DE69628554T2

DE69628554T2 - Chlamydia-pneumoniae-antigen, verfahren zu seiner herstellung, verfahren zur testung von anti-chlamydia-pneumoniae-antikörper durch seine verwendung und reagenz zum testen von anti-chlamydia-pneumoniae-antikörper

Info

Publication number: DE69628554T2
Application number: DE69628554T
Authority: DE
Inventors: Toshihide Morikawa; Kiyotaka Hitachi-shi KAWAGOE; Hiroshi Tsukuba-shi IZUTSU; Akifumi Hitachi-shi IGUCHI; Mitsuo Mito-shi YAMAKI
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co ltd
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2016-03-29
Also published as: EP0818681A1; ES2194979T3; EP0818681A4; CN1184532A; EP0818681B1; AU697218B2; CN1130565C; DE69628554D1; WO1996030763A1; AU5121596A; US6146839A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Chlamydia pneumoniae-Antigene, die verwendbar sind für die Diagnose von Chlamydia pneumoniae-Infektionen, Verfahren zur Herstellung der Antigene und Verfahren und Reagenzien zur Messung von Chlamydia pneumoniae-Antikörpern unter Verwendung der Antigene.
Chlamydia sind obligat intrazelluläre Parasiten, die nur in Wirtszellen überlebensfähig sind. Ihr Entwicklungszyklus ist einzigartig und das Elementarkörperchen (im Folgenden als Ek bezeichnet) von Chlamydia, welches sich morphologisch außerhalb der Zelle befindet, wird in die Zelle aufgenommen und bildet ein Vakuolen-Einschlußkörperchen, welches dann in ein Retikularkörperchen (im Folgenden als Rk bezeichnet) umgewandet wird. Rk besitzen die Fähigkeit sich zu vermehren aber ihnen fehlen infektiöse Eigenschaften und ein Rk, das sich in der Zelle vermehrt hat, wird schnell in ein Ek umgewandelt, welches durch Aufbrechen des Einschlußkörperchens und Ruptur der Zellwand aus der Zelle gelangt. Den Ek fehlt die Fähigkeit sich zu vermehren aber sie besitzen infektiöse Eigenschaften. Derzeit sind vier Chlamydia-Arten bekannt (C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae und C. pecorum), von denen Chlamydia pneumoniae bekanntermaßen Menschen über Luftinfektion infiziert.
In den letzten Jahren hat Chlamydia pneumoniae großes Aufsehen erregt als Verursacher von respiratorischen Infektionen wie Lungenentzündung, Bronchitis, akuter Entzündung der oberen Luftwege und dergleichen. Gemäß der serologischen, epidemiologischen Studie, die in verschiedenen Teilen der Erde durchgeführt wurde, liegt die Verbreitung des Antikörpers gegen Chlamydia pneumoniae in Europa und in den USA bei 40–50%, bei 60% oder mehr in Taiwan, Panama, Iran und dergleichen und bei 50–60% in Japan. Da die tatsächlichen Umstände von Chlamydia pneumoniae-Infektionen offensichtlicher werden, steigt das Interesse an diesen Infektionen.
Das sensitivste serologische Verfahren zum Nachweis von Chlamydia-Infektionen ist der indirekte Mikroimmunfluoreszenztest (Mikro-IF-Test) von Wang und Grayston („Trachoma and related disorders caused by Chlamydial agents", Excerpta Medica, Amsterdam, 273–288, 1971). Da das Testverfahren des Mikro-IF-Testes jedoch kompliziert ist, wurde es nicht als diagnostisches Verfahren in den klinischen Labors eingesetzt. Außerdem benötig man für den Standard Mikro-IF-Test gereinigte Chlamydia-Ek. Für den Mikro-IF-Test ist auch die morphologische und strukturelle Intaktheit des zu identifizierenden Mikroorganismus nötig, um die immunologischen Fluoreszenzreaktionen durchführen zu können, Daher können keine morphologisch oder strukturell veränderte Ek oder zerstörte Ek verwendet werden. Da Ek jedoch infektiöse Eigenschaften und Toxizität besitzen benötigt man für die Verwendung von Ek als Antigenmaterial eine spezielle Einrichtung, die Infektionsabwehr gewährleistet. Daher werden gewöhnlich mit einem Fixierungsmittel wie Formaldehyd, Aceton oder dergleichen behandelte Ek als Antigen verwendet.
Andererseits hat der kürzliche entwickelte Enzym-gebundene Immunadsorptionstest („enzyme-linked immunoadsorbent assay", ELISA) den Vorteil, dass man mit ihm einfach und schnell eine große Anzahl von Proben bearbeiten kann. Es gibt Berichte über die Verfahren zur Messung von anti-Chlamydia-Antikörper unter Verwendung des ELISA und die meisten der Verfahren verwenden intakte Ek von Chlamydia als Antigenmaterial. Deshalb ist die Anwesenheit von unspezifischen Reaktionen bekannt, die aus der Verwendung von mangelhaft gereinigtem Antigen resultieren. Dies wird zum Großteil verursacht durch die komplexe Antigenität von Chlamydia. Es wurde angenommen, dass gattungsspezifische Antigene, artspezifische Antigene und biobar-spezifische Antigene die Antigenität von Chlamydia ausmachen.
Als repräsentatives gattungsspezifisches Antigen von Chlamydia ist Lipopolysaccharid (im Folgenden als LPS bezeichnet) bekannt, das ein gemeinsames Antigen mit dem mutierten Re-LPS einiger Enterobakterien hat.
Außerdem ist als repräsentätives, artspezifisches oder biobar-spezifisches Antigen das Hauptprotein der äußeren Membran von Chlamydia („Major Outer Membrane Protein", im Folgenden als MOMP bezeichnet) bekannt, das schätzungsweise 60% der Proteine der äußeren Membran von Chlamydia ausmacht. Aber es ist auch bekannt, dass MOMP gattungsspezifische Antigenität besitzt (Collett et al., Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol., Washington D. C., Abstract No. D-159, 1986).
Die anderen Antigene der äußeren Membran von Chlamydia neben MOMP sind hauptsächlich gattungsspezifische Antigene, aber in manchen ist auch artspezifische Antigenität vorhanden. Zum Beispiel berichten Iijima et al., basierend auf den Ergebnissen eines Immunoblot-Testes unter Verwendung von Ek von Chlamydia pneumoniae, dass das MOMP von Chlamydia pneumoniae mit einem Molekulargewicht (MW) von 40 KDa gattungsspezifisch ist und die Proteine mit Molekulargewichten von 43 KDa, 46 KDa und 53 KDa artspezifisch sind und dass weiterhin die Proteine mit einem Molekulargewicht von 98 KDa wahrscheinlich artspezifisch sind (Iijima, Y. et al., J. Clin. Microbiol, 583–588, 1994).
Wie vorstehend beschrieben, ist die Antigenität von Chlamydia sehr kompliziert und so zeigen Antigene, die in einer Gattung von Chlamydia häufig vorkommen, innerhalb der verschiedenen Arten signifikant verschiedene Antigenität. Daher können die Verfahren zum Messen von Anti-Chlamydia trachomatis-Antikörpern, obwohl bekannt (Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung No. Hei 4-297871), nicht einfach zur Messung von Chlamydia pneumoniae in einer artspezifischen Weise verwendet werden, da die Antigenitäten von Chlamydia pneumoniae und Chlamydia trachomatis ziemlich verschieden sind. Außerdem zeigen Anti-Chlamydia-Antikörper in mit Chlamydia pneumoniae infizierten Personen eine der komplexen Antigenität von Chlamydia entsprechende Vielfalt. Obwohl das Muster in infizierten Personen variiert, könnte die Verwendung der Ek selbst als Antigen unspezifische Reaktionen bewirken und daher ist eine spezifische und hochgenaue Messung unter Verwendung derselben schwierig.
EP-A-0 456 524 offenbart Chlamydia trachomatis-Antigene (12,5-, 31-, 39,5-, 42-, 49,5-, 59,5-, 75-, 102- und 155 KDa). Gemäß dem beschriebenen Verfahren werden die Antigene aus einer nicht-solubilisierten Fraktion erhalten (Seite 5, Zeilen 27–38). Die Antigene werden schließlich mit SDS gelöst (Seite 5, Zeilen 39–45). Dadurch werden die Antigene denaturiert und verändern ihre Antigenität. Wenn derartige SDS-behandelte Proteine verwendet werden, kann das Problem auftauchen, dass einige der Proben, die negativ für Chlamydia pneumoniae sind, positiv werden.
Das erste Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Chlamydia pneumoniae-Antigen bereitzustellen, das eine hohe Artspezifität, wenige klinisch problematische falsch-negative Ergebnisse, wenige falsch-positive Ergebnisse und hervorragende Reproduzierbarkeit aufweist.
Ein zweites Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines Chlamydia pneumoniae-Antigens bereitzustellen, das eine hohe Artspezifität, wenige klinisch problematische falsch-negative Ergebnisse und wenige falsch-positive Ergebnisse gewährleistet.
Ein drittes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Messen von anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpern bereitzustellen, welches eine hohe Artspezifität, sehr wenige klinisch problematische falsch-negative Ergebnisse und wenige falsch-positive Ergebnisse bereitstellt, einfache Messung und einfache Probensammlung erlaubt, das klinische Bild des Probendonors reflektiert und hochsensitiv ist.
Ein viertes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Reagenz zum Messen von Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpern bereitzustellen, welches eine hohe Artspezifität, sehr wenige klinisch problematische falsch-negative Ergebnisse und wenige falsch-positive Ergebnisse bereitstellt, einfache Messung erlaubt und hochsensitiv ist.
Die Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind wie folgt:

(1) Ein Chlamydia pneumoniae-Antigen, das keine Kreuzreaktionen mit Anti-Chlamydia trachomatis-Antikörpern oder mit Anti-Chlamydia psittaci-Antikörper verursacht und im Wesentlichen aus einer Proteinfraktion besteht, die aus der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae gewonnen wird, wobei die Proteinfraktion mindestens eines der drei Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 43 KDa, etwa 46 KDa und etwa 53 KDa enthält, wobei das Antigen erhältlich ist durch: Solubilisieren des Cytosols und der cytoplasmatischen Membran eines Chlamydia pneumoniae-Elementarkörperchens mit einem ionischen Detergens und dann Entfernen des solubilisierten Anteils, um den Rückstand zu erhalten, der das Antigen enthält,
(2) Das Chlamydia pneumoniae-Antigen nach (1), das zusätzlich ein Protein von etwa 98 KDa enthält.
(3) Das Chlamydia pneumoniae-Antigen nach einem der Punkte (1) bis (2), wobei die von der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae gewonnene Proteinfraktion die drei Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 43 KDa, etwa 46 KDa und etwa 53 KDa enthält.
(4) Ein Verfahren zum Herstellen des Chlamydia pneumoniae-Antigens nach einem der Punkte (1) bis (3), welches umfasst: Solubilisieren des Cytosols und der cytoplasmatischen Membran von Chlamydia pneumoniae-Elementarkörperchen mit einem ionischen Detergens und dann Entfernen des solubilisierten Anteils, um den Rückstand zu erhalten, der das Antigen enthält.
(5) Ein Verfahren zum Messen eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, welches umfasst: Immobilisieren des Chlamydia pneumoniae-Antigens nach einem der Punkte (1) bis (3) auf einem festen Träger, Inkontaktbringen des Trägers mit einer zu messenden Probe, Inkontaktbringen des resultierenden Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem markierten Antikörper, der gegen den Antikörper in der Probe gerichtet ist, Messen der Menge der Markierung des gebundenen oder ungebundenen markierten Antikörpers und Bestimmen des Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers in der Probe aus dem gemessenen Wert.
(6) Das Verfahren nach (5) zum Messen eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin die zu messenden Proben menschliche Tränen, menschliche Rachenabstriche oder menschliche Seren sind.
(7) Das Verfahren nach (5) oder (6) zum Messen eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der markierte Antikörper ein markierter Antikörper gegen menschliches IgG, ein markierter Antikörper gegen menschliches IgA oder ein markierter Antikörper gegen menschliches IgM ist.
(8) Das Verfahren nach einem der Punkte (5) bis (7) zum Messen eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der markierte Antikörper ein Enzym-markierter Antikörper ist.
(9) Ein Reagenz zum Messen eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, weiches das Chlamydia pneumoniae-Antigen nach einem der Punkte (1) bis (3) umfasst.
(10) Das Reagenz nach (9} zum Messen eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, wobei das Reagenz ein auf einem festen Träger immobilisiertes Antigen und einen markierten Antikörper umfasst, der mit dem zu messenden Antikörper reagiert.
(11) Das Reagenz nach (10) zum Messen eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der feste Träger Polystyrolperlen oder eine Polystyrol-Mikrotiterplatte ist.
(12) Das Reagenz nach (10) oder (11) zum Messen eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der markierte Antikörper ein Enzym-markierter Antikörper ist.
(13) Das Reagenz nach (12) zum Messen eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der Enzym-markierte Antikörper ein Alkalische Phosphatase-markierter Antikörper oder ein Meerrettichperoxidase-markierter Antikörper ist.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im Detail erklärt.
Die äußere Membran von Chlamydia pneumoniae ist die Zellwand von Chlamydia pneumoniae ohne das Cytoplasma und die cytoplasmatische Membran davon und besteht hauptsächlich aus Proteinen und Lipiden.
Das erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigen umfasst Proteine, die aus der vorstehend erwähnten äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae gewonnen wurden.
Von den Chlamydia pneumoniae-Antigenen werden die bevorzugt, welche keine wesentlichen unspezifischen Reaktionen mit Chlamydia trachomatis oder Chlamydia psittaci hervorrufen, da diese sehr wenige klinisch problematische falsch-negative oder falsch-positive Ergebnisse liefern. Die hier gebrauchte Formulierung „keine wesentlichen unspezifischen Reaktionen ... hervorrufen" bedeutet, dass es keine oder fast keine unspezifischen Reaktionen gibt.
Als aus der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae gewonnene Proteine gibt es zum Beispiel die Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 30 KDa, etwa 37 KDa, etwa 40 KDa, etwa 43 KDa, etwa 46 KDa, etwa 53 KDa, etwa 60 KDa und etwa 98 KDa.
Als die erfindungsgemäßen Chlamydia pneumoniae-Antigene werden die Antigene verwendet, die mindestens eines der drei Proteine von etwa 43 KDa, etwa 46 KDa und etwa 53 KDa Molekulargewicht, die artspezifisch für Chlamydia pneumoniae sind, enthalten.
Als die erfindungsgemäßen Chlamydia pneumoniae-Antigene werden von den aus der vorstehend erwähnten äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae gewonnenen Proteine die Antigene bevorzugt, welche die drei Proteine von etwa 43 KDa, etwa 46 KDa und etwa 53 KDa Molekulargewicht enthalten, da sie eine hervorragende Fähigkeit besitzen, mit der Vielfalt von Chlamydia-Antikörpern fertigzuwerden, die in Personen, die mit Chlamydia pneumoniae infiziert sind, vorkommen.
Weiterhin werden als erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigene von den aus der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae gewonnenen Proteinen solche Antigene bevorzugt, die ein Protein von etwa 98 KDa Molekulargewicht zusammen mit mindestens einem der drei Proteine von etwa 43 KDa, etwa 46 KDa und etwa 53 KDa enthalten, da sie eine noch hervorragendere Fähigkeit besitzen, mit der vorstehend erwähnten Vielfalt fertigzuwerden.
Nun wird nachstehend das Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemäßen Chlamydia pneumoniae-Antigens erklärt.
Das erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigen kann erhalten werden aus der Zellmasse von Chlamydia pneumoniae und vorzugsweise werden Elementarkörperchen aus der Chlamydia pneumoniae-Zellmasse als Rohmaterial verwendet, da sie Antigene mit günstigen Eigenschaften bereitstellen können.
Als ein Verfahren zum Erhalten des erfindungsgemäßen Chlamydia pneumoniae-Antigens aus Chlamydia pneumoniae-Elementarkörperchen, ist zum Beispiel ein Verfahren beschrieben, worin das Cytoplasma und die cytoplasmatische Membran von Chlamydia pneumoniae-Elementarkörperchen unter Verwendung eines ionisierenden Detergens solubilisiert werden und dann der solubilisierte Anteil entfernt wird, um den Rückstand zu erhalten. Das Verfahren ist bevorzugt, da es die einfache Herstellung des Antigens erlaubt und das erhaltene Antigen eine günstige Antigenität zeigt. Als das vorstehend erwähnte ionische Detergens wird das anionische Sarcosin-Detergens bevorzugt, da das erhaltene Antigen eine günstige Antigenität zeigt und Sarcosyl (Sarcosinat-N-Lauroylnatrium) ist besonders bevorzugt. Weiterhin wird, wenn das Cytoplasma und die cytoplasmatische Membran von Chlamydia pneumoniae-Elementarkörperchen mit einem ionischen Detergens solubilisiert werden, bevorzugt, dass eine Nuclease wie Desoxyribonuclease (DNase) und Ribonuclease (RNase) umgesetzt wird, um Nucleinsäuren zu solubilisieren und zu entfernen.
Der durch Solubilisieren des Cytoplasmas und der cytoplasmatischen Membran von Chlamydia pneumoniae-Elementarkörperchen mit einem ionischen Detergens und anschließendem Entfernen des solibilisierten Anteils erhaltene Rückstand besteht hauptsächlich aus der Zellwand von Chlamydia pneumoniae-Elementarkörperchen ohne das Cytoplasma und die cytoplasmatische Membran, d. h. aus der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae. Die äußere Membran von Chlamydia pneumoniae enthält die vorstehend erwähnten Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 30 KDa, etwa 37 KDa, etwa 40 KDa, etwa 43 KDa, etwa 46 KDa, etwa 53 KDa, etwa 60 KDa und etwa 98 KDa und Spuren anderer Proteine Als das erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigen kann ein Teil dieser äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae, d. h. ein Komplex der äußeren Chlamydia Membran (im Folgenden bezeichnet als COMC, „Chlamydia outer membrane complex") verwendet werden.
Weiterhin kann als erfindungsgemäßes Chlamydia pneumoniae-Antigen das Reaktionsprodukt, das erhalten wird durch Umsetzen des Rückstands mit einem solubilisierenden Mittel, verwendet werden. Als ein derartiges solubilisierendes Mittel sei zum Beispiel Natriumdodecylsulfat (SDS) erwähnt. Das dadurch erhaltene Reaktionsprodukt enthält die solubilisierten Produkte oder die zersetzten Produkte des vorstehend erwähnten Rückstands.
Diese Chlamydia pneumoniae-Antigene besitzen eine hohe Artspezifität und liefern sehr wenige klinisch problematische falsch-negative und wenige falsch-positive Ergebnisse. Von diesen Chlamydia pneumoniae-Antigenen wird der vorstehend erwähnte Rückstand selbst, der hauptsächlich aus der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae besteht, vorzugsweise verwendet, das er sich in Bezug auf die vorstehenden Effekte und die Reproduzierbarkeit auszeichnet.
Das Verfahren zum Messen des erfindungsgemäßen Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers ist nicht beschränkt, solange das vorstehend erwähnte Chlamydia pneumoniae-Antigen als Teil- oder Gesamtantigen verwendet wird.
Als Verfahren zum Messen des Antikörpers werden als bevorzugte Verfahren zum Beispiel der Sandwich-Enzymimmuntest, bei dem verschiedene markierte Antikörper eingesetzt werden, das Latex-Agglutinationsverfahren, bei dem Latex-Trägerpartikel eingesetzt werden, der immunturbidometrische Test und dergleichen erwähnt.
Der Sandwich-Typimmuntest ist nachstehend detailliert beschrieben.
Als ein Verfahren zum Messen von Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpern durch den Sandwich-Typ-Immuntest unter Verwendung des erfindungsgemäßen Chlamydia pneumoniae-Antigens kann ein Verfahren verwendet werden, worin das vorstehende Antigen physikalisch oder chemisch an einem festen Träger immobilisiert ist, um das gebundene Antigen herzustellen. Dieses immobilisierte Antigen wird zur Inkubation für eine bestimmte Dauer mit der Probe in Kontakt gebracht, wodurch erreicht wird, dass der Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörper, sofern in der Probe vorhanden, an das immobilisierte Antigen bindet, um auf dem festen Träger einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Dieser wird wie gewünscht gewaschen wird und dann wird der markierte Antikörper gegen den Antikörper in der Probe damit in Kontakt gebracht, wobei die Probe und der markierte Antikörper gegebenenfalls gleichzeitig miteinander in Kontakt gebracht werden.
Wenn der vorstehend erwähnte Antigen-Antikörper-Komplex gebildet wurde, ist er weiter an den markierten Antikörper gebunden um so an den festen Träger immobilisiert zu sein. Anschließend wird die Menge der Markierung am markierten Antikörper, der am festen Träger gebunden oder ungebunden ist, bestimmt durch ein Verfahren, das von der An der Markierung abhängt und aus dem bestimmten Wert kann das Vorhandensein oder die Menge des Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers in der Probe bestimmt werden.
Als fester Träger können zum Beispiel Plastikmaterialien, wie Polystyrol, Vinylchlorid etc., faserige Materialien, wie Nitrocellulose, Nylon etc., anorganische Materialien, wie Glas, Silicagel etc., verwendet werden, die in jeder Form einschließlich Mikrotiterplatten, Perlen, magnetischen Perlen, einer Papierscheibe, Fäden etc., vorliegen können. Polystyrolperlen oder eine Polystyrol-Mikrotiterplatte werden bevorzugt, da sie einfach zu handhaben sind und die Polystyrol-Mikrotiterplatte ist am meisten bevorzugt, da sie besonders einfach zu handhaben ist.
Weiterhin werden als Verfahren zum Immobilisieren des Antigens auf dem vorstehend erwähnten festen Träger Verfahren auf der Basis physikalischer Adsorption, das kovalente Bindungsverfahren, bei dem BrCN₂ eingesetzt wird, etc. verwendet.
Als Proben sind zum Beispiel verschiedene menschliche Körperflüssigkeits-bestandteile zu erwähnen und menschliche Tränen, menschliche Rachenabstriche oder menschliche Seren werden bevorzugt, da diese das klinische Bild des Probendonors reflektieren und im Allgemeinen werden menschliche Seren verwendet.
Als markierte Antikörper sind die markierten Antikörper gegen die Antikörper (zum Beispiel menschliche Antikörper) in der Probe zu erwähnen, die mit verschiedenen Markierungen markiert wurden. Als zu markierende Antikörper sind ein Antikörper gegen menschliches IgG, ein Antikörper gegen menschliches IgA, ein Antikörper gegen menschliches IgM oder teilweise zersetzte Produkte davon, wie F(ab')2, Fab etc., und dergleichen zu erwähnen, die in geeigneter Weise entsprechend der Art des zu messenden Antikörpers verwendet werden.
Es wurde vermutet, dass nach der Oberflächeninfektion von Chlamydia pneumoniae innerhalb von ein bis zwei Wochen der IgM-Antikörper erscheint und der IgG-Antikörper auch relativ früh erscheint und mit der Zeit verschwindet aber für einen langen Zeitabschnitt vorhanden ist. Andererseits wurde vermutet, dass der sekretorische IgA-Antikörper eine Rolle spielt im Rahmen der zellulären Immunität und beim Schutz vor erneuter Infektion.
Daher wird bei dem Schritt in dem der markierte Antikörper mit dem Antikörper in der vorstehend erwähnten Probe in Kontakt tritt bevorzugt, dass die durch Markierung verschiedener Arten von Antikörpern erhaltenen markierten Antikörper zum Messen getrennt umgesetzt werden. Als durch Markierung verschiedener Arten von Antikörpern erhaltene markierte Antikörper sind ein markierter Antikörper gegen menschliches IgG, ein markierter Antikörper gegen menschliches IgA, ein markierter Antikörper gegen menschliches IgM und dergleichen zu erwähnen.
Als Markierungen, die für die markierten Antikörper verwendet werden, können zum Beispiel Enzyme, Radioisotope, Fluoreszenzverbindungen, Chemilumineszenzverbindungen und dergleichen verwendet werden und unter Berücksichtigung von Sensitivität, Sicherheit, Einfachheit etc. werden vorzugsweise Enzyme verwendet. Als Enzyme sind zum Beispiel Malat-Dehydrogenase (Enzym Nummer 1.1.137), Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (Enzym Nummer 1.1.1.49), Glucoseoxidase (Enzym Nummer 1.1.3.4), Meerrettichperoxidase (Enzym Nummer 1.11.1.7) Acetylcholinesterase (Enzym Nummer 3.1.1.7), Alkalische Phosphatase (Enzym Nummer 3.1.3.1), Glucoamylase (Enzym Nummer 3.2.1.3) Lysozym (Enzym Nummer 3.2.1.17), β-Galactosidase (Enzym Nummer 3.2.1.23) und dergleichen zu erwähnen.
Als Enzym-markierte Antikörper werden vorzugsweise Alkalische Phosphatasemarkierte Antikörper oder Meerrettichperoxidase-markierte Antikörper eingesetzt, da diese einfache und sensitive Tests erlauben und diese Enzym-markierten Antikörper kommerziell erhältlich sind.
Wie aus den nachstehend beschriebenen Beispielen ersichtlich ist, korreliert das erfindungsgemäße Verfahren zum Messen von Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpern gut mit den Ergebnissen, die durch den indirekten Mikro-IF-Test, bei dem herkömmliche Chlamydia-Ek eingesetzt werden, erhalten werden, hat eine hohe Artspezifität und liefert sehr wenige klinisch problematische falsch-negative und wenige falsch-positive Ergebnisse.
Das erfindungsgemäße Reagenz zum Messen von Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpern ist nicht beschränkt, solange das vorstehend erwähnte Chlamydia pneumoniae-Antigen als Teil- oder Gesamtantigen verwendet wird.
Als Reagenz zum Messen des Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, das im vorstehenden Sandwich-Immuntest verwendet wird, ist, obwohl die darin enthaltenen Elemente in Abhängigkeit des Messverfahrens unterschiedlich sind, zum Beispiel ein Reagenz zu erwähnen, das getrennt das immobilisierte Antigen, immobilisiert am festen Träger, und den markierten Antikörper, der mit dem zu messenden Antikörper reagiert, enthält.
Als feste Träger und markierte Antikörper gibt es die vorstehend erwähnten.
Der markierte Antikörper kann suspendiert in einer Pufferlösung und dergleichen aufbewahrt werden.
Als erfindungsgemäßes Reagenz wird bevorzugt, dass ein markierter Antikörper gegen menschliches IgG, ein markierter Antikörper gegen menschliches IgA und ein markierter Antikörper gegen menschliches IgM getrennt als markierter Antikörper für eine Probe hergestellt werden, da dies das klinische Bild des Probendonors reflektieren kann.
Dem erfindungsgemäßen Reagenz können wunschgemäß andere Komponenten zugegeben werden. Im Falle eines im Sandwich-Immuntest verwendeten Reagenzes zum Beispiel beinhalten andere Komponenten eine Negativkontrolle, eine Positivkontrolle, eine Waschlösung und ein Standardmaterial und, falls die Markierung ein Enzym ist, ein Reaktionssubstrat, eine Verdünnungslösung, eine Reaktionsstopplösung und dergleichen, die allein oder in Kombination verwendet werden können. Das Reagenz ist sehr nützlich für die Diagnose einer Chlamydia pneumoniae-Infektion.
Wie vorstehend beschrieben, umfasst das erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigen Proteine, die aus der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae gewonnen wurden, welche gewöhnlich relativ oder ziemlich viele Mengen von Chlamydia pneumoniaeunspezifischen Komponenten enthält. Gemäß der vorliegenden Erfindung können Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörper jedoch sogar unter Verwendung eines solchen Chlamydia pneumoniae-Antigens quantitativ bestimmt werden.
Daher wird angenommen, dass das erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigen keine wesentlichen unspezifischen Reaktionen mit Anti-Chlamydia trachomatis- und Anti- Chlamydia psittaci-Antikörpern hervorruft, hohe Artspezifität besitzt und dadurch zu sehr wenige klinisch problematische falsch-negative und wenige falsch-positive Ergebnisse liefert.
1 zeigt ein Muster einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Sarcosylunlöslichen Fraktion der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae, in dem die Pfeile Proteine mit einem Molekulargewicht von: 1: etwa 98 KDa, 2: etwa 60 KDa, 3: etwa 53 KDa, 4: etwa 46 KDa, 5: etwa 43 KDa, 6: etwa 40 KDa, 7: etwa 37 KDa und 8: etwa 30 KDa markieren.
2 ist eine graphische Darstellung, welche die Korrelation zwischen einem ELISA („enzyme linked immunoadsorbent assay") bei dem das erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigens verwendet wurde und einem Micro-IF-Test unter Verwendung von Chlamydia pneumoniae-Ek zeigt, worin die Ordinate die Absorption bei 405 nm im ELISA darstellt und die Abszisse den Serumverdünnungsfaktor (Titer) im Mikro-IF-Test.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele erklärt.
Beispiel
A) Reinigung von Chlamydia pneumoniae-Ek
Als Chlamydia wurde der Chlamydia pneumoniae-Stamm YK-41 (Kanamoto et al., KANSENSHOUGAKU ZASSI (Journal of Infectious Diseases) 66 (5), 637–641, 1992) verwendet.
Zu HL-Zellen, die zuvor mit dem YK-41-Stamm infiziert und 4 Tage kultiviert worden waren (in einer 6-well-Polystyrol-Gewebekulturplatte) wurde SPG-Lösung (eine wässrige Lösung aus 75 g Saccharose, 0,52 g Kalium-Monophosphat, 1,22 g Kalium-Diphosphat, 0,72 g Glutarsäure gelöst in einem Liter Wasser, pH 7,4 bis 7,6) in einer Menge von 1 ml/ Vertiefung gegeben. Unter Verwendung eines Silikon-Gummischabers wurden die HL-Zellen abgekratzt und die SPG-Lösung mit den HL-Zellen wurde erhalten.
Die gesammelte Lösung wurde 48-fach in SPG-Lösung verdünnt und in ein Polystyrol-Zentrifugenröhrchen gegeben, das dann in Intervallen von einer Sekunde 30 mal mit Ultraschall behandelt wurde. Das Zentrifugenröhrchen wurde bei 1500 g für drei Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde erhalten, um eine YK-41-Suspension herzustellen (10⁵ IFU/ml).
Nachdem andererseits 4 ml einer Suspension aus etwa 8 × 10⁴ HL-Zellen/ml, die in MEM-Medium mit 10% (v/v) fetalem Rinderserum (FBS) gewachsen waren, in eine 6-well-Kulturplatte gegeben wurden, wurde diese bei 36°C in einem 5% (v/v) CO₂-Inkubator kultiviert, um einen Monolayer der Zellen herzustellen. Zu diesem wurden 2 ml der vorstehenden Suspension des YK-41-Stammes (10⁵ IFU/ml) inokuliert und durch Zentrifugation adsorbiert (900 g, 60 min). Nach der Absorption wurde die inokulierte Lösung abgesaugt und es wurden 4 ml Eagle MEM-Medium mit 10% (v/v) FBS und Cycloheximid (1 μl/ml) zugegeben und der Ansatz wurde für vier Tage bei 36°C im 5% (v/v) CO₂-nkubator weiter kultiviert. Dann wurden die infizierten Zellen unter Verwendung eines Silikon-Gummischabers abgekratzt, um eine Suspension der infizierten Zellen zu erhalten. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein Deckgläschen von 13 mm Durchmesser in die 6-well-Kulturplatte gegeben und direkt vor dem Abkratzen der infizierten Zellen entfernt. Das Deckgläschen wurde unter Verwendung eines Cultureset^TM (Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan, N. J., USA) gefärbt, um die Infektionsrate zu bestätigen.
Nachdem die Zellen in der vorstehenden Suspension der infizierten Kultur im Homogenisator zertrümmert worden waren, wurde bei 20°C für 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten. Zwei Teile dieses Überstandes wurden auf zwei Teile 0,033 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,2 geschichtet, der 30% Urografin (Meglumin-Diatrizoat und Natrium-Trizoat) (w/v) enthielt und der auf einen Teil 0,033 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,2, der 50% (w/v) Saccharose enthielt, geschichtet worden war. Dann wurde bei 43.000 g bei 20°C für 60 Minuten zentrifugiert. Der somit erhaltene Niederschlag lieferte die rohen, gereinigten Ek.
Ein Teil der Suspension der vorstehenden rohen, gereinigten Ek wurde auf drei Teile 0,033 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,2, mit einem Gradienten von 35 bis 50 (w/v) Urografin geschichtet und der Ansatz wurde bei 43.000 g, bei 20°C für 60 Minuten zentrifugiert. Die trübe Schicht in der mittleren Phase nach Zentrifugation wurde gesammelt, um die gereinigten Ek zu erhalten.
B) Gewinnung der Sarcosin-unlöslichen Fraktion der äußeren Membran von Chlamydia
Die somit erhaltenen gereinigten Ek wurden in 0,01 M Natrium-Phosphatpuffer, pH 8,0, der 2% (w/v) Sarcosyl, 1,5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 0,14 M Salzlösung (Sarcosyl-Puffer) enthielt, suspendiert und bei 20 kHz für 60 Sekunden mit Ultraschall behandelt. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurde die Lösung bei 100.000 g bei 20°C für 60 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Niederschlag wieder in einer geringen Menge des vorstehenden Sarcosyl-Puffers suspendiert und bei 100.000 g bei 20°C für 60 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand wieder als die lösliche Fraktion erhalten. Der Niederschlag wurde zweimal mit PBS (pH 8,0) gewaschen, um überschüssiges Sarcosyl zu entfernen. Anschließend wurde der vorstehende Niederschlag in 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, der 10 mM MgCl₂ enthielt und worin DNase und RNase jeweils à 2,5 μg/ml gelöst waren, suspendiert, die Lösung wurde bei 37°C für 2 Stunden inkubiert und dann bei 100.000 g, bei 4°C für 60 Minuten zentrifugiert. Um DNase und RNase, die im Rückstand verbleiben können, zu entfernen, wurde der Rückstand zweimal mit PBS (pH 8,0) gewaschen, um den Rückstandsbestandteil (Sarcosyl-unlösliche Fraktion der äußeren Membran von Chlamydia) zu erhalten.
Der somit erhaltene Rückstandsbestandteil wurde einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zugeführt, um das Molekulargewicht jedes enthaltenen Proteins zu bestimmen.
Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde gemäß dem von Laemmli beschriebenen Verfahren (Nature 227, 680–685, 1970) in einem 4 bis 20% (w/v) Acrylamid-Gradientengel durchgeführt. Der verwendete Elektrophoresepuffer war 0,025 M Tris-Puffer, der 1% (w/w) SDS und 0,2 M Glyzin enthielt. Zu 60 μl des Rückstandsbestandteils (Proteinkonzentration 500 μg/ml) wurden 60 Probenbehandlungslösung (0,125 M Tris-Puffer, pH 6,8, mit 4% (w/v) SDS, 2% (v/v) Glycerin, 0,01% (w/v) BPB) und 12 μl 2-Mercaptoethanol als reduzierendes Mittel gegeben und die Lösung wurde bei 95°C für 5 Minuten gekocht. Von dieser Lösung wurden 10 μl auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 40 mA für etwa eine Stunde durchgeführt. Als Molekulargewichtsmarker wurde Kaleidoscope Prestain Standard (Biorad) verwendet und den gleichen Elektrophoresebedingungen wie vorstehend erwähnt unterworfen, um das Molekulargewicht von Proteinen in jeder Probe anhand ihrer Mobilität zu bestimmen.
Die Färbung wurde durchgeführt mit dem Silberfärbeverfahren unter Verwendung des Silver Staining Kit Wako (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.)
1 zeigt ein Muster einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. In 1 repräsentiert jeder Pfeil ein Protein mit einem Molekulargewicht von: 1: etwa 98 KDa, 2: etwa 60 KDa, 3: etwa 53 KDa, 4: etwa 46 KDa, S: etwa 43 KDa, 6: etwa 40 KDa, 7: etwa 37 KDa und 8: etwa 30 KDa.
C) Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers
Der vorstehend erhaltene Rückstandsbestandteil, der als Antigen verwendet wurde, wurde auf eine Proteinkonzentration von 5 μg/ml in Puffer für die Immobilisierung des Trägers (1 Liter enthält 2,93 g NaHCO₃ und 1,59 g Na₂Co₃) eingestellt und Aliquots à 100 μl wurden in jede Vertiefung einer 96-well-Polystyrol-Mikrotiterplatte gegeben und dann wurde die Platte bei 4°C über Nacht inkubiert. Dann wurde dreimal mit jeweils 300 μl PBS, pH 7,2, mit 0,05% (v/v) Tween 20 (nachstehend als 0,05% (v/v) Tween 20-PBS bezeichnet) gewaschen, um nicht-adsorbiertes Antigen zu entfernen. Dann wurden 250 μl Blockierungspuffer mit 5% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA, hergestellt von KPL, Puffer zum Blockieren und zur Probenverdünnung) in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde bei 37°C für eine Stunde inkubiert, um eine Platte mit immobilisiertem Antigen herzustellen. Die Platte wurde zweimal mit jeweils 250 μl 0,05% (v/v) Tween 20-PBS gewaschen. Nachdem 100 μl Serumprobe verdünnt im Puffer zum Blockieren und zur Probenverdünnung auf die vorstehende Platte mit immobilisiertem Antigen gegeben wurden, wurde die Platte bei 37°C für eine Stunde inkubiert und dann wurde dreimal mit jeweils 250 μl 0,05% (v/v) Tween-20-PBS gewaschen. Dann wurde der Antikörper gegen menschliches IgG, der mit Alkalischer Phosphatase markiert war (markierter Antikörper) auf 1 μg/ml in 0,05% (v/v) Tween 20-PBS verdünnt und hiervon wurden 100 μl in jede Vertiefung gegeben. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurde dreimal mit jeweils 250 μl 0,05% (v/v) Tween 20-PBS gewaschen. Dann wurden 100 μl einer Lösung von p-NPP (p-Nitrophenylphosphat), einem Substrat der Alkalischen Phosphatase, in Diethanolamin (Substrat für die Enzymreaktion, Konzentration 1 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde für zehn Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde dann durch Zugeben von 25 μl 3 N NaOH-Lösung (Reaktionsstopplösung) gestoppt und mit einem Lesegerät für Microtiterplatten (MTP-120, Corona Denki K. K.) wurde die Absorption (405 nm) bestimmt.
D) Sensitivität und Spezifität gegenüber menschlichem Serum
Dies wurde festgestellt anhand eines indirekten Micro-IF-Testes, der als Kontrolltest durchgeführt wurde. Die Tests auf Sensitivität und Spezifität wurden durchgeführt mit 55 Serumproben von Personen, bei denen Chlamydia pneumoniae-Antikörper vorhanden waren, und 66 Serumproben von Personen, bei denen keine Chlamydia pneumoniae-Antikörper vorhanden waren. Das menschliche Serum wurde mit 0,05% (v/v) Tween 20-PBS 200fach verdünnt, um Proben zur Messung von Chlamydia-Antikörpern herzustellen. Der indirekte Micro-IF-Test wird später erklärt.
Um den Effekt des vorliegenden Erfindung weiter zu verdeutlichen, wurde die Messung nach dem gleichen Verfahren wie die vorliegende Erfindung durchgeführt, außer dass gereinigte Ek des Chlamydia pneumoniae-Stammes YK-41 als Antigen zum Messen von Chlamydia pneumoniae-Antikörpern verwendet wurden, um dessen Sensitivität und Spezifität mit der des erfindungsgemäßen Chlamydia pneumoniae-Antigens zu vergleichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und 2 gezeigt.
2 ist eine graphische Darstellung in der ein „enzyme-linked immunoadsorbent assay" (ELISA), bei dem das erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigen verwendet wurde, mit einem Micro-IF-Test verglichen wird, wobei die Ordinate die Absorption bei 405 nm im ELISA repräsentiert und die Abszisse den Serumverdünnungsfaktor (Titer) im Mikro-IF-Test.
Tabelle 1
Der cut-off Wert jedes Testes war definiert als die mittlere Absorption von 66 negativen menschlichen Seren plus Standardabweichung.
Die Ergebnisse in 2 zeigen, dass die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ergebnisse eine sehr gute Korrelation mit denen aus dem herkömmlichen Micro-IF-Test aufweisen.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen auch, dass das erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigen eine viel bessere Übereinstimmung mit dem Micro-IF-Test zeigt als die gereinigten Ek, die als Kontrollantigen getestet wurden. Im Besonderen zeigte sich, dass es keine klinisch problematischen falsch-negativen Ergebnisse liefert und dadurch von großem klinischen Nutzen ist.
E) Untersuchung der Kreuzreaktivität mit Chlamydia trachomatis- und Chlamydia psittaci-Antikörpern
Die Reaktivität gegenüber Chlamydia pneumonia-, Chlamydia trachomatis- und Chlamydia psittaci-Antikörpern wurde unter Verwendung des indirekten Micro-IF-Testes getestet. Der Test wurde wie nachstehend gezeigt durchgeführt in Übereinstimmung mit dem Verfahren beschrieben in „Chlamydia Kansenshouno Kisoto Rinsho" (Grundlagen und klinische Pathologie von Chlamydia Infektionen), Seite 62–91, herausgegeben von Kinbara Shuppan K. K., 1988).
Unter Verwendung von Chlamydia pneumoniae-Stamm TW-183, Chlamydia trachomatis-Stamm L2 und Chlamydia psittaci-Stamm Budgerigar-1 wurden, wie vorstehend in A) beschrieben, Ek erhalten. Die erhaltenen Ek wurden jeweils mit 3% normalem Dottersack vermischt und dicht nebeneinander auf einen Objektträger getropft. Die aufgetropften drei verschiedenen Ek bildeten eine Gruppe und insgesamt wurden 16 Gruppen mit 4 Gruppen in einer Spalte und vier Gruppen von Ek in einer Reihe auf einen Objektträger getropft. Nach dem Auftropfen wurde Aceton auf den Objektträger gegeben, um die Ek zu fixieren.
Die menschlichen Serumproben wurden in seriellen 2-fach-Verdünnungen, wie 2-, 4-und 8-fach, in 0,05% (v/v) Tween 20-PBS verdünnt, um die Probenlösungen herzustellen. Die Probenlösungen wurden jeweils zu den Ek der vorstehenden Gruppen gegeben und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, die Probenlösungen wurden dann entfernt und der Objektträger wurde in Tween 20-PBS gewaschen.
FITC-Konjugat gegen menschliches IgG (fluoreszierender Antikörper, Sigma Chemicals Co. Ltd.) wurde zu den Ek jeder der vorstehenden Gruppen gegeben und es wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert, die Probenlösungen wurden entfernt und der Objektträger wurde in Tween 20-PBS gewaschen. Der somit erhaltene Objektträger wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, um das Vorhandensein von Fluoreszenz zu untersuchen und der höchste Verdünnungsfaktor bei dem Fluoreszenz beobachtet wurde, wurde als Titer definiert, mit dem Ergebnis, dass ein Titer von 16 als cut-off Wert festgelegt wurde.
Ausgehend von den Ergebnissen aus dem indirekten Micro-IF-Test wurden die Proben eingeteilt in solche mit Chlamydia pneumoniae-Antikörpern, solche mit Chlamydia trachomatis-Antikörpern und solche mit Chlamydia psittaci-Antikörpern, wie in den Tabellen 2 bis 4 gezeigt.
Für die anhand des vorstehenden Micro-IF-Testes getesteten menschlichen Serumproben (die Probenlösungen wurden in gleicher Weise hergestellt wie die vorstehenden Probenlösungen zur Messung von Chlamydia-Antikörpern) wurden Antikörper gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen, wie in C) beschrieben und in den Tabellen 2 bis 4 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigten, dass das erfindungsgemäße Messverfahren keine Kreuzreaktivität mit Chlamydia trachomatis oder Chlamydia psittaci zeigt.
Tabelle 2
Tabelle 3
Tabelle 4
In den Tabellen 2 bis 4 ist A eine Probe mit Antikörpern gegen C. pneumoniae, B eine Probe mit Antikörpern gegen C trachomatis und C eine Probe mit Antikörpern gegen C. psittaci (Ergebnisse des Micro-IF-Testes).
Der cut-off-Wert im erfindungsgemäßen Beispiel war 0,171.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Das erfindungsgemäße Chlamydia pneumoniae-Antigen besitzt hohe Artspezifität, liefert sehr wenige klinisch problematische falsch-negative und wenige falsch-positive Ergebnisse und hervorragende Reproduzierbarkeit und ist daher sehr nützlich zum Messen von Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpern.
Gemäß dem Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemäßen Chlamydia pneumoniae-Antigens ist es möglich, ein Verfahren für die Herstellung des Antigens bereitzustellen, das hohe Artspezifität besitzt und sehr wenige klinisch problematische falsch-negative und wenige falsch-positive Ergebnisse liefert.
Das Verfahren zum Messen des erfindungsgemäßen Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers besitzt hohe Artspezifität und liefert sehr wenige klinisch problematische falschnegative und wenige falsch-positive Ergebnisse, erlaubt die einfache Messung und einfache Probensammlung, reflektiert das klinische Bild des Probendonors und ist hochsensitiv, wodurch es sehr nützlich ist für die Diagnose von Chlamydia pneumoniae-Infektionen.
Das Reagenz zum Messen des erfindungsgemäßen Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers besitzt hohe Artspezifität, liefert sehr wenige klinisch problematische falschnegative und wenige falsch-positive Ergebnisse, ist leicht zu Messen und ist hochsensitiv und daher wertvoll für die Diagnose von Chlamydia pneumoniae-Infektionen.

Claims

Chlamydia pneumoniae-Antigen, das keine Kreuzreaktionen mit Anti-Chlamydia trachomatis-Antikörpern oder mit Anti-Chlamydia psittaci-Antikörpern verursacht und im Wesentlichen aus einer Proteinfraktion besteht, die aus der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae gewonnen wird, wobei die Proteinfraktion mindestens eines der drei Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 43 KDa, etwa 46 KDa und etwa 53 KDa enthält, wobei das Antigen erhältlich ist durch: Solubilisieren des Cytosols und der cytoplasmatischen Membran eines Chlamydia pneumoniae-Elementarkörperchens mit einem ionischen Detergens und dann Entfernen des solubilisierten Anteils, so dass man den Rückstand erhält, der das Antigen enthält.
Chlamydia pneumoniae-Antigen nach Anspruch 1, das zusätzlich ein Protein von etwa 98 KDa enthält.
Chlamydia pneumoniae-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die von der äußeren Membran von Chlamydia pneumoniae gewonnene Proteinfraktion die drei Proteine mit einem Molekulargewicht von etwa 43 KDa, etwa 46 KDa und etwa 53 KDa enthält.
Verfahren zur Herstellung des Chlamydia pneumoniae-Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches umfasst: Solubilisieren des Cytosols und der cytoplasmatischen Membran von Chlamydia pneumoniae-Elementarkörperchen mit einem ionischen Detergens und dann Entfernen des solubilisierten Anteils, so dass man den Rückstand erhält, der das Antigen enthält.
Verfahren zur Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, welches umfasst: Immobilisieren des Chlamydia pneumoniae-Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 auf einem festen Träger, Inkontaktbringen des Trägers mit einer zu messenden Probe, Inkontaktbringen des resultierenden Antigen-Antikörper-Komplexes mit einem markierten Antikörper, der gegen den Antikörper in der Probe gerichtet ist, Messen der Menge der Markierung des gebundenen oder ungebundenen markierten Antikörpers und Bestimmen des Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers in der Probe aus dem gemessenen Wert.
Verfahren nach Anspruch 5 zur Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin die zu messende Probe menschliche Tränen, menschlicher Rachenabstrich oder menschliche Seren sind.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 zur Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der markierte Antikörper ein markierter Antikörper gegen menschliches IgG, ein markierter Antikörper gegen menschliches IgA oder ein markierter Antikörper gegen menschliches IgM ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der markierte Antikörper ein Enzym-markierter Antikörper ist.
Reagens zur Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, welches das Chlamydia pneumoniae-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Reagens nach Anspruch 9 zur Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, wobei das Reagens ein auf einem festen Träger immobilisiertes Antigen und einen markierten Antikörper umfasst, der mit dem zu messenden Antikörper reagiert.
Reagens nach Anspruch 10 zur Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der feste Träger Polystyrolperlen oder eine Polystyrol-Mikrotiterplatte ist.
Reagens nach Anspruch 10 oder 11 zur Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der markierte Antikörper ein Enzym-markierter Antikörper ist.
Reagens nach Anspruch 12 zur Messung eines Anti-Chlamydia pneumoniae-Antikörpers, worin der Enzym-markierte Antikörper ein alkalische Phosphatase-markierter Antikörper oder ein Meerrettichperoxidase-markierter Antikörper ist.