DE68928007T2

DE68928007T2 - Antigene Zusammensetzungen aus Fragmenten von Campylobacter pylori und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE68928007T2
Application number: DE68928007T
Authority: DE
Inventors: Martin J Blaser
Original assignee: Enteric Research Laboratories Inc
Current assignee: Enteric Research Laboratories Inc
Priority date: 1988-02-18
Filing date: 1989-02-17
Publication date: 1997-12-04
Anticipated expiration: 2009-02-18
Also published as: EP0329570B1; DE68928007D1; CA1339067C; US5459041A; ES2100850T3; JP2738947B2; EP0329570A2; JPH0235096A; ATE152524T1; EP0329570A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Erfindungsgebiet

Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis des Vorliegens oder Fehlens von auf Campylobacter pylori spezifischen Antikörpern und insbesondere auf die klinische Verwendung neuer Antigenzusammensetzungen zum Nachweis des Vorliegens von Antikörpern gegen C.Pylori und/oder für die Diagnose bestimmter Gastrointestinalstörungen.
Ulcus pepticum-Leiden, Gastritis und andere entzündliche Gastroduodenalkrankheiten sind in der ganzen Welt vorkommende Leiden. Zahlreiche Studien haben gezeigt, daß eine Korrelation zwischen dem Vorliegen einer C. pylori-Infektion und dem Betroffensein mit Ulcus pepticum-Krankheit oder Typ B-Gastritis (der häufigsten Form von Gastritis) besteht. Daher kann die Bestimmung, ob eine C. pylori-Infektion bei einem Patienten, der über Gastrointestinalsymptome klagt, vorliegt oder nicht, hilfreich sein bei der Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, daß die Symptome auf Gastritis oder Ulcus pepticum zurückzuführen sind [siehe Infect. Immun. 1987, 55(5), 1256-1263].
Die meisten derzeitigen diagnostischen Verfahren für C. pylori- Infektionen sind kostspielig, unter klinischen Bedingungen schwierig durchzuführen, übermäßig zeitraubend und/oder unangemessen invasiv und unangenehm für den Patienten. Ein Test umfaßt z.B. das Einführen eines Schlauches durch den Mund in den Magen oder das Duodenum, um eine Gewebe-Biopsie zu erhalten. Ein anderer Test umfaßt eine Messung des Anstiegs des mit dem Atem abgegebenen Kohlendioxids eines Patienten, der eine harnstoffhaltige Lösung zu sich genommen hat. (C. pylori enthält das Enzym Ureasae, welches Kohlendioxid aus aufgenommenem Harnstoff freisetzt). Teure Apparaturen sind notwendig, um diesen Unterschied zu detektieren. Ein entsprechender Test, bei dem C14-markierter Harnstoff verwendet wird, führt zu der Produktion von C14-markiertem Kohlendioxid, das leichter zu detektieren ist. Dieser Test ist jedoch deshalb nicht wünschenswert, weil er mit sich bringt, daß der Patient einem radioaktiven Isotop ausgesetzt wird.
Es ist bekannt, daß mit C. pylori infizierte Personen Antikörper entwickeln können, die für diesen Organismus spezifisch sind. Im Stande der Technik bekannte Verfahren zum Nachweis dieser Antikörper gaben jedoch keine spezifischen Antigenzusammensetzungen an, die bezüglich der praktischen Nutzbarkeit und Genauigkeit für breiten klinischen Gebrauch geeignet gewesen wären. Antigene, die nicht genügend einheitlich sind, um im Wesentlichen sicherzustellen, daß nur C. pylori-spezifische Antikörper angezogen werden, führen zur Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen, die für das Vorliegen von Antikörpern gegen C. pylori nicht beweiskräftig sind. Auf der anderen Seite können Antigene, die nicht den meisten C. pylori-Stämmen gemein sind oder die keine starke Immunantwort erzeugen, möglicherweise nicht an die C. pylori-spezifischen Antikörper von Patienten binden, die mit bestimmten Stämmen infiziert sind. In einem solchen Fall zeigt die Tatsache, daß kein Antigen/Antikörper- Komplex gebildet wird, nicht notwendigerweise das Fehlen einer c. pylori-Infektion an. Im Stand der Technik fällt häufig eine angemessene Empfindlichkeit mit nicht ausreichender Spezifität zusammen und umgekehrt. Wenn die Empfindlichkeit gering ist, sind außerdem dem möglichen Verdünnungsgrad Grenzen gesetzt. Daher können falsche positive Signale nicht so leicht eliminiert werden, wie das bei höherer Verdünnung der Fall wäre.
Monoclonale Antikörper, die auf Campylobacter pyloridis ansprechen, sind bereits als Mittel für einen vorgeschalteten Test für Patienten vorgeschlagen worden, um eine mögliche Infektion mit Campylobacter pylori vor weiteren Untersuchungen sicherer zu machen (siehe WO 87/01119).

AUFGABEN DER ERFINDUNG

Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen in hohem Maße spezifischen und in hohem Maße empfindlichen diagnostischen Test für das Vorliegen einer C. pylori-Infektion zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Antigenzusammensetzung bereitzustellen, die spezifisch und mit hoher Sensitivität gegen C. pylori gerichtete Antikörper anzieht und bindet.
Genauer betrifft die Erfindung eine Antigenzusammensetzung zum Nachweis des Vorliegens von Antikörpern gegen Campylobacter pylori, wobei die Zusammensetzung an Antigenfragmenten von Campylobacter pylori angereichert ist, die durch Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyamidgel in Banden mit 63.000, 57.000 und 31.000 Dalton aufgetrennt werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Unterstützung der Diagnose bei Gastrointestinalsymptomen zur verfügung zu stellen, die im Verhältnis nicht-invasiv ist und dem Patienten wenig Unannehmlichkeiten bereitet. Dies Verfahren ist ein Nachweisverfahren für Gastritis oder für Ulcus pepticum-Krankheit (PUD peptische Ulcus-Krankheit) bei dem:
a) eine Probe einer Körperflüssigkeit von einem Patienten entnommen wird, der auf Gastritis oder Ulcus pepticum-Leiden untersucht werden soll;
b) die Probe mit der Antigenzusammensetzung, wie oben definiert, in Kontakt gebracht wird, die in Gegenwart von Anti-C.- pylori-Antikörpern einen Antigen/Antikörperkomplex bildet, worauf
c) eine Menge des in Schritt b) gebildeten Antigen/Antikörperkomplexes bestimmt wird.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, kosteneffektive klinische Diagnosetests auf Vorliegen von C. pylori zur Verfügung zu stellen, die unter den Bedingungen in der Klinik oder zu Hause einfach anzuwenden sind und die schnell ausgewertet werden können, und Kits zur Durchführung solcher diagnostischen Tests bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Mittel zur Verfügung zu stellen, mit denen die Wirksamkeit von Behandlungen, die der Reduzierung oder Eliminierung einer C. pylori- Infektion dienen sollen, überwacht werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen Diagnosetest bereitzustellen, der hinlänglich empfindlich ist, um hochverdünnte Untersuchungsproben verwenden zu können. Dieser Diagnosetest ist ein Verfahren zum Nachweis von Anti-c.-pylori- Antikörpern in einer Testprobe, bei dem folgende Schritte durchgeführt werden:
a) in Kontaktbringen der Probe mit der definierten Antigenzusammensetzung, die in Gegenwart der Antikörper einen Antigen/Antikörperkomplex bildet, und danach
b) Bestimung der Menge des in Schritt a) gebildeten Antigen/Antikörperkomplexes.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorgenannten und andere Aufgaben werden gelöst durch die Bereitstellung von Antigenzusammensetzungen, die wenigstens Fragmente von C. pylori enthalten und eine stärker angereicherte Konzentration wenigstens eines Fragments besitzen, das außerordentliche Antikörperantwort zeigt, den meisten Stämmen von C. pylori gemeinsam ist und hinreichend unitär ist, daß es von in nicht-infizierten Individuen vorhandenen Antikörpern im wesentlichen nicht erkannt wird. Der Ausdruck "wenigstens Fragmente" drückt aus, daß intakte Bakterien, d.h. die ganzen Organismen, ebenso wie Bruchstücke davon, verwendet werden können.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist die Zusammensetzung mit wenigstens einem Fragment angereichert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den 63.000, 57.000, 45.000 und 31.000 Dalton Fragmenten. Nach einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung besitzt die Antigenzusammensetzung eine erhöhte Konzentration von wenigstens Fragmenten von C.pylori-flagella. Nach einem weiteren Ausführungsbeispiel weist die Antigenzusammensetzung wenigstens Fragmente von wenigstens einem Stamm von C. pylori auf, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 5 Isolaten, bezeichnet mit den von den Erfindern vergebenen Identifikationsnummern 84-180, 84-182, 84-183, 86-63 und 86-86, die bei der amerikanischen Stammsammlung "American Type Culture Collection" (ATCC) unter ATCC- Registrierungsnummern: 53722, 53725, 53726, 53727 und 53721, am 16. Februar 1988 oder davor, vor der Hinterlegung dieser Patentanmeldung, hinterlegt worden sind (im nachfolgenden insgesamt als die "hinterlegten Stämme" bezeichnet). Diese Hinterlegung stellt die Dauerhaftigkeit der Hinterlegung und die unmittelbare Zugänglichkeit in Übereinstimmung mit dem US- Patentgesetz und dem Budapester Vertrag und anderen hier anwendbaren Gesetzen und Bestimmungen sicher.
Die oben beschriebenen Antigenzusammensetzungen wirken einschließlich der spezifizierten Antigene sowohl einzeln als auch in Verbindung miteinander als Antigenzusammensetzungen, die C. pylori-spezifische Antikörper binden können. Die Antigenzusammensetzungen neigen zur Komplexbildung mit Antikörpern, die systemisch in fast jedem C. pylori-infizierten Individuum vorhanden sind, unabhängig vom spezifischen Stamm, mit dem das Individuum infiziert ist. Darüberhinaus werden diese Antigene selten durch in den Körperflüssigkeiten nicht-infizierter Individuen vorliegende Antikörper erkannt. Spezielle bevorzugte Antigene für die Zusammensetzung, die eine hohe Fähigkeit zur Antikörperdetektion zeigen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf C. pylori-Fragmente mit einem scheinbaren Molekulargewicht nach der Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel (im folgenden "SDS-PAGE") von ungefähr 63.000, 57.000, 45.000 und 31.000 Dalton. Alle hier angegebenen scheinbaren Molekulargewichte wurden aus Kalibrierungskurven berechnet, die auf die relative elektrophoretische Migration der folgenden Molekulargewichtstandards bezogen sind:: Lysozym 14.400 Dalton, Sojabohnen Trypsin-Inhibitor 21.500 Dalton, Carboanhydrase 31.000 Dalton, Ovalbumin 45.000 Dalton, Rinder- Serumalbumin 66.200 Dalton, Phosphorylase B 92.500 Dalton, Beta-Galactosidase 116.250 Dalton und Myosin 200.000 Dalton. Die Verwendung einer solchen Kalibrierungskurve ermöglicht typischerweise die Festlegung des Molekulargewichts in diesem Molekularsgewichtsbereich plusminus etwa 1.000 Dalton. Proben von 1 bis 2 Mikrogramm werden auf jede Bahn aufgegeben, nachdem 5 Minuten in einer Pufferlösung gekocht wurde, die Sodiumdodecylsulfat (im folgenden "SDS"), Dithiothreitol und Glycerol enthielt. Das Trenngel ist 10% Acrylamid, und die Elektrophorese wird bei 35 mAmps über 2 Stunden bei einer konstanten Temperatur von 8ºC durchgeführt. Die Banden werden mit einer Silberfärbung aufgetrennt. In bestimmten bevorzugten Ausführungsbeispielen werden isolierte Flagella von C.pylori und insbesondere isolierte Fragmente von diesen Flagella mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 63.000, 57.000 bzw. 31.000 Dalton als Antigen(e) der Wahl verwendet, einzeln oder in Kombination miteinander,. Die 63.000, 57.000, 45.000 und 31.000 Dalton dFragmente der hinterlegten Stämme werden in den meisten C.pylori - nicht nur in den hinterlegten Stämmen - gefunden und sind in der Antigenzusammensetzung der Erfindung verwendbar, unabhängig aus welcher Quelle sie stammen. Geeignete synthetische Antigene, die zu den spezifizierten Antigenfragmenten homolog sind, können ebenfalls verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Proben, die auf C.pylori-spezifische Antikörper getestet werden sollen, mit der hier definierten Antigenzusammensetzung in Kontakt gebracht. In bevorzugten Ausführungsbeispielen wird dieses in Kontaktbringen gefolgt von einer Bestimmung, ob das Ausmaß der Antigen/Antikörperkomplexbildung einen Schwellenwert überschreitet, was anzeigt, daß die Probe für C. pylori-spezifische Antikörper positiv ist. Die Bildung von Antigen/Antikörperkomplex wird mittels üblicher Techniken nachgewiesen. Der Detektionsgrad für den Antigen/Antikörperkomplex, der als positives Signal angesehen werden sollte (d.h., eine Anzeige, daß die Testprobe C.pylori-spezifische Antikörper enthält) hängt von den gewählten Detektionsmitteln ab, kann jedoch allgemein als ein Wert größer als der Mittelwert + 1 (und vorzugsweise 3) Intervalle der Standardabweichung von den bei einer negativen Kontrollgruppe beobachteten Werten definiert werden. Die negative Kontrollgruppe sollte aus asymptomatischen Individuen bestehen, die Miglieder einer Population sind, von der es unwahrscheinlich ist, daß sie mit C. pylori infizierte Individuen enthält. Eine bevorzugte Kontrollgruppe ist z.B. eine Gruppe von asymptomatischen Kindern unter 10 Jahren. Solche Kinder bilden eine Population, von der es unwahrscheinlich ist, daß sie infiziert ist.
Bevorzugte Techniken zum Nachweis der Bildung von Antigen/Antikörperkomplexen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, den enzymgebundenen Immunoabsorbtionstest (ELISA), den indirekten Fluoreszenztest und den Test auf Basis von Liposomen. Alternativ hierzu kann eine Western-Blot-Technik verwendet werden, in welchem Fall die Banden durch visuelle Kontrolle detektiert werden, wobei deutlich dunkel erscheinende Banden als eine positive Anzeige genommen werden können.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden klinische Kits bereitgestellt, die sowohl Antigenzusammensetzungen gemäß der Erfindung als auch Mittel zum Nachweis des Antigen/Antikörperkomplexes umfassen. Wegen der Korrelation zwischen einer C. pylori-Infektion und bestimmten Magenkrankheiten, wie z.B. Ulcus pepticum und Gastritis, können diese Krankheiten durch einen Test auf Antikörper gegen C. pylori gemäß der vorliegenden Erfindung diagnostiziert werden. Darüberhinaus können Nachsorgetests auf Antikörper nach einer Behandlung der C. pylori-Infektion verwendet werden, um den Fortschritt einer solchen Behandlung zu überwachen. Da eine C.pylori-Infektion an sehr verschiedenen physischen Lokationen im oberen Gastrointesinaltrakt auftreten kann, können die Tests der Erfindung sogar die durch Endoskopie und Biopsie, die nur bestimmte Bereiche erfassen, erreichbare Genauigkeit verbessern.
In bestimmter Hinsicht stellt die Erfindung auch Fragmente von C. pylori bereit, die produziert werden, ohne daß die Konzentration eines bestimmten Antigens erhöht würde, wobei die Antigenmischung immobilisiert wird und dann mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wird und wobei der Grad der Bildung von Antigen/Antikörperkomplex entweder durch ELISA oder Liposomtest bestimmmt wird. Für dieses Verfahren ist es zweckmäßig, aber nicht notwendig, die Antigenmischung mit einem oder mehreren der hier beschriebenen bevorzugten Antigenen anzureichern.
In dem hier verwendeten Sinn wird eine Antigenzusammensetzung als "angereichert" bezüglich der Konzentration an einem oder mehreren bestimmten Antigenen betrachtet, sobald die Konzentration des bestimmten Antigens die natürliche Konzentration (relativ zu anderen Antigenen) überschreitet, was sich ergibt, wenn C.pylori unter Bedingungen extrahiert und fragmentiert wird, die nicht selektiv die Konzentration der bestimmten Antigene erhöhen.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Ausdruck "Fragment" einen Teil eines Bakteriums, der von dem Zerteilen der Bakterienzelle mit herkömmlichen Mitteln zur Erzeugung bakterieller Antigene herstammt, oder synthetische Homologe dieser Teile, wie z.B. synthetisch oder rekombinant produzierte Polypeptide.

FIGURENKURZBESCHREIBUNG

Figur 1 zeigt die Diffenzierung von Urinproben von Personen, von denen bekannt ist, daß sie seropositiv oder seronegativ auf C. pylori-Infektionen sind, durch Bestimmung der Urin-IgG- Antikörper gegen C. pylori.
Figuren 2 bis 4 beziehen sich auf Beispiel 5 und sind dort erklärt.
Figur 5 bezieht sich auf Beispiel 4 und ist dort erklärt.
Figur 6 ist ein ganzes Zellenprofil der hinterlegten Stämme, wobei die Streifen 1 bis 5 die hinterlegten Stämme 86-63 (ATCC 53727), 84-180 (ATCC 53722), 84-182 (ATCC 53725), 86-86 (ATCC 53721) bzw. 84-183 (ATCC 53726) repräsentieren.
Figur 7 ist das Lipopolysaccharidprofil der 5 hinterlegten Stämme aus Figur 6 (wobei jede Bahn den gleichen Stamm wie in Figur 6 wiedergibt).
Figur 8 ist ein Western Blot der hinterlegten Stämme, wobei jeder Stamm mit Kaninchenserum gegen den bestimmten Stamm geblottet worden ist. Streifen A beispielsweise bezieht sich auf Fragmente der ganzen Zelle von Organismus A, der anspricht auf Kaninchenantiserum, das gegen Organismus A gebildet wurde. Die Bahnen A bis E repräsentieren die hinterlegten Stämme 84-180 (ATCC 53722), 84-182 (ATCC 53725), 84-183 (ATCC 53726), 86-63 (ATCC 53727) bzw. 86-86 (ATCC 53721).
Figur 9 ist ein Western Blot der 5 hinterlegten Stämme (wobei jede Bahn die gleichen Stämme repräsentiert wie in Figur 8), wobei jede Bahn Proteinase-K-behandelte Lysate von ganzen Zellen enthält, die mit gegen den homologen Organismus gewonnenem Antiserum geblottet wurden. Figur 9 zeigt in erster Linie Lipopolysaccharide, weil Proteine durch Proteinase-K abverdaut werden.

BESCHREIBUNG BESTIMMTER BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE IM EINZELNEN

Jede Probe, von der angenommen wird, daß sie C.pylori- Antikörper enthält, kann in Übereinstimmung mit den hier dargestellten Verfahren getestet werden. Vorzugsweise sind die zu testenden Proben Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, Serum, Urin, Tränenflüssigkeit, Schweiß und dergleichen. Sowohl medizinische als auch veterinärmedizinische Applikationen sind hierein einbezogen. zusätzlich zu menschlichen Proben können Proben von anderen Säugetieren, wie z.B. nichthumanen Primaten, Pferden, Schweinen etc. genommen werden. wegen der hohen Sensitivität des beschriebenen Tests ist es sowohl möglich als auch zu bevorzugen, die Probe vor dem Test stark zu verdünnen. Die Verdünnung kann durch Zugabe irgendeiner Flüssigkeit erfolgen, die mit der Probe, sowie den zu testenden Antikörpern als auch der immobilisierten Antigenzusammensetzung kompatibel ist. Wenn Serum als Probe verwendet wird, wird es vorzugsweise mit einer oder mehreren Flüssigkeiten verdünnt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,0 bis 7,4 (im folgenden "PBS"), PBS enthaltendes Tween 20(im folgenden "PBS T"), PBS T mit Thimerosal (im folgenden "PBS TT"), PBS TT (Gelatine) (im folgenden "PBS TTG) und PBS TTG mit Rinder-Gammaglobulin (im folgenden "PBS TTGG") und wird bei einem Test auf IgG-Antikörper vorzugsweise verdünnt in einem Verhältnis von zwischen 1:500 bis etwa 1:1.000, wie beispielsweise etwa 1:800. Bevorzugte Verdünnungsverhältnisse beim Test auf IgA-Antikörper sind etwa 1:50 bis etwa 1:200, beispielsweise 1:100 . IgG-Tests sind bevorzugt.
Bevorzugte Verdünnungsmittel und Verdünnungsverhältnisse können entsprechend der zu testenden Probe variieren. Urin beispielsweise ist bereits verhältnismäßig verdünnt und wird daher typischerweise nicht weiter verdünnt. Es ist jedoch nicht nötig, Urin auf zukonzentrieren, wie häufig bei anderen Tests. Vor dem Test wird der pH des Urins vorzugsweise auf etwa 7,0 bis 7,4 eingestellt, den bevorzugten pH-Wert für die Antikörperfunktion.
Obwohl die Verdünnung der Proben nicht erforderlich ist, wird angenommen, daß große Verdünnungsverhältnisse die Möglichkeit, daß sich signifikante Antigen/Antikörperkomplexe in Abwesenheit von C. pylori-spezifischen Antikörpern bilden, verringert wird. Der Verdünnungsgrad sollte bei der Einstellung des Schwellenwerts für Antigen/Antikörperkomplex, der als positives Signal betrachtete wird, berücksichtigt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung verwenbare Antigenzusammensetzungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, spezielle Antigene, die aus Fragmenten der 5 hinterlegten Stämme isoliert werden, ein oder mehrere komplette Organismen aus den hinterlegten Stämmen sowie Mischungen hiervon. Isolierte Flagella haben sich z.B. als effektive Antigene für die Antigenzusammensetzung erwiesen. Die Antigenfragmente der C. pylori-Stämme, die Proteine, Lypopolysaccharide etc. sein können, werden durch ihr scheinbares Molekulargewicht identifiziert, das abgeleitet ist aus ihrer elektrophoretischen Wanderung auf Natriumdodecylsulfat/Polyacrylamidgelen, wie vorher beschrieben.
Bevorzugte Antigenmischungen umfassen isolierte Flagella aus C. pylori-Stämmen oder Fragmente dieser Flagella und isolierte Fragmente beliebiger C. pylori-Stämme, wobei die Fragmente ein scheinbares Molekulargewicht auf SDS-PAGE von 63.000, 57.000, 45.000 oder 31.000 Dalton besitzen. Es wird angenommen, daß eine Antigenmischung, die aus einem Pool aller 5 hinterlegten Stämme erhalten wurde, wenigstens 1 Antigen enthält, von dem wahrscheinlich ist, daß es in fast allen C. pylori-Stämmen enthalten ist. Auf diese Weise ergibt sich eine breite Spezifität, die es ermöglicht, daß die Antigenmischung in serologischen Tests verwendet werden kann. Es ist bevorzugt, daß die Antigenzusammensetzung an Flagella oder wenigstens einem der 63.000, 57.000, 45.000 oder 31.000 Dalton Fragmente angereichert ist. Weiter vorzugsweise sind wenigstens 50% der Zusammensetzung oder wenigstens 50% der C. pylori-Fragmente Flagella oder die Fragmente mit dem spezifizierten Molekulargewicht. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen erreicht die Konzentration 85% oder mehr. Bei einigen Anwendungen kann es erwünscht sein, daß die Antigenzusammensetzung im wesentlichen frei ist von anderen Antigenen als den Flagella oder den Fragmenten von spezifizierten Molekulargewicht.
Eine Antigenzusammensetzung wird als im wesentlichen frei von anderen als den interessierenden Antigenen angesehen, wenn die Antigenzusammensetzung, wenn sie einer Elektrophorese auf SDS- PAGE und geeigneter Anfärbung unterworfen wird, einzelne wohl definierte Banden zeigt, die den interessierenden Antigenen entsprechen und optisch keine anderen Banden erkennbar sind.
Die vorliegende Offenbarung stellt ein einfaches Verfahren zur Verfügung, um die bevorzugten Antigene aus den hinterlegten C. pylori-Stämmen zu erhalten, es wird dabei betont, daß diese Antigene einer großen Anzahl von C. pylori-Stämmen gemeinsam sind, wie durch ihre Effizienz beim Test auf das Vorhandensein von C.pylori gezeigt wird. Während die hinterlegten Stämme und die Erläuterung im Zusammenhang mit der vorliegenden Patentbeschreibung eine einfache Möglichkeit bieten, diese Antigene zu isolieren, wird gleichzeitig betont, daß die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Antigene in einem weiteren Bereich umfaßt, unabhängig von der Quelle aus der sie erhalten wurden.
Die Antigenzusammensetzungen gemäß dieser Erfindung werden vorzugsweise mit üblichen Techniken auf einem Substrat immobilisiert. Beispielsweise können Polystyrolplatten mit gemäß der Efindung hergestellten Antigensuspensionen inkubiert werden. Alternativ können z.B. Antigene, die als Proteinbanden auf Elektrophoresegel isoliert worden sind, mit bekannten Verfahren auf ein Nitrozelluloseblatt übertragen werden. Siehe Towbin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 76, 4350-54 (1979); Burnette, et al., Biochem., 112: 195-203 (1981). Zahlreiche andere Techniken sind im Stand der Technik bekannt, um Antigene auf im wesentlichen inerte Substrate zu binden.
Die gebundenen Antigene gemäß der Erfindung werden vorzugsweise mit einem hochverdünnten Fluid in Kontakt gebracht, welches die auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen C. pylori zu testende Probe enthält. Das Antigen und die Probe werden vorzugsweise für wenigstens etwa eine Stunde inkubiert. Deutlich weniger Zeit ist erforderlich, wenn die Inkubation bei oder nahe menschlicher Körpertemperatur, etwa 37ºC, stattfindet. Inkubation bei anderen Temperaturen z.B. 4ºC, ist ebenfalls geeignet, erfordert aber allgemein zusätzliche Inkubationszeit. Die bevorzugte Inkubationszeit bei 37ºC liegt zwischen etwa 10 Minuten bis etwa 90 Minuten. Die gebundenen Antigene sollten dann gespült werden, um jegliche nicht gebundenen Antikörper zu entfernen, d.h. solche die nicht spezifisch für die Antigene sind. Vorzugsweise wird das Spülen mit eine Pufferlösung wie z.B. PBS T, PBS TT oder TRIS/Tween /Natriumchlorid/Azid durchgeführt. Mehrfaches Spülen ist bevorzugt.
Während der Inkubation binden C. pylori-spezifische Antikörper an die immobilisierten Antigene und bilden Antigen/Antikörperkomplexe. Alle ungebundenen Antikörper werden während des Waschvorgangs im wesentlichen entfernt. Aufgrund der hohen Spezifität der Antigene nach der Erfindung sind Antikörper, die nicht spezifisch für C. pylori sind, an diesem Punkt im wesentlichen entfernt. Wenn die getestete Probe natürlich keine C. pylori-spezifischen Antikörper enthielt, sind die immobilisierten Antigene dann im wesentlichen frei von menschlichen Antikörpern und der nachfolgende Test auf Antigen/Antikörperkomplex sollte keine signifikante Anwesenheit solcher Komplexe anzeigen. Wenn andererseits die getestete Probe reich an C. pylori-spezifischen Antikörpern war, sollten diese Antikörper auf den immobilisierten Antigenen gebunden haben und eine große Anzahl von nachfolgend zu detektierenden Antigen/Antikörperkomplexen gebildet haben.
Der Nachweis von Antigen/Antikörperkomplex kann durch eine große Vielzahl bekannter Methoden vorgenommen werden. Die bevorzugten Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf den ELISA-Test, die Western-Blot-Technik, den Test mit indirekter Fluoressenz oder einen Test auf Liposomen-Basis.
Typischerweise werden die C. pylori-spezifischen Antikörper, die mit immobilisierten Antigen komplexiert haben, durch den Kontakt mit markierten oder anders nachweisbaren zweiten Antikörpern, die für Humanimmunoglobin spezifisch sind, nachgewiesen. Die markierten zweiten Antikörper können für irgendeinen Humanantikörper spezifisch sein, vorzugsweise vom IgG oder IgA- Typ, weiter vorzugsweise IgG. Wenn akute Serokonversion angenommen wird, kann ein IgM-Test angebracht sein. Die zweiten Antikörper werden mit den immobilisierten Antigenen für etwa 15 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 30 bis 60 Minuten bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 37ºC inkubiert. Dann werden die Antigene mit einer Pufferlösung gewaschen (vorzugsweise mehrere Male), um alle nichtgebunden markierten Antikörper zu entfernen. An diesem Punkt werden die markierten Antikörper im wesentlichen entfernt, außer dort, wo sie an auf den Antigenen vorhandenes Humanimmunoglobin gebunden haben. Natürlich sollte das im wesentlichen einzige Humanimmunoglobin, das zu diesem Zeitpunkt vorhanden ist, C. pylori-spezifischer Antikörper sein. Die Anwesenheit C. pylori-spezifischen Antikörpern kann daher indirekt durch Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesen heit der markierten zweiten Antikörper gemessen werden. Es gibt viele bekannte Techniken zum Nachweis der Markierung. Beispielsweise können Fluorescein-markierte Antikörper durch Scannen der Lichternission bei der charkteristischen Wellenlänge für Fluorescein nachgewiesen werden. Alternativ kann eine Enzymmarkierung durch Inkubieren mit einem geeigneten Substrat und Nachweis der Farbänderung detektiert werden. Dies kann durch optische Kontrolle bestimmt oder automatisch mit einem Spektrophotometer mit Voreinstellung auf die bestimmte wellenlänge gelesen werden. Bei einem Western Blot z.B. kann das positive Signal detektiert werden, wenn ein Enzym mit dem zweiten Antikörper konjugiert ist. Inkubieren mit einem geeigneten Substrat erzeugt auf enzymatischen Wege ein gefärbtes Produkt in unmittelbarer Nachbarschaft der durch diesen Vorgang erkannten Antigenbande. Die Anwesenheit einer reaktiven Bande kann durch optische Kontrolle nachgewiesen werden. Bei einem indirekten Immunofluoreszenztest können Fluorescein-markierte Antikörper mit Fluorescein-aktivierten Detektoren oder durch optische Kontrolle nachgewiesen werden. Ein auf Liposomen basierender Test kann die Anwesenheit von Fluorescein, einem Enzym oder einem Substrat im Inneren des Liposoms, auf dessen Oberfläche C.pylori-Antigene expremiert sind, umfassen. Diese Liposomen werden mit der zu testenden Körperflüssigkeitsprobe in angemessener Verdünnung inkubiert und dann sorgfältig gewaschen. Solche Liposomen, die Humanimmunoglobine auf ihrer Oberläche tragen, welche einen Antigen/Antikörperkomplex bilden, können erkannt werden, indem ein zweiter Antikörper auf ein spezielles Human Ig auf die Innenseite der Wände eines Polystyrolröhrchens eingebracht wird. Solche Liposomen, die an die C. pylori-Antigene gebundene Antikörper tragen, werden immobilisiert und nicht im mobilisierte Liposome werden ausgewaschen. Die Liposome können z.B. mit Detergenz oder Komplement lysiert werden, und das Enzym oder Substrat, das sich im Inneren des Liposoms befand, ist dann frei, mit dem komplentären Substrat (oder Enzym) in der Lösung in dem Röhrchen zu reagieren. Die resultierende Farbreaktion kann durch optische Kontrolle oder spektrophotometrische Farbbestimmung nachgewiesen werden. Alternativ kann vorhandenes Fluorescein durch einen Fluoreszenz-aktivierten Detektor nachgewiesen werden.
Das Austesten bestimmter Antigenpools der Erfindung mit Kaninchenantiserum, das gegen Stämme, die nicht in der Antigenmischung enthalten waren (heterolog) erhalten wurde, zeigt, daß der Pool Antikörpern gegen diese Stämme nachweisen konnte, ebenso wie er Entikörper gegen die homologen Stämme nachweisen konnte. Dies zeigte an, daß der Antigenpool, der sowohl die konservierten als auch die diversen (strangspezifischen) Antigene enthielt, die Art breiter Spezifizität besaß, die für serologische Tests brauchbar ist.
Die Sensitivität und Spezifität des Antikörpernachweises gemäß der vorliegenden Erfindung ist mit Serum bestimmt worden, das von Personen aus definierten Populationen erhalten wurde. Die Anfangsanalyse umfaßte 40 gesunde Kinder und es wurden keine Antikörper in dieser Gruppe im IgA-Test gefunden und nur einmal im IgG-Test (Tabellen 1 und 2). Dies ist signifikant, weil sowohl Gastritis als auch Ulcus pepticum in dieser Population sehr ungewöhnlich sind, und die Gruppe dient als negative Kontrollgruppe. Die Verteilung der Werte der optischen Dichte in der ELISA-Bestimmung zu dieser Population wurde dann verwendet, um eine Positivitätsgrenze zu etablieren. Dies ist bedeutsam, weil der Test dann mit Hochrisiko- und Niedrigrisiko- Populationen auf voraussichtliche Fälle untersucht wurde. Die Beispiele 1 und 2 illustrieren die Ergebnisse dieses Ansatzes.
Die Efindung wird weiter verdeutlicht, unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die lediglich als nicht beschreibende Erläuterungen zu der Erfindung angegeben sind.

BEISPIEL 1

IgG-Test mit gepoolten Suspensionen von ultraschallbehandelten Proben aller 5 hinterlegten Stämme in der Antigenzusammensetzung
Es wurde eine Antigenzusammensetzung aus 5 C. pylori-Stämmen hergestellt (ATCC Hinterlegungsnummern 53722, 53721, 53725, 53726 und 53727), die einen diversifizierten Bereich von Antigenen wiedergibt. Es wurden Bakterienzellen auf Schokoladenagar plattiert, dann 48 Stunden bei 35ºC in einer Atmosphäre inkubiert, die 5% Sauerstoff, 10% Kohlendioxid, 5% Wasserstoff und den restlichen Anteil Stickstoff enthielt. Die Zellen von den Platten wurden in steriles destilliertes Wasser geerntet (3ml/Platte), 2x mit 5000 x g 10 Minuten bei 25ºC zentrifugiert und dann in sterilem destillierten Wasser suspendiert. Die Zellkonzentration jedes Stammes wurde (bei 450 Nanometern) auf eine optische Dichte von 1,5 standardisiert, dann wurden die Suspensionen in gleichen Volumina (je 3ml) zusammengegeben. Die gepoolten Suspensionen wurden 4x auf Eis mit einem Branson Ultraschallgerät sonifiziert (Modell S-75, Branson Instruments, Danbury, CT), 30 Sekunden lang mit 30-sekündigen Ruhepausen. Die Präparation wurde dann 2x mit 5000 x g 20 Minuten zentrifugiert, um ganze Zellen abzutrennen, und der Überstand wurde eine Stunde mit 100.000 x g bei 4ºC (L-78 Ultrazentrifuge, Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA) zentrifugiert. Das Pellet wurde in sterilem destillierten Wasser suspendiert und auf eine Standardkonzentration von 1 bis 2mg/ml gebracht. Die Sonikate wurden aliquotiert und bei -70ºC bis zum Gebrauch eingefroren. Für die Verwendung im ELISA wurden die Sonikate in einem Carbonatpuffer (pH 9,6) auf eine Konzentration von 10mg/ml verdünnt.
Flachbodenschälchen in einer Polystyrolplatte mit 96 Vertiefungen, wie z.B. IMMULON II, erhältlich von Dynatech Laboratories, Alexandira, Virginia, wurden über Nacht bei 4ºC mit den ultraschallbehandelten Proben der gepoolten Suspensionen dieser 5 ausgewählten C. pylori-Stämme inkubiert, mit 1,0µg je Vertiefung in 100µl 50mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6. Die Vertiefungen wurden trockengesaugt und dann 2x mit 0,0lm phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, ph 7,2) mit 0,05% Tween-20 und 0,1mg/ml Thimerosal (PBS-TT) gewaschen, und dann 2x mit 200µl PBS-TT mit 0,1% Gelatine (PBS-TTG) gewaschen, um nichtspezifische Reaktivität einzuschränken.
Es wurden Blutserumproben von verschiedenen Patienten vorbereitet, deren bekannte C. pylori-Charakteristik in Tabelle 1 unten angegeben ist. Je 100µl von verschiedenem Testserum, 1:800 verdünnt in PBS-TTG, das auch 5mg/ml Rindergammaglobulin enthielt (hier nach "PBS-TTGG"), wurde zu jeder von 3 verschiedenen Vertiefungen zugegeben, und die Platten wurden 1 Stunde bei 37 ºC inkubiert. Die Vertiefungen wurden aspiriert und 3x mit PBS-TT gewaschen, um nichtgebundene Antikörper zu entfernen, und dann eine Stunde bei 37 ºC mit 100 Microtitern Meerrettich- Peroxidase-markiertem Ziege-Anti-Mensch-IgG bei einer Verdünnung von 1:5.000 in PBS-TT, das 1% Rinderserum Albumin und 0,1% Rindergammaglobulin enthielt, inkubiert. Ziege-Anti-Mensch-IgG ist ein zweiter Antikörper, der mit dem Antigen/Antikörperkomplex bindet, der sich nur in Vertiefungen gebildet haben sollte, die positivem Serum ausgesetzt waren, d.h. Serum, das C. pylori-spezifische Antikörper enthieltn Die Vertiefungen wurden dann 5x mit PBS-TT gewaschen, um nichtgebundenen Ziegeantikörper zu entfernen.
Eine 0,1ml-Probe Entwicklerlösung, die 1,0mg 2,2'-Azino-di-(3- ethylbenzthiasolinsulfonsäure) (ABTS) pro ml in McIlvain's Puffer (pH 4,6) mit 0,005% Wasserstoffperoxid enthielt, wurde jeder Vertiefung zugegeben und es wurde bei 25 ºC 30 Minuten inkubiert.
Diese Substratmischung weist die Peroxidasemarkierung nach und bildet ein farbiges Produkt, welches mit einem ELISA-Lesegerät nachgewiesen werden kann, das Licht bei einer Wellenlänge von etwa 410 Nanometern detektieren kann. Der ELISA-Reader quantifiziert die Farbablesung. Die Tests wurden 3-fach durchgeführt. Kontrollvertiefungen auf jeder Platte wurden in identischer Weise behandelt, außer daß an Stelle von Tests Serumverdünnungsmittel zugegeben wurde. Absorbtionsanzeigen größer als der Mittelwert + 3 Intervallen der Standardabweichung für die Ergebnisse, die beobachtet wurden, wenn eine Gruppe von 40 gesunden Kindern unter 10 Jahren getestet wurde, wurden als positiv bewertet. Der Positivgrenzwert wurde zu 0,910 Einheiten optischer Dichte bei 410 Nanometern bestimmt, wobei 100 Mikroliter Entwicklerlösung in die standardisierten Flachboden-Mikrotitervertiefungen wie oben angegeben eingebracht wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 - IgG-Test mit Sonikaten aller 5 hinterlegten Stämme

BEISPIEL 2

IgA-Test mit gepoolten Suspensionen von Sonikaten aller 5 hinterlegten Stämme in der Antigenzusammensetzung

Die verwendeten Verfahren entsprachen den in Beispiel 1 angegebenen, außer daß das menschliche Testserum für die IgA- Bestimmung (die die untere IgA-Konzentration im Serum wiedergibt) in 1:50-Verdünnung verwendet wurde und daß Peroxidasemarkiertes Ziege-Anti-Human-IgA in Verdünnung 1:1.000 als markierter zweiter Antikörper verwendet wurde. Der Positivschwellenwert wurde auf 0,47 Einheiten optischer Dichte, wie in Beispiel 1 bestimmt, festgelegt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 - IgA-Test an Sonikaten aller 5 hinterlegten Stämme

BEISPIEL 3

IgG-Antikörper gegen C. pylori im Urin von Personen mit Serum- Antikörpern gegen C.pylori

Urin von Personen, von denen bekannt war, daß sie Serum- Antikörper gegen C. pylori (wie mit dem Serumtest nach Beispiel 1 bestimmt) besaßen, wurde beurteilt, um zu bestimmen, ob spezifische IgG-Antikörper im Urin nachweisbar sind. Die verwendeten Methoden sind identisch mit denen aus Beispiel 1 und 2, außer daß der pH der Urinproben mit in Natriumhydroxid auf 7,4 neutralisiert wurde und 100µg dieser Proben in jede Mikrotitervertiefung gegeben wurde. Um Unterschiede im Wasseraufnahmestatus der gestesteten Personen und die Verdünnung des Urins zu berücksichtigen, wurden die Creatinin-Konzentrationen der Urinproben bestimmt, und die Ergebnisse wurden als ein Verhältnis optischer Dichte im ELISA geteilt durch die Creatinin- Konzentration ausgedrückt. Dies standardisiert den Test unabhängig von Variationen in der Urinkonzentration. Die aus dem IgG-ELISA erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 1 wiedergegeben. Es gab keine Überschneidung der Werte, die von den 4 Personen erhalten wurden, von denen bekannt war, daß sie sero-positiv sind, und den 10 als sero-negativ bekannten. Mit dem Mittelwert + 3 Intervallen der Standardabweichung für die Urinproben, die von sero-negativen Personen erhalten wurden, als Ausschlußgrenze für Positivität waren alle sero-positiven Personen positiv. Der Indikator für den positiven Schwellenwert betrug (in Einheiten bestimmt durch Multiplizieren der optischen Dichte mit 1.000 und Dividieren des Produktes durch die Creatinin- Konzentration in mg pro Deciliter) 2,6 Einheiten.

BEISPIEL 4

Western Blot Test

Es wurde eine Western-Blot-Analyse der Testseren wie folgt durchgeführt: Ein Pool aus Sonikaten wie in Beispielen 1 bis 3 wurde durch Elektrophorese auf einem 10%igen Polyacrylamid- Slab-Gel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) fraktioniert. Die Banden auf dem Gel wurden elektrophoretisch auf ein Nitrocelluloseblatt übertragen, gemäß dem Verfahren von Towbin et al. (Proc. Ntl. Sci. USA 76:4350-54 (1979), modifiziert nach Burnette et al. Anal. Biochem. 112:195-203, (1981)). Dann wurden Festphase-Enzym-Immunoessays mit Streifen durchgeführt.
Nach SDS-PAGE wurden kurzgesagt die Gele mit Nitrocellulosepapier (NCP) bedeckt, das in Elektrodepuffer (192mm Glycine, 25mM Tris-Base, 20% Methanol) vollgesaugt war. Elektroblotting- Schwämme wurden mit deionisiertem Wasser gespült und dann mit dem Elektrodenpuffer gesättigt. Nachdem das Gel auf den Schwamm aufgebracht war, wurde das NCP über das Gel gelegt, und dann wurde der zweite Schwamm darübergelegt. Dieses Sandwich wurde in ein Elektroblotting-Gerät gelegt und die Proteine wurden bei 100mA 18 Stunden elektrophoresiert. Das NCP wurde in Boratpuffer (pH 8,0) mit 0,05% Tween -80 gespült und dann bei Raumtemperatur 1 Stunde mit 3% getrockneter fettarmer Milch in Boratpuffer inkubiert. Nach dem Spülen in Boratpuffer wurde das NCP in senkrechte Mehrfachbanden aufweisende Streifen geschnitten und jeder Streifen wurde bei 25ºC 4 Stunden in einer 1:400- Verdünnung der Testserumproben in 3%iger trockener Magermilch in Boratpuffer inkubiert. Nach 3 einstündigen Waschvorgängen in 1%iger trockener Magermilch in Boratpuffer wurden die NCP- Streifen 2 Stunden bei 25ºC mit Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-Anti-Human-IgG inkubiert, das 1:5000 in 1%igem Milch- Boratpuffer verdünnt war. Nach 3 20-minütigen Waschvorgängen in Boratpuffer wurden die NCP-Streifen in DAB-Lösung (50mM Tris mit 0,025% Diaminobenzidin mit 2 Tropfen Wasserstoffperoxid) 5 bis 10 Minuten lang eingelegt, bis die Reaktionsprodukte optimal entwickelt waren. Die Reaktion wurde gestoppt, indem die Streifen mit Leitungswasser gewaschen wurden. Die Streifen wurden visuell (durch Ansicht) ausgelesen.
Figur 5 gibt die Ergebnisse dieser Experimente graphisch an. Streifen A wurde in Abwesenheit von Humanantikörper inkubiert, mit nur 3% getrockneter Magermilch in Boratpuffer; Streifen B wurde mit Serum eines Patienten mit Gastrointestinalsymptomen inkubiert, der weder eine C. pylori-Infektion noch Gastritis hatte; Streifen C wurde mit dem Serum eines anderen Patienten mit Gastrointestinalsymptornen inkubiert, der weder C. pylori- Infektion noch Gastritis hatte; Streifen D wurde mit dem Serum eines Patienten mit Ulcus-Pepticum-Krankheit inkubiert; Streifen E wurde mit Serum eines zweiten Patienten mit Ulcus- Pepticum-Krankheit inkubiert, Streifen F wurde mit Serum eines Patienten mit Gastrointestinalsymptomen inkubiert, bei dem man durch Endoskopie (Magenintubation) gefunden hatte, daß er sowohl eine C. pylori-Infektion als auch Gastritis hatte, wobei Biopsie und Kultur eine Gastritis und die Gegenwart des Organismus zeigten; Streifen G wurde mit Serum eines anderen Patienten mit Gastrointestinalsymptomen inkubiert, bei dem man festgestellt hatte, daß er sowohl eine C. pylori-Infektion als auch Gastritis hatte; Streifen H wurde mit dem Serum einer asymptomatischen Person inkubiert, bei der sowohl eine C. pylori-Infektion als auch eine Gastritis festgestellt worden war; Streifen I wurde mit dem Serum einer weiteren asymptomatischen Person inkubiert, bei der sowohl C. pylori-Infektion als auch Gastritis gefunden worden war.

BEISPIEL 5

Um die Spezifität der Reaktion zu untersuchen wurden C. pylori- Zellen im Vergleich mit Zellen anderer enteropathogener Organismen analysiert. Die angewendeten Tests bestimmten, ob eine Vorinkubation der bekannt positiven Seren im C. pylori-ELISA mit C. pylori- oder Kontrollzellen die optischen Dichtedaten signifikant reduzieren würden. Das verwendete Serum war ein Pool von C. pylori-infizierten Personen, die hohe Werte im IgA-, IgG- und IgM-ELISA hatten. Das gepoolte Serum wurde mit ganzen Zellen von C. pylori, Escherichia coli. Campylobacter fetus oder Campylobacter jejuni absorbiert. Das Bakterienwachstum aus einer Kultur auf einer Platte über Nacht wurde geerntet, die Zellen wurden in destilliertem Wasser suspendiert, 2x mit sterilem destillierten Wasser gewaschen, dann mit 1,0ml des gepoolten Humanserums gemischt und bei 37ºC 45 Minuten inkubiertn
Antikörper auf die Bakteriensuspension wurden durch Zentrifugation über 5 Minuten bei 12.000 x g entfernt. Nachdem ein 100 µl Aliquot für die ELISA-Bestimmung nach jeder Absorption zurückbehalten worden war, wurde der Überstand 5x reabsorbiert. Eine nichtabsorbierte Serumkontrolle wurde den gleichen Inkubations- und Zentrifugationsbedingungen unterworfen. Die Vorinkubation des positiven Serumpools mit C. pylori-Zellen reduzierte die optische Dichte in allen 3 Immunoglobulinklassen signifikant. Die Absoption des Pools mit C. jejuni, C. fetus oder E. coli erzeugte minimale Abfälle in der optischen Dichte im IgA (Figur 2) und IgG ELISA (Figur 3), im IgM-ELISA (Figur 4) erzeugte die Absorption mit den homolgen und heterologen Organismen weniger diverse Inhibierungslevel. Diese Ergebnisse zeigen, daß die im IgA- und IgG- nachgewiesenen Antigene spezifischer für C. pylori sind, als die im IgM-ELISA detektierten.
Um die Spezifität der C. pylori-ELISAS für die Serumdiagnose von C. pylori-Infektionen weiter zu definieren, wurden die Antikörperlevel in anderen Kontrollgruppen verglichen. Es zeigten sich keine Serokonversionen zwischen Proben aus der akuten und der konvaleszenten Phase von 30 Patienten mit akuter bakteriel-1er Enteritis unter Anwesenheit fecaler Leukozyten. Unter diesen waren 12 Patienten mit akuter C. jejuni-Infektion, von denen jeder auf C. jejuni-Antigene seroconvertierte.

BEISPIEL 6

Verwendung eines einzelnen C. pylori-Stammes anstelle des 5- Stämmepools als Antigen im Test

Stamm 84-183 (ATCC 53726) wurde genauso behandelt, wie in Beispiel 1 angegeben. Bei der Aufstellung des Tests jedoch wurde, statt daß Sonikate von 5 Stämmen zusammengenommen wurden, um insgesamt eine Proteinkonzentration von 1,0µg pro Vertiefung zu erreichen, das Sonikat von Stamm 84-183 (ATCC 53726) alleine in einer Konzentration von 1,0µg pro Vertiefung verwendet. Die Ergebnisse des Vergleichs zwischen den Tests, wenn das Standard- 5-Stämme-Antigen verwendet wurde und wenn das Einzelantigen verwendet wurde, sind in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Vergleich der diagnostischen Effizienz des C. pylori-Serum- ELISA mit 5-Stamm-Sonikaten (5-Ag) gegenüber Sonikaten vom Stamm 84-183 allein (1-Ag)
a. Standardtest unter Verwendung von 5 C. pylori-Stämmen als Antigen; optische Dichte oberhalb 0,910 als Positivschwelle.
b. Vergleichstest unter Verwendung eines C. pylori-Stammes (84- 183) als Antigen; optische Dichte über 0,700 als Positivgrenzwert.
c. Standardtest unter Verwendung von 5 pylori-Stämmen als Antigen; optische Dichte oberhalb 0,470 als Positivgrenzwert.
da Vergleichstest unter Verwendung eines C. pylori-Stammes (84- 183) als Antigen; optische Dichte oberhalb 0,470 als Positivgrenzwert.
e. Bei diesen Patienten war C. pylori im Gewebe bei histologischer Untersuchung vorhanden, C. pylori war aus Kultur isoliert worden und sie waren als gastritisch biopsiert.
f. Diese Patienten hatten C. pylori im Gewebe oder in der Kultur und hatten keine Gastritis.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Auswahl eines einzelnene C. pylori-Stammes, der bestimmte konservierte Antigene besitzt, die Entwicklung eines Testes zulassen, der eine ähnliche oder identische diagnostische Effizienz zur Verwendung von gepoolten Antigen besitzt.

BEISPIEL 7

Verwendung gereinigter C. pylori-Flagella als Antigen im Test anstelle des 5-Stämme-Pools

Flagella von gram-negativen Bakterien besitzen gewöhnlich wichtige Oberflächenantigene, gegen die infizierte Wirtsorganismen im allgemeinen Antikörper erzeugen. Um zu bestimmen, ob unter den Antigenen, auf die C. pylori-infizierte Personen mit einer Immunantwort reagieren, tatsächlich irgendwelche dieser Antikörper waren, reinigten wir Flagella für weitere Untersuchungen.
Der Stamm 84-182 (ATCC 53725) wurde genau wie in Beispiel 1 angegeben gezüchtet. Nachdem die Zellen von den Platten in steriles destilliertes Wasser geerntet worden waren, wurde die Suspension bei 3000 x g 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde aspiriert und das Pellet wurde in 0,1m Tris-HCl (pH 7,4) bis auf eine optische Dichte von 1,5 bei der 450 Nanometer- Einstellung resuspendiert. Diese Suspension wurde in einem Durchlauf in einem Virtis-Mischer 45 Sekunden bei mittelhoher Intensität bei 0ºC behandelt. Diese Prozedur schert die Flagella von der Campylobacter Spezies ab (Blaaser et aln Infection and Immunity 1986; 53:47-52). Die Suspension wurde dann bei 12.000 x g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um Zellen und Zelltrümmer zu pelletieren. Der Überstand wurde dann 60 Minuten mit 55.000 x g bei 5ºC zentrifugiert, um die abgescherten Flagella zu sedimentieren. Dieses Pellet wurde in Trispuffer bei 4 ºC resuspendiert, und die Proteinkonzentration wurde bestimmt. Zur Gewinnung des ELISA wurde diese Präparation in einer Proteinkonzentration von 100ng pro Vertiefung der Mikrotiterplatte verwendet. Die weiteren Schritte in dem Test waren genau wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse des Vegleichs zwischen den IgG-Tests, wenn das Standard-5-Stamm- Antigen verwendet wurde und wenn die Flagella-Präparation verwendet wurde, sind in Tabelle 4 gezeigt.
Ein anderer Stamm als die hinterlegten wurde willkürlich ausgesucht, und Flagella-Zusammensetzungen wurden hergestellt wie oben angegeben. Diese Zusammensetzungen wurden mit 100 und 500ng pro Vertiefung getestet und die Ergebnisse in Tabelle 4 tabellarisch erfaßt. TABELLE 4 Vergleich der diagnostischen Effizienz des C. pylori-Serum-IgG- ELISA mit 5-stämmigem Sonikat im Vergleich zu gereinigten Flagella-Präparationen als Antigen.
a. Standardtest mit 5 C. pylori-Stämmen als Antigen; optische Dichte oberhalb 0,910 als Positivschwelle.
b. Vergleichstest mit gereinigten C. pylori-Flagella aus dem hinterlegten Stamm 84-182 (ATCC 53725) als Antigen in einer Konzentration von 100 ng/Vertiefung; optische Dichte oberhalb 0,080 als Positivschwelle.
c. Vergleichstest mit gereinigten C. pylori-Flagella aus dem nicht hinterlegten ausgewählten Stamm als Antigen in einer Konzentration von 500 ng/Vertiefung; optische Dichte oberhalb 0,090 als Positivgrenzwert.
d. Vergleichstest mit gereinigten C. pylori-Flagella aus dem nicht hinterlegten ausgewählten Stamm als Antigen in einer Konzentration von 100 ng/Vertiefung; optische Dichte oberhalb 0,090 als Positivgrenzwert.
e. Diese Patienten hatten bei histologischer Untersuchung C. pylori im Gewebe, C.pylori war aus Kultur isoliert und sie hatten Gastritis als Biopsiebefund.
f. Diese Patienten hatten kein C.pylori im Gewebe oder in der Kultur und hatten keine Gastritis.

BEISPIEL 8

Verwendung von gepoolten Gelfiltrations-Fraktionen von C. pylori-Flagella als Antigen im Test anstelle des 5-Stämme-Pools

Um zu bestimmen, welches der mit C. pylori-Flagella gebundenen Antigene diejenigen waren, auf die C. pylori-infizierte Personen reagierten, wurde eine Flagella-Präparation von einem willkürlich ausgewählten C. pylori-Stamm (demselben derartigen Stamm wie in Beispiel 7) durch Durchgang durch eine Gelfiltrations-Chromatographiesäule fraktioniert. Die verwendete Säule war eine Superose 12-Säule (Pharmacia Laboratories, Piscataway, NJ) in einem Pharmacia-Apparat für schnelle Proteinflüssigchromatographie (Pharmacia Fast Protein Liquid Chromatographic (FPLC) apparatus). Die Flagella-Präparation wurde in 20mM Tris-Puffer (ph 8,0) suspendiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,3ml/min, und es wurden über einen Zeitraum von 100 Minuten Fraktionen gesammelt. Der erste Peak hatte die Säule nach zwischen 20 und 30 Minuten passiert, und weitere Peaks waren nach 60 Minuten zu sehen. Die Analyse des Inhalts des ersten Peaks erfolgte durch SDS-PAGE und anschließende Silberanfärbung. Mit Hilfe dieses empfindlichen Anfärbmittels wurden nur 3 Banden für die den Peak wiedergebenden Fraktionen aufgelöst. Diese migrierten bei bei 63.000, 57.000 und 31.000 Dalton. Zur Gewinnung des ELISA wurden diese Fraktionen gepoolt, und diese Präparation wurde in einer Proteinkonzentration von 100 ng/Vertiefung der Mikrotiterplatte verwendet. Weitere Schritte in diesem Test waren exakt wie in Beispiel 1 angegeben. Die Ergebnisse des Vergleichs zwischen den IgG-Tests, wenn das Standard-5-Stämme-Antigen verwendet wurde und wenn die Gelfiltrationfraktionen der Flagella-Präparation verwendet wurden, sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 Vergleich der diagnostischen Effizienz des C. pylori-Serum-IgG ELISA mit 5-stämmigem Sonikat gegenüber der Gelfiltration der Flagella-Präparation als Antigen
a. Standardtest mit 5 C. pylori-Stämmen als Antigen; optische Dichte oberhalb 0,910 als Positivgrenze.
b. Vergleichstest mit ausgewählten Fraktionen von C. pylori- Flagella, die eine Gelfiltrationschromatographiesäule durchlaufen hatten, bei einer Konzentration von 100 ng/Vertiefung; optische Dichte oberhalb 0,100 als Positivgrenze.
c. Diese Patienten hatten bei histologischer Untersuchung C. pylori im Gewebe, C.pylori war aus Kultur isoliert und sie hatten Gastritis als Biopsiebefund.
d. Diese Patienten hatten kein C.pylori im Gewebe oder in der Kultur und hatten keine Gastritis.

BEISPIEL 9

Persistenz der Serum-Antikörder gegen C. pylori

Es wurden 5 Personen mit hohen IgA- oder IgG-Serum- Antikörperleveln gegen C. pylori für weitere Studien ausgesucht. Von jeder Person wurde eine zweite Probe nochmals untersucht, die wenigstens 1 Jahr nach der ursprünglichen Bewertung erhalten worden war (im Mittel 1,25 Jahre). Die mittleren Antikörperlevel in den ersten und zweiten Seren sind in Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 6 Persistenz der Serum-Antikörper gegen C.pylori bei 5 seropositiven Personen
a. Mittelwert ± Standarfehler des Mittelwerts
b. Serum 2, wenigstens 1 Jahr nach Serum 1 erhalten.
Die Level blieben bei allen 5 Personen stabil. Keines der Seren änderte sich während des Intervalls von sero-positiv nach seronegativ.

BEISPIEL 10

Sero-Konversion bei einem mit C. pylori zur Immunreaktion angeregten Freiwilligen

Einem Freiwilligen wurde C. pylori zugeführt und entwickelte Symptome für akute Gastritis mit Achlorhydrie (Magenanazidität) (siehe Morris und Nicholson; American Journal of Gaastroenterology, 1987; 82:192-199). Danach verschwanden seine Symptome wieder, jedoch entwickelte er chronische Gastritis und die C. pylori-Infektion persistierte. Es wurden Serum-Reihenproben gewonnen und auf Antikörper gegen C. pylori untersucht. Die Tests auf C. pylori-spezifisches IgG- und IgA waren exakt wie in Beispielen 1 und 2 beschrieben. Der Test auf IgM wurde genau wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer daß das Serum 1:400 verdünnt wurde, um eine nicht spezifische Reaktivität zu verringern. Das Serum-IgM wurde durch einen für IgM spezfischen Peroxidasekonjugierten Ziegenantikörper nachgewiesen, und die Reaktion wurde 60 Minuten entwickelt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 7 gezeigt. Die Sero-Konversion in Klasse IgA und IgG trat zwischen dem 60. und 431. Tag nach der Provokation durch das Experiment auf. Obwohl keine speziellen IgM-Sero- Konversionskriterien definiert wurden, ist der nahezu 4-fache Anstieg der optische Dichte zwischen Tag 8 und 22 nach der Immunherausforderung und der allmähliche Abfall signifikant. Es ist bemerkenswert, daß der Anstieg an C. pylori-spezifischen IgM im Laufe der Infektion deutlich früher erfolgt als die IgA- oder IgG-Antworten. TABELLE 7 Seroconversion gegen C. pylori-Antigene bei einem Freiwilligen, der mit C. pylori zur Antigenproduktion angeregt worden war.
a. Jeder gezeigte Wert ist der Mittelwert einer Dreifachbestimmung.
b. Serumverdünnung 1:800; Grenzwert für positive Bestimmung 0,910
c. Serumverdünnung 1:50; Grenzwert für positive Bestimmung 0,470.
d. Serumverdünnung 1:400; kein Grenzwert für die Positivität wurde angesetzt, aber Serum, das 22 Tage nach der Anregung erhalten worden war, zeigt einen nahezu 4-fachen Anstieg gegenüber früheren Proben.

BEISPIEL 11

Es wurden C. pylori-spezifische Testkits zum Nachweis von Antikörpern mit Hilfe verschiedener unterschiedlicher Techniken für die Detektion konstruiert. Ein Testkit für die Antikörperbestimmung bestand aus einem unterteilten geschlossenen Teil mit einer Vielzahl von Vertiefungen (Wells), Platten, die vor der Vewendung mit C. pylori-Antigenen beschichtet worden waren, und ELISA-Materialien für den Enzymnachweis, bestehend aus Peroxidase-markiertem Ziege-Anti-Human-IgG und einem Farbänderungsindikator, bestehend aus ABTS in McIlvain's Puffer mit 0,005 Prozent Wasserstoffperoxidn Selbstverständlich können auch andere Enzyme und Entwicklungsmittel verwendet werden. Beispielsweise könnte Ziege-Anti-Human-IgG, das mit alkaliner Phosphatase markiert wurde, in Verbindung mit p-Nitrophenylphosphat in Diethanolamin und Magnesiumchlorid-Puffer verwendet werden.
Ein zweites Testkit für den Nachweis von Antikörpern mit Hilfe der Western-Blot-Technik bestand aus einem Behälter, einer Abdeckung, Nitrocelluloseblatt und einem Polyacrylamid-Slab-Gel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat, oberflächenaktiven Stoffen, pH-Regulatoren, getrockneter fettarmer Milch und Materialien zur Enzymdetektion, und schließlich einem Farbumschlagindikator bestehend aus DAB in Tris mit Wasserstoffperoxid. Dieser Western-Blot-Analysekit enthält ebenfalls Peroxidasemarkiertes Ziege- oder Kaninchen-Anti-Human-Immunoglobulin und eine Quelle für C. pylori-Antigene. Ein anderer C. pylorispezifischer Testkit für den Nachweis von Antikörpern mittels indirektern Immunofluoressenz-Test kann einen abgeteilten Behälter mit C. pylori-Antigenen, Humantestserum&sub1; phosphatgepufferte Salzlösung und Fluorescein-konjugiertes Ziege-Anti-Human-IgG enthalten.
Schließlich verwendet noch ein weiteres C. pylori-spezifisches Testkit zum Nachweis von Antikörpern Liposomen und umfaßt einen Behälter, Human-Testserum, Fluoreszenzmarker- (oder Enzym- oder Substrat-)-gefüllte Liposomen mit C. pylori-Antigenen in ihrer Oberfläche und ein oberflächenaktives Mittel. In diesem Test kann der Behälter ein mit Ziege-Anti-Human-IgG vorbeschichtetes Röhrchen oder Well sein.
Die hierin verwendeten Termini und Beschreibungen sind nur zum Zwecke der Verdeutlichung ausgeführte bevorzugte Ausführungsbeispiele und sind nicht als Beschränkungen im Hinblick auf die vielen Variationen zu verstehen, die der Fachmann als möglich bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung, wie durch die nachfolgenden Ansprüche definiert, erkennen wird.

Claims

1. Antigenzusammensetzung zum Nachweis des Vorliegens von Antikörpern gegen Campylobacter pylori, wobei die Zusammensetzung an Antigenfragmenten von Campylobacter pylori angereichert ist, die durch Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel in Banden mit 63 000, 57 000 und 31 000 Dalton aufgetrennt werden.

2. Antigenzusammensetzung zum Nachweis des Vorliegens von Antikörpern gegen Campylobacter pylori, wobei die Zusammensetzung an Campylobacter-pylori-Antigenen angereichert ist, die durch ein Verfahren erhältlich sind, bei dem:

a) durch Scheren mechanisch von C. pylori Antigene entfernt werden und

b) im Anschluß daran die Konzentration an Antigenen erhöht wird, die durch Elektrophorese auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel in Banden mit 63 000, 57 000 und 31 000 Dalton aufgetrennt werden.

3. Verfahren zum Nachweis von Anti-C.-pylori-Antikörpern in einer Testprobe, bei dem:

a) die Probe mit der Antigenzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2 in Kontakt gebracht wird, welche in Gegenwart der Antikörper einen Antigen/Antikörperkomplex bildet, woraufhin

b) die Menge des in Schritt a) gebildeten Antigen/Antikörperkomplexes bestimmt wird.

4. Verfahren zum Nachweis von Gastritis oder peptischer Ulcuskrankheit, bei dem:

a) eine Probe einer Körperflüssigkeit von einem Patienten entnommen wird, der auf Gastritis oder peptische Ulcuskrankheit untersucht werden soll,

b) die Probe mit der Antigenzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2 in Kontakt gebracht wird, die in Gegenwart von Anti-C.-pylori-Antikörpern einen Antigen/Antikörperkomplex bildet, worauf

c) die Menge des in Schritt b) gebildeten Antigen/Antikörperkomplexes bestimmt wird.

5. Diagnostischer Kit zum Nachweis von Antikörpern gegen Campylobacter pylori, wobei der Kit die Antigenzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, ein Mittel zum Inkontaktbringen der Antigenzusammensetzung mit einer Probe, die vermutlich die Antikörper enthält, so daß ein Antigen/Antikörperkomplex gebildet wird, wenn die Probe die Antikörper enthält, und ein Mittel zum Bestimmen der Menge des gebildeten Antigen/Antikörperkomplexes aufweist.

6. Diagnostischer Kit zum Nachweis von Gastritis oder peptischer Ulcuskrankheit, wobei der Kit die Antigenzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, ein Mittel zum Inkontaktbringen der Antigenzusammensetzung mit einer Probe Körperflüssigkeit, die vermutlich Antikörper gegen Campylobacter pylori enthält, so daß ein Antigen/Antikörperkomplex gebildet wird, wenn die Probe die Antikörper enthält, und ein Mittel zum Bestimmen der Menge des gebildeten Antigen/Antikörperkomplexes aufweist.

7. Kit nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Mittel zum Bestimmen markiertes Anti-IgM umfasst.

8. Kit nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Antigenzusammensetzung auf einem Substrat immobilisiert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Probe Blut oder Serum ist.

10. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Antigen/Antikörperkomplex unter Verwendung eines markierten, für IgM spezifischen zweiten Antikörpers bestimmt wird.