DE60025605T2

DE60025605T2 - Synthetische antigene zum nachweis von syphilis

Info

Publication number: DE60025605T2
Application number: DE60025605T
Authority: DE
Inventors: Victoria Hoschton POPE; R. Arnold Monroe CASTRO; E. William Snellville MORRILL
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 2000-06-08
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2020-06-09
Also published as: JP4531314B2; WO2000075666A1; BRPI0011449B8; EP1185872A1; AU5475600A; AU771548B2; CA2375448A1; BR0011449A; CA2375448C; CN1195986C; JP2003501662A; RU2244933C2; BR0011449B1; ATE316245T1; EP1185872B1; DE60025605D1; CN1353815A

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereiche Mikrobiologie und Immunologie, und noch spezifischer betrifft sie Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweis, Diagnostizieren und Überwachen der Behandlung von Syphilis. Insbesondere betrifft die Erfindung synthetische Cardiolipin- und Lecithin-Antigenzusammensetzungen und ihre Verwendungen in Immuntestverfahren.
Hintergrund der Erfindung
Syphilis ist eine sexuell übertragene Erkrankung („STD" = „sexually transmitted disease"), verursacht durch das Bakterium Treponema pallidum. Über 100.000 Fälle der Syphilis bei Erwachsenen werden jedes Jahr weltweit berichtet. Die Erkrankung wird auch kongenital übertragen, was 3000 oder mehr Säuglinge jährlich beeinträchtigt. Das Versagen, eine Antibiotika-Behandlung in den frühen Stadien der Erkrankung zu erhalten, ermöglicht das Fortschreiten der Erkrankung durch den gesamten Körper, was oft zu einem nicht mehr umkehrbaren Schaden an Organen, zu Geisteskrankheit, Erblindung oder Tod führt. Die weltweite Ausbreitung des humanen Immundefizienz Virus (HIV) hat die Schwere der Syphilis als ein Gesundheitsproblem außerordentlich vergrößert, da genitale Geschwüre, die während der frühen Stadien der Syphilisinfektion erzeugt wurden, die sexuelle Übertragung von HIV erleichtern.
Der Ablauf der Syphilis wurde in Stadien unterteilt: Erstes, Zweites, latentes, Neurosyphilis und Drittes (spät). Ein infiziertes Individuum kann während der ersten zwei Stadien andere infizieren. Übertragung geschieht, wenn Bakterien von dem Geschwür einer infizierten Person auf die Haut oder die Schleimhäute des Genitalbereiches, des Mundes oder Anus eines sexuellen Partners verteilt wurden. T. pallidum-Organismen können auch durch gerissene Haut auf andere Körperteile passieren. In der tertiären Syphilis und Neurosyphilis ist die bakterielle Infektion nicht ansteckend, aber das Eindringen des Organismus in die Organe, Ge webe und das Hirn kann fatale Konsequenzen zur Folge haben, wie zum Beispiel ernsthafte kardiovaskuläre Abnormalitäten oder neurologische Erkrankung.
Eine vertikale oder transplazentare Syphilisinfektion kann während der ersten vier Jahre auftreten, nachdem eine schwangere Frau infiziert und nicht behandelt wurde. Obgleich eine adäquate Behandlung der Mutter normalerweise die kongenitale Syphilis verhindert, werden ungefähr 25% der menschlichen Föten, die einer T. pallidum-Infektion in utero ausgesetzt waren, als Totgeburten berichtet. Einige Säuglinge mit kongenitaler Syphilis haben Symptome bei der Geburt, aber die meisten entwickeln Symptome zwei oder drei Monate past partum. Diese Symptome umfassen Hautentzündungen, Ausschläge, Fieber, geschwollene Leber und Milz, Gelbsucht, Anämie und verschiedene Missbildungen. Während infizierte Säuglinge heranwachsen, können sie Symptome der Spätstadium-Syphilis entwickeln, einschließlich irreversibler Schäden an Knochen, Zähnen, Augen, Ohren und dem Gehirn.
Das erste Symptom der primären Syphilis ist ein Geschwür oder Schanker. Der Schanker erscheint innerhalb 10 Tage bis drei Monate nach Exposition und wird gewöhnlich auf dem Teil des Körpers gefunden, der dem Geschwür des infizierten Sexualpartners ausgesetzt war, wie dem Penis, Vulva, Vagina, Cervix, Rektum, Zunge oder Lippe. Da der Schanker nur einige Wochen bleibt und schmerzlos sein kann oder innerhalb des Körpers auftritt, kann er unbeobachtet verschwinden. Der Schanker verschwindet mit oder ohne Behandlung. Bei Personen, die unbehandelt sind, werden sekundäre Symptome ungefähr neun Wochen nach erscheinen der ersten Läsion auftreten.
Sekundäre Syphilis wird oft durch einen Hautausschlag gekennzeichnet, der durch braune Entzündungen, ungefähr von der Größe eines Penny's, charakterisiert ist. Da aktive Bakterien in diesen Wunden anwesend sind, kann jeder physikalische Kontakt, sexuell oder nicht-sexuell, mit der gerissenen Haut eines infizierten Individuums in diesem Stadium die Infektion verbreiten. Andere Symptome umfassen geringes Fieber, Müdigkeit, Kopfschmerzen, Halsentzündung, ungleichmäßiger Haarverlust und geschwollene Lymphknoten. Diese Symptome können mild sein und werden, wie bei dem Schanker der primären Syphilis, mit oder ohne Behandlung verschwinden. Wenn es zu keiner Behandlung kommt, tritt die infizierte Person dann in eine Latenzperiode ein.
Latente Syphilis ist durch das Fehlen von klinischen Symptomen oder abnormalen Befunden in der cerebrospinalen Flüssigkeit (CSF), in Verbindung mit positiven Resultaten der serologischen Tests, charakterisiert. Die frühe latente Syphilis, die innerhalb eines Jahres nach Infektion auftritt, ist möglicherweise übertragbar und Rezidive können auftreten, während die späte, latente Syphilis mit Immunität gegen Rezidiv und Resistenz gegen Re-Infektion verbunden ist.
Während der Frühstadien der Syphilisinfektion können Bakterien in das Nervensystem eindringen. Wenn keine Behandlung vorgenommen wird, kann sich Neurosyphilis entwickeln. Progression der Erkrankung zur Neurosyphilis kann bis zu 20 Jahre erfordern und einige Individuen, die Neurosyphilis haben, verfehlen es, erkennbare Symptome zu entwickeln, was die Diagnose sehr schwierig macht. Diejenigen, die Symptome zeigen, können über Kopfschmerzen, steifen Hals oder Fieber klagen, was aus einer Entzündung der Hirnhaut resultiert. Anfälle und Schlaganfallsymptome wie Taubheit, Schwäche oder visuelle Probleme können auch Neurosyphilispatienten beeinträchtigen.
Obgleich ungefähr zwei Drittel der T. pallidum-infizierten Individuen, die daran scheitern, eine Behandlung zu erhalten, keine weiteren Konsequenzen der Erkrankung erleiden werden, entwickelt ungefähr ein Drittel derjenigen mit unbehandelter latenter Syphilis die Komplikationen der späten oder tertiären Syphilis. In dem tertiären Stadium der Syphilis schädigen die Bakterien das Herz, Augen, Gehirn, Nervensystem, Knochen, Gelenke oder beinahe jeden anderen Teil des Körpers. Das tertiäre Stadium kann sich über Jahre oder sogar Dekaden hinweg erstrecken. Späte Syphilis resultiert üblicherweise in kardiovaskulärer Erkrankung, Geisteskrankheit, Blindheit oder sogar Tod.
Aufgrund der bisweilen ernsthaften und lebensbedrohlichen Auswirkungen der Syphilisinfektion und dem Risiko der HIV-Übertragung und Infektion, ist eine präzise und frühe Diagnose der Infektion unerlässlich. Jedoch wurde Syphilis manchmal als „der große Imitator" bezeichnet, weil seine frühen Symptome ähnlich zu denen von vielen anderen Erkrankungen sind. Daher verlässt sich ein Arzt normalerweise nicht allein auf den Nachweis der Anzeichen und Symptome der Syphilis, sondern ist auf Resultate der klinischen Tests angewiesen, einschließlich der mikroskopischen Identifizierung der Syphilisbakterien und analytischer Tests zum Sichtbarmachen der Syphilisinfektion in biologischen Proben.
Diagnose der Syphilis durch mikroskopische Identifizierung der Bakterien wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt. Ein Abstrich wird von der Oberfläche des Geschwürs oder Schankers genommen und unter einem speziellen „Dunkelfeld"-Mikroskop" untersucht, um den Organismus zu ermitteln. Die Dunkelfeldmikroskopie erfordert beträchtliche Geschicklichkeit und ist anfällig für Missinterpretation.
Aus diesen Gründen werden die meisten Fälle der Syphilis unter Verwendung nicht-treponemaler Tests zuerst serologisch diagnostiziert. Nicht-treponemale Tests weisen Substanzen nach, wie zum Beispiel Antikörper, die in Gegenwart einer T. pallidum-Infektion hergestellt werden. Die derzeit erhältlichen nicht-treponemalen Tests, die am meisten verwendet werden um einen Nachweis auf eine Syphilisinfektion festzustellen, sind der „Venereal Disease Research Laboratory „Venerische oder Geschlechtskrankheit-Forschungslabortests(VDRL)-Test" und der „Schnelle Plasma-Reagin (RPR)-Test". Der VDRL-Test verwendet Lipide, die aus natürlich auftretenden Quellen gewonnen wurden, um anti-lipoidale Antikörper nachzuweisen, die nach Infektion durch T. Pallidum erzeugt wurden. Diese Antikörper werden von dem Immunsystem des Individuums, das mit T. pallidum infiziert wurde gegen das Cardiolipin des T. pallidum-Organismus, erzeugt und können in dem Serum oder in der cerebrospinalen Flüssigkeit des Individuums gefunden werden.
Ein Nachteil der gegenwärtig erhältlichen nicht-treponemalen Tests ist die geringe Spezifität. Viele medizinische Beschwerden, einschließlich Mycoplasmeninfektion, Lungenentzündung, Malaria, akute bakterielle und virale Infektionen, und auch Immunerkrankungen können in den gegenwärtig erhältlichen Tests auf Syphilis falsch-positive Ergebnisse verursachen. Zum Beispiel verursacht die Verwendung eines intravenösen Medikamentes oder einer Autoimmunerkrankung Gewebeschädigung, die in der Freisetzung von Cardiolipin und der Herstellung von Anti-Cardiolipin-Antikörpern resultiert. Der Nachweis von diesen Anti-Cardiolipin-Antikörpern in einem nicht-treponemalen Test würde daher ein falsch-positives Ergebnis hervorrufen. Eine erfolgreiche Diagnose ist besonders für den Nachweis der Neurosyphilis problematisch.
Wenn diese existierenden Tests verwendet werden, ist aufgrund des Auftretens von falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnissen normalerweise eine Bestätigung unter Verwendung eines alternativen Analyseverfahrens wie der Mikroskopie oder einem Treponema-basierten serologischen Test erforderlich. Standard-treponemale Tests beinhalten den Fluo reszenz-Treponema betreffenden Antikörperabsorptionstest („FTA-ABS") und den FTA-ABS-Doppelanfärbungstest („FTA-ABS DS"). Obgleich Treponema-basierte Tests verwendet werden können, um ein positives Testergebnis zu bestätigen, sind diese Tests oft teuer, kompliziert und zeitaufwendig und können die Verwendung einer hoch anspruchsvollen wissenschaftlichen Geräteausstattung und eines ausgebildeten wissenschaftlichen Personals erfordern. Zusätzlich können Treponema-betreffende Tests nicht als Testverfahren zum Überwachen des Erfolgs einer Antibiotikatherapie verwendet werden, weil infolge der fortwährenden Gegenwart von Anti-T.pallidum-Antikörpern nach einer Behandlung bei ungefähr 85% der erfolgreich behandelten Individuen die Testergebnisse positiv bleiben, selbst sogar nach Ausrottung der Infektion.
US-A-4307074 offenbart ein synthetisches Cardiolipin, Ei-Lecithin und Cholesterin. British Journal of Cancer, Vol. 74, Nummer 1, 1996, Seite 43 bis 48 betrifft eine Lösung, die Tetramiristoylcardiolipin, Phosphatidylcholin und Cholesterin, in Chloroform-Methanol gelöst, umfasst. GB-A-1053504 betrifft eine ethanolische Lösung, die Cardiolipin, Cholesterin und Lecithin umfasst. Chemistry and Physics of lipids, IR, limeric, Band 3, Nummer 1, 1969, Seite 17 bis 77 beschreibt eine alkoholische Lösung, die Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin enthält. Technical Bulletin of the Registry of Medical Technologists, Vol. 3, Oktober 1963, Seite 171 bis 176 betrifft den Kline-Cardiolipin-synthetischen Lecithintest. Immunol Ser., Vol. 52, 1990, Seite 101 bis 124, Zusammenfassung, bestätigt, dass Wassermann-Antikörper die klassischen Cardiolipin-Antikörper im Syphilispatienten darstellen. Ann Vharm Spalte 57, Nummer 1, 1999, S. 68 bis 77, Zusammenfassung, bestätigt, dass der Kline-Test ein Agglutinationstest ist.
Daher wird ein Einzel-Test zum empfindlichen und präzisen Nachweis der T. pallidum-Infektion in einer Probe zur Diagnose der Frühstadium-Syphilis oder Neurosyphilis benötigt. Benötigt wird auch ein einfacher, billiger Test, der verwendet werden kann, um den Erfolg einer Syphilisbehandlung zu überwachen.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Antigenzusammensetzung und ein Verfahren zur Bestimmung der Treponema pallidum-Infektion und daher zum Diagnostizieren der Syphilis werden zur Verfügung gestellt. Die Antigenzusammensetzung umfasst eine Kombination oder ein Gemisch aus synthetischem Cardiolipin und synthetischem Lecithin. Die bevorzugte Antigenzusammensetzung beinhaltet auch ein Cholesterin. Die bevorzugte Antigenzusammensetzung beinhaltet weiterhin einen Alkohol. Der Alkohol löst die Lipide in der Antigenzusammensetzung, um eine Suspension zu bilden. Die Antigenzusammensetzung ist nützlich als ein Reagenz in Tests zur Bestimmung der Antikörper, die mit der T. pallidum-Infektion in einer biologischen Probe assoziiert sind, insbesondere einer Körperflüssigkeit wie Serum oder cerebrospinale Flüssigkeit. Die Antigenzusammensetzung ist bevorzugt ein Immuntestverfahren-Reagenz zur Bestimmung oder Messung von Antikörpern, die mit der T. pallidum-Infektion assoziiert sind.
Die noch weiter bevorzugte Antigenzusammensetzung umfasst aufgereinigtes, synthetisches Cardiolipin, synthetisches Lecithin, natürliches oder nicht-synthetisches Cholesterin und einen Alkohol. Die optimale Reinheit des synthetischen Cardiolipins und Lecithins in der Zusammensetzung ist 99% oder größer. Die optimale Reinheit des Cholesterins ist 98% oder größer, oder ist aschefrei. Die am meisten bevorzugte Antigenzusammensetzung enthält Tetramyristoylcardiolipin, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, Cholesterin und absoluten (100%) Ethanol. Die bevorzugte Konzentration nach Volumen des synthetischen Cardiolipins in der Zusammensetzung liegt zwischen ungefähr 0,02 bis 0,04%, weiter bevorzugt 0,03%. Die bevorzugte Konzentration nach Volumen des synthetischen Lecithins in der Zusammensetzung liegt zwischen ungefähr 0,11–0,16%, weiter bevorzugt 0,14%. Die bevorzugte Konzentration nach Volumen des Cholesterins in der Zusammensetzung ist ungefähr 0,9% und der Rest der Zusammensetzung ist der Alkohol.
Die hier zur Verfügung gestellte Antigenzusammensetzung ist auch im allgemeinen nützlich als ein in vitro-Forschungshilfsmittel, um Syphilis zu untersuchen. Noch genauer ist die Zusammensetzung nützlich in Testverfahren oder diagnostischen Kits, um die Anwesenheit einer T. pallidum-Infektion nachzuweisen, was diagnostisch oder prognostisch für das Auftreten oder die Wiederkehr der Syphiliserkrankung ist.
Das hier zur Verfügung gestellte bevorzugte Verfahren ist ein Immuntestverfahren zur Bestimmung von Cardiolipin-Antikörpern in einer biologischen Probe, wie Serum oder cerebrospinaler Flüssigkeit. In Übereinstimmung mit dem Verfahren wird die hier beschriebene Antigenzusammensetzung mit der biologischen Probe für eine ausreichende Zeitdauer kombiniert, unter Bedingungen, die die Bindung der anti-lipoidalen Antikörper in der Probe an eine synthetische Cardiolipin-Lecithin-Matrix ermöglichen, um einen Antikörper-Antigen- Komplex zu bilden. Dieser Komplex wird dann mit Hilfe von Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, nachgewiesen, wie den Ausflockungs- oder Mikroausflockungstests oder ähnlichem.
Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von Trägern der T. pallidum-Infektion zur Verfügung zu stellen, und daher die Ausbreitung von T. pallidum von einem Wirt zum anderen zu verhindern.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein empfindliches Verfahren zur Diagnose der frühen oder latenten Syphilis oder Neurosyphilis zur Verfügung zu stellen.
Es ist noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen schnellen, einfachen und billigen Test zum genauen Nachweis von T. pallidum zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine billig hergestellte Antigenzusammensetzung zur reproduzierbaren Messung oder zum Nachweis des T. pallidum zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Test zum Nachweis des T. pallidums zur Verfügung zu stellen, der Vorteile in der Standardisierung und Stabilität des VDRL-Antigens besitzt.
Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach einer Durchsicht der folgenden detaillierten Beschreibung der offenbarten Ausführungsformen und der angefügten Ansprüche offensichtlich werden.
Detaillierte Beschreibung
Eine Antigenzusammensetzung und ein Verfahren zum Nachweis von Treponema pallidum werden hier beschrieben. Die Antigenzusammensetzung beinhaltet ein Gemisch oder eine Kombination von synthetischem Cardiolipin und synthetischem Lecithin. Cardiolipin ist ein 1,3-Bis(phophatidyl)glycerin, das antigene Eigenschaften hat. Lecithin ist ein Phospholipid.
Die Antigenzusammensetzung beinhaltet auch vorzugsweise ein nicht-synthetisches (natürliches) Cholesterin. Ein Alkohol ist auch eine Komponente der bevorzugten Antigenzusammensetzung. Der Alkohol löst die Lipide, indem er dabei eine Suspension bildet. Synthetisches Cardiolipin und Lecithin haben eine optimale Reinheit von 99% oder höher. Das Cholesterin hat eine optimale Reinheit von 98% oder höher oder ist aschefrei. Die Antigenzusammensetzung ist nützlich als ein Reagenz in Tests zum Nachweis von Antikörpern, die mit der T. pallidum-Infektion in einer biologischen Probe assoziiert sind. Vorzugsweise ist die Antigenzusammensetzung ein Immuntestverfahren zum Nachweis oder zur Messung von Antikörpern, die von einem Patienten, der mit T. pallidum infiziert ist, hergestellt wurde, was ein diagnostisches oder ein prognostisches Anzeichen für das Auftreten oder die Wiederkehr der Syphilis ist.
Das hier beschriebene Verfahren ist ein Testverfahren zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Antikörpern in einer biologischen Probe, die mit einer Infektion eines Patienten durch T. pallidum assoziiert sind, besonders einer Körperflüssigkeitsprobe wie Serum oder cerebrospinaler Flüssigkeit. Das Verfahren erlaubt den Nachweis von zirkulierenden Antikörpern, die mit der T. pallidum-Infektion assoziiert sind, um eine T. pallidum-Infektion zu bestimmen oder zu überwachen. Ein bevorzugtes, hier zur Verfügung gestelltes Verfahren ist ein Immuntestverfahren. In Übereinstimmung mit dem bevorzugten Verfahren wird die Antigenzusammensetzung mit der biologischen Probe während einer ausreichenden Zeitdauer kombiniert, unter Bedingungen, die die Bindung der anti-lipoidalen Antikörper in der Probe an das Cardiolipin in der Antigenzusammensetzung ermöglichen, um Antikörper-Antigenkomplexe zu bilden. Diese Antikörper-Antigenkomplexe werden dann unter Verwendung von Verfahren nachgewiesen, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie zum Beispiel dem VDRL-Flockungs- oder -Mikroflockungstest, der mikroskopisch gelesen wird.
Definitionen
Die Begriffe „ein", „eine" und „der, die, das", wie sie hier benutzt werden, sind definiert, um „eine oder mehrere" zu bedeuten und beziehen den Plural mit ein, sofern der Zusammenhang nicht unpassend ist.
Der Begriff „Antikörper", wie er hier verwendet wird, beinhaltet monoklonale Antikörper, polyklonale, chimäe, Einzelketten, bispezifische, affenspezifische und menschenspezifische Antikörper sowie Fab-Fragmente, einschließlich der Produkte einer Fab-Immunglobulin-Expressionsbibliothek.
Die Ausdrücke „bindet spezifisch an" oder „spezifisch immunreaktiv mit" verweist, wenn sie auf einem Antikörper Bezug nehmen, auf eine Bindungsreaktion, die für die Anwesenheit des Antigens von Interesse bestimmend ist, in der Anwesenheit einer heterogenen Population von Peptiden, Proteinen, Lipiden und anderen biologischen Stoffen. So binden unter bestimmen Bedingungen des Immuntestverfahrens das vorgegebene Antigen oder die Antigene bevorzugt an bestimmte Antikörper und binden nicht in einer signifikanten Menge an andere Antikörper, die in der Probe vorhanden sind. Eine spezifische Bindung unter solchen Bedingungen erfordert ein Antigen, das wegen seiner Spezifität für einen bestimmten Antikörper ausgewählt wurde. Eine Vielzahl von Formaten der Immuntestverfahren können verwendet werden, um Antigene auszuwählen, die spezifisch immunreaktiv mit einem bestimmten Antikörper sind. Zum Beispiel werden Festphasen-ELISA Immuntestverfahren routinemäßig verwendet, um ein Antigen auszuwählen, das spezifisch immunreaktiv mit einem Antikörper ist. Siehe, Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, für eine Beschreibung der Formate der Immuntestverfahren und der Bedingungen, die verwendet werden können, um eine spezifische Immunreaktivität zu bestimmen.
Der Begriff „Antigen" betrifft eine Einheit oder ein Fragment davon, das eine Immunantwort in einem Säuger induzieren kann. Der Begriff beinhaltet Immunogene und Bereiche, die verantwortlich für Antigenität oder antigene Determinanten sind. Der Begriff „Antigenzusammensetzung", wie hier verwendet, betrifft eine Zusammensetzung, die synthetisches Cardiolipin und synthetisches Lecithin enthält. „Antigene Determinante", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Bereich eines Antigens, der von einem Antikörper erkannt wird.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Nachweisen" oder „Nachweis" auf eine qualitative oder quantitative Bestimmung der Anwesenheit des Biomoleküls, das unter Ermittlung ist.
Mit „isoliert" ist ein biologisches Molekül gemeint, das frei von zumindest einigen der Komponenten ist, mit denen es natürlicherweise auftritt.
Antigenzusammensetzungen
Die hier zur Verfügung gestellte Zusammensetzung beinhaltet eine Kombination, Suspension oder ein physikalisches Gemisch von einem oder mehreren synthetischen Cardiolipinen und Lecithinen. Eine bevorzugte Zusammensetzung enthält synthetisches Cardiolipin, synthetisches Lecithin und synthetisches oder nicht-synthetisches (natürlich auftretendes) Cholesterin. Eine weiter bevorzugte Zusammensetzung enthält synthetisches Cardiolipin, synthetisches Lecithin, natürliches Cholesterin und einen Alkohol.
Die bevorzugte Konzentration des synthetischen Cardiolipins in der Zusammensetzung liegt zwischen ungefähr 0,02 bis 0,04% nach Volumen, weiter bevorzugt 0,03% nach Volumen. Die bevorzugte Konzentration des synthetischen Lecithins in der Zusammensetzung liegt zwischen ungefähr 0,11 und 0,16% nach Volumen, weiter bevorzugt 0,14% nach Volumen. Bevorzugte Konzentration des natürlichen Cholesterins in der Zusammensetzung ist ungefähr 0,9% nach Volumen, und der Rest der Zusammensetzung ist Alkohol, vorzugsweise Ethanol, am meisten bevorzugt absoluter (100%) Ethanol.
Das synthetische Cardiolipin kann aus semi-synthetischen Lipidvorstufen synthetisiert werden, die von Pflanzenquellen abstammen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Cardiolipin Tetramyristoylcardiolipin, das von Quellen wie Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) kommerziell erhältlich ist.
Das synthetische Lecithin kann aus Sojabohnen oder Ei abstammen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lecithin ein 16:0-, 18:1-Lecithin, auch beschrieben als 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin oder 3-sn-phosphatidylcholin (sn bedeutet stereospezifisch numeriert), das auch von Quellen wie Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) kommerziell erhältlich ist.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung eine Suspension, die ungefähr 0,03% Tetramyristoylcardiolipin, 0,11–0,16% 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und 0,9% natürliches Cholesterin in absolutem Ethanol enthält. Das Cholesterin ist auch von kommerziellen Quellen wie Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) er hältlich. Der Alkohol kann von chemischen Zulieferern wie Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erworben werden.
Wenn sie zusammen mit Alkohol kombiniert werden, bilden das Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin eine Lipidmatrix oder -mizelle. Wie unten eingehender beschrieben, binden Antikörper, die mit dem Auftreten einer menschlichen T. pallidum-Infektion assoziiert sind, hier als Anti-Cardiolipin-Antikörper bezeichnet, an diese Lipidmizellen und bilden Antikörper-Antigenkomplexe. Daher kann der Nachweis oder Messung dieser Antikörper-Antigerilcomplexe dazu verwendet werden, um eine T. Pallidum-Infektion zu diagnostizieren. Ohne an die folgende Hypothese gebunden zu sein, wird vermutet, dass die Anti-Cardiolipin-Matrix-Antikörper an die hier beschriebene synthetische Antigenzusammensetzung mit größerer Spezifität und größerer Aktivität binden, als sie an natürlich vorkommendes Cardiolipin und Lecithin binden. Die synthetische Antigenzusammensetzung stellt dabei ein effizienteres, empfindlicheres und spezifischeres Mittel zur Verfügung, um Antikörper, die mit einer Syphilisinfektion assoziiert sind, nachzuweisen.
Es wird für einen Fachmann verständlich sein, dass eine oder mehrere Komponenten der Antigenzusammensetzung mit einer nachweisbaren Markierung gekennzeichnet werden können, um die direkte Messung oder den Nachweis der Antikörper-Antigenkomplexbildung zu erleichtern. Verschiedene Arten von Markierungen und Verfahren zur Konjugierung der Markierungen an die Antigenzusammensetzung sind dem Fachmann bekannt.
Die Antigenzusammensetzung kann auch als ein Forschungswerkzeug für das Labor verwendet werden, um Anti-Cardiolipin-Antikörper herzustellen, zu isolieren oder aufzureinigen, und die Antikörper können verwendet werden, um Syphilis im allgemeinen zu studieren. Die Antigenzusammensetzung ist daher für Zwecke wie für in vivo- und in vitro-Diagnostika und für die Laborforschung nützlich.
Herstellung des VDRL-Antigens
Das VDRL-Antigen kann zum Beispiel durch Präparieren einer ethanolischen Lösung von Tetramyristoylcardiolipin bei einer Konzentration nach Volumen im Bereich von 0,02 bis 0,04%, weiter bevorzugt 0,03%, hergestellt werden. Eine ethanolische Lösung des synthetischen Lecithins, die eine Konzentration nach Volumen von ungefähr 0,11 bis 0,16% auf weist, weiter bevorzugt 0,14%, und eine ethanolische Lösung des natürlichen Cholesterins von 0,9% werden zu der Cardiolipinlösung hinzugefügt. Die Komponenten werden in der folgenden Reihenfolge hinzugefügt: Cardiolipin, Lecithin, Cholesterin und Ethanol auf das Volumen. Das Antigen wird solubilisiert und bei Raumtemperatur über Nacht aufbewahrt, bevor es getestet wird.
Nachweis der Anti-Cardiolipin-Antikörper
Das hier zur Verfügung gestellte Verfahren beinhaltet diagnostische und prognostische Verfahren zum Nachweis und Quantifizieren von Antikörpern, die fähig sind, an die oben beschriebene Antigenzusammensetzung zu binden. Diese Verfahren erlauben den Nachweis zirkulierender Antikörper gegen die Cardiolipin-Lecithin-Matrix, um die Anwesenheit einer T. pallidum-Infektion anzuzeigen und dadurch die Infektion zu diagnostizieren oder den Fortschritt eines Antibiotikum in der Behandlung der T. pallidum-Infektion zu überwachen.
Es gibt viele dem Fachmann bekannte Techniken zum Nachweisen oder Messen von Antikörper-Antigenkomplexen, hier auch als Immunkomplexe bezeichnet. Die klassische Verfahren beruhen auf dem Reagieren einer Probe, die den Antikörper enthält, mit einer bekannten Überschussmenge des für den Antikörper spezifischen Antigens, dem Trennen des gebundenen und freien Antigens, und dem Bestimmen der Menge des gebundenen Antigens oder freien Antigens. Wenn freies Antigen gemessen wird, kann die Menge an gebundenem Antigen durch Subtrahieren der Menge des freien Antigens von der bekannten Startmenge berechnet werden. Oft ist das Antigen direkt oder indirekt mit einer Reportergruppe oder einer nachweisbaren Markierung gekennzeichnet, um die Bestimmung der Menge des Antikörper-Antigenkomplexes, wie hier beschrieben, zu unterstützen. Die Reportergruppe oder „Markierung" ist normalerweise eine fluoreszente oder radioaktive Gruppe oder ein Enzym. Die Markierung wird dann mit Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, nachgewiesen, wie zum Beispiel Spektrophotometrie, Szintillationszählung oder Durchflusszytometrie.
Das Antigen kann als Alternative an ein Festphasenkügelchen oder Partikel konjugiert werden, das gefiltert, zentrifugiert oder anderweitig von dem Gemisch entfernt wird, wie zum Beispiel durch magnetisches Entfernen eines metallischen oder magnetisierten Partikels. Das Anbringen des Antigens an Festphasenkügelchen, wie zum Beispiel Latexkügelchen, stellt einen neuen empfindlicheren und schnellen Träger-Agglutinationstest zur Verfügung.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Antigen durch das Cardiolipinmolekül an die Kügelchen angeheftet. Ein Verfahren zum Anheften des Antigens an die Kügelchen geschieht durch das Modifizieren des Cardiolipinmoleküls in solch einer Weise, dass es kovalent an die Kügelchen gebunden werden kann. Zum Beispiel kann eine Amingruppe an die terminalen Methylgruppen der Fettsäureketten des Cardiolipins angefügt werden. Das in dieser Weise modifizierte Cardiolipin kann an carboxylierte oder aminierte Latexkügelchen angefügt werden.
Ein bevorzugtes Immuntestverfahren zur Bestimmung von Anti-Cardiolipin-Antikörpern in einer Probe wird wie folgt durchgeführt. Eine Probe wird unter der Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, gesammelt oder gewonnen. Die Probe, die die zu ermittelnden Anti-Cardiolipin-Antikörper enthält, wird von einer biologischen Quelle gewonnen. Die Probe wird bevorzugt von einer biologischen Flüssigkeit gewonnen, wie zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt auf, Gesamtblut, Blutserum, Blutplasma, Speichel, cerebrospinale Flüssigkeit und ähnliches. Optimale diagnostische Ergebnisse werden gewonnen, wenn die Probe Serum oder spinale Flüssigkeit ist. Die Probe kann vor dem Immuntestverfahren gefiltert oder anderweitig manipuliert werden, um die Ergebnisse des Immuntestverfahrens zu optimieren.
Die Probe wird dann mit der hier beschriebenen Antigenzusammensetzung inkubiert, um einen Antikörper-Antigen-Immunkomplex zu bilden. Der Antikörper-Antigenkomplex wird dann unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, ermittelt. Der Begriff „ermitteln" oder „ermittelt", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Verwendung von bekannten Techniken zum Nachweis von biologischen Molekülen, wie zum Beispiel immunchemischen oder histologischen Verfahren. Solche Verfahren beinhalten immunologische Techniken, die monoklonale oder polyklonale Antikörper für die Lipide einsetzen, wie Enzym-verbundene Immunabsorbenstests (ELISA), Sandwichtests, durchflusszytometrische Tests, Radioimmuntests oder andere Arten von Tests, die Antikörper einschließen und dem Fachmann bekannt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsart des Verfahrens werden Anti-Cardiolipin-Antikörper in einer Probe unter Verwendung der hier beschriebenen synthetischen Antigenzusammensetzung in einem Flockungsstestverfahren ermittelt. Beispiele für bekannte Flockungstestverfah ren beinhalten den nicht-erhitzten Serum-Reagin-Test (USR), den schnellen Plasma-Reagin-10-mm-Kreiskartentest (RPR), den Toluidin-Rot nicht-erhitzten Serum-Test (TRUST) und das VDRL-Trägertestverfahren. Diese Testverfahren sind alle Flockungstests. Es wird von dem Fachmann verstanden werden, dass die Anti-Cardiolipin-Antikörper auch unter Verwendung der hier beschriebenen Antigenzusammensetzung in Koagulationstests, die weiterhin Trägerpartikel einsetzen, angewendet werden können. In einer weiter bevorzugten Ausführungsart des Verfahrens wird die synthetische Antigenzusammensetzung in einem VDRL-Trägertestverfahren verwendet, wie unten kurz beschrieben und noch genauer in „Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) Slide Test" (Geschlechtskrankheit-Forschungslaborträgertest), Kennedy, E.J. Jr. und Creighton E.T., 157–78 (1998) in „A Manual of Tests for Syphilis", 9. Edition, Larsen, S.A., Pope, V., Johnson, R.E. und Kennedy, E.J. Jr. (Herausgeber), American Public Health Association, Washington, D.C., das hier als Referenz aufgenommen ist.
Das VDRL-Trägertestverfahren wird wie folgt durchgeführt. VDRL-gepufferte Kochsalzlösung, die Formaldehyd, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl und destilliertes Wasser enthält, wird in ein Gefäß gebracht. Die Antigenzusammensetzung wird langsam bei konstanter Rate zu der Kochsalzlösung hinzu gegeben, während das Gefäß rotiert, und das Gemisch wird dann umgerührt, um die Bestandteile gründlich zu vereinigen und eine Suspension zu bilden. Die Probe, wie zum Beispiel Serum, wird in einen Paraffinring oder einen keramisch umringten Träger gebracht und ein Tropfen der Suspension der Antigenzusammensetzung wird hinzugefügt. Der Träger wird in Rotation gebracht, um die Probe und die Antigenzusammensetzung zu messen und wird dann mikroskopisch gelesen. Die Anwesenheit von Klumpen, Klumpenbildung oder Körnung zeigt Antikörper-Antigenbildung an. Serielle Verdünnungen der Antigensuspension können für eine qualitative Messung des Antikörpers in der Probe verwendet werden. Quantitative Bestimmungen können durchgeführt werden, indem der Test mit Standardkonzentrationen des Antikörpers durchgeführt wird und die Resultate der Probe mit den Resultaten, die von den Standards erzeugt wurden, verglichen werden.
Es wird verstanden, dass die Testverfahren so vorgesehen sind, dass sie die Verwendung von synthetischen Antigenzusammensetzungen, wie oben beschrieben, sowie synthetische Derivate von den hier beschriebenen Antigenzusammensetzungen beinhalten, vorausgesetzt, dass die Derivate antigene Aktivität beibehalten oder eine äquivalente antigene Aktivität aufweisen, und Spezifität für Anti-Cardiolipin-Antikörper aufweisen.
Kit zum Nachweisen der Anwesenheit von T. pallidum
Ein Kit zum Diagnostizieren oder anderweitigem Evaluieren einer Syphilisinfektion durch Nachweisen der Anwesenheit oder Menge von Anti-Cardiolipin-Antikörpern wird auch zur Verfügung gestellt. Der Kit kann in jeder Konfiguration, die dem normalen Fachmann gut bekannt ist, vorliegen und ist zur Durchführung eines oder mehrerer der hier beschriebenen Verfahren zum Nachweis von Anti-Cardiolipin-Lecithin-Matrix-Antikörpern in biologischen Proben oder zur Bestimmung oder Überwachung der T. pallidum-Infektion in einem Patienten oder Träger nützlich. Die Kits sind dadurch zweckmäßig, dass sie viele, wenn nicht alle der notwendigen Reagenzien zum Durchführen eines Tests zur Bestimmung der Syphilis-Antikörper in einer biologischen Probe bereitstellen. Die Reagenzien können vorab gemessen und in einer stabilen Form in Gefäßen aufbewahrt werden, oder auf einer Festphase, in oder auf der das Testverfahren durchgeführt werden kann, wodurch die Anzahl der Manipulationen, die von einem Individuum, das den Test durchführt, vorgenommen werden, minimiert werden. Zusätzlich kann das Testverfahren gleichzeitig mit einem Standard, wie eine vorbestimmte Menge eines Antikörpers, der in dem Kit eingeschlossen ist durchgeführt werden, so dass die Ergebnisse des Tests validiert oder gemessen werden können.
Der Kit enthält vorzugsweise die hier beschriebene Antigenzusammensetzung, die für die Bestimmung der Cardiolipin-Antikörper, die mit der T. pallidum-Infektion assoziiert sind, verwendet werden können. Der Kit enthält auch vorzugsweise Cholesterin und kann zusätzlich die geeigneten Reagenzien enthalten, die in der Bestimmung der Antikörper-Antigen-Komplexe helfen. Der Kit kann zusätzlich Ausstattungen zum sicheren Erhalt der Probe beinhalten, ein Gefäß zum Aufnehmen der Reagenzien, einen Puffer zum Verdünnen der Probe oder Reagenzien und kreisförmige Karten, wie die 10-mm-Träger oder 18 mm-kreisförmigen Karten, die in VDRL-, RPR- und TRUST-Testverfahren verwendet werden.
Der Testverfahrenkit beinhaltet, ist aber nicht begrenzt auf Reagenzien, die in den folgenden Techniken angewendet werden; Flockungstests wie USR, RPR und TRUST; Agglutinationstestverfahren; und Sandwich- oder ELISA-Testverfahren. Materialien, die in Verbindung mit diesen Techniken verwendet werden, beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, Mikrotiterplatten, Antikörper-beschichtete Streifen oder Messstäbchen zum schnellen Kontrollieren von biologischen Flüssigkeiten. Für jeden Kit wird der Meßbereich, Empfindlichkeit, Genauig keit, Sicherheit, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit des Tests ermittelt. Standardisierung kann unter Verwendung von Referenzkontrollseren erreicht werden, und das Titrieren der Seren zum Endpunkt oder ein Zusammenschluss von Seren kann verwendet werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsart verwendet der Testkit VDRL-Trägertechniken und stellt Instruktionen und die oben beschriebene Antigenzusammensetzung zur Verfügung. Der Kit ist für die Messung der T. pallidum-Infektion nützlich und, noch spezifischer, für die Messung von Antikörpern, die gegen Cardiolipin in biologischen Flüssigkeiten von Menschen gerichtet sind, die Symptome der Syphilis zeigen oder die ein Risiko für die Syphilisinfektion aufweisen.
Diese Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die in keiner Weise so ausgelegt werden sollten, daß sie Begrenzungen für den Anwendungsbereich hiervon bewirken. Es sollte im Gegenteil klar sein, dass der Einsatz von verschiedenen andere Ausführungsformen, Modifikationen und Äquivalenten hiervon möglich sein kann, die sich, nach dem Lesen der hier aufgeführten Beschreibung dem Fachmann von selbst ergeben.
Beispiel 1
Herstellung einer synthetischen Cardiolipin- und Lecithin-Zusammensetzung
Tetramyristoylcardiolipin, durch Silicagel-Chromatographie auf ungefähr 99% Reinheit aufgereinigt, wurde von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) in Pulverform bezogen. Die Endkonzentration des Natriumsalzes wurde durch Dünnschichtchromatographie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie auf Reinheit getestet. Die Probe wurde bei –20° aufbewahrt. Das Tetramyristoylcardiolipin wurde ursprünglich von semi-synthetischen Lipidvorstufen, die aus einer Pflanzenquelle stammen, synthetisiert.
Lecithin (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholin)-Pulver, durch Silicagel-Chromatographie auf eine Reinheit von ungefähr 99% aufgereinigt, wurde auch von Avanti Polar Lipids bezogen. Das Lecithin wurde ursprünglich aus Sojabohnen isoliert.
Eine 1,2%-ige Lösung von Cholesterin (Avanti Polar Lipids) in absolutem Ethanol wurde hergestellt und durch mit Alkohol ausgewaschenem Filterpapier #560 filtriert. Das Choleste rin stammte ursprünglich aus Wollfett und wurde durch Rekristallisation aufgereinigt und die Kristalle bei –20° C aufbewahrt.
Eine Antigenzusammensetzung wurde durch Kombinieren von synthetischem Cardiolipin mit synthetischem Lecithin, der Cholesterinlösung und dem Ethanol in dieser Reihenfolge hergestellt. Die Endkonzentration des synthetischen Cardiolipins war 0,02–0,03% nach Volumen. Die Endkonzentration des synthetischen Lecithins war 0,11–0,16% nach Volumen. Die Endkonzentration von Cholesterin war 0,9% nach Volumen und der Rest der Antigenzusammensetzung war Ethanol.
Beispiel 2
Vergleichende Analyse des synthetischen VDRL-Trägertestverfahrens gegen das konventionellen VDRL-Trägertestverfahren
Die Empfindlichkeit des VDRL-Trägertestverfahrens unter Verwendung der synthetischen Cardiolipin- und Lecithin-Zusammensetzung wie beschrieben in Beispiel 1, wurde mit der Empfindlichkeit des konventionellen VDRL-Trägertestverfahrens, wie beschrieben in „A Manual of Test for Syphilis", 9. Ausgabe, 159–77, Larsen, S.A., Pope, V., Johnson, R. E. und Kennedy, E.J. Jr. (Herausgeber), American Public Health Association, Washington D.C., verglichen. In Kürze, wurden 0,4 ml VDRL-gepufferte Kochsalzlösung (Formaldehyd, Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl und destilliertes Wasser) auf den Boden einer runden 30 ml Glasstopfenflasche mit einer flachen Innenbodenoberfläche oder eines 25 ml Glasstopfen-Erlenmeyerkolbens gegeben. Nachfolgend wurde 0,5 ml der Suspension der Antigenzusammensetzung direkt zu der Kochsalzlösung, mit einer Geschwindigkeit von 6 Sekunden/0,5 ml der Antigensuspension hinzugegeben, während die Flasche kontinuierlich rotierte. Die Rotation wurde zehn Sekunden fortgeführt, bis 4,1 ml der gepufferten Kochsalzlösung hinzugefügt worden war. Die Flasche wurde fest verschlossen und von oben bis unten ungefähr dreißig mal in zehn Sekunden durchgeschüttelt. Die Antigensuspension wurde innerhalb von acht Stunden verwendet.
Die qualitativen Tests wurden durchgeführt, indem 50 μl Serum unter Verwendung einer Sicherheitspipettierhilfe in einen Paraffinring oder keramisch umringten Träger gegeben wurde. Die Antigensuspension wurde vorsichtig resuspendiert und ein freifallender Tropfen (17 μl) wurde hinzugefügt. Der Träger wurde auf einen mechanischen Rotator für vier Minuten bei 180 ±2 U/min plaziert. Der Träger wurde sofort entfernt und mikroskopisch gelesen, unter Verwendung von 10X-Okularen und einem 10X-Objektiv. Resultate wurden wie folgt berichtet: reaktiv – mittlere oder größere Klumpen, schwach oder minimal-reaktiv – kleine Klumpen, nicht-reaktiv – keine Klumpenbildung oder eine sehr leichte Körnung. Quantitative Tests wurden ähnlich mit seriellen, zweifachen Verdünnungen des Serums durchgeführt.
Die Ergebnisse, die in Tabelle 1 unten ausgegeben sind, zeigten, dass der Test unter Verwendung der synthetischen Antigenzusammensetzung sensitiver war als der Test unter Verwendung des Standard-VDRL-Antigens, das mit Hilfe von natürlichem Cardiolipin und Lecithin hergestellt worden war.
Tabelle 1 Vergleich der Empfindlichkeiten von natürlichem VDRL versus synthetischem VDRL-Testverfahren
Die Empfindlichkeiten des VDRL-Trägertestverfahrens unter Verwendung der synthetischen Cardiolipin- und Lecithin-Antigenzusammensetzung wie beschrieben in Beispiel 1, und des konventionellen VDRL-Trägertestverfahrens, wurden auch gegen das konventionelle RPR-Trägertestverfahren verglichen. Wie unten in Tabelle 2 und 3 gezeigt, war das Testverfahren unter Verwendung der synthetischen VDRL-Antigenzusammensetzung reaktiver mit Proben, die den RPR-Test verwendeten, als das Testverfahren, welches das nicht-synthetische VDRL-Antigen verwendete.
Tabelle 2 RPR versus synthetisches VDRL
Tabelle 3 RPR versus natürliches VDRL
Beispiel 3
Vergleichende Analyse von synthetischem VDRL-Antigen und natürlichem VDRL-Antigen (Qualitativer Test)
Proben von 100 in einer Serenbank weggefroren Seren, reaktiv nach den nicht-treponemalen (RPR) Tests, wurden verwendet, um das CDC-synthetische VDRL-Antigen und ein Referenz-VDRL-Antigen (natürliches VDRL-Antigen) zu vergleichen. Die Serumproben wurden 30 Minuten bei 56°C Hitze-inaktiviert. Fünfzig Mikroliter von jeder Serumprobe wurden in einen korrespondierenden Paraffin- oder keramisch umringten Träger plaziert. Ein Tropfen (17 μl) jedes Antigens wurde in die entsprechenden Ringe des Trägers plaziert. Die Träger wurden in einen mechanischen Rotator gestellt und 4 Minuten bei 180 U/min rotiert und dann mikroskopisch gelesen. Der Grad der Flockung der zwei Antigene wurde beobachtet und aufgezeichnet.
Wie in Tabelle 4 berichtet (undokumentiert), waren alle Seren (100%), reaktiv nach RPR, reaktiv mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen, während nur 88% reaktiv mit dem natürlichen VDRL-Antigen waren.
Zusätzlich wurden das synthetische VDRL-Antigen und das natürlich VDRL-Antigen in dem gleichen Test unter Verwendung von 100 Proben von dokumentierten Syphilisfällen verglichen. Die Resultate von diesem Test sind auch in Tabelle 4 gezeigt (dokumentiert). Alle Ergebnisse von diesen Tests wurden mit Hilfe des SERODIA Treponema pallidum-Partikel-Agglutinationstest (TP-PA) (Fujirebio America, Inc., Fairfield, NJ) bestätigt.
Tabelle 4
Beispiel 4
Vergleichende Analyse von synthetischem VDRL-Antigen und natürlichem VDRL Antigen (Quantitativer Test)
Proben von 100 in einer Serenbank weggefrorenen Seren, reaktiv nach dem nicht-treponemalen (RPR) Test, wurden verwendet, um das CDC-synthetische VDRL-Antigen und ein Referenz-VDRL-Antigen (Natürliches VDRL-Antigen) zu vergleichen. Die Serumproben wurden zweifach in einem Teströhrchen mit 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt. Fünfzig Mikroliter von jedem der Röhrchenverdünnungen wurde auf die korrespondierenden Ringe eines keramischen oder Paraffin-umringten Trägers transferiert. Ein Tropfen (17 μl) von jedem Antigen wurde in die entsprechenden Ringe des Trägers plaziert. Die Träger wurden in einen mechanischen Rotator gegeben und 4 Minuten bei 180 U/min rotiert. Der Endpunkt-Titer von jedem der Serumverdünnungen wurde mikroskopisch gelesen. Ein Verdoppelungs verdünnungsunterschied wurde als ein Endpunkt von entweder (R) einem Antigen oder (N) für das andere Antigen definiert.
Wie in Tabelle 5 aufgeführt (undokumentiert), zeigte dieser Test, dass 85% der in einer Serenbank weggefrorenen, in dem RPR-Test reaktiven Seren, einen Endpunkt-Titer von der Hälfte oder eine Verdünnung größer mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen als mit dem natürlichen VDRL-Antigen hatten. In 15% der Fälle war der Endpunkt-Titer, der mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen gewonnen wurde, gleich dem, der mit dem natürlichen VDRL-Antigen gewonnen wurde. In keinem der getesteten Proben war der Endpunkt-Titer mit dem natürlichen Antigen größer als mit dem CDC-synthetischen Antigen.
Dieser Test wurde unter Verwendung von 100 Proben von dokumentierten Syphilisfällen wiederholt. Wie in Tabelle 5 gezeigt (dokumentiert), hatten 84% der Seren von dokumentierten Syphilisfällen einen Endpunkt-Titer von der Hälfte oder eine Verdünnung größer mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen als mit natürlichem VDRL-Antigen. In 7% der Fälle war der Endpunkt-Titer, der mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen gewonnen wurde, gleich dem, der mit dem natürlichen VDRL-Antigen gewonnen wurde, während in 3% der Fälle der Endpunkt-Titer des natürlichen VDRL-Antigens von der Hälfte oder eine Verdünnung größer war als der des CDC-synthetischen VDRL-Antigens. Die Ergebnisse dieser Tests wurden durch den TP-PA-Test bestätigt.
Tabelle 5
Beispiel 5
Vergleichende Analyse des Synthetischen VDRL-Antigens und des Natürlichen VDRL-Antigens (Qualitativer Test) in Patienten, die andere Krankheiten als die Syphilis haben
Proben von 100 Patienten, die Krankheiten anders als die Syphilis haben, wurden qualitativ unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 3 getestet. Diese Tests wurden durch den TP-PA-Test und den FTA-ABS-Test bestätigt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 6 aufgeführt, die zeigt, dass alle Proben sowohl mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen als auch mit dem natürlichen VDRL-Antigen nicht-reaktiv waren. Vier der Proben waren in dem TP-PA-Test reaktiv, aber nicht-reaktiv in dem FTA-ABS-Test.
Tabelle 6

R

= reaktiv;

N

= nicht-reaktiv

Beispiel 6
Vergleichende Analyse des Synthetischen VDRL-Antigens und des Natürlichen VDRL-Antigens (Qualitativer Test) in biologischen falsch positiven Proben
Proben von 50 Individuen wurden gewonnen, die ursprünglich als biologisch falsch-positiv klassifiziert worden waren (BFP). Diese Individuen testeten auf nicht-treponemale Test reaktiv und auf treponemale Tests nicht-reaktiv. Diese Proben wurden unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 3 getestet. Die Ergebnisse von diesem Test sind in Tabelle 7 gezeigt. Vier der Serumproben, die ursprünglich als BFP falsch klassifiziert worden waren, zeigten, dass sie reaktiv mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen, dem TP-PA- und dem FTA-ABS-Test waren. Drei von diesen vier Proben waren auch reaktiv mit dem natürlichen VDRL-Antigen.
Tabelle 7

R

= reaktiv;

N

= nicht-reaktiv

Beispiel 7
Vergleichende Analyse des Synthetischen VDRL Antigens und des Natürlichen VDRL-Antigens (Qualitativer Test) in unbekannten Proben
495 Proben mit keiner Patienten-Identifizierung wurden mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen und dem natürlichen VDRL-Antigen unter Verwendung des Verfahrens im Beispiel 3 oben getestet. Reaktive Proben wurden mit dem TP-PA-Test bestätigt, dem ELISA-Test für Syphilis IgG-Antikörper oder dem FTA-ABS-Test. Achtunddreißig Proben waren reaktiv in einem der treponemalen Tests und 457 waren nicht reaktiv. Wie in Tabelle 8 gezeigt, waren alle der Proben, die treponemal reaktiv waren, reaktiv mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen und 36 waren reaktiv mit dem natürlichen VDRL-Antigen. Von den 457 Serumproben, die treponemal nicht-reaktiv waren, waren 452 nicht-reaktiv mit dem CDC-synthetischen VDRL-Antigen und 450 waren nicht-reaktiv mit dem natürlichen VDRL-Antigen.
Tabelle 8

R

= reaktiv;

N

= nicht-reaktiv

Claims

Antigen-Zusammensetzung umfassend Tetramyristoylcardiolipin und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin.
Antigen-Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend Cholesterin.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Konzentration des Cholesterins ungefähr 0,9% ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, weiterhin umfassend einen Alkohol.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Cardiolipins zwischen ungefähr 0,02 und 0,04% liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Konzentration des Cardiolipins ungefähr 0,03% ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin zwischen ungefähr 0,11 und 0,16% liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Konzentration des 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin ungefähr 0,14% ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der Alkohol Ethanol ist.
Verfahren zum Nachweis anti-lipoidaler Antikörper im Menschen umfassend: Kombinieren einer biologischen Probe vom Menschen mit einer Zusammensetzung umfassend Tetramyristoylcardiolipin und 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und Nachweisen eines Immunkomplexes gebildet zwischen einem anti-lipoidalen Antikörper in der biologischen Probe und der Zusammensetzung.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zusammensetzung weiterhin Cholesterin und einen Alkohol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Konzentration des Cholesterins in der Zusammensetzung ungefähr 0,09% ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Alkohol Ethanol ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Konzentration des Tetramyristoylcadiolipin in der Zusammensetzung etwa zwischen 0,01 und 0,05% liegt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Konzentration des 1-Palmitoyl-2-Ooeoyl-sn-glycero-3-phosphocholin in der Zusammensetzung zwischen ungefähr 0,11 und 0,16% liegt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Nachweis eines Immunkomplexes zur Diagnose von Syphilis im Menschen benutzt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Immunkomplex unter Verwendung des Ausflockungs- oder Agglutinationstestes nachgewiesen wird.
Antigen-Zusammensetzung nach Anspruch 9, umfassend zwischen ungefähr 0,02 und 0,04% Tetramyristoylcardiolipin, zwischen ungefähr 0,11 und 0,16% 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, ungefähr 0,9% Cholesterin und Ethanol auf Volumen.
Antigen-Zusammensetzung nach Anspruch 18, umfassend ungefähr 0,03% Tetramyristoylcardiolipin, zwischen ungefähr 0,11 und 0,16% 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, und ungefähr 0,9% natürliches Cholesterin in absolutem Ethanol auf Volumen.
Verfahren nach Anspruch 10, zur Bestimmung anti-lipoidaler Antikörper in einem Menschen umfassend: (a) Bereitstellen einer biologischen Probe von einem Menschen (b) Kombinieren der biologischen Probe mit einer Zusammensetzung umfassend zwischen ungefähr 0,02 und 0,04% Tetramyristoylcardiolipin, zwischen ungefähr 0,11 und 0,16% 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin, ungefähr 0,9% Cholesterin und Ethanol auf Volumen; und (c) Nachweisen eines Immunkomplexes, gebildet zwischen einem anti-lipoidalen Antikörper in der biologischen Probe und der Zusammensetzung.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Nachweis des Immunkomplexes verwendet wird, um Syphilis im Menschen zu diagnostizieren.