CN110117648B

CN110117648B - 昼夜节律性睡眠障碍生物标志物

Info

Publication number: CN110117648B
Application number: CN201910257177.2A
Authority: CN
Inventors: 宋伦; 邢陈; 黄欣; 胡美茹; 顾晔; 徐秀段; 胡永亮; 邹书仙
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2019-04-01
Filing date: 2019-04-01
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2039-04-01
Also published as: CN110117648A

Abstract

本发明公开了HMGB1作为昼夜节律性睡眠障生物标志物的应用。通过检测生物样品中HMGB1的水平，用于判断昼夜节律紊乱及睡眠障碍状态，为分子水平判断提供参考。

Description

昼夜节律性睡眠障碍生物标志物

技术领域

本发明属于睡眠障碍早期诊断技术领域，具体涉及一种昼夜节律性睡眠障碍生物标志物。

背景技术

睡眠不足、睡眠障碍对人的认知功能和情绪产生显著影响，易造成注意力不集中、警觉能力减弱、记忆力下降、行动迟缓、反应变慢、出现视听幻觉、易激惹和躁狂等焦虑症状。昼夜节律性睡眠障(CRSD)是由于睡眠-觉醒周期与人体的24h生物节律失调所致的一类睡眠疾病。它以失眠和(或)白天过度嗜睡、影响生活质量为主要临床表现。近年来，由于生物节律基础研究在临床睡眠医学实践中的转化应用，CRSD的发病机制进一步被明确，诊断和治疗取得了进展主要包括睡眠日记、活动记录仪和褪黑素水平测定、体温检测等等。针对生物节律的促睡和促醒信号靶向性开发新的药物成为睡眠障碍药物研发的新方向。但目前以CRSD的诊疗缺少生物标志物以便更加准确地诊断并指导治疗。因此发现一种快速高效的诊断CRSD的方法十分必要与迫切。

高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1protein,HMGB1，NP_002119)是一种非组蛋白染色体结合蛋白，因其在聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)中迁移速度快而得名。作为一个核蛋白，HMGB1普遍存在于哺乳动物组织细胞中。临床研究显示，脓毒血症病人的血清中HMGB1水平明显高于正常人。出血性休克中也发现血清HMGB1水平的增高。HMGB1作为晚期促炎因子在炎症过程中发挥重要作用。但HMGB1在CRSD的作用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供HMGB1作为昼夜节律性睡眠障生物标志物的应用。

本发明的目的还在于提供HMGB1在制备用于检测或诊断昼夜节律性睡眠障的产品中的应用。

本发明的目的也在于检测样品中生物标志物的试剂在制备用于检测或诊断昼夜节律性睡眠障的产品中的应用，所述生物标志物为HMGB1。

上述应用中，所述样品为血清、血浆、血液、唾液、尿液或组织裂解物。

上述应用中，所述样品来源于人、牛、猪、兔、小鼠或大鼠。

上述应用中，与参照相比，生物标志物表达水平上调。

上述应用中，所述试剂选自：

特异性识别HMGB1的mRNA的探针；或

特异性识别HMGB1的mRNA的引物；或

特异性识别HMGB1的抗体或配体。

例如，利用HMGB1特异性抗体，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行检测。

采用酶联免疫吸附实验(ELISA)将HMGB1特异性抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。与HMGBl结合的抗体是已知的且本领域公知的制备方法,包括产生针对HMGBl的多克隆抗体和针对HMGBl特定片段的单克隆抗体。可商购的HMGBl抗体是人HMGBl的兔多克隆抗体(Abcam公司,货号:ab18256)，其针对源自人HMGBl的150号残基至其碳端的KLH缀合合成肽。

应用双抗体夹心法测定标本中人HMGB1的含量。用纯化的特异性的HMGB1抗体包被微孔板，制成固相抗体，往微孔中依次加入生物样品(血清、血浆、血液、唾液、尿液、组织裂解物),再与辣根过氧化物酶HRP标记的HMGB1抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HMGB1的含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人HMGB1浓度。

本发明的目的同时也在于产品在制备诊断或检测昼夜节律性睡眠障的工具中的应用，所述产品包括检测HMGB1水平的试剂。

上述应用中，所述的试剂选自：

特异性识别HMGB1的mRNA的探针；或

特异性识别HMGB1的mRNA的引物；或

特异性识别HMGB1的抗体或配体。

本申请涉及血清中HMGBl蛋白在诊断或检测昼夜节律性睡眠障碍中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了HMGB1能够作为血清和尿液中昼夜节律性睡眠障碍的生物学标志物的应用，对于检测和判断昼夜节律紊乱及睡眠障碍状态，为分子水平判断提供参考。

附图说明

图1为睡眠剥夺72小时诱发大鼠焦虑行为的统计结果，(A)为睡眠剥夺后大鼠悬尾不动时间统结果；(B)为睡眠剥夺后大鼠高架十字迷宫中心区域进入次数统计结果；其中，Control:对照组，SD：睡眠剥夺组。

图2为睡眠剥夺72小时大鼠血清、尿液中HMGB1的含量。

图3为睡眠障碍受试者血清、尿液中HMGB1的含量。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请中的“生物标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度”。

在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)和蛋白(例如肽、多肽)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。

实施例中涉及的样本的处理方法为：

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟(2,000-3,000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟(2,000-3,000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2,000-3,000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

4.组织标本：切割标本后，称取重量。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后置于冰上，加入一定量的磷酸盐缓冲液(PH7.4)，用匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(12,000转/分)。

5.标本采集后尽早进行提取，提取尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，应避免反复冻融。

实施例1大鼠睡眠剥夺模型建立

一、大鼠睡眠剥夺模型的制备

将雄性SD大鼠(体重240g±20g)放入睡眠剥夺仪持续保持清醒72小时，大鼠可自由摄取食物和水，每天12h小时昼夜节律，制备大鼠睡眠剥夺模型。

二、大鼠焦虑行为学评价

1.高架十字迷宫

将大鼠置于迷宫中央，头朝开臂，观察者距离迷宫中心至少1m。记录实验期(5分钟)内大鼠进入开臂和闭臂的次数和在两臂滞留时间。计算大鼠进入开臂次数和在开臂滞留时间分别占总次数(进入开臂和闭臂次数之和)和总时间(在开臂与闭臂滞留时间之和)的百分比，以此作为评价焦虑的指标。

2.悬尾实验

通过固定大鼠尾部使其头向下悬挂，动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，记录5分钟该环境的动物产生绝望的不动时间。

结果如图1所示，睡眠剥夺72小时诱发大鼠焦虑行为的统计结果，(A)为睡眠剥夺后大鼠悬尾不动时间统结果；(B)为睡眠剥夺后大鼠高架十字迷宫中心区域进入次数统计结果；其中，睡眠剥夺组的大鼠悬尾不动时间和睡眠剥夺后大鼠高架十字迷宫中心区域进入次数都高于对照组，睡眠剥夺大鼠出现明显的焦虑样行为学特征。

实施例2大鼠血清HMGB1的ELISA检测方法

将SD大鼠置于睡眠剥夺仪持续保持清醒72小时观察其焦虑样行为学特点。收集血浆和尿液，利用ELISA方法检测血清和尿液中HMGB1的含量。结果如图2所示，睡眠剥夺大鼠的血清及尿液中HMGB1的含量明显升高。

检测方法为：

对来自大鼠血清和尿液中的HMGBl蛋白浓度进行了定量，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)将HMGB1特异性抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。与HMGBl结合的抗体是已知的且本领域公知的制备方法,包括产生针对HMGBl的多克隆抗体和针对HMGBl特定片段的单克隆抗体。其中样本处理和具体检测方法如实施例3中所示。

实施例3患者血清中HMGB1的ELISA检测方法

同时，收集31名睡眠障碍受试者的血浆和尿液(解放军总医院)，利用ELISA检测HMGB1的变化。

对来自睡眠障碍患者血清中的HMGBl蛋白浓度进行了定量，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)将HMGB1特异性抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。与HMGBl结合的抗体是已知的且本领域公知的制备方法,包括产生针对HMGBl的多克隆抗体和针对HMGBl特定片段的单克隆抗体。可商购的HMGBl抗体是人HMGBl的兔多克隆抗体(Abcam公司,货号:ab18256)，其针对源自人HMGBl的150号残基至其碳端的KLH缀合合成肽。

应用双抗体夹心法测定标本中人HMGB1的含量。用纯化的特异性的HMGB1抗体包被微孔板，制成固相抗体，往微孔中依次加入生物样品(血清、血浆、血液、唾液、尿液或组织裂解物)，再与辣根过氧化物酶HRP标记的HMGB1抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HMGB1的含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人HMGB1浓度。具体实验方法如下：

1.HMGB1标准品的稀释与加样：

在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为90μg/L，60μg/L，30μg/L，15μg/L，7.5μg/L)。

2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液50μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将3浓缩洗涤液用蒸馏水稀释后备用。

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。

三、计算：

采用上述方法，以HMGB1标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式。

将处理待测样品，并按上述方法进行检测，得到OD值。将得到的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为HMGB1的实际浓度。

结果显示：如图3所示，且睡眠障碍受试者血浆和尿液中HMGB1的含量较正常受试者的含量明显升高。

以上说明，HMGB1可以作为昼夜节律性睡眠障的生物标志物。

以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.检测血清样品中生物标志物蛋白水平的试剂在制备用于检测或诊断昼夜节律性睡眠障的产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物为HMGB1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样品来源于人或大鼠。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与参照相比，生物标志物表达水平上调。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：

特异性识别HMGB1的抗体。

5.产品在制备诊断或检测昼夜节律性睡眠障的工具中的应用，所述产品包括检测HMGB1蛋白水平的试剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括：

特异性识别HMGB1的抗体。