DK160591B - Fremgangsmaade til bestemmelse af den maengde igg, der er til stede i en nyfoedt kalv, et nyfoedt foel eller i kolostrum hos en ko eller en hoppe - Google Patents

Description

DK 160591 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af den mængde igG, der er til stede i en nyfødt kalv, et nyfødt føl eller i kolostrum hos en ko eller en hoppe.

5 Nyfødte mennesker og andre arter nyfødte har modtaget immunoglobuliner, dvs. antistoffer, tværs over placentabarrieren inden fødslen. Tilstedeværelsen af sådanne immunoglo-buliner tilvejebringer især tilstrækkelige antistofniveauer hos den nyfødte til opnåelse af resistens mod infektionssyg-10 domme. Én type immunoglobulin, IgG, fremkommer meget tidligt efter en immunogen stimulering, og sammen med dets væsentlige intravaskulære fordeling kan IgG tjene som en første forsvarslinie.

I modsætning hertil modtager føl eller kalve praktisk 15 taget ikke noget IgG tværs over placentabarrieren og har ved fødelen ekstremt lave niveauer af IgG, hvilket betegnes som hy-pogammaglobulinæmi. Denne situation ændres almindeligvis efter indtagelse af IgG-rigt kolostrum og absorption deraf gennem det intestinale epitel. IgG skal være absorberet ved die-20 givning i løbet af ca. 24 timer efter fødslen. Efter dette tidsrum absorberes IgG ikke længere i tarmen.

Absorption af kolostrum-IgG er essentiel for det gode helbred for føllet eller kalven i den nyfødte periode. Svigtende absorption af passende mængder IgG er den vigtigste fak-25 tor, der foruddisponerer i øvrigt normale føl for infektion og død, jfr. J. Am. Vet. Med. Ass., 166, 71 (1975).

Svigtende evne til overførsel af IgG bør diagnosticeres nøjagtigt og hurtigt således, at det kan afgøres, om dyret skal behandles terapeutisk eller aflives. Terapien kan omfatte 30 injektion af IgG.

I talrige tidligere artikler beskrives der en test for immunoglobulin under anvendelse af en "latex-flokkulations-test", f.eks. flokkulation af polystyren-latexpartikler. Testen omfatter almindeligvis overtrækning af latexpartikler 35 med et antigent stof, f.eks. hormoner, eller blodproteiner, såsom albumin, eller immunoglobuliner såsom IgG og IgM. La-

O

2 DK 160591 B

texpartikler er negativt ladet, og proteinet bindes ved hjælp af et adsorptionsfænomen. Et andet trin omfatter tilsætning af et andet reagens, der kan forårsage agglutination for de overtrukne latexpartikler.

5 I Aust. Vet. J., 5£, 513 (1980) er der beskrevet en test til detektering af absorption af kolostrum-immunoglo-buliner hos nyfødte føl. Testproceduren omfatter sammenr blanding af latexpartikler og antiserum til renset heste-im-munoglobulin til overtrækning af latexpartiklerne med anti-10 -heste-IgG-antistoffer. Efter inkubering vaskes de overtruk ne latexpartikler fri for uadsorberet anti-heste-IgG med frisk puffer og rekonstitueres med puffer. Antistof-latex-blandingen sættes derpå til forsøgsprøver af følplasma. Udviklingen af et grynet, hvidt agglutinationsmønster indike-15 rer en positiv test for tilstedeværelsen af immunoglobulin.

I Am. J. Med., 21, 888-893 (1956) beskrives omvendelsen af latex-flukkulationstesten til den serologiske diagnose af rheumatoid arthritis, idet der anvendes et IgM-immuno-globulin, der kendes som rheumatoid faktor (RF). Testproce-20 duren omfatter først overtrækning af latexpartikler med humant gammaglobulin. Efter inkubering vaskes de overtrukne latexpartikler fri for uadsorberet gammaglobulin med frisk puffer og rekonstitueres med puffer. Gammaglobulin-latex--blandingen sættes derefter til en serumprøve fra en patient 25 med rheumatoid arthritis. Når testen modificeres ved blanding af en latexpartikelsuspension og serummet uden gammaglobulin, forårsager kun 11% af rheumatoide sera agglutination.

I US patentskrift nr. 3.088.875 beskrives der en la-texflokkulationstest for et wC-reaktivt" protein, der alminde-30 ligvis findes i serum fra patienter med aktive inflammatoriske eller vævsødelæggende sygdomme. Testen involverer blanding af latexpartiklerne med humant gammaglobulin og opvarmning til 57°C. De med antistof overtrukne latexpartikler blandes dernæst med fortyndet serum fra en patient. Agglutination indi-35 kerer nærværelsen af det C-reaktive protein.

3

DK 160591 B

I US patentskrift nr. 3.551.555 beskrives der en test, der kan anvendes til detektering af et antigen, såsom humant choriongonadotropin, idet latexpartikler først overtrækkes med et indifferent protein, f.eks. albumin eller lactalbumin, og 5 derpå overtrækkes med enten et antigen eller et antistof. De med protein-antistof eller med protein-antigen overtrukne latexpartikler blandes derefter med fortyndet serum fra en patient. Agglutination indikerer nærværelsen af et antigen.

Ifølge alle de ovenfor nævnte litteratursteder er der 10 tale om først at overtrække latexpartiklerne med et proteinmateriale, hvorpå man omsætter de overtrukne latexpartikler med et andet reagens, idet det andet reagens i virkeligheden danner inter-latex-tværbroer, der igen forårsager "bro"-agglutination. I de nævnte litteratursteder er der ikke tale om an-15 givelse af eller noget forslag om, at niveauet af føl- eller kalve-IgG eller niveauet af IgG i kolostrum fra en hoppe eller en ko kan bestemmes uden anvendelse af en antistof-antigen--reaktion.

Opfindelsens formål er derfor at angive en fremgangs-20 måde til bestemmelse af den mængde IgG, der er til stede i en nyfødt kalv, et nyfødt føl eller i kolostrum hos en ko eller en hoppe uden anvendelsen af en antistof-antigenreak-tion. Dette formål opnås ved fremgangsmåden ifølge krav 1, der omfatter trin, hvorved man bringer en legemsvæskeprøve 25 fra det nyfødte dyr eller en prøve af kolostrum i kontakt med biologisk indifferente latexpartikler, måler den mængde agglutination, der fremkommer, og ud fra denne bestemmer den mængde IgG, der er til stede i prøven, hvorhos latexpartiklerne, der har en partikelstørrelse fra 0,109 til 0,81 30 μτ&, fortyndes med en puffer til en slutkoncentration fra 0,65 til 2,0% (vægt/rumfang) ved en pH-værdi fra ca. 7,5 til ca. 9,0 idet legemsvæske- eller kolostrum-prøven fortyndes med en puffer til et område fra 0,01:12 dele til 0,01:-2160 dele på rumfang/rumfangsbasis, ved en pH-værdi fra ca.

35 7,5 til ca. 9,0.

O

4

DK 160591 B

De kritiske grænser fra IgG synes at være følgende: under 200 mg/dl indikerer et behov for terapi, mellem 200 og 400 mg/dl er tvivlsomt, og over 400 mg/ml er tilstrækkeligt.

Den her omhandlede fremgangsmåde tilvejebringer en bekvem må-5 ling af disse niveauer.

De latexpartikler, der anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, kan være vilkårlige, egnede biologisk indifferente partikler. Egnede partikler omfatter polyvinyl--toluen, styren-butadien-latex, styren-divinylbenzen-latex, 10 acryl-latex og polystyren-latex. Latexpartiklerne har som nævnt en størrelse fra 0,109 til 0,81 Mm. Latexpartikler er kommercielt tilgængelige fra Dow Chemical Company, Midland, Michigan, Monsanto and Company, St. Louis, Missouri, Rhone-Poulenc,

Paris, Frankrig, og AB Bofors, Orebro, Sverige.

15

Latexpartiklerne er kommercielt tilgængelige i form af en suspension, f.eks. en 10%'s vandig (vægt/rumfang) latexop-løsning, og kan fortyndes med en egnet puffer. Egnede puffere er de, der er tilstrækkeligt opløselige i vand og har en høj pufferkapacitet ved en pH-værdi på fra ca. 7,5 til ca. 9.

20

Eksempelvis er borat-salt-opløsning, glycin-salt-opløsnxng og N, N-bis-2-hydroxyethyl-glycin egnede puffere.

En egnet boratpuffer kan fremstilles ud fra 12,2 mmol 3

Na2B40^ og 7,1 mmol HC1 pr. cm . En saltopløsning med fra O, 08 til 10% (vægt/rumfang) kan sættes til boratet. Et fore- 25 trukkent område er fra 0,3 til 1,25 vægt%. Om ønsket kan bo- 3

rat-saltopløsnings-pufferen fremstilles ud fra 50 cm 0,1 M

3 borsyre og 0,1 N NaOH, idet der fyldes op til 100 cm med vand, og pH-værdien indstilles på ca. 8,2. Der sættes 0,85 g

NaCl til hver 100 ml puffer.

30

En egnet glycin-salt-puffer er 0,1 M med en pH-værdi på 8,2 og indeholder 10 g NaCl pr. liter. Latexpartiklerne fortyndes til en slutkoncentration på fra 0,65 til 2% (vægt/-rumfang) ved en pH-værdi på fra ca. 7,5 til ca. 9,0.

Legemsvæsken kan være blodplasma, serum eller helblod 35 fra en nyfødt kalv eller et nyfødt føl, eller der kan anvendes kolostrum fra en hoppe eller en ko. Legemsvæsken

O

DK 160591 B

5 fortyndes til et område fra 0,01:12 dele til 0,01:2160 dele legemsvæsker:puffer på basis af rumfang/rumfang, idet der an- « vendes en puffer som ovenfor beskrevet.

Eksperimentelt arbejde har vist, at partikelstørrelses-5 begrænsninger på fra 0,109 til 0,81 pm er af betydning. Når latexpartikelstørrelsen formindskes, forøges mængden af overfladeareal kraftigt, hvilket gør det vanskeligt at detektere agglutination. Når latexpartikelstørrelsen forøges, formindskes overfladearealet kraftigt.

10 Lignende betragtninger gør sig gældende med hensyn til 0,65:2,0 vægt%-begrænsningerne for mængden af tilstedeværende latexpartikler. Når koncentrationen af latexpartik-ler forøges til mere end 2,0 vægt%, bliver IgG-bestemmelsen ugennemførlig på grund af de store mængder IgG, der kræves.

15 Når koncentrationen åf latexpartikler formindskes til mindre end 0,65 vægt%, bliver det i stigende grad vanskeligt at detektere agglutination.

Under anvendelse af latexpartikelstørrelser og koncentrationer som ovenfor beskrevet har det vist sig, at den 20 legemsvæske, der skal testes, skal fortyndes i området fra 0,01-12 dele til 0,01:2160 dele legemsvæske:puffer (på basis af rumfang/rumfang). Hvis legemsvæsken fortyndes til mere end 0,01:2160 legemsvæske:puffer, vil der kræves partikler større end 1 pm til agglutination inden for det samme IgG-niveau, og 25 de ville være vanskelige at arbejde med i systemet. Hvis legemsvæsken er mere koncentreret end svarende til 0,01:12 dele legemsvæske:puffer, vil enhver af de beskrevne størrelser latexpartikler blive agglutineret ved insignifikante niveauer af IgG.

30 Den rette fortynding af latex og serum med en egnet puffer kan let bestemmes af en fagmand på den i det følgende beskrevne måde. I en foretrukken udførelsesform anvendes der latexpartikler, der har en størrelse på 0,22 pm, fortyndet til en slutkoncentration på 2,0 vægt%.

35 I de følgende eksempler anvendes der, såfremt andet ikke er anført, latexpartikelopløsninger fra Dow Chemical Company.

DK 160591 B

O

6

Kontrolprocedure:

Prøver af følserum fås fra nyfødte føl ca*. 6 til ca.

8 timer efter fødslen. Radial-immunodiffusions-testsæt ("RID"), der er kommercielt tilgængelige fra Miles Laboratories, Inc., 5 Elkhart, Indiana, anvendes på følgende måde. Testsættet indeholder anti-heste—IgG inkorporeret i pufret agarose. Agarosen har huller udstanset deri. En valgt standardmængde af det serum, på hvilket der skal måles, anbringes i et hul, og standard-kontrolprøver anbringes i andre huller. Serummet og agarosen får lov at inkubere ved stuetemperatur i fra ca. 16 til ca. 24 timer. Der dannes en ring af udfældning omkring hvert af hullerne, idet hver ring er proportional med den tilstedeværende mængde IgG. Diameteren af hver af ringene måles og afsættes mod koncentrationen på 15 halvlogaritmisk papir. På basis heraf bestemmes den mængde IgG, der er til stede i serumprøverne.

Eksempel 1

En 10%'s (vægt/rumfang) opløsning af polystyren-la- 20 texpartikler med en partikelstørrelse på 0,22 Mm fortyndes i forholdet 1:5 (rumfang:rumfang) med N,N-bis-2-hydroxy- ethylglycin-puffer (0,2 M, pH = 8,5) til en slutkoncentra- tion på ca. 2% (vægt/rumfang).

Til hver test anvendes der følserum-prøver in duplo 25 som anvendt ved kontrolprocedurerne. Det bestemmes ud fra en række forsøg, at et bekvemt IgG-bestemmelsesniveau vil blive tilvejebragt, såfremt den nødvendige mængde serum ikke er større end ca. 4 til ca. 6 dråber. På basis af disse forsøg sættes der 5 ul følserum til 8 ml N,N-bis-2-hydroxy-30 ethylglycin-puffer (0,2 M, pH = 8,5), og der blandes grundigt (0,01 del prøve : 16 dele puffer, rumfang:rumfang).

Hver dråbe af den fortyndede latexpartikelblanding bestemmes at være 0,025 ml, og en halv dråbe af den fortyndede latex bestemmes at være ca. 0,10 ml. To dråber (hver 35 med en størrelse på 0,025 ml) af den fortyndede latexpartikelblanding anbringes på en glasplade. Én dråbe følserum,

O

7 DK 160591 B

der er fortyndet som ovenfor angivet, tilsættes, og der omrøres. Pladen trækkes og drejes forsigtigt frem og tilbage, og blandingen iagttages for agglutination. Såfremt der ikke er nogen klart synlig agglutination efter ca. 10 sekunder, 5 tilsættes der en yderligere dråbe fortyndet serum, og der blandes på samme måde. Denne titreringsprocedure fortsættes, indtil der fremkommer agglutination. Proceduren gentages for hver fortyndet prøve af følserum.

IgG-agglutinations-testresultaterne, der opnås, sam-10 menlignes med de IgG-testresultater, der opnås ved kontrolproceduren. De opnåede testresultater er sammenfattet i den følgende tabel.

Tabel I 15 RID IgG-niveau Testmetode - Tilsat serummængde >400 mg/dl 1 dråbe fortyndet serum/2 dråber fortyndet latex; positiv agglutination 20 ^400 mg/dl 2 dråber; positiv agglutination 200-400 mg/dl 3 dråber; positiv agglutination £ 200 mg/dl 4 dråber; positiv agglutination <200 mg/dl 4 dråber; positiv agglutination 25 Under anvendelse af de kriterier, der fremgår af ta bel I, testes en serie på 77 følprøver ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen og sammenlignes med de IgG-niveauer, der fastlægges ved RID-kontrolproceduren. Testresultaterne er sammenfattet i den følgende tabel.

30 35

8 DK 160591 B

ft Φ m Λ — dfi »•id Ο Ο es Ο ιη ^ "-'Μ ft ®

Φ X

Μ ιη ι0 Ο Ο Ο <σ 1¾ φ ο

OH dP

η φ ιη ft ιη Λ cs λ # X -»Id Ο ri ‘ ri Ο Φ -ςΓ η . 10 — Η Φ >9 +1 •m η <ιρ ft Φ in X r^CM Λ# l) d'-H) O ri * ID ο φ Φ η 10 w ΙΟ ft ft Ό ft φ 3 ιη ft Id ft

θ' Λ Φ dP

ι in A r-» η 3 C - ·ιΰ Ο m - Ο Φ ο η Μ ^ οο ft Φ Η >9 r-l

φ > X

χ η id me c η

4-) I -ri Φ dP

i-4 O 4-) A «-» n

3 O' 3 <η ·ιο o σι - O

ιη η η η «« Φ θ' ό in η n & ιη φ id O' > ft C A r4 Φ •η s ιηΛ rh ^in n -Η *0 »'Λ * m * o Η Φ 4JCMjj"'r^'-'C4 H n ft C *0 r4 4-1 φ Φ

Η -Η X O

Φ 4-> Λ O ft

A A η Φ ~ dP

Id 44 r4 ft XI 00 Π Ο Ο

Ed (0 3 \ CN ·Π3 cn ιη ιη — η ~ θ' φ r4 >ΰ en ns •η +ι C tn 3 n 4J Φ C φ <-« *

id .Η ·—· in X n n O O

<n i-4 *hij rim C « i-4 n 'r-

Φ in >S

I <n

id id Φ dP

to X — m

i-4 i-4 -Id 00 i O O

Φ n ^ m Ό 'O r4

X

c Φ ft u Φ 0 > Φ ft ·& ft

Pi ft ft ft 3 es ιο σ> r- ft m r4 r~ i-4 O' id ft X -ri φ c t> «C o.

0H 3

6iK O X

H HO C

I Ό sr Id Φ 2 \ Q I o a$ & o o o x ft® S O es h E| Λ ~ V 2 O c o

Ed

O

9 DK 160591 B

Ud af i alt 77 testede prøver er IgG-niveauet for 73 prøver (94,8%) i overensstemmelse med de IgG-niveauer, der opnås ved RID-kontrolproceduren. Tilsvarende resultater opnås, når testmetodens nøjagtighed sammenlignes med den 5 ZnSO^-test, der er beskrevet i Eq. Vet., €f 109 (1974).

Disse testresultater viser, at fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til bestemmelse af IgG-niveau er i besiddelse af en høj grad af nøjagtighed, når der måles i forhold til en anerkendt, kommercielt tilgængelig test.

10 Ved de bestemte reaktionsbetingelser, der anvendes, dvs. en latexpartikelstørrelse på 0,22 μιη, fortyndet til 2,0% (vægt/rumfang), og et forhold legemsvæske:puffer på 0,01 del: 16 dele (rumfang:rumfang), bestemmes IgG-niveauet bekvemt ved anvendelse af op til. 4,5 dråber fortyndet legemsvæske.

15

Eksempel 2

Serumprøver tages fra to føl og bestemmes ved RID-test at have en IgG-koncentration på henholdsvis ca. 1500 og ca.

0-200 mg/dl. Prøverne blandes til opnåelse af en serie med 20 følgende IgG-niveauer (mg/dl): 750, 500, 375, 300, 250 og 166.

Disse serumprøver anvendes som beskrevet i det følgende:

En 10%'s (vægt/rumfang) opløsning af polystyren-latex-partikler med en partikelstørrelse på 0,22 pm fortyndes i forholdet 1:5 (rumfang/rumfang) med en N,N-bis-2-hydroxyethyl-25 glycin-puffer (0,2 M, pH = 8,5) til en slutkoncentration på ca. 2% (vægt/rumfang).

For hver test sættes der 5 jjlI følserum, der har den ovenfor angivne koncentration, til 6 ml af den ovenfor angivne puffer, og der blandes grundigt til en slutkoncentration 30 på 0,01 dele serum til 12 dele puffer (rumfang/rumfang).

1 dråbe af den fortyndede latexblanding blandes på en plade med 1 dråbe af det fortyndede serum, bevæges og drejes og iagttages for agglutination. Hvis der ikke fremkommer nogen agglutination, blandes en anden fortyndet latexprøve (1 dråbe) 35 på en plade med 2 dråber af det fortyndede serum. Hvis der in- 0

10 DK 160591 B

gen agglutination fremkommer, gentages proceduren igen med 3 dråber fortyndet serum. De opnåede testresultater er sammenfattet i den følgende tabel.

5 Tabel III

mg/dl IgG (RID) Tilsat serummangde 750 x 2 = 1500 1 dråbe; positiv agglutination 500 x 2 = 1000 1 dråbe; positiv agglutination 375 x 2 = 750 1 dråbe; positiv agglutination 10 300 x 2 = 600 1 dråbe; positiv agglutination 250 x 2 = 500 1 dråbe; negativ, 2 dråber; po sitiv agglutination 166 x 2 = 332 1 og 2 dråber; negativ, 3 dråber; positiv agglutination 15

De testresultater, der er opnået ifølge tabel III, sammenlignes med titreringsresultaterne fra eksempel 1. Eftersom de i tabel I viste titreringsresultater er opnået under anvendelse af 1 dråbe serum/2 dråber fortyndet latex, multipliceres 20 de i tabel III viste koncentrationer med en faktor 2 til sammenligning af tabel I og tabel III.

Resultaterne viser, at proceduren fra eksempel 2 korre-lerer IgG-niveauet med det IgG-niveau, der fås ved titreringsproceduren ifølge eksempel 1 (korreleret til RID-kontrolproce-25 duren). Eksempelvis giver 3 dråber serum ved et niveau på 166 mg/dl IgG (x 2 = 332 mg/dl) en positiv agglutination. Dette falder inden for området 200-400 mg/dl, der er indikeret ved en 3 dråbers agglutination som vist i tabel I. Tilsvarende resultater er vist for de andre IgG-niveauer.

30 Det er klart, at ved udførelse af den fremgangsmåde, der er beskrevet i eksemplerne 1 og 2f kan agglutinationen af legemsvæsken og latex iagttages, og niveauet af IgG, der er til stede i prøven, kan bestemmes herudfra. En fagmand kan indstille den koncentration af puffer og den størrelse og kon-35 centration af latexpartikler, der kræves til detektering af

O

n DK 160591 B

IgG-niveauer i en legemsvæske. Disse niveauer kan let optimeres til tilvejebringelse af en bekvem IgG-test.

I de følgende eksempler anvendes der et bredt område af reaktionsbetingelser. Reaktionsbetingelserne er ikke nød-5 vendigvis optimerede, og derfor er de opnåede agglutinations-værdier, dvs. IgG-niveauerne, i mange af eksemplerne ikke direkte sammenlignelige med de ifølge eksempel 1 opnåede agglu-tinationsværdier. Det fremgår imidlertid af hvert eksempel, at når mængden af IgG, der er til stede i prøverne, forøges 10 eller formindskes, varierer mængden af agglutination således, at IgG kan måles ved hjælp af den her omhandlede fremgangsåde.

Såfremt intet andet er angivet, opnås de koncentrationer af følserum, der anvendes i de følgende eksempler, som beskrevet i eksempel 2·.

15 Til bestemmelse af virkningen af ændring af partikel størrelsen til ca. 0,10 Mm udføres der den i det følgende beskrevne procedure.

Eksempel 3 20 En 10%'s vandig opløsning af polystyren-butadien-latex- partikler med en partikelstørrelse på 0,109 Mm fortyndes i forholdet 1:15 med pufferen ifølge eksempel 1 til en slutkoncen-tration på ca. 0,67% (vægt/rumfang).

Ved hver test sættes der 5 pi følserum til 6 ml af den 25 ovennævnte puffer, og der blandes grundigt til en slutkoncen- tration på 0,01 dele serum til 12 dele puffer (rumfang/rumfang).

1 dråbe af døn fortyndede latexblanding blandes med 1, 2 eller 3 dråber af det fortyndede serum som beskrevet i eksempel 1.

De opnåede testresultater er sammenstillet i den følgende tabel.

30 35

O

12 DK 160591 B

Tabel IV

mq/dl IgG (RID) Tilsat serummængde 750 x 2 = 1500 1 dråbe; negativ, 2 dråber; posi tiv agglutination 5 500 x 2 = 1000 1 dråbe; negativ, 2 dråber; posi tiv agglutination 375x2=750 1, 2 dråber; negativ, 3 dråber; positiv agglutination 300 x 2 = 600 lf 2, 3 dråber; negativ agglutionation 10

Som det fremgår af de ovenstående resultater, er forholdet det, at når den mængde IgG, der er til stede i serumprøven, formindskes, forøges den mængde serum, der kræves til agglutination. Den formindskede latexpartikelstørrelse frembringer en 15 tilsvarende forøgelse af overfladearealet, hvilket kræver en større fortynding af latexpartikelkoncentrationen.

I eksemplerne 4 og 5 indstilles prøverne af følserum til opnåelse af en serie med de IgG-koncentrationer, der fremgår af de respektive tabeller.

20

Eksempel 4

En 10%'s vandig opløsning af polystyren-latexpartikler med en partikelstørrelse på 0,497 Mm fortyndes i forholdet 1:5 med en puffer ifølge eksempel 1 til en slutkoncentration på 25 ca. 2% (vægt/rumfang).

Ved hver test sættes der 5 pi følserum til 108 ml af den ovennævnte puffer, og der blandes grundigt til en slut-koncentration på 0,01 del serum til 216 dele puffer (rumfang/-rumfang). 1 Dråbe af den fortyndede latex blandes med 1, 2 30 eller 3 dråber af det fortyndede serum som beskrevet i eksempel 1. De opnåede testresultater er sammenfattet i den følgende tabel.

35

O

13 DK 160591 B

Tabel V

xng/dl IgG (RID) Tilsat serummængde 900 x 2 = 1800 1 dråbe; positiv agglutination 370 x 2 = 740 1 dråbe; tvivlsom, 2 dråber; 5 positiv agglutination 200 x 2 = 400 1 dråbe; negativ, 2 dråber; po sitiv agglutination

Det fremgår af ovenstående resultater, at forholdet er 10 det, at når mængden af IgG, der er til stede ifølge eksemplet, formindskes, forøges den mængde serumprøve, der kræves til agglutination. Det er nødvendigt at forøge fortyndingen af serumprøven, fordi forøgelsen i latexpartikelstørrelse tilvejebringer en formindskelse af overfladearealet af latexpartik-15 lerne.

Eksempel 5

En 10%'s vandig opløsning af polystyren-latexpartikler med en partikelstørrelse på 0,807 μιη fortyndes i forholdet 1:5 20 med en puffer ifølge eksempel 1 til en slutkoncentration på ca. 2% (vægt/rumfang).

Ved hver test sættes 5 yil følserum til 1080 ml af den ovennævnte puffer, og der blandes grundigt til en slutkoncen-tration på 0,01 del serum til 2160 dele puffer. 1 Dråbe af den 25 fortyndede latex blandes på en plade med 1 eller 3 dråber af det fortyndede serum som beskrevet i eksempel 1. De opnåede testresultatér er sammenfattet i den følgende tabel.

Tabel VI

30 mg/dl IgG (RID) Tilsat serummængde 900 x 2 = 1800 1 dråbe; positiv agglutination 370 x 2 = 740 1 dråbe; negativ agglutination, 3 dråber; positiv agglutination 200 x 2 * 400 3 dråber; negativ agglutination 35 Ο M DK 160591 Β

Det fremgår af de ovenstående data, at forholdet er det, at når den mængde IgG, der er til stede i serumprøven, formindskes, forøges den mængde af serumprøve, der kræves til agglutination. De ovenstående data illustrerer endvide-5 re den virkning, der er vist i eksempel 4: en forøgelse af latexpartikelstørrelsen fører til en formindskelse i overfladearealet af latexpartikleme, hvilket kræver en yderligere forøgelse af fortyndingen af serumprøven.

10 Eksempel 6 10 g natriumchlorid sættes til 1 liter af en puffer ifølge eksempel 1 til fremstilling af en 2-hydroxyethyl-glycin-salt-puffer. En 10%'s vandig opløsning af polystyren--butadien-latexpartikler med en partikelstørrelse på 0,109 Mm 15 fortyndes i forholdet 1:15 i denne puffer til en slutkoncen-tration på ca. 0,67% (vægt/rumfang).

Ved hver test sættes der 5 pi følserum til 6 ml af den ovennævnte puffer, og der blandes grundigt. 1 dråbe af den fortyndede latexblanding blandes på en plade med 1, 2 eller 20 3 dråber af den fortyndede serum som beskrevet i eksempel 1.

De opnåede testresultater er sammenfattet i den følgende tabel.

Tabel VII

25 mg/dl IgG (RID) Tilsat serummængde 750 x 2 = 1500 1 dråbe; positiv agglutination 500 x 2 = 1000 1 dråbe; positiv agglutination 375x2=750 1 dråbe; positiv agglutination 300 x 2 = 600 1 dråbe; positiv agglutination 30 250 x 2 = 500 1 dråbe; negativ, 2 dråber; positiv agglutination 166 x 2 = 332 1 og 2 dråber; negativ, 3 dråber; positiv agglutination 35

O

is DK 160591 B

Som det ses af de ovenstående data, er forholdet det, at når mængden af IgG, der er til stede i serumprøven, formindskes, forøges den mængde serumprøve, der kræves til agglutination. Desuden viser disse resultater også den ændring, δ der opnås ved valg af pufferen. Tilsætningen af saltopløsning til pufferen bevirker, at latexpartiklerne med en størrelse på 0,109 jjm fungerer på en måde, der svarer mere til opførslen af latexpartiklerne med en størrelse på 0,22 Mm ifølge eksempel 2 end til opførslen af latexpartiklerne med en størrelse 10 på 0,109 pm ifølge eksempel 3.

Prøver af følserum blandes til fremstilling af en serie, der indeholder 3000 mg/dl IgG og 1500 mg/dl IgG, bestemt ved RID-afprøvning, og disse prøver anvendes som beskrevet i det følgende eksempel.

15

Eksempel 7

En 10%'s vandig opløsning af polystyren-latexpartikler med en partikelstørrelse på 0,22 Mm fortyndes i forholdet 1:5 med en glycinpuffer (0,1 M, pH = 8,2) til en slutkoncentra-20 tion på ca. 2% (vægt/rumfang).

Ved hver test sættes der 5 pi følserum til 6 ml af den ovennævnte glycinpuffer, og der blandes grundigt. 1 Dråbe af den fortyndede latex blandes på en plade med 1, 2 eller 3 dråber af det fortyndede serum som beskrevet i eksempel 1. De 25 opnåede testresultater er sammenfattet i den følgende tabel.

Tabel VIII

mg/dl IgG (RID) Tilsat serummængde 3000 x 2 = 6000 . 1 og 2 dråber; negativ, 3 dråber; 30 positiv agglutination 1500 x 2 = 3000 1, 2 og 3 dråber; negativ agglu tination

Forholdet er atter det, at når den mængde IgG, der er 35 til stede i serumprøven, formindskes, forøges den mængde se-

DK 160591 B

16

O

rumprøve, der kræves til agglutination. Nærværelsen af gly-cin i stedet for pufferen ifølge det foregående eksempel kræver tilstedeværelse af stor mængde igG til frémkaldelse af agglutination.

5

Eksempel 8

En 10%'s vandig opløsning af polystyren-latexpartik-ler med en partikelstørrelse på 0,22 ym fortyndes i forholdet 1:5 med en glycin-salt-puffer (0,1 M, pH = 8,2, 10 g natrium-10 chlorid pr. liter) til en slutkoncentration på ca. 2% (vægt/-rumfang).

Ved hver test sættes der 5 yil følserum til 6 ml af gly-cin-salt-pufferen, og der blandes grundigt. 1 Dråbe af den fortyndede latex blandes på en plade med 1, 2 eller 3 dråber 15 af det fortyndede serum som beskrevet i eksempel 1. De opnåede testresultater er sammenfattet i den følgende tabel.

Tabel IX

mg/gl IgG (RID) Tilsat serummængde 20 750 x 2 = 1500 1 dråbe; positiv agglutination 500 x 2 = 1000 1 dråbe; positiv agglutination 375 x 2 = 750 1 dråbe; positiv agglutination 300 x 2 = 600 1 dråbe; positiv agglutination 250 x 2 = 500 1 dråbe; negativ, 2 dråber; po- 25 sitiv agglutination 166 x 2 = 332 1 og 2 dråber; negativ, 3 dråber; positiv agglutination

Forholdet er atter det, at når den mængde IgG, der er 30 til stede i serumprøven, formindskes, forøges den mængde af serumprøven, der kræves til agglutination. Tilsætningen af salt til glycinpufferen ifølge eksempel 7 forøger kraftigt sensitiviteten af IgG-testen. Når glycin alene som puffer kræver store mængder IgG til agglutination, har den ovennævnte 35 glycin-salt-puffer en sensitivitet svarende til den, der frem-

17 DK 160591 B

O

går af eksempel 2 (N,N-bis-2-hydroxyethylglycin-puffer).

Eksempel 9

En 10%'s opløsning af polystyren-latexpartikler med en 5 partikelstørrelse på 0,22 μπι fortyndes i forholdet 1:5 med en borat-salt-puffer (0,125 M, pH = 8,4, 8,5 g natriumchlorid pr.

Ilter) til en slutkoncentration på ca. 2% (vægt/rumfang).

Borat-salt-pufferen fremstilles ved blanding af 50 ml 0,1 M borsyre og 5,9 ml 0,1 N NaOH, idet der fortyndes op til 10 100 ml med vand, og pH-værdien indstilles på ca. 8,2. Der sæt tes 0,85 g NaCl til hver 100 ml puffer.

Ved hver test sættes der 5 pi følserum til 6 ml af bo-rat-salt-pufferen, og der blandes grundigt. 1 Dråbe af den fortyndede latex blandes på en plade med 1, 2 eller 3 dråber 15 af det fortyndede serum som beskrevet i eksempel 1. Testresultaterne er i det væsentlige de samme som ved anvendelsen af glycin-salt-pufferen ifølge eksempel 8.

Eksempel 10 20 En 10%'s vandig opløsning af polystyren-butadien-la- texpartikler med en partikelstørrelse på 0,109 pm fortyndes i forholdet 1:5 med en puffer ifølge eksempel 1 til en slutkoncentration på ca. 2%.

Ved hver test fremstilles der prøver af følserum som 25 beskrevet i eksempel 1. Der sættes 5 pi følserum til 10 ml af den ovennævnte puffer og blandes grundigt. 1. Dråbe af det fortyndede serum sættes til 1 dråbe af den fortyndede latex som beskrevet i eksempel 1. De opnåede testresultater er sammenstillet i den følgende tabel.

30 35

O

18 DK 160591 B

Tabel X

mg/dl IgG (RID) Tilsat serummængde 900 x 2 = 1800 4 dråber; positiv agglutination 370 x 2 = 740 7 dråber; positiv agglutination 5 200 x 2 = 400 9 dråber; positiv agglutination

Agglutinationen kan reverseres ved tilsætning af en yderligere dråbe fortyndet latex, og derefter kan der agglu-tineres igen med mere fortyndet serum. Denne reversibilitet 10 af agglutinationen viser, at slutpunktet kan fastlægges nøjagtigt.

Eksempel 11

Fremgangsmåden fra eksempel 1 og eksempel 2 gentages 15 under anvendelse af neonatalt kalveserum i stedet for følserum. Testresultaterne viser, at når mængden af IgG, der er til stede i serumprøven, formindskes, forøges den mængde serumprøve, der kræves til agglutination. Testresultaterne viser, at fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan 20 anvendes til måling af agglutination og til bestemmelse af mængden af IgG, der er til stede i prøven af kalveserum.

Eksempel 12

Fremgangsmåden fra eksempel 1 gentages, idet der anven-25 des helblod fra føl og helblod fra kalve i stedet for følserum. Testresultaterne viser, at den her omhandlede fremgangsmåde kan anvendes til måling af agglutination og til bestemmelse af den mængde IgG, der er til stede i helblod fra et føl eller en kalv.

30

Eksempel 13

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 kan gentages med kolo-strum i stedet for serum til bestemmelse af egnetheden af ko-lostrum fra en fødende hoppe eller ko til overførsel af immuno-35 globulin til et nyfødt føl eller en nyfødt kalv.

19 ·*»

DK 160591 B

O

Anvendeligt kolostrum vil have en IgG-niveau på ca.

1000 mg/dl eller derover. For at bringe kolostrujn-prøven ind i et område, der nogenlunde svarer til serumområdet i eksempel 1, fortyndes det anvendte kolostrum i forholdet 1:5 med 5 en egnet puffer til fremstilling af en prøve med en koncentration på ca. 200 mg/dl.

En 10%'s (vægt/rumfang) opløsning af polystyren-partikler med en partikelstørrelse på 0,22 Mm fortyndes i forholdet 1:5 (rumfang/rumfang) med N,N-bis-2-hydroxyethylglycin-10 -puwer (0,2 M, pH = 8,5) til en s lutkoncentration på ca. 2% efter vægt/rumfang.

Til hver test sættes der en 5 pi prøve af det fortyndede kolostrum til 8 ml af den ovennævnte puffer, og der blandes grundigt til en slutkoncentration på 0,01 dele kolostrum 15 til 16 dele puffer (rumfang/rumfang). Denne fortynding anvendes derpå til titrering af 2 dråber latex som i eksempel 1.

20 25 30 35

Claims (4)

0 20 DK 160591 B Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af den mængde IgG, der er til stede i en nyfødt kalv, et nyfødt føl eller 5. kolostrum hos en ko eller en hoppe, kendet egnet ved, at man bringer en legemsvæskeprøve fra det nyfødte dyr eller en prøve af kolostrum i kontakt med biologisk indifferente latexpartikler, måler den mængde agglutina- % tion, der fremkommer, og ud fra denne bestemmer den mængde IgG, 10 der er til stede i prøven, hvorhos latexpartiklerne, der har en partikelstørrelse fra 0,109 til 0,81 μπι, fortyndes med en puffer til en slutkoncentration fra 0,65 til 2,0%, beregnet på vægt/rumfangsbasis, ved en pH-værdi fra ca. 7,5 til ca. 9.0, idet legemsvæske- eller kolostrum-prøven fortyndes med 15 en puffer til et område fra 0,01:12 dele til 0,01:2160 dele på rumfang/rumfangsbasis, ved en pH-værdi fra ca. 7,5 til ca. 9.0.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som legemsvæske anvendes blodplasma, blodserum eller helblod.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at der anvendes en puffer valgt fra gruppen bestående af borat-salt, glycin-salt og N,N-bis-2-hydroxyethylglycin-salt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes latexpartikler med en partikelstørrelse 30 på 0,22 μιη og et forhold mellem legemsvæske og puffer på 0,01: 16 dele. 35