DD214000A5 - Verfahren zur bestimmung von igg - Google Patents

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DD214000A5
DD214000A5 DD83254775A DD25477583A DD214000A5 DD 214000 A5 DD214000 A5 DD 214000A5 DD 83254775 A DD83254775 A DD 83254775A DD 25477583 A DD25477583 A DD 25477583A DD 214000 A5 DD214000 A5 DD 214000A5
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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an IgG, die bei einem neugeborenen Fohlen oder Kalb oder im Kolostrum einer Stute oder einer Kuh vorhanden ist, gezeigt. Bei dem Verfahren wird eine Koerperfluessigkeitsprobe mit biologisch inerten Latexteilchen in Beruehrung gebracht und die Menge der eintretenden Agglutination wird gemessen und die Menge an vorhandenem IgG bestimmt. Die Latexteilchen werden auf eine Endkonzentration von etwa 0,65 bis 2,0% (Gew./Vol) bei einem pH von etwa 7,5 bis 9,0 mit einem Puffer verduennt. Die Koerperfluessigkeit wird in einem Bereich von 0,01:12 Teilen bis 0,01:2160 Teilen (Vol/Vol) bei einem pH von etwa 7,5 bis 9,0 verduennt.

Description

Verfahren zur Bestimmung der bei einem neugeborenen Kalb, Fohlen oder in dem Kolostrum einer Kuh oder einer Stute enthaltenen Menge an IgG
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Neugeborene Menschen oder і?іэге erwerben Immunoglobuline t d· h. Antikörper, schon vor der Geburt durch die Plazentatrennwand hindurch. Insbesondere durch die Gegenwart solcher Immunoglobuline wird bei dem Neugeborenen ein ausreichendes Niveau an Antikörpern, um gegen. Infektionskrankheiten гезі-stent zu sein, zur Verfügung gestellt· Sin Typ eines Immunoglobulins, IgG, tritt schon зепг früh nach einem immunogenen Stimulus auf und dient dann aufgrund seiner hauptsächlich intravaskulären Verteilung аіз sine erste- Verteidigungslinie.
Ln Gegensatz hierzu erhalten Fohlen oder Kälber praktisch kein IgG innerhalb der Plazentaabgrenzung und haben bei der Geburt extrem niedrige Niveaus an IgG, was man als eine Hypogammaglobulinaraie bezeichnet. Diese Situation wird im allgemeinen im Anschluß an die Aufnahme von IgG-reicheia Kolostrum und dessen
-2 -
Absorption durch das intestinale Epitel umgekehrt. IgG muss durch Säugen innerhalb annähernd 24 Stunden nach der Geburt absorbiert werden; nach dieser Zeit wird IgG nicht mehr von den Eingeweiden absorbiert.
Die Absorption von Kolostrum-IgG ist für die gute Gesundheit von Fohlen oder Kälbern in der neonatalsn Zeit wesentlich. Werden keine ausreichenden Mengen an IgG absorbiert, dann ist dies einer der Hauptfaktoren für die Anfälligkeit von sonst normalen Fohlen gegenüber Infektionen und Tod (J. Am. Vet. Med. Ass., 166:71 (1975)).
Findet keine Übertragung von IgG statt, so muss dies genau und scbneil diagnostifiziert werden, so dass man entscheiden kann ob eine Therapie möglich ist ode: ob man das Tier aufgibt. Die Therapie kann Injektionen von IgG sinschliessen.
Zahlreiche Aufsätze befassen sich mit einem Immunoglobulintest unter Anwendung eines "Latexflockungstests", d.h. der Ausflockung von Polystyrollatexteilchen. Bei diesem Test werden im allgemeinen Latexteilchen mit einer antigenen Substanz, z.3. Hormonen, oder mit Blutproteinen, wie Albumin oder Immunoglobulin, wie IgG und IgM, beschichtet. Die Latexteilchen sind negativ geladen und das Protein wird durch ein Adsorptionsphäncmen gebunden. In einer zweiten Stufe gibt man ein zweites Reagenz zu, durch welches die
30 überzogenen Latexteilchen agglutinieren.
In Aust. Vet. J., 56:513 (1980) wird ein Versuch zum Nachweis der Adsorption von Kolostrum-Immunoglobulinen bei neugeborenen Fohlen beschrieben. Bei diesem Test werden Latexteilchen und Antiserum mit gereinigtem Pferdeimmunoglobulin vermischt, um auf diese Weise Latexteilchen mit Anti-Pferd-IgG-Antikörpem zu überziehen. Nach dem Inkubieren werden die beschichteten Latexteilchen von ni'cht-adsorbiertem Anti-Pferd-IgG mit frischem Puffer freigewaschen und mit Puffer rekonstituiert. Die Antikörper-Latex-Mischung wird dann zu der Testprobe von Fohlenplasma gegeben. Die Entwicklung eines griesigen, weis sen Agglutinationsmusters ist ein positiver Test für die Anwesenheit von Immunoglobulin.
In Am. -J. Med., 2^:338-393 (1956) wird die Anwendung des Latexflockulationstests auf die serologische Diagnose von rheumatoider Arthritis beschrieben, wobei ein igM-Immunoglobulin, das als rheumatischer Faktor (RF) bekannt ist, verwendet wird. Bei.diesem Test werden zunächst latexteilchen mit humanem Gammaglobulin beschichtet. Nach dem .Inkubieren werden die beschichteten Latexteilchen von unadsorbiertem Gammaglobulin mit frischem Puffer freigewaschen und dann mit Puffer 5 rekonstituiert. Die Gammaglobulin-Latex-Mischung wird dann zu einer Serunprobe eines Patienten mit rheumatischer Arthritis gegeben. In 71 % der Fälle von Patienten mit Arthritis trat eine Agglutination ein. Wurde der Test so modifiziert, dass man eine Latex-0 teilchensuspension und das Serum ohne Gammaglobulin vermischte, dann verursachten nur 11.% der rheumatischen
• » « β.
-4- 12.12.1933
AP G 01 S/254 775/8 62 972/13
Seren eine .Agglutination.
In US-PS 3 038 375 wird ein Latexflockungstest für ein "G-reaktives" Protein, das hauptsächlich im Serum von Patienten mit aktiven Entzündungen oder gewebezerstörenden Krankheiten auftritt, beschrieben. Bei diesem Test werden die Latexteilchen mit humanem Gammaglobulin vermischt und auf 57 0C erwärmt. Die mit dem Antikörper überzogenen Latexteilchen werden dann mit dem verdünnten Serum eines Patienten vermischt, Eine Agglutination zeigt das Vorhandensein des C-reaktiven Proteins an.
In US-PS 3 551 555 wird ein Test beschrieben, den man zum Nachweis eines Antigens, wie humanem Choriongonadotropin, verwenden kann. Dabei werden Latexteilchen zunächst mit einem inerten Protein, wie Albumin oder Lactalbumin, überzogen und anschließend mit entweder einem Antigen oder einem Antikörper beschichtet. Die Protein-Antikörperoder Protein-Antigen-beschichteten Latexteilchen werden dann mit einem verdünnten Serum des Patienten vermischt. Eine Agglutination zeigt die Gegenwart eines Antigens
In allen vorerwähnten Druckschriften werden zunächst Latexteilchen mit einem proteinhaltigen Material beschichtet und dann werden die beschichteten Latexteilchen mit einem zweiten Reagenz umgesetzt, wobei das zweite Reagens Interlatexvernetzungen bildet, durch welche eine "Brücken"-Agglutination verursacht wird.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Bestimmung von IgG im Kolostrum einer Kuh,
-5- 12,12.1983
AP G 01 ϊϊ/254 775/3 62 972/18
Stute oder eines neugeborenen Kalbes oder Fohlens, mit dem auf einfache /»'eise sehr genaue Ergebnisse erzielt -werden können,
Darlegung; des ffesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem das Niveau von Sohlen- oder Kälber-IgG oder das Niveau von IgG im Kolostrum von einer Stute oder einer Kuh bestimmt werden kann, ohne daß san eine Antikäroer-Anti^en-Reaktion anwenden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sachweis des Niveaus von IgG bei neugeborenen Fohlen und Kälbern odar im Kolostrum einer Stute oder einer Kuh· Das Verfahren umfaßt die Stufen, bei denen man eine Körperflüssigkeitsprobe mit biologisch inerten Latexteilchen in Berührung bringt, die Menge der stattfindenden Agglutination mißt und die Menge des in der Probe vorhandenen IgG bestimmt. Die Letexteilchen werden auf eine ündkonzentration von etwa 0,65 bis 2,0 % (Gew./VoI9) bei einem pH von etwa 7,5 bis 9,0 mit einem Puffer verdünnt. Die Körperflüssigkeit wird auf einen Bereich von etwa 0,01 ; 12 feilen bis 0,01 : 21o0 *eilen (VoI,/Vol.) bei einem pH von etwa 7,5 Ьіз 9,0 verdünnt.
Die kritischen Ыеѵеаиз an IgG scheinen die folgenden zu sein: Unterhalb 200 mg/dl besteht die Notwendigkeit für eine Therapie; zwischen 200 und 400 mg/dl ist eine 2harapie fraglich und Mengen oberhalb 400 mg/dl reichen aus. Das beanspruchte Verfahren ermöglicht eine einfache Messung dieser Uiveaus.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Latexteilchen können alle geeigneten biologisch inerten Teilchen sein. Ge-
-6- 12.12.1983
AP Q 01 ϊί/254 775/3 62 972/18
eignete Teilchen schließen Polyvinyltoluol, 8tyrol-Butadien-Latex, Styrol-Divinylbenzol-Latex, Äcryllatex und Polystyrollatex ein« Die Latexteilchen können zwischen 0,109 und 0,81/Um groß sein·
Die Latexteilchen sind im Handel als Suspensionen, z· 3. als eine 10/iige wäßrige (w/v) Latexlosung erhältlich und können mit einem geeigneten Puffer verdünnt werden· Geeignete Puffer sind solche, die eine ausreichende WasserlÖslichkeit und eine hohe Pufferkapazität bei einem pH von etwa 7,5 bis 9 aufweisen. Geeignete Puffer sind beispielsweise Borat-physiologische Kochsalzlösung, Glyzin-physiologische Kochsalzlösung und H,I-Bis-2-hydroxethyl-Glyzin·
Einen geeigneten Boratpuffer erhält man aus 12,2 mMol Ua3B4Oy und 7,1 mMol HCl/cm · Zu dem Borat wird eine Kochsalzlösung mit einem Gehalt von 0,08* bis 10 % (Gew./Vol) zugegeben. Ein bevorzugter Bereich liegt zwischen 0,3 und 1,25 Gew.-/β. Gewünschtenfalis kann man den Puffer aus Boratphysiologischer Kochsalzlösung herstellen aus 50 ccr Q,IM Borsäure und 5»9 ml 0,Ш NaOH, aufgefüllt auf 100 cm^ mit Wasser und auf einen pH von etwa 3,2 eingestellt, wobei man dann 0,35 g JSaCl pro 100 ml des Puffers zugibt·
Ein geeigneter Glyzin-physiologische Kochsalzlösung-Puffer ist 0,1M mit einem pH von 8,2 und enthaltend 10 g HaCl/1, Die Latexteilchen werden auf eine Endkonzentration von 0,65 bis 2 Gew.-% (w/v) bei einem pH von etwa 7,5 bis 9,0 verdünnt.
Die Kürperflüssigkeit kann Blutplasma, Blutserum oder Gesamtblut eines neugeborenen Fohlens oder Kalbs sein oder sie kann aus dem Kolostrum einer Stute oder Kuh stammen. Die Körperflüssigkeit wird auf einen Bereich von 0,01:12 Teilen bis 0,01:2160 Teilen Körperflüssigkeit zu Puffer (Vol/Vol) mit einem der oben beschriebenen Puffer verdünnt.
Versuchsergebnisse haben die Wichtigkeit der Teilchengrössenbeschränkung auf 0,109 bis 0,31 jam ergeben. Mit abnehmender Latexteilchengrösse nimmt die Menge der Oberfläche erheblich zu und dann wird es schwierig, eine Agglutination nachzuweisen. Wenn die Latexteilchengrösse ansteigt, dann nimmt die Oberfläche erheblieh ab.
Ähnliche Überlegungen betreffen die 0,65 bis 2,0 Gew.%-Begrenzung der Menge der vorhandenen Latexteilchen. Nimmt die Konzentration der Latexteilchen auf mehr als 2,0 Gew.% zu, dann lässt sich die IgG-Bestimmung nicht durchführen wegen der grossen Mengen an erforderlichem IgG. Nimmt die Konzentration an Latexteilchen auf weniger als 0,65 Gew.% ab, dann wird es zunehmend schwieriger, die Agglutination nachzuweisen.
Unter Anwendung der vorerwähnten Latexgrössen und -konzentrationen wurde festgestellt, dass man die zu untersuchende Körperflüssigkeit auf einen Bereich von 0,01:12 Teilen bis 0,01:2160 Teilen Körperflüssigkeit zu Puffer (v/v) verdünnen kann. Wird die Körperflüssigkeit auf mehr als 0,01:2160 Körperflüssigkeit
-8- 12.12.1983
ΔΡ С 01 Η/254 775/3 62 972/18
zu Puffer verdünnt, dann werden leuchen mit einer Größe von mehr als erforderlich, um innerhalb des gleichen IgQ-ITiveaus eine Agglutination zu bewirken und es wäre schwierig, mit einem solchen System zu arbeiten« Ist die Körperflüssigkeit konzentrierter als 0,01 : 12 Teilen Körperflüssigkeit zu Puffer, würden alle der vorerwähnten Größen von Latexteilchen schon bei unbedeutenden Niveaus von IgG agglutinieren.
Die richtige Verdünnung des Latex und des Serums mi sinem geeigneten Puffer kann von einem Fachmann, wie nachstehend beschrieben, in einfacher v/eise bestimmt werden. Ge mäß einer bevorzugten Ausführungsform werden Latexteilchen einer Größe von 0,22/Um auf eine ändkonzentration von 2,0 w.-?« verdünnt·
Aasführungsbeispiel
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.
Kontrollverfahren
Fohlenserumproben wurden von neugeborenen Fohlen etwa 6 bis Stunden nach der Geburt erhalten, Radialimmunodiffuaionslestkits ("RID"), erhältlich von Miles Laboratories Inc., 31khart, Indiana, USA, wurden in der nachfolgenden Weise verwendet. Das Kit enthielt Anti-Pferde-IgG, inkorporiert in gepufferter Agaröse. In die Agarose waren Löcher gestanzt ".vorden. iine
ausgewählte Standardmenge des zu inessenden Serums wurde in ein Loch gefüllt und die Standard-Kontiollproben wurden in die anderen Löcher gefüllt. Das Serum und die Agarose wurden bei Raumtemperatur während etwa 16 bis 24 Stunden inkubiert. Ein Niederschlagsring bildete sich um jedes der Löcher und zwar proportional der Menge an vorhandenem IgG. Der Durchmesser der Ringe wurde gemessen und gegen die Konzentration auf halblogarithmischem Papier aufgetragen. Auf dieser Basis wurde die Menge an in den Serumproben enthaltenem IgG bestimmt.
15 Beispiel 1
Eine 10 %-ige (Gew./VoI) Lösung von Polystyrollatex-, teilchen mit einer Teilchengrösse von 0,22 um, wurde 1:5 (v/v) mit N ,N-Bis-2-hydroxyethylglyzin-Puffer (0,2M, pH 8/5) auf eine Endkonzentration von etwa 2 % (Gew./ VoI) verdünnt.
Für jeden Test wurden Duplikat-Fohlenserumproben, wie sie in dem Kontrollverfahren verwendet wurden, angewendet. Aus einer Testreihe wurde festgestellt, dass eine einfache Bestimmung der IgG-Niveaus möglich ist, wenn die Menge des erforderlichen Serums nicht mehr als etwa 4 bis б Tropfen beträgt. Basierend auf diesen Versuchen wurden. 5 μΐ Fohlenserum zu 8 ml N,N-Bis-2-hydroxyethylglyzin-Puffer (0,2M, pH 8,5) gegeben und gut vermischt (0,01 Teile der Probe zu 1 б Teilen Puffer, v/v) .
Jeder Tropfen in der verdünnten Latexteilchenmischung enthielt 0,025 ml; ein halber Tropfen des verdünnten Latex enthielt etwa 0Λ10 ml. Zwei Tropfen (mit jeweils 0,025 ml) der verdünnten Latexteilchenmischung wurden auf einen Glasobje!<tträger gegeben. Dazu wurde ein Tropfen Fohlenserum, in der vorerwähnten Weise verdünnt, gegeben und gerührt. Der Objektträger wurde sanft geschaukelt und hin- und hergedreht und die Mischung wurde auf das Auftreten einer Agglutination
beobachtet. Wenn nach etwa 10 Sekunden keine deutlich sichtbare Agglutination vorlag, wurde ein zweiter Tropfen des verdünnten Serums zugegeben und das iMischen in der gleichen Weise vergenommen. Dieses Titrierverfahren wurde fortgesetzt, bis eine Agglutination eintrat. Diese Verfahrensweise wurde für jede der Proben des verdünnten Fohlenserums wiederholt.
Die erhaltenen IgG-Agglutinationstests wurden mit den im Kontrollverfahren erzielten IgG-Tests verglichen
0 Die Testergebnisse werden nachfolgend in Tabelle 1 zusammengefasst.
• ·
- 11 -
Tabelle
RID IgG-Niveau mg/dl mg/dl Testmethode - Menge Serums des zugegebenen
>400 mg/dl mg/dl 1 Tropfen verdünntes fen verdünnter Latex Agglutination Serum/2 Trop- ; positive
>400 200-400 mg/dl 2 Tropfen; positive Agglutination
4:200 3 Tropfen; positive Agglutination
<200 4 Tropfen; positive Agglutination
Ά Tropfen; positive Agglutination
Unter Verwendung der in Tabelle 1 erhaltenen Kriterien wurde eine Reihe von 77 Fohlenproben nach dem erfindungsgemässen Verfahren untersucht und mit den IgG-Niveaus, wie sie in dem RID-Kontrollverfahren festgestellt wurden, verglichen. Die Ergebnisse werden nachfolgend zusammengefasst:
Tabelle 2
Zusammenfassung der Titrationsergebnisse.
Prozentsatz der gemeinsamen Ergebnisse innerhalb der einzelnen IgG-Niveaugruppen
IgG-Gruppe Niveau (RlD) mg/dl Anzahl der Proben in der Gruppe (Nr.) Test ν 1* /Proze erfahr 1,5* ntsatz en 2* Aggl 2,5* utinatii 3* эп, bez< 3,5* эдеп aui 4* : das 4,5* 5* 5,5*
>400 52 (8) 15,3t, (12) 2 3 4 (28) 53 % (4) 7,7 0 0 0 0 0 0
200-400 16 0 0 0 (2) 12,5 (9) 56,3% (3) 18,3% (1) 6,25% (D 6,25% 0 0
<20ü 9 0 0 0 0 0 0 (6) 60% (1) 10% 0 (2) 20%
zusammen 77 Proben
*Txopfen
Von insgesamt 77 untersuchten Proben lag das IgG-Niveau bei73 Proben (94,8 %) in Übereinstimmung mit den IgG-Niveaus, die bei dem RID-Kontrollverfahren erhalten wurden. Gleiche Ergebnisse erzielte man, wenn man die Genauigkeit dieses Testverfahrens mit dem in Eq. Vet., _6:109 (1974) beschriebenen ZnSO4-TeSt verglich.
Diese Testergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung von IgG-Niveaus einen hohen Genauigkeitsgrad aufweist im Vergleich zu einem anerkannten in der Praxis durchgeführten Test.
unter den speziellen angewendeten Reaktionsbedingungen, d.h. einer Latexteilchengrösse von 0,22 μΐη, verdünnt auf 2,0 % (Gew./VoI) und einem Körperflüssigkeit-zuPuffer-Verhältnis von 0,01 Teilen zu 16 Teilen (v/v), konnten die IgG-Niveaus in einfacher Weise unter Verwendung von bis zu 4,5 Tropfen der verdünnten Körperflüssigkeit bestiiront werden.
20
Beispiel 2
Von zwei Fohlen wurden Serumproben erhalten und durch den RID-Test wurde festgestellt, dass die IgG-Konzentration etwa 1.500 mg/dl bzw. etwa 0 bis 200 mg/dl betrug. Die Proben wurden vermischt unter Erhalt einer Serie mit den folgenden IgG-Niveaus (mg/dl): 750, 500, 375, 300, 250 und 166. Diese Serumproben wurden in der nachfolgenden Weise verwendet.
Eine 10 %-ige (w/v) Lösung von Polystyrollatexteilchen mit einer Teilchengrösse von 0,22 μΐη wurde auf 1:5 (v/v) mit einem N,N-Bis-2-hydroxyethylglyzin-Puffer (0,2M, pH 8,5) auf eine Endkonzentration von etwa 2 % (Gew./VoI) verdünnt.
Für jeden Test wurden 5 μΐ Fohlenserum mit der oben beschriebenen Konzentration zu б ml des obigen Puffers gegeben und gut auf eine Endkonzentration von 0,01 Teilen Serum auf 12 Teilen Puffer (v/v) vermischt. Ein Tropfen der verdünnten Latexmischung wurde auf einem Objektträger mit einem Tropfen des verdünnten Serums vermischt, geschaukelt und gedreht und auf Agglutination beobachtet. Trat keine Agglutination ein,
15 wurde eine zweite verdünnte Latexprobe (1 Tropfen)
auf dem Objektträger mit 2 Tropfen des verdünnten Serums vermischt. Wenn wiederum keine Agglutination eintrat, wurde das Verfahren mit 3 Tropfen des verdünnten Serums wiederholt. Die Testergebnisse werden nach-
20 folgend in Tabelle 3 gezeigt.
β ч » no»
Tabelle 3
mg/dl χ IgG (RID) Menge des Tropfen; zugegebenen Serums Agglutination
750 χ 2 = 1500 1 Tropfen; positive Agglutination
500 χ 2 = 1000 1 Tropfen; positive Agglutination
375 X 2 = 750 "I Tropfen; positive Agglutination
300 X 2 = 600 1 Tropfen; Tropfen; positive Agglutination Agglutination·
250 X 2 = 500 1 negative positive und 2 Tropfen; negativ, Tropfen; positive Agglutination
166 2 = 332 1 3
Die in Tabelle 3 gezeigten Testergebnisse wurden mit den Titrationsergebnissen des Beispiels 1 verglichen. Da die Titrationsergebnisse, wie sie in Tabelle 1 gezeigt werden, erhalten wurden unter Verwendung von 1 Tropfen Serum/2 Tropfen verdünntem Latex, wurden die in Tabelle 3 gezeigten Konzentrationen mit 2 multipliziert, um Tabelle 1 mit Tabelle 3 vergleichbar zu machen.
Die Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren von Beispiel 2 hinsichtlich der IgG-Niveaus mit den IgG-Niveaus, die durch das Titrationsverfahren von Beispiel 1 (die in Beziehung zu dem RID-Kontrollverfahren stehen) in enger Beziehung steht. Beispielsweise ergaben bei einem
30 Niveau von 160 mg/dl IgG (x 2 = 332 mg/dl) 3 Tropfen des Serums eine positive Agglutination; dies liegt
л.
innerhalb des Bereiches von 200 bis 400 ml/dl, wie es durch die Agglutination mittels 3 Tropfen in Tabelle 1 gezeigt wird. Ähnliche Ergebnisse liegen auch bei den anderen IgG-Niveaus vor
5
Es ist klar, dass bei Durchführung des in Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens die Agglutination der Körperflüssigkeit und des Latex festgestellt und das Niveau an IgG in den Proben daraus bestimmt wer-
10 den kann. Ein Fachmann kann die Konzentration des
Puffers und die Grosse und die Konzentration der Latexteilchen, wie sie erforderlich sind, um die IgG-Niveaus in einer Körperflüssigkeit zu bestimmen, einstellen. Diese Niveaus können leicht optimiert werden, um einen
15 bequemen IgG-Test zu erhalten.
In den folgenden Beispielen wird ein grosser Bereich an Reaktionsbedingungen angewendet. Die Reaktionsbedingungen waren dabei nicht unbedingt optimal; deshalb
20 sind die erhaltenen Agglutinationswerte, d.h. die
IgG-Niveaus in vielen der Beispiele nicht direkt mit den Agglutinationswerten, wie sie in Beispiel 1 erhalten wurden, vergleichbar. In jedem der Beispiele wurde jedoch in dem Masse, wie die Menge an vorhandenem IgG in den Proben erhöht oder erniedrigt wurde, die Agglutination so verändert, dass das IgG nach dem beanspruchten Verfahren messbar war.
Wenn nicht anders angegeben, wurden die Konzentrationen 0 der in den nachfolgenden Beispielen erhaltenen Fohlenseren gemäss dem Beispiel 2 erhalten.
1J *? О
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um die Wirkung einer Veränderung der Teilchengrösse auf etwa 0,10 μΐη festzustellen, wurde das folgende Verfahren durchgeführt:
Beispiel 3
Eine 10 %-ige wässrige Lösung von Polystyrol-Butadien-Latexteilchen, mit einer Teilchengrösse von 0,109μΐΐι wurde mit demPuffer von Beispiel 1 im Verhältnis 1:15 auf eine Endkonzentration von etwa 0,67 % (Gew./VoI) verdünnt.
3ei jedem Test wurden 5 u.1 Fohlenserum zu β ml des obigen Puffers gegeben und gut auf eine Endkonzentration von 0,01 Teilen Serum auf 12 Teile Puffer (v/v) vermischt. Ein Tropfen der verdünnten Latexmischung wurde mit 1 , 2 oder 3 Tropfen des verdünnten Serums in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise vermischt. Die erzielten Versuchsergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
mg/dl IgG (RID)
750 X 2 = 1 500
500 X 2 = 1 000
375 X 2 = 750
300 X 2 — 600
Menge des zugegebenen Serums
1 Tropfen; negative,
2 Tropfen positive Agglutination
1 Tropfen; negative,
2 Tropfen; positive Agglutination
1, 2 Tropfen; negative,
3 Tropfen; positive Agglutination
1, 2, 3 Tropfen; negative Agglutination
Aus den obigen Daten geht hervor, dass in aera Masse , wie die Menge an in den Serumproben vorhandenem IgG abnahm, die Menge des für die Agglutination erforderlichen Serums anstieg. Die verkleinerte Latexteilchengrösse ergab eine entsprechende Erhöhung der Oberfläche, wodurch eine grössere Verdünnung der Latexteilchenkonzentration erforderlich wurde.
In den Beispielen 4 und 5 wurden die Fohlenserumpro-25 ben so verdünnt, dass man Serien mit IgG-Konzentrationen, wie sie in den jeweiligen Tabellen gezeigt werden, erhielt.
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Beispiel 4
Eine 10 %-ige wässrige Lösung von Polystyrollatexteilchen mit einer Teilchengrösse von 0,497 μΐη wurde im Verhältnis 1:5 mit dem Puffer von Beispiel 1 auf eine Endkonzentration von etwa 2 % (w/v) verdünnt.
Bei jedem Test wurden 5 μΐ Fohlenserum zu 108 ml des obigen Puffers gegeben und gut auf eine Endkonzentration von 0,01 Teilen Serum pro 216 Teilen Puffer (v/v) vermischt. Ein Tropfen des verdünnten Latex wurde mit 1, 2 oder 3 Tropfen des verdünnten Serums in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise vermischt. 'Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
mg/dl IgG (RID) Menge des Tropfen; zugegebenen Serums Agglutination r Agglutination
900 χ 2 = 1800 1 Tropfen; Tropfen; positive fragliche, positive Agglutination
370 χ 2 = 740 1 2 Tropfen; Tropfen; negative positive
200 χ 2 = 400 1 2
Die obigen Daten zeigen, dass in dem Masse wie das 30 in den Beispielen verwendete IgG abnahm, die Menge der für die Agglutination erforderlichen Serumprobe
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zunahm. Die Verdünnung der Serumprobe musste erhöht werden, weil durch die Erhöhung der Latexteilchengrösse eine Abnahme der Oberfläche der Latexteilchen erfolgte.
3eispiel 5
Eine 10 %-ige wässrige Lösung von Polystyrollatexteilchen mit einer Teilchengrösse von 0,807 μΐη wurde im Verhältnis 1:5 mit dem Puffer gemäss Beispiel 1 auf eine Endkonzentration von etwa 2 % (Gew./VoI) verdünnt. Sei jedem Test wurden 5 μΐ Fohlenserum zu 1030 ml des obigen Puffers gegeben und gut auf eine Endkonzentration von 0,01 Teilen Serum zu 2160 Teilen Puffer vermischt. Ein Tropfen des verdünnten Latex wurde auf einem Objektträger mit 1 bis 3 Tropfen des verdünnten Serums in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise vermischt Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle б
mg/dl IgG (RID) Menge des Tropfen zugegebenen Serums Agglutination
900 χ 2 = 1800 1 Tropfen Tropfen ; positive Agglutination Agglutination
370 χ 2 = 740 1 3 Tropfen ; negative ; positive Agglutination
200 x 2 = 400 3 ; negative
Aus den obigen Daten geht hervor, dass in dem Masse, wie die Menge an in den Serumproben enthaltenem IgG abnahm, die Menge an für die Agglutination erforderlichen Serumproben zunahm. Die obigen Daten zeigen weiterhin die Wirkung, die in Beispiel 4 gezeigt wird: eine Erhöhung der Latexteilchengrösse ergibt eine Abnahme der Oberfläche der Latexteilchen und dadurch wird eine weitere Erhöhung der Verdünnung der Serumprobe notwendig
10
Beispiel 6
10g Natriumchlorid wurden zu 1 1 des Puffers von Beispiel 1 gegeben, unter Erhalt eines N,N-Bis-2-hydroxyethylglyzin-physiologische Kochsalzlösung-?uffers. Eine 10 %-ige wässrige Lösung von Polystyrol-Butadien-Latexteilchen, mit einer Teilchengrösse von 0,109 μη,
20 wurde im Verhältnis 1:15 mit diesem Puffer auf eine Endkonzentration von etwa 0,67 % (Gew./VoI) verdünnt.
Bei jedem Test wurden 5 μΐ Fohlenserum zu β ml des obigen Puffers gegeben und gut vermischt. Ein Tropfen der verdünnten Latexlösung wurde auf einem Objektträger mit 1, 2 oder 3 Tropfen des verdünnten Serums, wie in Beispiel 1 beschrieben, vermischt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7
mg/dl X IgG (RID) Menge des Tropfen; zugegebenen Serums Agglutination
750 X 2 = 1500 1 Tropfen; positive Agglutination
500 X 2 = 1000 1 Tropfen; positive Agglutination
375 X 2 = 750 1. Tropfen; positive Agglutination
300 X 2 0 600 1 Tropfen; Tropfen; positive Agglutination
250 X 2 = 500 1 2 negative positive und 2 Tropfen; negative, Tropfen; positive Agglutination
166 2 = 332 1 3
Aus den obigen Daten geht hervor, dass in dem Masse, wie die Menge an in den Serumproben vorhandenem IgG abnahm, die Menge der für die Agglutination erforderlichen Serumprobe zunahm. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, die man durch eine Auswahl des Puffers erzielt. Die Zugabe der Kochsalzlösung zu dem Puffer bewirkt, dass die 0,109 μΐη Latexteilchen ähnlicher den 0,22 um Latexteilchen von Beispiel 2 als den 0,109 μΐη Latexteilchen von Beispiel 3 wirken.
Fohlenserumproben wurden zu einer Serie vermischt mit 300Ό mg/dl und 1500 mg/dl IgG, bestimmt durch den RID-Test,und in dem folgenden Beispiel verwendet.
Beispiel 7
Eine 10 %-ige wässrige Lösung von Polystyrollatexteilchen mit einer Teilchengrösse von 0,22 \xm wurde im Verhältnis von 1:5 mit einem Glyzin-Puffer (0,1M, pH 8,2) auf eine Endkonzentration von etwa 2 % (Gew./ VoI) verdünnt.
Bei jedem Test wurden 5 ці des Fohlenserums zu β ml des obigen Glyzin-Puffers gegeben und gut vermischt. Sin Tropfen des verdünnten Latex wurde auf einem Objektträger mit 1, 2 oder 3 Tropfen des in Beispiel 1 beschriebenen verdünnten Seruns vermischt. Dia Versuchsergebnissa werden in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8
mg/dl IcG (RID) 3000 χ 2 1500 χ 2
6000 3000
Menge des zugegebenen Serums
1 und 2 Tropfen? negative, 3 Tropfen; positive Agglutination
1,2 und 3 Tropfen; negative Agglutination
Wiederum erfolgt mit einer Abnahme der Menge des in der Serumprobe enthaltenen IgG's eine Zunahme der für die Agglutination erforderlichen Menge der Serumprobe. Die Gegenwart von Glyzin anstelle des Puffers
in dem vorhergehenden Beispiel macht die Gegenwart einer grossen Menge an IgG, um eine Agglutination hervorzurufen, erforderlich.
Beispiel 8
Eine 10 %-ige wässrige Lösung von Polystyrollatexteilchen mit einer Teilchengrösse von 0,22 μη wurde im Verhältnis 1:5 mit einem Glyzin-physiologische Kochsalzlösung-Puffer (0,1M, pH 8,2, 10 g Natriumchlorid pro Liter) auf eine Endkonzentration von etwa 2 % (w/v) verdünnt.
Bei jedem Test wurden 5 ml des Fohlenserums zu 6 ml des Glyzin-physiologische Kochsalzlösung-Puffers gegeben und gut vermischt. Ein Tropfen der verdünnten Latexteilchen wurde auf einem Objektträger mit 1, 2 oder 3 Tropfen des verdünnten Serums, wie in Beispiel 1 beschrieben, vermischt. Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle
mg/dl χ IgG (RID) Menge des Tropfen; zugegebenen Serums Agglutination
750 χ 2 = 1500 1 Tropfen; positive Agglutination
500 χ 2 = 1000 1 Tropfen; positive Agglutination
375 X 2 = 750 г Tropfen; positive Agglutination
300 X 2 = 600 1 Tropfen; Tropfen; positive Agglutination
250 X 2 = 500 1 2 negative, positive und 2 Tropfen; negative, Tropfen; positive Agglutination
166 2 = 332 1 3
Wiederum nahm in dem Masse, wie die Menge des in der Serumprobe vorhandenen IgG abnahm, die Menge der für die Agglutination erforderlichen Serumprobe zu. Dia Zugabe der Kochsalzlösung zu dem Glyzin-Puffer von Beispiel 7 erhöhte erheblich die Empfindlichkeit des IgG-Tests. Während Glyzin allein als Puffer eine grosse Menge an IgG für eine Agglutination benötigt, wies der obige Glyzin-Kochsalzlösung-Puffer eine Empfindlichkeit auf, die ähnlich der in Beispiel 2 (N,N-3is-2-hydroxyethylglyzin-Puffer) gezeigten war.
Beispiel 9
Eine 10 %-ige Lösung von Polystyrollatexteilchen mil
einer Teilchengrösse von 0,22 \im, wurde im Verhältnis 1:5 mit einem Borat-physiologische Kochsalzlösung-Puffer (0,125M, pH 8,4, 8,5 g Natriumchlorid/l) auf eine Endkonzentration von etwa 2 % (Gew./VoI)
5 verdünnt.
Der Borat-Kochsalzlösung-Puffer wurde hergestellt, indem man 50 cm3 einer4 0,1 M Borsäure und 5,9 ml einer 0,1N NaOH, aufgefüllt auf 100 cm3 mit Wasser und auf einen pH von etwa 8,2 eingestellt, vermischte und zu jeweils 100 ml des Puffers 0,85 g NaCl gab.
Bei jedem Test wurden 5 ml Fohlenserum zu 6 ml des Borat-Kochsalzlösung-Puffers gegeben und gut vermischt
15 Ein Tropfen des verdünnten Latex wurde auf einem
Objektträger mit 1, 2 oder 3 Tropfen des verdünnten Serums, wie in Beispiel 1 beschrieben, vermischt. Die Testergebnisse waren im wesentlichen die gleichen, wie sie für den Glyzin-Kochsalzlösung-Puffer von
20 Beisoiel 8 erhalten wurden.
Beispiel 10
Eine 10 %-ige wässrige Lösung von Polystyrol-Butadien-Latexteilchen mit einer Teilchengrösse von 0,109 um, wurde im Verhältnis 1:Ξ mit dem Puffer des Beispiels 1 auf eine Endkonzentration von etwa 2 % verdünnt.
Bei jedem Test wurden Fohlenserumproben, wie in Beispiel
1 beschrieben, hergestellt. 5 ml des Fohlenserums wurden zu 10 ml des obigen Puffers gegeben und gut vermischt. Ein Tropfen des verdünnten Serums wurde zu 1 Tropfen des verdünnten Latex, wie in Beispiel 1 beschrieben, gegeben. Die Testergebnisse werden in Tabelle 10 gezeigt.
Tabelle 10
mg/dl IgG /RID)
900 χ 2 = 1300 370 χ 2 = 740
Menge des zugegebenen Serums
4 Tropfen; positive Agglutination 7 Tropfen; positive Agglutination
200 χ 2 = 400 J 9 Tropfen; positive Agglutination
0 Die Agglutination konnte rückgängig gemacht werden durch Zugabe eines weiteren Tropfens des verdünnten Latex und dann erfolgte bei Zugabe von weiterem verdünnten Serum wiederum eine Agglutination. Dieser ümkenrvergleich der Agglutination zeigt, dass man den Endpunkt ganz genau festlegen kann.
- 28 -
Beispiel 11
Das Verfahren von Beispiel 1 und Beispiel 2 wurde wiederholt, unter Verwendung von Serum eines neugeborenen Kalbs anstelle von Fohlenserum. Die Testergebnisse zeigten, dass in dem Masse, wie die Menge an in den Serumproben vorhandenen Mengen an IgG abnahm, die Mengen der für die Agglutination erforderlichen Serumproben zunahmen. Die Testergebnisse zeigten, dass das erfindungsgemässe Verfahren zum Messen der Agglutination und zur Bestimmung der in der Kalbsserumprobe enthaltenen Menge an IgG geeignet ist.
Seispiel 12
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, unter Verwendung von Fohlengesamtblut und Kalbsgesamtblut anstelle von Fohlenserum. Die Testergebnisse zeigten, dass das erfindungsgemässe Verfahren verwendet wer 'en kann, um die Agglutination zu messen und um die in Fohlen- und Kalbsgesamtblut enthaltene Menge an IgG zu bestimmen.
Beispiel 13
0 Das Verfahren von Beispiel 1 kann mit Kolostrum anstelle von Serum wiederholt werden, um festzustellen, ob Kolostrum von einer Stute oder einer Kuh, die
gerade gefohlt oder gekalbt hat, in der Lage ist, Immunoglobulin auf ein neugeborenes Kalb oder Fohlen zu übertragen.
Ein geeignetes Kolostrum hat ein IgG-Niveau von annähernd 1000 mg/dl oder mehr. Um die Kolostrumprobe in den Bereich zu bringen, der annähernd dem Serumbereich von Beispiel T entspricht, wurde das Kolostrum im Verhältnis 1:5 mit einem geeigneten Puffer auf einen Bereich von etwa 200 mg/dl verdünnt.
Eine 10 %-ige (Gew./VoI) Lösung von Polystyrolteilchen mit einer Teilchengrösse von 0,22 цлі wurde im Verhältnis 1:5 (v/v) mit N,N-Bis-2-hydroxyethylglyzin-15 Puffer (0,224, pH 8,5) auf eine Endkonzentration von etwa 2 % (Gew./VoI) verdünnt.
Bei jedem Test wurden 5 ці-Proben des verdünnten Kolostrums zu 8 ml des obigen Puffers gegeben und dann gut auf eine Endkonzentration von 0,01 Teilen Kolostrum zu 16 Teilen. Puffer (v/v) verdünnt. Diese Lösung wird dann zum Titrieren von 2 Tropfen Latex wie in Beispiel 1 verwendet.

Claims (5)

1. Verfahren zur Bestimmung der bei einem neugeborenen Kalb, Fohlen oder in dem Kolostrum einer Kuh oder einer Stute enthaltenen Menge an IgG, gekennzeichnet durch die Stufen;
Kontaktieren einer Körperflüssigkeitsprobe von dem Neugeborenen oder dem Kolostrum mit biologisch inerten Latexteilchen, Messen der erhaltenen Agglutinationsmenge und Bestimmungen daraus der in der Probe enthaltenen Menge an IgG, wobei die Latexteilchen mit einer Teilchengröße von 0,109 bis 0,81уum mit einem Puffer auf eine Endkonzentration von etwa 0,65 bis 2,0 % (Gew./Vol.) bei einem pH von etwa 7,5 bis 9,0 verdünnt sind und wobei die Körperflüssigkeits- oder Kolostrumprobe mit einem Puffer im Bereich von 0,01 : 12 Teilen bis 0,01 ί 216O Teilen (Vol./Vol.) bei einem pH von etwa 7,5 bis 9,0 verdünnt ist·
2. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Körperflüssigkeit Blutplasma, Blutserum oder
Gesamtblut verwendet·
3. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, äaß man als Körperflüssigkeit Kolostrum verwendet·
4· Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man den Puffer aus der Gruppe Borat/Kochsalzlösung, Glycin/Kochsalzlösung und H,2J-Bis-2-hydroa^ethylglycin/ Kochsalzlösung auswählt.
-31- 12.12И933
AP G 01 Ш/254 775/3 62 972/13
5« Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Latexteilchen eine Teilchengröße von 0,22,um aufweisen und daß das Verhältnis von Körperflüssigkeit au Puffer 0,01 : 16 Teilen beträgt.
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