ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ellipsometrie, vergleichender Ellipsometrie, Spektrophotometrie, Reflektometrie, Dünnfilm-Interferenzeffekten, Oberflächenplasmonresonanz, interner Totalreflexion, Interferometrie, abgeschwächter Totalreflexion, piezoelektrischen Sensoren, frustrierter interner Reflexion, Änderungen der Drehung der Polarisation oder Änderungen der Intensität von polarisiertem Licht, Wellenleiter-Sensoren, AFM, STM und Immunoassays, die radioaktive, enzymatische, metallische Partikel, fluoreszierende oder chemilumineszierende Markierungen oder Agglutination nutzen.
Die Erfindung stellt einen Assay-Kit für den Nachweis von Antigenen bereit, die aus Mikroorganismen unter Verwendung der Verfahren der Erfindung extrahiert sind, umfassend Extraktionsröhrchen, die getrocknetes Natriumnitrit, ein Aliquot Hypochlorit oder festes Hypochloritsalz, ein Aliquot Essigsäure-Lösung, ein Aliquot eines Neutralisierungspuffers und ein Aliquot EDTA und Dithiothreithol, ein Aliquot einer Sekundärmarkierung, ein Aliquot Präzipitationssubstrat, ein Aliquot Waschlösung, Probentransfer-Pipetten und eine Testoberfläche enthalten.
Mit „Präzipitationssubstrat" ist ein Substrat gemeint, das in der Lage ist, mit einem Massenzunahme-Reagenz oder einer Sekundärmarkierung wechselzuwirken, um ein unlösliches Präzipitat zu bilden.
Mit „Waschlösung" ist Wasser, eine gepufferte Lösung, eine Detergens enthaltende Lösung oder ein anderes derartiges Reagenz gemeint.
In einer bevorzugten Anwendungsform wird das Hypochlorit durch Lösen eines festen Salzes zu der erwünschten Endkonzentration erzeugt.
Kurzbeschreibung der Figuren
Zunächst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.
Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung, die die Verfahrensschritte für die Verwendung der Einmal-Testvorrichtung zeigt.
Beschreibung der bevorzugten Anwendungsformen
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung.
Drei verschiedene optische Immunoassay-Nachweisverfahren werden bei den bevorzugten Anwendungsformen der vorliegenden Erfindung angewendet. Die Verfahren basieren auf der Beobachtung von Dünnfilmen. Wenn auch diese Techniken optimal sind, so kann auch eine Reihe anderer Verfahren mit diesen Extraktionstechniken zweckdienlich sein. Die Auswahl der verwendeten geeigneten Testoberfläche für das Nachweisverfahren sollte für den Fachmann klar sein. Zum Beispiel wäre das Diffraktionsassay-Verfahren, das von Gustafson im US Patent 4.876.208 oder von Nicoli im US Patent 4.647.544 beschrieben ist, oder verwandte Verfahren ein geeignetes Nachweisverfahren für diese Erfindung. Die verwendete Testoberfläche würde das Diffraktionsgitter enthalten, das für die Erzeugung des geeigneten Signals erforderlich ist. Weitere geeignete Nachweisverfahren sind: Oberflächenplasmonresonanz, wie in US Patenten 4.828.387 und 4.931.384 und in anderen Veröffentlichungen beschrieben; die Techniken der internen Gesamtreflexion, Interferometrien, abgeschwächte Totalreflexion, piezoelektrische Sensoren, Atomkraftmikroskopie (AFM), Rastertunnelmikroskopie (STM), frustrierte interne Reflexion, Spektrophotometrie, Reflektometrie und verschiedene Wellenleiter-Sensoren. Jede Art von Immu noassay-Verfahren würde von den Antigen-Präparationsverfahren der gegenwärtigen Erfindung profitieren.
Ein bevorzugtes optisches Verfahren beruht auf der Wechselwirkung von weißem Licht mit einer Reihe von Dünnfilmen. In diesem Fall werden Dünnfilme verwendet, um eine destruktive Interferenz von weißem Licht zu schaffen, was zu einer sichtbaren Farbänderung auf der Oberfläche des optischen Substrats führt. Die Komponenten dieser optisch aktiven Testoberfläche umfassen ein optisches Substrat, einen optischen Dünnfilm, eine Anlagerungsschicht und ein saugfähiges Material. Das optische Substrat ist so ausgewählt, dass es für den erwünschten Reflexionsgrad sorgt. Dies kann eine intrinsische Eigenschaft des Substratmaterials sein oder das Substrat kann durch zusätzliche Schichten modifiziert sein, um die erwünschten Eigenschaften zu liefern. Der optische Dünnfilm ist auf Basis der Brechungszahlen des Dünnfilms und des Substrates und der erwünschten Änderung der endgültigen Farbe ausgewählt. Allerdings erfolgen die entscheidenden Einstellungen der Dicke des optischen Dünnfilms auf Basis der Art der Anlagerungsschicht und des saugfähigen Materials, die in dem endgültigen Assay verwendet werden. Die Anlagerungsschicht ist bevorzugt aus einer Reihe verzweigter Siloxanen ausgewählt. Das saugfähige Material basiert auf dem nachzuweisenden Antigen oder Analyt.
Siliziumnitrid ist ein derartiger optischer Dünnfilm und kann auf Siliziumscheiben unter Anwendung eines Aufdampf-Verfahrens, das von einem Fachmann für Halbleiter oder optische Materialien gut verstanden ist, aufgebracht sein. Eine Reihe optischer Materialien können die Siliziumnitrid-Schicht ersetzen und sind in US Patenten 5.541.057 und 5.869.272 beschrieben.
Die anderen Verfahren beruhen auf der Wechselwirkung von ellipsometrisch oder linear polarisiertem Licht mit Dünnfilmen auf dem optischen Substrat. Die Auswahl eines Substrates basiert wiederum auf dem erwünschten Reflexionsvermögen für das zu verwendende Instrument. Die Verwendung eines optischen Dünnfilms ist optional beim instrumentellen Nachweis von Änderungen des Dünnfilms; die verwendete Anlagerungsschicht und das saugfähige Material sind jedoch die gleichen wie beim ersten optischen Verfahren. Reagierte Testoberflächen werden dann auf eine Änderung der Lichtintensität der Reaktionszone im Verhältnis zur nichtreagierten Zone geprüft. Diese Änderung der Lichtintensität kann eine Verschiebung in der Wellenlänge, eine Änderung des Elliptizitätsgrads oder der Elliptizitätsintensität, eine Änderung des Polarisationsgrads oder der Polarisationsintensität, eine Änderung des Grads oder der Intensität des elliptisch polarisierten Lichts, eine Änderung des Grads oder der Intensität des linear polarisierten Lichts darstellen. Für eine detailliertere Beschreibung siehe US Patente 5.541.057 und 5.869.272 oben.
Die Anlagerungsschicht ist vorzugsweise aus einer Reihe an Reagenzien ausgewählt, bestehend aus verzweigten Siloxanen, Dendrimeren, Stern-Polymeren, molekularen selbst zusammenfügenden Polymeren, polymeren Siloxanen oder filmbildenden Latizes. Eine bevorzugte Anlagerungsschicht ist ein verzweigtes Siloxan mit T-Struktur und ist mit einer Drehbeschichtungstechnik hergestellt. Eine 1:300 (v/v)-Verdünnung des T-Polymers (T-Polymer-Aminoalkyl T-Struktur-Verzweigungsstelle Polydimethylsiloxan, Petrarch, Bristol, Pa) kann in 2-Methyl-2-butanol hergestellt werden. Die Anlagerungsschicht wird auf die Siliziumscheibe mit Hilfe eines Drehbeschichtungsverfahrens aufgetragen und wird 24 Stunden bei 140°C vor Gebrauch gehärtet. Eine Endschicht mit 100–160
ist allgemein bevorzugt. Für eine Drehbeschichtung wird eine 300-Mikroliter-Probe auf diese Lösung auf eine 100 mm unbehandelte Testsiliziumscheibe mit einer Mikropipette verbracht, obwohl automatische Aerosol- oder Sprühzuführsysteme ebenfalls zweckdienlich sind, während die Scheibe mit 7.000 UpM auf einem Photoresist-Drehbeschichter rotiert. Mit der Drehbeschichtung kann eine große Anzahl an Substraten schnell bearbeitet werden. Der Vorgang ist ohne weiteres zu automatisieren.
Saugfähige Materialien werden auf die Anlagerungsschichten, die auf dem optischen Substrat aufgetragen sind, aus einer gepufferten Lösung aufgetragen. Es ist gezeigt worden, dass Puffer im pH-Bereich von 5,0 bis 9,0 eine effektive saugfähige Beschichtung liefern. Eine große Vielfalt an Puffer-Formulierungen kann verwendet sein. Saugfähige Materialien können auf der Anlagerungsschicht mittels Inkubation bei unterschiedlichen Temperaturen und in variierenden Zeiträumen aufgetragen werden. Eine derartige saugfähige Schicht und eine für einen Immunoassay bevorzugte Schicht ist ein Antikörper. Der Antikörper wird dann mit einer schützenden Pro teinbeschichtung stabilisiert.
Antikörper-beschichtete Testoberflächen können in Einmal-Testvorrichtungen vor dem Assay eingesetzt werden. Die Verwendung der Assay-Vorrichtung ist unten beschrieben.
Sobald das Antigen extrahiert ist, kann es erforderlich sein, das immobilisierte Antigen mit einer Sekundärmarkierung umzusetzen, um den Nachweis zu erleichtern. In den optischen Dünnfilm-Verfahren bedeutet dies eine Zunahme der auf der Oberfläche erzeugten Masse als eine Funktion der Menge an Analyt auf der Oberfläche. In einer bevorzugten Anwendungsform wird das extrahierte Antigen 5:1 (Probe : Sekundärmarkierung) mit einer 1:100-Verdünnung der Zubereitung der Sekundärmarkierung gemischt, die 50 mM MOPSO, pH 7,0, 3% alkalisch behandeltes Casein, 0,2% TWEEN20^TM Detergens und 0,5% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel enthält. Die eingesetzte exakte Verdünnung variiert mit Zubereitung der Sekundärmarkierung und dem Nachweisverfahren. Eine Schwankungsbreite des Verhältnisses von Probe zu Sekundärmarkierung ist akzeptabel. Das Gemisch aus Probe/Sekundärmarkier-ung wird 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann werden 20 μl Gemisch auf die Testvorrichtung aufgetragen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert; oder alternativ 10 Minuten direkt auf der Oberfläche. Die Inkubationszeiten können mit der Konzentration und dem Verhältnis der Sekundärmarkierung variieren.
Für die Massenzunahme eines optischen Immunoassays kann ein Antikörperpräparat an HRP, Meerrettich-Peroxidase, unter Anwendung des Nakane Periodat-Verfahrens konjugiert sein. Ein Enzym zusammen mit einem Präzipitationssubstrat bildet eine zusätzliche Materialschicht, die den zu messenden Dünnfilm-Effekt verstärkt. Sekundäre bindende Reagenzien können mit weiteren Arten von Material kombiniert werden, die zusätzliche Masse in den auf der Oberfläche gebildeten Dünnfilm als Funktion der Analytkonzentration einbauen. US Patente 5.541.057 und 5.869.272 oben.
Unter Bezugnahme auf 1 ist ein Verfahren gezeigt, bei dem eine Einmal-Testvorrichtung verwendet wird. Genauer, in Schritt 1 wird eine Probe erhalten und auf die Testoberfläche aufgetragen. Derartiges Auftragen erfolgt bei der offenen Testvorrichtung. In Schritt 2 wird die Probe inkubiert, so dass jegliches in der Probe vorhandene Analyt mit der Antikörperschicht reagiert. In Schritt 3 wird die Probe von der Testoberfläche abgewaschen, und die überschüssige Flüssigkeit kann in den Filter unter der pyramidenförmigen Halterung fließen. In diesem Stadium ist die Position des oberen Filtermaterials auf 1. In Schritt 4 wird die Vorrichtung geschlossen und eingerastet, so dass der Filter die Testoberfläche ablöscht. In Schritt 5 wird ein Tropfen TMB-Präzipitationssubstrat auf die Vorrichtung gegeben und 5–10 Minuten inkubiert und wiederum wie oben abgespült. Zu diesem Zeitpunkt wird das obere Filtermaterial von Position I zu II bewegt und die Vorrichtung wiederum geschlossen, um die Testoberfläche trocken werden zu lassen. Zu diesem Zeitpunkt wird die Vorrichtung wieder geöffnet und das Ergebnis abgelesen.
Sind instrumentierte Ergebnisse erwünscht, so wird das Wasch-Trocknungsprotokoll mittels Spülen der Testoberfläche mit entionisiertem Wasser und Trocknen unter einem Stickstoffstrom durchgeführt.
Beispiel 1
Drei Extraktionsverfahren wurden mit einem salpetrigen Standardverfahren auf ihre Fähigkeit verglichen, gruppenspezifisches Polysaccharid aus GBS freizusetzen. Relative Ausbeuten der Extraktionstechniken wurden unter Verwendung eines visuellen, optischen Immunoassays bestimmt, der auf der Interferenz von Licht basiert. Eine ellipsometrische Analyse dieser Oberflächen ist ebenfalls möglich. Bei allen hier beschriebenen Ergebnissen wurde der CDC Stamm, Nr. CDCSS893, von GBS verwendet.
Das polyklonale Antikörper-Präparat, das zur Beschichtung der mit T-Polymer und 495
Si₃N₄ optischem Dünnfilm beschichteten Siliziumscheibe verwendet wurde, war eine Affinitäts- und Protein G gereinigte IgG-Fraktion. Das für die Produktion von Antikörpern verwendete Immunogen waren inaktivierte ganze Zellen von GBS. Die Antikörper-Konzentration für die Beschichtung lag im Bereich von 100 bis 500 μg Antikörper pro 100 mm-Scheibe. Die Scheiben wurden bei 2 – 8°C 2 bis 48 Stunden beschichtet. Die bevorzugte Antikörper-Konzentration für die Beschichtung war 200 μg pro 100 mm-Scheibe in einem 0,1 M HEPES-haltigen Puffer, pH 8,0.
Um die Wirkung eines jeden Extraktionsverfahrens zu bewerten, wurden klinisch negative Vaginalabstriche verwendet. Einige dieser Abstriche wurden mit GBS-Zellen versetzt, und die Wiedergewinnung von GBS wurde in einer klinisch relevanten Probenmatrix, d.h. eine Schleim, Blut etc. enthaltende Probe, bewertet. Während der Schwangerschaft gesammelte Vaginalabstriche sind häufig mit Schleim, Blut und einem weiten Spektrum unterschiedlicher Mikroorganismen kontaminiert. Folglich wurde ein besonderes Augenmerk auf die Fähigkeit des Extraktionsreagenz gerichtet, die relevanten Antigene zu extrahieren und ebenfalls gleichzeitig als mucolytisches Agens zu dienen. Ein mucolytischer Effekt oder andere Mechanismen für die Zerstörung der Probenmatrix vermindert oder eliminiert unspezifisches Binden und sollte ebenfalls die Wiedergewinnung extrahierter Antigene erhöhen. Ähnliche analytische Empfindlichkeitsuntersuchungen wurden mit reinen, sterilen Abstrichen ohne Matrix durchgeführt. Die Ergebnisse waren mit denjenigen identisch, die in der Untersuchung mit einer klinisch relevanten Probenmatrix beschrieben sind.
Ein Vergleich eines Standardextraktionsverfahrens mit salpetriger Säure wurde bezogen auf Basen- oder Hypochloritmodifikationen dieser Technik durchgeführt. Zusätzlich wurde eine Extraktionsmethode mit ausschließlich Hypochlorit untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Das Basen-modifizierte Protokoll wurde mit zwei verschiedenen Essigsäure-Konzentrationen untersucht: 0,25 M und 1,6 M.
Wie zuvor beschrieben, wurden klinisch negative Vaginalabstriche mit den genannten Mengen an GBS-Zellen versetzt und dann die Abstriche nach dem Extraktionsprotokoll verarbeitet.
In dem Standardverfahren mit salpetriger Säure wird ein Gemisch aus 120 μl 0,25 M Essigsäure und 100 μl 2,3 M Natriumnitrit (zuvor in dem Extraktionsröhrchen getrocknet) verwendet, um salpetrige Säure zu erzeugen. Es wurde festgestellt, dass die Essigsäure Antigen im Bereich von 0,1 M bis 1,0 M effektiv extrahiert. Antigen wird aus dem Organismus 5 Minuten extrahiert, obwohl ein Zeitraum von einem Moment bis 30 Minuten akzeptabel ist. Die Lösung wird unter Verwendung von 120 μl Puffer neutralisiert, der 1,5 M MOPSO, pH 7,3, 0,2% TWEEN20^TM Detergens, 15% Rinderserum, 0,5% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel und 20 mM EGTA enthält. Ein pH-Endwert im Bereich von 7,0 bis 7,5 ist erwünscht.
Eine Basenmodifikation dieses salpetrige Säure-Standardverfahrens besteht aus einem 10 mM EDTA und 5 mM DTT-haltigen Gemisch aus 120 μl 0,25 M oder 1,6 M Essigsäure, abhängig vom Experiment, und 100 μl 2,3 M Natriumnitrit (zuvor im Extraktionsröhrchen getrocknet), das zur Erzeugung von salpetriger Säure verwendet wird. Die Essigsäure extrahiert Antigen im Bereich von 0,25 M bis 1,0 M bei dieser Modifikation der salpetrigen Technik. Antigen wird 5 Minuten aus dem Organismus extrahiert. Der pH-Wert des Säureschrittes sollte im Bereich von 4,0 bis 5,0 liegen. Ein Zeitraum von einem Moment bis 10 Minuten ist akzeptabel. Eine weitere Extraktion wird beobachtet, wenn 100 μl 2 N NaOH zugegeben wird und 1 Minute inkubiert wird. Ein Bereich von 2 N bis 6 N ist für die NaOH akzeptabel, während die Inkubationszeit 0,5 bis 10 Minuten betragen kann. Der pH-Wert des Basenschrittes sollte im Bereich von 12 – 14 liegen. Die Lösung wird unter Verwendung von 250 μl Puffer neutralisiert, der 2,0 M MOPSO, pH 6,0, 0,2% TWEEN20^TM Detergens, 15% Rinderserum, 0,5% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel und 20 mM EGTA enthält. Ein pH-Endwert im Bereich von 6,0 bis 7,5 ist erwünscht.
Die Hypochlorit-Extraktionstechnik verwendet 120 μl 10% verfügbares Hypochlorit in Lösung in Form von Natriumhypochlorit. Dieses Verfahren arbeitet optimal, wenn mehr als 6% Hypochloritlösung verwendet wird. Antigen wird 5 Minuten aus dem Organismus extrahiert. Ein Zeitraum von einem Moment bis 30 Minuten ist akzeptabel. Die Hypochloritlösung wird nach dem Inkubationsschritt mit 120 μl 1,5 M MOPSO, pH 7,3, 0,2% TWEEN20^TM Detergens, 15% bovines Serum, 0,5% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel und 20 mM EGTA neutralisiert. Wenn Hypochlorit mit Natriumnitrit kombiniert wird, dann wird 100 μl 2,3 M Natriumnitrit verwendet (in den Extraktionsröhrchen getrocknet).
In dem Hypochlorit/salpetrige Säure-Extraktionsverfahren geht die Extraktion durch die Zugabe zur Lösung aus Hypochlorit und Natriumnitrit von 120 μl 0,5 M Essigsäure weiter, die 10 mM EDTA und 5 mM DTT enthält, und die Inkubation dauert 5 Minuten. Es wurde festgestellt, dass die Essigsäure das GBS-Antigen im Bereich von 0,25 M bis 2,0 M bei dieser Modifikation der salpetrigen Technik extrahiert. Die Lösung wird unter Verwendung von 300 μl (bei 2 M Essigsäure) Puffer neutralisiert, der 1,5 M MOPSO, pH 7,0, 0,2% TWEEN20^TM Detergens, 15% Rinderserum, 0,5% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel und 20 mM EGTA enthält. Ein pH-Endwert im Bereich von 6,0 bis 7,5 ist erwünscht.
Das extrahierte Antigen wird mit einer 1:100 Verdünnung der Konjugat-Zubereitung, die 50 mM MOPSO, pH 7,0, 3% alkalisch behandeltes Casein, 0,2% TWEEN20^TM Detergens und 0,5% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel enthält, 5:1 (Probe : Konjugat) gemischt. Die exakte Verdünnung der verwendeten Konjugat-Zubereitung variiert mit der Konjugat-Zubereitung. Eine Schwankungsbreite des Verhältnisses von Probe zu Konjugat ist akzeptabel. Das Probe/Konjugat-Gemisch wird 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann werden 20 μl Gemisch auf die Testvorrichtung aufgetragen und bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert; oder alternativ 10 Minuten direkt auf die Oberfläche aufgetragen. Die Inkubationszeiten können mit der Konzentration des Konjugats und dem Probe:Konjugat Verhältnis variieren.
Wird die visuelle Interferenz-Testoberfläche verwendet (siehe 1), wird die Probe von der Oberfläche mit entionisiertem Wasser abgewaschen und der Deckel der Testvorrichtung geschlossen. Dies bringt saugfähiges Material in Kontakt mit der Oberfläche und trocknet die Testoberfläche. Die Vorrichtung wird wieder geöffnet, um die Testoberfläche zu exponieren. Ein Präzipitationssubstrat wird dann auf die Testoberfläche aufgetragen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Schieber im Deckel der Vorrichtung wird verschoben, um trockenes saugfähiges Material bereitzustellen, und sobald das Substrat von der Testoberfläche abgewaschen ist, wird der Deckel geschlossen, um den Trocknungsvorgang zu wiederholen. Die Vorrichtung wird geöffnet und das Ergebnis ausgewertet.
TABELLE 1

* Anzahl an Zellen pro Assay
^a Keine Inkubationszeit im Anschluss an die Zugabe der Base. Eine hohe Konzentration der Essigsäure (1,6 M) wurde im Extraktionsprotokoll verwendet.
^b Keine Inkubationszeit im Anschluss an die Zugabe der Base. Eine geringe Konzentration der Essigsäure (0,25 M) wurde im Extraktionsprotokoll verwendet.

Untersuchungen der analytischen Empfindlichkeit, die die Wirkung einer starken Base auf die fortgesetzte Extraktion von GBS untersuchen, deuteten darauf hin, dass eine erhöhte Wiedergewinnung des GBS-spezifischen Antigens im Vergleich zum salpetrige Säure-Standardverfahren vorlag. Zusätzlich scheint die Basen-modifizierte Extraktion mit salpetriger Säure einen mucolytischen Effekt auf die Probenmatrix zu besitzen. Folglich war das Basen-modifizierte Protokoll insgesamt effektiver als das salpetrige Standardprotokoll. Ein geringer Verlust an Signalintensität war zu beobachten, wenn die Basenmodifikation mit der Extraktion mit einer sehr starken salpetrigen Säure (Verwendung von 1,6 M Essigsäure) kombiniert war und eine Neutralisierung des Extraktes schwieriger zu erreichen war. Folglich werden Essigsäure-Konzentrationen von weniger als 0,75 M in Kombination mit einer Basenmodifikation bevorzugt. Die eingesetzte geringere Essigsäure-Konzentration war ebenfalls auf Änderungen der Menge an zugegebenem Neutralisationsmittel oder überschüssiger Säure toleranter. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass die beobachtete Verbesserung beim Antigennachweis auf das Basen-modifizierte Protokoll und nicht auf die höhere Konzentration von salpetriger Säure zurückzuführen ist. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Basenwirkung schnell erfolgt. Es war keine Inkubationszeit bei ei nem erhöhten pH-Wert erforderlich, um diese Wirkung auszulösen.
Das Hypochlorit/salpetrige Säure-Protokoll lieferte die beste Extraktionsausbeute. Die analytische Empfindlichkeit war besser als ausschließlich mit salpetriger Säure. Der größte Vorteil bei dieser Technik war die Verbesserung der Ausbeute der Antigenextraktion bei einer klinisch relevanten Probenmatrix. Die klinisch negativen Probenabstriche lieferten eindeutig negative Reaktionen, d.h. verringertes unspezifisches Binden. Das Hypochlorit/salpetrige Säure-Protokoll war toleranter als das Basen-modifizierte Protokoll auf die Variation von überschüssigen Reagenzvolumina. Folglich war das Verfahren stabil. Hypochlorit allein zeigte ebenfalls eine verbesserte analytische Empfindlichkeit im Vergleich zu dem salpetrige Säure-Verfahren und zeigte den erwünschten mucolytischen Effekt.
Diese beiden Verfahren, das Basen-modifizierte wie auch das Hypochlorit/salpetrige Verfahren, extrahieren Gruppe A-Streptococci-(GAS)-Antigen, Gruppe B-Streptococci-(GBS)-Antigen, Gruppe F-Streptococci-Antigen und Gruppe G- Streptococci-Antigen. Diese Extraktionstechniken extrahieren ohne weiteres das GBS-Antigen aus Kolonien, die nicht-beta-hämolytisch sind und folglich nicht ohne weiteres mit Hilfe von Kulturstandardtechniken identifiziert werden.
Beispiel 2: Hypochloritextraktion von Streptococci-Organismen
Im Handel erhältliche serotypisierende Reagenzien für die Streptococci-Gruppen A, B, C, F und G wurden verwendet, um die Brauchbarkeit des Hypochlorit/salpetrige Säure-Reagenz für die Extraktion spezifischer Polysaccharid-Antigene zu bewerten. Trypticase-Soja-Agarplatten, die 5% Schafblut enthalten, wurden verwendet, um reine, isolierte Kolonien von jedem Organismus zu gewinnen. Mit einem Zahnstocher wurden mehrere Kolonien gepickt. Die Abstriche wurden mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Hypochlorit/salpetrige Säure-Protokoll extrahiert. Extrahierte Antigene wurden mit dem geeigneten serotypisierenden Reagenz gemäß dem Herstellerprotokoll getestet.
Das in Beispiel 1 beschriebene Hypochlorit/salpetrige Säure-Protokoll wurde für die Extraktion von Gruppe B-spezifischem Polysaccharid optimiert. Der Optimierungsprozess beinhaltete die Untersuchung variierender Konzentrationen von Essigsäure, Hypochlorit, NaNO₂ und Neutralisierungsmittel (und pH für das Neurealisierungsmittel). Zusätzlich wurde die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien und die Inkubationszeiten für jeden Schritt getestet. Im Allgemeinen wird ein Reagenz variiert, während die anderen konstant gehalten werden. Mit einer bekannten Menge an GBS-Zellen versetzte Abstriche wurden mit einer großen Anzahl dieser verschiedenen Protokolle verarbeitet und dann unter gleichen Bedingungen mit der Interferenz-Testoberfläche getestet. Die Ergebnisse wurden verglichen, um den Effekt auf die negativen Proben, schwach positiven und stark positiven zu bestimmen. Sobald große Bereiche für alle Reagenzien ausgewählt waren, wurden zusätzliche Experimente genutzt, um die Reagenzienzusammensetzung endgültig zu bestimmen. Folglich sind die Bedingungen für GBS ziemlich spezifisch. Ein ähnliches Verfahren könnte für jeden Organismus gefolgert werden. Diese Art der Optimierungsuntersuchung sind vom Fachmann für die Assay-Entwicklung wohlverstanden. Ohne jegliche Optimierung für die anderen Organismen wird eine Extraktion gruppenspezifischer Polysaccharide beobachtet. Die Bedingungen scheinen für die Extraktion von Gruppe B und F gut geeignet zu sein.
Beispiel 3: Hypochlorit/salpetrige Säure-Extraktion von GBS in Kombination mit einem Membran-EIA-Assay
Ein im Handel erhältlicher GBS-Antigentest zusammen mit dem Hypochlorit/salpetrige Säure-Extraktionsprotokoll von Beispiel 1 wurde verwendet. Der Membran-Assay wurde gemäß Herstellerprotokoll durchgeführt. Eine GBS-Zellsuspension wur de in 0,85% steriler Saline in einer Dichte von 3 × 10⁸ Zellen/ml zubereitet. Zellverdünnungen wurden mit einer Verdünnungsreihe in steriler Saline hergestellt. Ein 100 μl Aliquot wurde zu den Extraktionsröhrchen gegeben und dann wie beschrieben extrahiert. Dieses Extraktionsverfahren wurde mit dem vom Hersteller empfohlenen Extraktionsprotokoll verglichen, das auf salpetriger Säure basiert.

* Anzahl an Zellen pro Assay.

Ohne Optimierung für das Membran-Assaysystem erhöht das Hypochlorit/salpetrige Säure-Extraktionsprotokoll das beobachtete Signal für eine Zellkonzentration von 3 × 106.
Beispiel 4: Vergleich der analytischen Empfindlichkeit eines optischen Interferenz-GBS-Assays, einschließlich des Hypochlorit/salpetrige Säure-Extraktionsprotokolls, mit im Handel erhältlichen GBS-Assays.
Der Strep B OIA^TM Tests Kit wurde mit im Handel erhältlichen GBS-Assays auf die analytische Empfindlichkeit verglichen.
Der Strep B OIA^TM Tests Kit für den Test von Vaginalabstrichen zum Nachweis von GBS besteht aus den folgenden Bestandteilen:
Extraktionsröhrchen, die getrocknetes Natriumnitrit enthalten, Essigsäure in einem Tropffläschchen, Hypochloritlösung in einem Tropffläschchen, Neutralisierungsmittel in einem Tropffläschchen, ein Tropffläschchen, das eine Sekundärmarkierung enthält, ein Tropffläschchen mit Präzipitationssubstrat, ein Fläschchen Waschlösung, Einmaltransferpipetten und eine einmal zu verwendende Assay-Vorrichtung, die eine Testoberfläche mit einer Siliziumnitrid-beschichteten Siliziumscheibe enthält.
Strep B OIA^TM Tests Kit Bestandteile:
Die Extraktionsröhrchen enthalten getrocknetes Natriumnitrit (NaNO₂) 2,3 M; 100 μl.
Extraktionsreagenz 1A: Enthält Natriumhypochlorit (<15% verfügbares Chlor).
Extraktionsreagenz 1B: Enthält 0,5 M Essigsäure, pH 3.
Reagenz 2 (Neutralisierungsreagenz): Enthält 1,5 M MOPSO, 20 mM EGTA, 0,2% TWEEN20^TM Detergens, (15% bovines Serum) und 0,5% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel.
Reagenz 3 (Sekundärmarkierung): Enthält gepufferten Gruppe B-Streptococcus- Antikörper (Kaninchen), konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP). 1:100 Ak-Verdünnung in 50 mM MOPSO, pH 7,0, 3% alkalisch behandeltes Casein, 0,2% TWEEN20^TM, 0,5% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel.
Reagenz 4 (Waschlösung): H₂O w 0,1% PROCLIN300^TM Konservierungsmittel.
Reagenz 5 (Präzipitationssubstrat): Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid (H₂O₂).
Testvorrichtungen: Mit anti-Gruppe B Streptococcus Antikörper (Kaninchen) beschichtete Oberfläche.
Positive Kontrolle: Gereinigtes Gruppe B Streptococcus-Antigen. Transferpipetten.
Testverfahren

1. Entnahme des/der Reagenzien) aus dem Kühllager und Erwärmenlassen auf Raumtemperatur (18°C–30°C). Reagenz 4 nach Öffnen bei Raumtemperatur aufbewahren. Testvorrichtungen können bei Raumtemperatur oder gekühlt bei 2°C–30°C aufbewahrt sein.
2. Entnahme eines Reaktionsröhrchens, das trockenes Reagenz enthält, aus dem Kit und Aufrechtstellen in einen Ständer oder eine Halterung.
3. Beschriftung der Testvorrichtungen mit geeigneten Patienteninformationen. Testvorrichtung auf eine ebene Fläche stellen, während der Assay durchgeführt wird.
4. Zugabe von 3 Tropfen von Reagenz 1A in das Extraktionsröhrchen und vorsichtiges Schütteln des Röhrchens, um trockenes Reagenz am Boden aufzulösen.
5. Innerhalb einer Minute positive Kontrolle oder Abstrichstäbchen mit einer Probe in das Röhrchen stellen. Mischen der Lösung mit dem Abstrichstäbchen, so dass die Flüssigkeit um die faserige Spitze bewegt wird. Das Abstrichstäbchen sollte mindestens 3 Minuten und nicht mehr als 5 Minuten in der Extraktionslösung stehen.
6. Das Stäbchen an die Seite halten und 3 Tropfen von Reagenz 1B direkt in das Extraktionsröhrchen geben. Mit dem Stäbchen das Reagenz mit dem Extrakt mischen. Das Abstrichstäbchen sollte mindestens 3 Minuten und nicht mehr als 5 Minuten in der Extraktionslösung stehen.
7. Das Stäbchen an die Seite halten und 3 Tropfen von Reagenz 2 direkt in das Extraktionsröhrchen geben. Mit dem Stäbchen das Reagenz mit dem Extrakt mischen
8. Zusammenpressen der Wände des Extraktionsröhrchens, wenn das Abstrichstäbchen herausgezogen wird, und soviel wie möglich Flüssigkeit in das Röhrchen drücken. Verwerfen des Abstrichstäbchens und die Röhrcheninhalte zurückbehalten. Soviel wie möglich Flüssigkeit vom Abstrichstäbchen zurückbehalten. Anmerkung: Falls ein nicht ausreichendes Probenvolumen erhalten wird, wenn die Flüssigkeit vom Abstrichstäbchen herausgedrückt wird, können weitere 1 oder 2 Tropfen von Reagenz 2 zum Extraktionsröhrchen gegeben werden. Gut mit dem Abstrichstäbchen mischen und Schritt 8 wiederholen.
9. Zugabe von 1 Tropfen von Reagenz 3 zum Extrakt und entweder durch Verwirbeln oder Schütteln des Röhrchens gründlich mischen. Nicht länger als 5 Minuten stehen lassen.
10. Mit Hilfe einer sauberen Transferpipette 1 Tropfen (0,05 ml) Lösung direkt in die Mitte der Oberfläche der entsprechenden Testvorrichtung geben. Nicht die ganze Oberfläche der Testvorrichtung bedecken.
11. 10 Minuten warten.
12. Testoberfläche mit einem festen Spritzer von Reagenz 4-Waschlösung kräftig abwaschen und darauf achten, die Kapazität des saugfähigen Materials, das die Vorrichtung umgibt, nicht zu erschöpfen. Ein kräftiges Waschen, das 3 bis 4 Sekunden dauert, ist sehr wichtig. Anmerkung: Ein kräftiges Waschen ist sehr wichtig, um ein vollständiges und gründliches Abspülen der Testoberfläche vor dem nächsten Verfahrensschritt sicherzustellen. Bei einem nicht ausreichenden Waschen der Testoberfläche können Zelltrümmer zurückbleiben, was zu einem schwachen Hof um den Kontrollpunkt herum führen kann. Obwohl dieser Hofeffekt nicht als ein positives Signal aufgrund der nicht-vorhanden Farbabstufungen innerhalb der Hoffläche gedeutet werden würde, wird durch kräftiges Waschen eine saubere Testoberfläche erhalten.
13. Es ist zu kontrollieren, dass die Lösch-Vorrichtung in Position 1 ist. Schließen der Testvorrichtung erfolgt durch Zusammendrücken der Seiten. 10 Sekunden geschlossen lassen, um restliche Feuchtigkeit von der Oberfläche zu entfernen. Anmerkung: Löschen mit einer sauberen Oberfläche bei jedem neuen Löschen ist erforderlich. Löscher sollte in Position I sein, wenn zum erstenmal gelöscht wird. Falls er in Position 2 ist, für einen zweiten Löschvorgang in Position I verschieben. Wiederholtes Löschen in der gleichen Position kann die Testergebnisse beeinträchtigen.
14. Öffnen des Deckels und 1 Tropfen von Reagenz 5 direkt in die Mitte der Testoberfläche der Testvorrichtung geben und 10 Minuten stehen lassen. Anmerkung: Falls der erste Tropfen nicht direkt in die Mitte der Testvorrichtung gegeben wurde, so ist der Tropfen von Reagenz 5 direkt auf den Bereich des ersten Tropfens zu geben.
15. Wiederholung des 12. Schrittes, kräftiges Waschen der Testoberfläche mit einem festen Spritzer Reagenz 4-Waschlösung. Siehe Anmerkung von Schritt 12.
16. Den Löscher im Deckel der Testvorrichtung in Position 2 schieben. Schließen der Testvorrichtung durch Zusammendrücken der Seiten. 10 Sekunden geschlossen lassen, um restliche Feuchtigkeit von der Oberfläche zu entfernen. Öffnen des Deckels und die Testoberfläche auf eine Farbänderung prüfen.

Auswertung der Testergebnisse
Nach Vollendung eines jeden Tests, sollte die Testoberfläche in hellem Licht geprüft werden. Das Licht muss von der Testoberfläche reflektiert werden, um die Testergebnisse zu beobachten.
Ein interne Verfahrenskontrolle ist bei jeder Testoberfläche vorhanden. Sie erscheint als ein kleiner blau/purpurfarbener Fleck in der Mitte der Testoberfläche nach Vollendung eines jeden Tests. Ein negatives Testergebnis zeigt nur die interne Verfahrenskontrolle. Ein positives Testergebnis zeigt die interne Kontrolle innerhalb des Reaktionshofes an. Bei sehr stark positiven Ergebnissen kann die interne Kontrolle innerhalb des Reaktionshofes weniger ausgeprägt sein.
Positive oder schwach positive Ergebnisse:
Voller blau/purpurfarbener Reaktionshof beliebiger Intensität erscheint in der Mitte der Testoberfläche.
Negatives Ergebnis
Bei einem negativen Ergebnis sollte kein volle blau/purpurfarbene Farbe über die gesamte Testoberfläche zu beobachten sein, sondern nur ein kleiner Verfahrenskontrollfleck. Ein ungültiges Ergebnis kommt vor, wenn kein Verfahrenskontrollfleck beobachtet wird. Das Verfahren ist unter sorgfältigem Befolgen der Anleitungen zu wiederholen.
Die reagierte Testoberfläche und die mit einer positiven Reaktion einhergehende Farbänderung wird sich mit der Zeit nicht verschlechtern. Deshalb kann die Testvorrichtung als eine dauerhafte Aufzeichnung betrachtet werden. Falls eine Testvorrichtung als Referenz aufbewahrt werden soll, so sollte das Lösch-Material im Deckel entfernt und in einem Behälter für biogefährliche Stoffe beseitigt werden. Die Vorrichtung sollte zum Aufbewahren geschlossen sein.
Andere Kits, die mit dem optischen Assay-System verglichen wurden, waren ein DNA-Sondenverfahren, ein Membran-EIA-Verfahren und ein Latex-Agglutinierungsverfahren. Alle Tests wurden gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt.
Das OIA-Verfahren ist 10 und 1000-mal empfindlicher auf der Basis der analytischen Empfindlichkeit als irgendein im Handel erhältlicher GBS-Assay.

Claims

Verfahren zum Extrahieren eines Antigens aus einem Mikroorganismus, der in einer Probe enthalten ist, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kontaktieren der Probe mit Hypochlorit für einen ausreichenden Zeitraum, um das Antigen zu extrahieren, wobei das Hypochlorit als ein festes Hypochloritsalz oder ein ungepuffertes wässriges Hypochlorit-Reagenz bereitgestellt wird; und (b) anschließend Neutralisieren der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, außerdem umfassend das Kontaktieren der Probe mit Natriumnitrit vor Schritt (b).
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Zeitraum in Schitt (a) ausreichend ist, um Schleim in der Probe aufzulösen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Hypochlorit bei einer Konzentration von zwischen 0,1 % und 10% vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Probe gleichzeitig mit Hypochlorit und Natriumnitrit kontaktiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei, anschließend an Schritt (a) und vor Schritt (b), die Probe mit salpetriger Säure erzeugendem/n Reagenz(ien) für einen ausreichenden Zeitraum kontaktiert wird, um die Exposition des Antigens zu erhö hen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das/die salpetrige Säure erzeugende(n) Reagenzien) Essigsäure umfassten.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Natriumnitrit bei einer Konzentration von 0,5 M bis 2,5 M vorhanden ist und die Essigsäure bei einer Konzentration von 0,25 M bis 2 M vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Probe mit Hypochlorit in Gegenwart eines Komplexbildners und eines Disulfidbrücken-Reduktionsmittels kontaktiert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Komplexbildner EDTA oder EGTA ist, der bei einer Konzentration von 0,1 mM bis 100 mM vorhanden ist, und das Disulfidbrücken-Reduktionsmittel Dithiothreitol ist, das bei einer Konzentration von 0,1 mM bis 100 mM vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Neutralisieren mit einem Puffer vorgenommen wird, umfassend MOPSO, bei einer Konzentration von 1 bis 2,5 M bei einem pH von 7.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Zeitraum bei Schritt (a) 2 Minuten bis 30 Minuten beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Organismus von der Gattung Streptococcus ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Organismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gruppe A Streptococcus, Gruppe B Streptococcus, Gruppe G Streptococcus und Gruppe F Streptococcus.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Kohlehydraten, Proteinen, Lipoproteinen, Lipopolysacchariden, Polysacchariden, Nukleinsäuren, Kohlehydraten, komplexiert mit Proteinen, Lipiden, DNA und RNA.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, außerdem umfassend das Nachweisen eines extrahierten Antigens, welches Nachweisen die Schritte des Kontaktierens der Probe mit einer Testoberfläche, die das Antigen spezifisch bindet, und des Nachweisens der Bindung des Antigens durch eine geeignete analytische Methode umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die analytische Methode ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ellipsometrie, vergleichender Ellipsometrie, Dünnfilm-Interferenzeffekten, Oberflächenplasmonresonanz, Totalreflexion, Spektrophotometrie, Reflektometrie, Interferometrie, abgeschwächter Totalreflexion, piezoelektrischen Sensoren, frustrierter Totalreflexion, Unterschieden bei der Rotation von polarisiertem Licht, Unterschieden bei der Intensität von polarisiertem Licht, Wellenleiter-Sensoren, Atomkraftmikroskopie, Rastertunnelmikroskopie und Immunoassay.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Probe mit einer Sekundärmarkierung oder signalerzeugenden Komponente im Anschluß an den Neutralisationsschritt kontaktiert wird.
Reagenzsatz, geeignet zum Extrahieren eines Antigens aus einem Mikroorganismus, der in einer Probe enthalten ist, gemäß der Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 15, umfassend Extraktionsröhre(n), die getrocknetes Natriumnitrit, eine Aliquote einer Hypochloritlösung oder eines festen Hypochloritsalzes, eine Aliquote eines Neutralisationspuffers, eine Aliquote von Essigsäure und eine Aliquote von EDTA und Dithiothreitol umfassten.
Reagenzsatz nach Anspruch 19, geeignet zum Nachweisen eines Antigens, das aus einem Mikroorganismus extrahiert ist, der in einer Probe enthalten ist, außer dem enthaltend eine Aliquote eines Präzipitationssubtrats, eine Aliquote einer Sekundärmarkierung und eine Aliquote einer Waschlösung, Probentransfer-Pipetten und eine Testoberfläche.