CN1130565C

CN1130565C - 肺炎衣原体抗原,制备该抗原的方法,利用该抗原测定抗肺炎衣原体抗体的方法及试剂

Info

Publication number: CN1130565C
Application number: CN96193991A
Authority: CN
Inventors: 守川俊英; 川越清隆; 井筒浩; 井口晃史; 山木光男
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co ltd
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 2003-12-10
Anticipated expiration: 2016-03-28
Also published as: ES2194979T3; EP0818681A4; CN1184532A; US6146839A; AU5121596A; AU697218B2; EP0818681A1; DE69628554T2; DE69628554D1; EP0818681B1; WO1996030763A1

Abstract

本发明涉及一种包含来源于肺炎衣原体外膜蛋白质的肺炎衣原体抗原；制备肺炎衣原体抗原的方法，该方法包括用离子型去污剂溶解肺炎衣原体的胞液和胞质膜，然后去除溶解的部分以得到残余部分；测定抗肺炎衣原体抗体的方法，该方法包括应用肺炎衣原体抗原；一种用于测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，该试剂包含肺炎衣原体抗原。根据本发明，提供了一种肺炎衣原体抗原，该抗原具有高度的种特并性，很少出现困扰临床的假阴性问题，很少出现假阳性，本发明提供了制备该抗原的方法，测定抗肺炎衣原体抗体的方法，以及用于测定抗肺炎衣原体抗体的试剂。

Description

肺炎衣原体抗原，制备该抗原的方法，利用该抗原测定抗肺炎衣原体抗体的方法及试剂

发明领域

本发明涉及用于诊断肺炎衣原体感染的肺炎衣原体抗原，制备该抗原的方法，用该抗原测定抗肺炎衣原体抗体的方法及试剂。

发明背景

衣原体是专性的细胞内寄生物，只能在宿主细胞内生存。它的生长周期是独特的，形态学上位于细胞外面的衣原体原生小体(以后称作EB)被摄取到细胞内形成空泡包涵体，然后转变为网状小体(以后称作RB)。RB具有繁殖能力，但缺少感染能力，并且在细胞内繁殖的RB很快转变为EB，它穿破包涵体，破坏细胞壁，到达细胞外。EB缺乏繁殖能力但具有感染能力。目前证实有四种衣原体(沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体，肺炎衣原体和猫心衣原体)，已知其中的肺炎衣原体通过空气传播感染人体。

最近几年，肺炎衣原体作为肺炎、支气管炎、急性上呼吸道感染等呼吸系统感染的致病微生物而引起广泛的注意。在世界不同地方所进行的血清流行病学研究表明，抗肺炎衣原体抗体的发生率，在欧洲和美国为40-50％，在台湾、巴拿马、伊朗等为60％或60％以上，在日本为50-60％。由于肺炎衣原体感染的实际情况变得更加显而易见，因此增加了人们对感染的关注。

诊断衣原体感染最灵敏的血清学方法是Wang和Grayston建立的间接微量免疫荧光试验(微量IF试验)(衣原体试剂引起的沙眼和相关疾病，医学摘要，阿姆斯特丹，pp.273-288，1971)。但是由于微量IF试验的步骤复杂，临床实验室中还没用它作为诊断方法。而且，标准的微量IF试验需要纯化的衣原体EB。为了进行免疫荧光反应，微量IF试验要求所鉴定微生物的形态和结构完整。因此不能应用形态或结构改变了的EB或破坏了的EB。但是由于EB具有感染能力和毒性，应用完整的EB作抗原物质需要特殊的处理使机体能防御感染。因此可应用甲醛，丙酮等固定剂处理的EB作抗原。

另一方面，近来建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)具有这样的优越性，即它可以简单、便利地处理大量样品。有应用ELISA测定抗衣原体抗体的方法的报道，大多数的方法应用完整的衣原体EB作抗原。因此，由于应用了不完全纯化的抗原而导致非特异性反应的存在。这大多由衣原体的复合抗原性引起。关于衣原体的抗原性，据信有属特异性抗原，种特异性抗原和biobar特异性抗原。

衣原体的代表性属特异性抗原为脂多糖(以后称为LPS)，它具有与来源于某些肠细菌Re突变体LPS共同的抗原。

代表性的种特异性或biobar特异性的抗原为衣原体的主要外膜蛋白(以后称作MOMP)，该蛋白占衣原体外膜蛋白的60％左右。但是，MOMP也具有属特异的抗原性(Collett等，美国微生物协会年会，华盛顿特区，摘要号D-159，1986)。

除MOMP外的衣原体外膜抗原主要是属特异性抗原，但也存在一些种特异的抗原性。例如Iijima等报道，用肺炎衣原体的EB进行免疫印迹测定，结果显示肺炎衣原体的分子量(MW)为40K道尔顿的MOMP是属特异性的，分子量为43K道尔顿、46K道尔顿和53K道尔顿的蛋白质是种特异性的，另外分子量为98K道尔顿的蛋白质可能是种特异性的(Y.Iijima等，临床微生物学杂志，p583-588(1994))。

如上所述，衣原体的抗原性很复杂，同属的衣原体在不同种间其抗原性存在着明显的差异。因此，尽管已经建立测定抗沙眼衣原体抗体的方法(日本未审查专利出版物Hei4-297871)，但由于肺炎衣原体和沙眼衣原体的抗原性彼此大不相同，该方法不能简单地以种特异性的方式测定肺炎衣原体。感染有肺炎衣原体的个体携带的抗衣原体抗体也表现出与衣原体复杂的抗原性相一致的多样性。尽管这种模式随被感染的个体而变化，但应用EB本身作抗原可产生非特异性反应，因此用它进行特异的和高度精确的测定是困难的。

发明公开

本发明的第一目的是提供肺炎衣原体抗原，该抗原具有高度的种特异性，很少有困扰临床的假阴性，假阳性率低，有很好的重现性。

本发明的第二目的是提供一种制备肺炎衣原体抗原的方法，该抗原具有高度的特异性，很少有困扰临床的假阴性，假阳性率低，并且有很好的重现性。

本发明的第三目的是提供一种测定抗肺炎衣原体抗体的方法，该方法具有高度的种特异性，很少有困扰临床的假阴性，假阳性率低，允许简单的测定和样品的简单收集，能反映样品供体的临床情况，并且具有高度灵敏性。

本发明的第四目的是提供测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它可提供高度的种特异性，很少有困扰临床的假阴性，假阳性率低，允许简单的测定，并且有高度的灵敏性。

本发明的主题如下：

(1)一种肺炎衣原体抗原，它包括从肺炎衣原体外膜而来的蛋白质。

(2)上面(1)中的肺炎衣原体抗原，它与抗沙眼衣原体抗体或抗鹦鹉热衣原体抗体基本上不发生非特异性反应。

(3)上面(1)或(2)中的肺炎衣原体抗原，其中来源于肺炎衣原体外膜的蛋白质，至少包括分子量为大约43K道尔顿，46K道尔顿和53K道尔顿这样三种蛋白质中的一种。

(4)上面(1)-(3)中的肺炎衣原体抗原，其中来源于肺炎衣原体外膜的蛋白质包括分子量为大约43K道尔顿，46K道尔顿，53K道尔顿的三种蛋白质。

(5)一种制备肺炎衣原体抗原的方法，包括用离子型去污剂溶解肺炎衣原体原生小体的胞液和胞质的膜，然后移去溶解的部分，得到残余部分。

(6)一种测定抗肺炎衣原体抗体的方法，包括应用上面(1)-(4)中的任意肺炎衣原体抗原。

(7)上面(6)中测定抗肺炎衣原体抗体的方法，包括把(1)-(4)中的一种肺炎衣原体抗原固定到固相载体上，使固相载体与待测样品接触，使所得抗原-抗体复合物与标记的抗样品中抗体的抗体接触，测定结合的或未结合的标记的抗体数量，根据测定值来确定样品中的抗肺炎衣原体抗体。

(8)上面(7)中测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中待测的样品是人的泪液，咽部化验标本或人的血清。

(9)上面(7)或(8)中测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中标记的抗体是标记的抗人IgG抗体，标记的抗人IgA抗体或标记的抗人IgM抗体。

(10)上面(7)-(9)中任意测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中标记的抗体是酶标记的抗体。

(11)一种测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包含上面(1)-(4)中任意肺炎衣原体抗原。

(12)上面(11)中测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包含固定在固相载体上的固定化抗原和与待测抗体反应的标记的抗体。

(13)上面(12)中测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，其中的固相载体是聚苯乙烯珠或聚苯乙烯微量滴定板。

(14)上面(12)或(13)中用于测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，其中标记的抗体是酶标记的抗体。

(15)上面(14)中用于测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，其中酶标记的抗体是碱性磷酸酶标记的抗体或辣根过氧化物酶标记的抗体。

下面对本发明进行详细阐述。

肺炎衣原体的外膜是不包含胞质和胞质膜的肺炎衣原体细胞壁，主要由蛋白质和脂类组成。

本发明的肺炎衣原体抗原包括来源于上述肺炎衣原体外膜的蛋白质。

在肺炎衣原体抗原中，优选那些与沙眼衣原体或鹦鹉热衣原体基本上不发生非特异性反应的抗原。因为它们很少有困扰临床的假阴性或假阳性。本文所用术语“基本上不产生非特异性反应物”指没有或几乎没有非特异性反应。

来源于肺炎衣原体外膜的蛋白质为这样一些蛋白质，它们的分子量为大约30K道尔顿、大约37K道尔顿、大约40K道尔顿、大约43K道尔顿、大约46K道尔顿、大约53K道尔顿、大约60K道尔顿和大约98K道尔顿。

对于本发明的肺炎衣原体抗原，在来源于上述肺炎衣原体外膜的蛋白质中优选对肺炎衣原体具有种特异性的，分子量为大约43K道尔顿，大约46K道尔顿，大约53K道尔顿的蛋白质中的至少一种。

对于本发明的肺炎衣原体抗原，在来源于上述肺炎衣原体外膜的蛋白质中更优选包含分子量为大约43K道尔顿，大约46K道尔顿，大约53K道尔顿这三种蛋白质的抗原，因为它们有很好的应付肺炎衣原体感染者中抗衣原体抗体的多样性的能力。

另外，对于本发明的肺炎衣原体抗原，在来源于上述肺炎衣原体外膜的蛋白质中优选那些除含有分子量为大约43K道尔顿，大约46K道尔顿，大约53K道尔顿的三种蛋白质中的至少一种外，还包含有分子量为大约98K道尔顿的蛋白质，因为它们有更好的应付上述多样性的能力。

下面将解释本发明中制备肺炎衣原体抗原的方法。

本发明的肺炎衣原体抗原可从肺炎衣原体的细胞团中获得，因为肺炎衣原体细胞团外的EB可提供具有有利特性的抗原所以优选用它作初始物质。

下面举例说明从肺炎衣原体EB中获得本发明的肺炎衣原体抗原的方法，其中用离子型去污剂溶解肺炎衣原体EB的胞质和胞质膜，然后移去溶解的部分以得到残余部分。因为该方法能容易地产生抗原并且获得的抗原具有良好的抗原性，所以该方法是优选的。上述的离子型去污剂优选应用阴离子肌氨酸去污剂，因为这样获得的抗原具有良好的抗原性，特别优选Sarcosyl(N-十二烷酰肌氨酸钠)。另外，用离子型去污剂溶解肺炎衣原体EB的胞质和胞质膜时，优选应用脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(Rnase)进行反应以溶解并移去核酸。

用离子型去污剂溶解肺炎衣原体EB的胞质和胞质膜后，移去溶解部分，所获得的残余部分主要由肺炎衣原体EB除胞质和胞质膜之外的细胞壁组成，即肺炎衣原体的外膜。肺炎衣原体的外膜包含上述分子量为大约30K道尔顿、大约37K道尔顿、大约40K道尔顿、大约43K道尔顿、大约46K道尔顿、大约53K道尔顿、大约60K道尔顿和大约98K道尔顿的蛋白质，并且含有微量的其它蛋白质。

对于本发明的肺炎衣原体抗原，可应用肺炎衣原体的部分外膜，即衣原体外膜复合体(以后称作COMC)。

另外，对于本发明的肺炎衣原体抗原，反应产物通过残余部分与溶解剂反应而获得。对于溶解剂，这里提到的实例为十二烷基硫酸钠(SDS)。获得的反应产物包含上述残余部分的溶解产物或分解产物。

这些肺炎衣原体抗原具有高度的种特异性，很少出现困扰临床的假阴性和假阳性。

在这些肺炎衣原体抗原中，优选上面提到的主要由肺炎衣原体外膜组成的残余成分，因为它的效果及重现性较好。

只要上述的肺炎衣原体抗原用作部分抗原或全部抗原，用于测定抗肺炎衣原体抗体的方法并不受限制。

对于测定抗体的方法，这里例举的是优选的方法，如应用各种标记的抗体的夹心型酶促免疫测定，应用乳胶载体颗粒的乳胶凝集法，免疫比浊法等。

下面详述夹心型免疫测定。

用本发明的肺炎衣原体抗原通过夹心型免疫测定方法检测抗肺炎衣原体抗体的方法，其中可用物理或化学方法把上面的抗原固定在固相载体上，以制备固定化抗原，该固定化抗原与样品接触，培养一段时间，当样品中存在抗肺炎衣原体抗体时，该抗体与固定化抗原结合，在载体上形成抗原-抗体复合物，按需要进行洗涤，然后接触样品中标记的抗体的抗抗体，样品和标记的抗体任选地同时彼此接触。

当上述抗原-抗体复合物形成时，它还与标记的抗体结合以固定在固相载体上。随后用依赖于标记种类的方法来测定结合或未结合在固相载体上的标记的抗体的标记量，根据测定值可确定样品中抗肺炎衣原体抗体的存在或数量。

对于固相载体，可应用例如塑料物，如聚苯乙烯，乙烯基氯等，丝状物如硝基纤维素，尼龙等，无机物如玻璃，硅胶等，它们可以是滴定板，珠，磁珠，纸盘，线等任何一种形式。优选聚苯乙烯珠或聚苯乙烯微量滴定板，因为它们易于控制，最优选的是聚苯乙烯微量滴定板，因为它特别易于控制。

另外，对于把抗原固定在上述固相载体上的方法，所应用的是基于物理吸附的方法，用BrCN₂等形成共价结合的方法。

这里提到的样品可以是人的各种液体组分，优选人的泪液，咽部化验标本或血清，因为它们可反映受试者的临床情况，通常应用人的血清。

对于标记的抗体，这里指的是用不同标记物标记的样品抗体(例如，人的抗体)的抗抗体。对于被标记的抗体，这里指的是抗人IgG抗体，抗人IgA抗体，抗人IgM抗体，或是其部分分解产物，如F(ab′)₂，Fab等，可依据被测抗体的种类适当应用。

已知肺炎衣原体表面感染后，1-2周内出现IgM，IgG抗体相对出现较早并随时间的延长而消失，但可保持较长时间。另一方面，已知分泌型IgA抗体在细胞免疫和抗再感染中起着一定作用。

因此，在标记的抗体与上述样品中的抗体接触的步骤中，优选由标记不同种类的抗体而得到的标记的抗体在测定中单独进行反应。对于由标记不同种类的抗体而得到的标记的抗体，这里指的是标记的抗IgG抗体，标记的抗IgA抗体，标记的抗IgM抗体等。

标记的抗体时应用的标记物可以应用例如酶，放射性同位素，荧光化合物，化学发光物等，优选应用具有灵敏、安全、简单等特性的酶类。所应用的酶类例如苹果酸脱氢酶(酶号1.1.1.37)，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(酶号1.1.1.49)，葡萄糖氧化物(酶号1.1.3.4)，辣根过氧化物酶(酶号1.11.1.7)，乙酰胆碱酯酶(酶号3.1.1.7)碱性磷酸酶(酶号3.1.3.1)，糖淀粉酶(酶号3.2.1.3)，溶菌酶(酶号3.2.2.17)，β-半乳糖苷酶(酶号3.2.1.23)等。

对于酶标记的抗体，优选用碱性磷酸酶标记的抗体或辣根过氧化物酶标记的抗体，因为它们能进行简单和灵敏的测定，并且这些酶标记的抗体可以购得。

下面描述的实施例表明，本发明用于测定抗肺炎衣原体抗体的方法与用传统的衣原体EB所进行的间接微量IF试验结果有很好的相关性，具有高度的种特异性，很少有困扰临床的假阴性和假阳性。

只要测定中用上述肺炎衣原体抗原作为部分或全部抗原，本发明中用于测定抗肺炎衣原体抗体的试剂并不受限制。

对于在上述夹心免疫测定中用于测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，尽管其组成元素依测定方法而不同，但这里所指的是，例如该试剂分别包含固定在固相载体上的固定化抗原和与待测抗体反应的标记的抗体。

固相载体和标记的抗体如上所述。

标记的抗体可悬浮在缓冲液等之中。

对于本发明的试剂，优选的是以分别制备的标记的抗人IgG抗体，标记的抗人IgA抗体和标记的抗人IgM抗体作标记的抗体，因为这样可反映样品供体的临床情况。

本发明的试剂可按需要联合其它组分。例如，在夹心免疫测定中应用的其它组分包括阴性对照样品、阳性对照样品、洗液、标准品，并且在标记物为酶时，反应物、稀释液、反应终止液等可单独应用或联合应用。该试剂对肺炎衣原体感染的诊断非常有益。

如上所述，本发明的肺炎衣原体抗原包括来源于肺炎衣原体外膜的蛋白质，该蛋白质常含有相对或绝对大量的肺炎衣原体非特异性组分。但是，依照本发明，即使应用该肺炎衣原体抗原也可对抗肺炎衣原体抗体进行定量测定。

由此可知，本发明的肺炎衣原体抗原在抗沙眼衣原体抗体和抗鹦鹉热衣原体抗体间基本上不引起非特异性反应，且具有高度的种特异性，因此很少出现困扰临床的假阴性和假阳性。

附图简述

图1显示了肺炎衣原体的十二烷酰肌氨酸钠-非溶解性外膜部分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的图谱，其中每一箭头代表一种蛋白质，其分子量为：1：大约98K道尔顿，2：大约60K道尔顿，3：大约53K道尔顿，4：大约46K道尔顿，5：大约43K道尔顿，6：大约40K道尔顿，7：大约37K道尔顿，8：大约30K道尔顿。

图2显示了用本发明的肺炎衣原体抗原进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和用肺炎衣原体的EB进行微量IF试验时二者的相关性，其中纵座标代表ELISA于405nm处的吸收值，横座标代表微量IF试验的血清稀释因子(滴度)。

本发明的最佳实施方案

现在参照下面的实施例对本发明进行阐释。

实施例：A)肺炎衣原体EB的提纯

所用的衣原体是肺炎衣原体YK-41株(Kanamoto等，传染性疾病杂志66(5)，637-641(1992))。

用YK-41株预先感染HL细胞，培养4天(在6孔聚苯乙烯组织培养板中)，每孔加入1ml的SPG液(75.0g蔗糖，0.52g磷酸二氢钾，1.22g磷酸氢二钾，0.72g谷氨酸溶于1升水中配成水溶液，pH 7.4-7.6)。用硅酮橡胶块刮掉HL细胞，收集含HL细胞的SPG液。

将收集的溶液在SPG液中稀释48倍，然后放置于聚苯乙烯离心管中，每隔1秒进行30次声处理，离心管在1500xg离心3分钟，收集上清液制备YK-41株悬液(10⁵IFU/ml)。

把在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的MEM培养基中生长的HL细胞悬液(约8×10⁴细胞/ml)4ml分散到6孔培养板中后，在36℃5％CO₂的培养箱中培养3天，以制备单层细胞。向其中接种2ml上述YK-41株悬液(10⁵IFU/ml)，然后离心吸收(900xg，60分钟)。吸收后，吸去接种的溶液，加入4ml补充有10％(v/v)FBS，含有环己酰亚胺(1μl/ml)的Eagle MEM培养基，然后在36℃5％CO₂(v/v)的培养箱中培养4天。用硅酮橡胶块刮去感染的细胞，收集感染细胞的上清液。此时在6孔培养板中放置直径为13mm的盖玻片，在刮掉感染的细胞前立即移去。用Cultureset^TM对盖玻片进行染色以确定感染率(Ortho诊断系统，Raritan，N.J.美国)。

在上面感染的培养物悬液中的细胞经匀浆破裂后，在20℃离心10分钟，收集上清液。上清液的两部分在含30％泛影葡胺(泛影葡胺和泛影钠)(w/v)，pH7.2的0.033M Tris-HCl缓冲液的两部分中分层，所述泛影葡胺已在一部分含50％(w/v)蔗糖，pH7.2的0.033MTris-HCl缓冲液中分层，然后43000xg，20℃离心60分钟。所获得的团块作为粗提纯的EB。

上述粗提纯EB的一部分悬液在三部分含梯度尿泛影葡胺35-50(w/v)，pH 7.2的0.033M Tris-HCl缓冲液中分层，然后离心，43,000xg，20℃离心60分钟。收集离心后位于中段的混浊层，此为纯化的EB。B)肌氨酸不可溶的衣原体外膜级分的获得

所得的纯化EB悬于含2％(w/v)十二烷酰肌氨酸钠，1.5mMEDTA(乙二胺四乙酸)，0.14M盐水(十二烷酰肌氨酸钠缓冲液)(pH8.0)的0.01M磷酸钠缓冲液中，然后在20KHz声波处理60秒。在37℃培养1小时后，离心，100,000xg，20℃离心60分钟。离心后，将团块重悬在少量的上述十二烷酰肌氨酸钠缓冲液中，100,000xg，20℃离心60分钟。离心后，再次收集上清液作为溶解部分。将团块用PBS(pH 8.0)洗涤2次，以除去剩余的十二烷酰肌氨酸钠。随后，将上面的团块悬于含10mM MgCl₂，pH8.0的0.02M磷酸钠缓冲液中，其中DNase和RNase均以2.5μg/ml溶解，在37℃反应两小时后，100,000xg，4℃离心60分钟。为了除去可能残留的DNase和RNase，用PBS(pH8.0)冲洗残余物两次，从而获得残余物组分(十二烷酰肌氨酸钠不可溶的衣原体外膜级分)。

所得残余物组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以确定其中所含每一种蛋白质的分子量。

按照Laemuli(英国，自然，227，680-685，1970)所描述的方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中丙烯酰胺凝胶的梯度为4-20％。电泳缓冲液为含1％(w/w)SDS和0.2M甘氨酸的0.025M Tris缓冲液。每孔10μl的要进行电泳的样品预先制备，加60μl残余物(蛋白质浓度为500μg/ml)，60μl样品处理液(0.125M Tris缓冲液，pH6.8，其中含有4％(w/v)SDS，2％(v/v)甘油，0.01％(w/v)BPB)，加12μl的2-巯基乙醇作还原剂，然后在95℃处理5分钟。电泳在40mA进行1小时。用Kaleidoscope Prestain Standard(BioRad产品的商品名)作分子量标记物，按上面的条件进行同一电泳，以每一样品中蛋白质的迁移率来确定其分子量。

用Wako银染试剂盒(商品名，Wako纯化工有限公司产品)以银染方法进行染色。

图1给出了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的图谱。其中每一箭头代表蛋白质，其分子量为：1：大约98K道尔顿，2：大约60K道尔顿，3：大约56K道尔顿，4：大约46K道尔顿，5：大约43K道尔顿，6：大约40K道尔顿，7：大约37K道尔顿，8：大约30K道尔顿。C)抗肺炎衣原体抗体的测定

上面所得的残余物组分被用作抗原，在固定载体用的缓冲液(1升含NaHCO₃ 2.93g和Na₂CO₃ 1.59g)中调整蛋白质的浓度为5μg/ml，在96孔聚苯乙烯微量滴定板的每一孔中加100μl，在4℃过夜培养。然后用含有0.05％(v/v)吐温20，pH7.2的PBS(以后称作0.05％(v/v)吐温20-PBS)300μl洗三次，以去除未吸附的抗原。然后每孔加入含5％(w/v)胎牛血清(BSA)(KPL产)的封阻缓冲液250μl(缓冲液用于封阻和稀释样品)，37℃培养1小时，从而制备抗原固定的板。板在250μl 0.05％(v/v)吐温20-PBS中洗两次。然后把100μl在用以封阻和稀释样品的缓冲液中稀释了的样品血清加到上面的抗原固定的板中，37℃培养1小时，用250μl 0.05％(v/v)的吐温20-PBS洗3次。然后用0.05％(v/v)吐温20-PBS把用碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗原(标记的抗体)稀释为1μg/ml，每孔加100μl。37℃培养1小时后，用250μl 0.05％(v/v)的吐温20-PBS洗3次。然后每孔加入100μl的P-NPP(对硝基苯基磷酸酯)，P-NPP为碱性磷酸酶的底物，溶于二乙醇胺中(酶反应的底物，浓度1mg/ml)，室温下培养10分钟。加入25μl 3N NaOH溶液(反应终止液)来终止反应，用微量滴定板读数仪(Corona Denki K.K.产，商品名MTP-120型)来测定吸收值(405nm)。D)对人血清的敏感性和特异性

通过用间接微量IF试验作对照来进行具体说明。用55个肺炎衣原体抗体阳性者的血清样品和66个肺炎衣原体抗体阴性者的血清样品来进行敏感性和特异性试验。用0.05％(v/v)的吐温20-PBS稀释人血清200倍，以制备用于测定衣原体抗体的样品。后面将对间接微量-IF试验进行阐释。

为了进一步明确本发明的效果，除用肺炎衣原体YK-41的纯化EB作抗原来检测抗肺炎衣原体抗原外，均用同一方法进行测定，以与本发明的肺炎衣原体抗原比较敏感性和特异性。结果如表1和图2所示。

图2中的图对用本发明的肺炎衣原体抗原进行的酶联免疫吸附试验(ELISA)与微量IF试验的相关性进行比较，其中纵座标代表ELISA405nm的吸收值，横座标代表微量IF试验的血清稀释因子(滴度)。

表1所用抗原阳性试验的预值阴性试验的预值截断值

(灵敏性) (特异性)

(阳性样品＝55) (阴性样品＝66)肺炎衣原体外膜复合体 98.2％(54) 86.4％(57) 0.171纯化的原生小体(EB) 54.5％(30) 83.3％(55) 0.453每一试验截断值的确定是66个阴性样品的平均吸收值加标准差。

图2中的结果显示用本发明的方法所获得的结果与常规的微量IF试验有很好的相关性。

表1的结果也显示本发明的肺炎衣原体抗原与微量IF试验的一致性要好于用作对照抗原的纯EB的试验。尤其是，它显示出没有困扰临床的假阴性，因此有很好的临床应用价值。E)与沙眼衣原体抗体和鹦鹉热衣原体抗体进行交叉反应的研究

用间接微量IF试验测定与肺炎衣原体，沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体的反应性。该试验按照衣原体感染的基础与临床病理学，pp62-91(Kinbara Shuppan K.K.于1988年2月20日出版)中描述的方法如下进行。

用肺炎衣原体TW-183株，沙眼衣原体L2株，和鹦鹉热衣原体澳洲长尾小鹦鹉Budgerigar-1株按上述的方法(A)获得EB。每种EB与3％正常卵煮囊混合，以彼此极近的距离点在载玻片上。所点的三种EB为一组，总共16组，四组一列，四组一行，点在载玻片上。点完后，把丙酮加到载玻片上以固定EB。

人的血清样品在0.05％(v/v)吐温20-PBS中进行系列稀释，如稀释成2、4、8倍，以制备样品溶液。将每一样品溶液加到上面各组中的EB上，37℃培养30分钟，移去样品溶液，在吐温20-PBS中洗涤载玻片。

把抗人IgG-FITC连接物(荧光抗体由Sigma化学公司产)加到各组的EB上，37℃培养30分钟，除去样品溶液，在吐温20-PBS中洗载玻片。在荧光显微镜下观察载玻片，检测荧光的存在，把能观察到荧光的最高稀释度定为可得结果的滴度，滴度16被定为截断值。

由间接微量IF试验的结果，将样品分组，即分为含有肺炎衣原体抗体的，含有沙眼衣原体抗体的和含有鹦鹉热衣原体抗体的，如表2-4所示。

用上述间接微量IF试验检测人血清样品时(样品溶液的制备与测定衣原体抗体时制备样品溶液的方式一样)，如C)中描述的本发明的方法检测抗体。如表2-4所示。

结果显示本发明的测定方法与沙眼衣原体或鹦鹉热衣原体没有交叉反应性。

表2样品号微量IF试验(滴度) 本发明的测定方法

肺炎衣原体鹦鹉热衣原体沙眼衣原体 (吸收值)A 1 64 小于8 小于8 0.3722 32 小于8 小于8 0.1723 32 8 8 0.3014 16 小于8 小于8 0.2075 64 小于8 小于8 0.2776 16 小于8 小于8 0.2707 32 小于8 小于8 0.2348 512 8 16 0.5019 128 小于8 小于8 0.38710 512 小于8 小于8 0.434

表6样品号微量IF试验(滴度) 本发明的测定方法

肺炎衣原体鹦鹉热衣原体沙眼衣原体 (吸收值)B 11 小于8 小于8 16 0.14312 小于8 小于8 8 0.11513 小于8 小于8 16 0.10614 小于8 小于8 16 0.07015 8 小于8 16 0.14816 小于8 小于8 16 0.08817 8 8 16 0.08918 小于8 小于8 64 0.12119 小于8 小于8 64 0.12420 小于8 16 16 0.117

表4样品号微量IF试验(滴度) 本发明的测定方法

肺炎衣原体鹦鹉热衣原体沙眼衣原体 (吸收值)B 21 小于8 小于8 128 0.11722 小于8 小于8 128 0.12023 小于8 小于8 64 0.063C 24 小于8 16 8 0.13125 小于8 16 小于8 0.065

表2-4中，A是含抗肺炎衣原体抗体的样品，B为含抗沙眼衣原体抗体的样品，C是含抗鹦鹉热衣原体抗体的样品(微量IF试验结果)。

本发明实施例中的截断值为0.171。

工业应用性

本发明的肺炎衣原体抗原具有高度的种特异性、很少有困扰临床的假阴性问题，很少出现假阳性，有很好的重现性，因此有利于检测抗肺炎衣原体抗体。

依照本发明制备肺炎衣原体抗原的方法，可以提供一种制备抗原的方法，该抗原具有高度种特异性，很少出现困扰临床的假阴性问题，且很少有假阳性。

本发明测定抗肺炎衣原体抗体的方法，具有高度的种特异性，很少出现困扰临床的假阴性问题，很少出现假阳性，允许简单的测定和样品的简单收集，反映样品供体的临床情况，具有高度的灵敏性，因此使它对肺炎衣原体感染的诊断非常有益。

本发明用于测定抗肺炎衣原体抗体的试剂具有高度的种特异性，很少出现困扰临床的假阴性问题，很少出现假阳性，易于测定，具有高度灵敏性，因此对于肺炎衣原体感染的诊断很有价值。

Claims

1.一种肺炎衣原体抗原，其剂量不引起与抗沙眼衣原体抗体或抗鹦鹉热衣原体抗体发生交叉反应，并且主要由来源于肺炎衣原体外膜的蛋白级分组成，所述抗原可通过如下方法获得：用阴离子肌氨酸去污剂溶解肺炎衣原体原生小体的胞液和胞质膜，然后移去溶解的部分，得到含有所述抗原的残余部分。

2.权利要求1的肺炎衣原体抗原，其中蛋白级分来源于肺炎衣原体外膜，包含分子量为大约43K道尔顿，大约46K道尔顿和大约53K道尔顿的三种蛋白中的至少一种。

3.权利要求1或2的肺炎衣原体抗原，其中蛋白级分来源于肺炎衣原体外膜，包含分子量为大约43K道尔顿，大约46K道尔顿和大约53K道尔顿的三种蛋白。

4.制备肺炎衣原体抗原的方法，所述抗原的剂量不引起与抗沙眼衣原体抗体或抗鹦鹉热衣原体抗体发生交叉反应，所述方法包括用阴离子肌氨酸去污剂溶解肺炎衣原体原生小体的胞液和胞质膜，然后移去溶解的部分，得到含有所述抗原的残余部分。

5.测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其包括将权利要求1的肺炎衣原体抗原固定到固相载体上，使所述载体与待测样品接触，使所得抗原-抗体复合物与标记的抗样品中抗体的抗体接触，测定结合的或未结合的标记的抗体的标记量，根据测定值来确定样品中的抗肺炎衣原体抗体。

6.测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其包括将权利要求2的肺炎衣原体抗原固定到固相载体上，使所述载体与待测样品接触，使所得抗原-抗体复合物与标记的抗样品中抗体的抗体接触，测定结合的或未结合的标记的抗体的标记量，根据测定值来确定样品中的抗肺炎衣原体抗体。

7.测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其包括将权利要求3的肺炎衣原体抗原固定到固相载体上，使所述载体与待测样品接触，使所得抗原-抗体复合物与标记的抗样品中抗体的抗体接触，测定结合的或未结合的标记的抗体的标记量，根据测定值来确定样品中的抗肺炎衣原体抗体。

8.权利要求5-7中任一权项的测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中待测的样品是人的泪液、咽部化验标本或人的血清。

9.权利要求5-7中任一权项的测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中标记的抗体是标记的抗人IgG抗体、标记的抗人IgA抗体或标记的抗人IgM抗体。

10.权利要求8的测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中标记的抗体是标记的抗人IgG抗体、标记的抗人IgA抗体或标记的抗人IgM抗体。

11.权利要求5-7中任一权项的测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中标记的抗体是酶标记的抗体。

12.权利要求8的测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中标记的抗体是酶标记的抗体。

13.权利要求9的测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中标记的抗体是酶标记的抗体。

14.权利要求10的测定抗肺炎衣原体抗体的方法，其中标记的抗体是酶标记的抗体。

15.测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包含权利要求1的肺炎衣原体抗原。

16.测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包含权利要求2的肺炎衣原体抗原。

17.测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包含权利要求3的肺炎衣原体抗原。

18.权利要求15-17中任一权项的测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，它包含固定在固相载体上的固定化抗原和与待测抗体反应的标记的抗体。

19.权利要求18的测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，其中的固相载体是聚苯乙烯珠或聚苯乙烯微量滴定板。

20.权利要求18的测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，其中标记的抗体是酶标记的抗体。

21.权利要求19的测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，其中标记的抗体是酶标记的抗体。

22.权利要求20或21的测定抗肺炎衣原体抗体的试剂，其中酶标记的抗体是碱性磷酸酶标记的抗体或辣根过氧化物酶标记的抗体。