JPH04145366A - ヒトヘモグロビンを含有する被検液の保存方法及びそれに用いる便溶解用緩衝液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的なヒ
トヘモグロビン検出方法に関し、特に糞便を含む被検液
中に存在するヒトヘモグロビンを高感度にて検出するこ
とができる方法、及びそれに用いる便溶解用緩衝液に関
する。

〈従来の技術〉 近年、大腸癌などの下部消化器の疾患を検査する方法と
して、消化器管からの出血に起因する糞便中の潜血成分
、特にヒトヘモグロビンの検出が主に行われている。

中でも、食品摂取や薬剤投与の制限を必要としない、抗
ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的な検出方法が提
案されている。

このような検出方法には例えば、寒天板肉での抗ヒトヘ
モグロビン抗体と、被検液中のヒトヘモグロビンとの沈
降線を利用してヘモグロビンを検出する一次元免疫拡散
法や、動物血球に抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したも
のと、被検液とを混合して生じる沈降現象像を利用して
検出する逆受身血球凝集法、高分子ラテックス粒子に抗
ヒトヘモグロビン抗体を感作したものと、被検液を混合
して生じる凝集像を利用して検出するラテックス凝集法
、酵素や放射性同位元素で標識した抗ヒトヘモグロビン
抗体を利用する酵素免疫法などがある。

上記検出法においては被検物質であるヒトヘモグロビン
は通常、溶解液状で検査に供され、例えば便潜血検査で
は糞便を生理食塩水や緩衝液中に溶解する事により、糞
便中のヒトヘモグロビンを溶解液状態にして被検液とし
て用いられている。

ヒトヘモグロビンの構造は、例えば、ヘモグロビン八で
はアミノ酸１４１個からなるα鎖とアミノ酸１４６個か
らなるβ鎖と呼ばれるポリペプチドが、それぞれ２個か
ら形成してなる四量体であり、これらが立体構造で配置
されている。このような構造のヒトヘモグロビンは糞便
溶解液中で徐々に変性するために、従来から用いられて
いる免疫学的方法ては検出感度が著しく低下するもので
ある。

特に、被検液中の糞便濃度が高い場合には上記ヒトヘモ
グロビンの変性が著しく、診断上、意義のある低濃度領
域での検出が困難となる。

一方、便暦血検査では検査員の手間や不快感を少なくす
るために、被検者自身が自宅などで糞便中に含まれるヒ
トヘモグロビンを溶解液状態にする場合があり、このよ
うな場合は溶解液状態で数日間放置されることが多い。

また、検査員がヒトヘモグロビンを溶解液状態にした場
合でも、作業の都合上、検査までに数時間放置される場
合もあり、このような放置状態では前述のようにヒトヘ
モグロビンの変性が起こってしまい好ましくない。

また、酵素免疫法のような検出方法を採用した場合、高
温度下で数分間上記溶解液をインキュベートすることか
あり、やはりヒトヘモグロビンの変性によって正確な検
出が困難となる。このようなヒトヘモグロビンの変性を
防止する目的で、例えばウシ血清アルブミンや糖類など
を添加することが行われているが、充分に効果を発揮で
きるものとはいえないのが実情である。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明は上記従来の技術の欠点を解決するため１こなさ
れたものであって、その目的とするところは糞便を含有
する被検液中に存在するヒトヘモグロビンの放置下での
変性を防止しながら、かつ、高感度で正確にヒトヘモグ
ロビンを検出できる方法、およびこれに用いる便溶解用
緩衝液を提供することにある。

〈課題を解決するための手段〉 即ち、本発明は、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いたヒト
ヘモグロビンの検出において、ヒト以外の動物血清を被
検液中に添加することを特徴とする検出方法およびこれ
に用いる便溶解用緩衝液に関する。

本発明の方法において被検体としてのヒトヘモグロビン
もしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便を溶解するた
めの液としては、例えばりん酸緩衝液、グリシン緩衝液
、トリス−塩酸緩衝液、はう酸緩衝液などがベース液と
して用いられる。緩衝液のｐＨは６〜９、好ましくは６
．５〜８．５の範囲とする。緩衝液中には生理食塩濃度
近傍の食塩を添加することが好ましい。また、細菌など
によるヒトヘモグロビンの変性を抑制するために、０．
０５〜０．５重量％濃度のアジ化ナトリウムなどの抗菌
剤を添加することが好ましい。

本発明の方法においては、上記緩衝液中にヒト以外の動
物血清を添加し、ヒトヘモグロビンの変性を抑制する。

添加するヒト以外の動物種としては、例えばウサギ、ヤ
ギ、ウマ、ウシ（ウシ胎児）ブタ、マウスなどが挙げら
れる。これらのうちヒトヘモグロビンとアミノ酸配列が
非常に類似したサルやヒヒなどの血清を用いると、検出
時に抗ヒトヘモグロビン抗体と結合してしまう、所謂交
差反応を起こすことがあるので、このようなときはこれ
らの動物血清を用いないほうがよい。

ヒト以外の動物血清の添加量は被検液中の糞便の濃度に
よって適宜設定するが、糞便濃度４■／−の場合、０．
０１体積％以上、好ましくは０．１〜４０体積％の濃度
となるように添加する。添加量が少なすぎるとヒトヘモ
グロビンの変性を抑制する作用が充分てなくなり好まし
くなく、また多すぎると増量効果が認められず不経済で
ある。

本発明の方法では上記のようにしてヒト以外の動物血清
を添加した緩衝液中に、被検物質であるヒトヘモグロビ
ンもしくはヒトヘモグロビンを含有する糞便を溶解して
被検液とする。具体的には、便漕血検査の場合、被験者
の糞便の一定量をヒト以外の動物血清を含有する一定量
の緩衝液中に溶解することにより調製することができる
。

本発明の検出方法を実施するには、従来から知られてい
る抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的検出方法が
採用できる。

以下にラテックス凝集法を利用した検出方法について例
示する。

精製したヘモグロビン八を抗原としてウサギ、ヤギなど
の動物に免疫したのち、採血、精製をして抗ヒトヘモグ
ロビン抗体を得る。この抗体を中性ｐＨでポリスチレン
ラテックス（粒径０．３μｍ）と混合して数時間吸着反
応させたのち、ウシ血清アルブミンおよび食塩を含む緩
衝液などで遠心分離精製を行い、抗ヒトヘモグロビン抗
体感作ラテックス試薬を得る。

次に、このラテックス試薬と被検液とをガラス板上で撹
拌混合し、数分後のラテックスの凝集像によって、ヒト
ヘモグロビンを定性的に検出することができる。

また、酵素免疫法の場合は、抗ヒトヘモグロビン抗体を
感作したマイクロプレートのウェルに被検液を入れ、洗
浄した後、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファター
ゼで標識した抗体を添加し、洗浄して基質溶液を添加す
る。

〈発明の効果〉 以上のように本発明の方法によれば、ヒト以外の動物血
清を添加しているので、被検液中のヒトヘモグロビンが
糞便中の酵素・細菌などによって変性することを制御で
きるので、被検液を長時間放置する場合でも高感度にヒ
トヘモグロビンを検出することができるものである。

〈実施例〉 以下に本発明の実施例を示し、さらに具体的に説明する
。

実施例１ ０．２ｍｏｌ／Ｉ！−グリシン、０．１　％ＢＳＡ、０
．１％アジ化ナトリウム、０．９％　塩化ナトリウムか
らなる水溶液を作製し、ＩＮ−水酸化ナトリウム水溶液
にてｐＨ８，０に調製し、この溶液にヒト以外の動物血
清としてウシ胎児血清を濃度を変えて溶解した。

次に、５％カルボキシル化ポリスチレン１０−に、１■
／ｉの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド１０−を加え、２０分間撹拌しなから
反応させた後、０．０１ｍｏｌ　／　１−はう酸緩衝液
（ｐＨ８，０）で２回遠心分離精製した。

このラテックス（濃度５％）ｌＯ−に、精製ヒトヘモグ
ロビンをウサギに免疫して作製した抗ヒトヘモグロビン
抗体（ウサギＩｇＧ、濃度５■／−）７ｍｌを添加し、
５時間ゆっ（りと撹拌しながら反応させ、さらに０．１
％−ウシ血清アルブミンを含む０．０１ｍｏｌ−はう酸
緩衝液（ｐＨ８，０）で３回遠心分離精製し、ラテック
ス濃度１％の抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試
薬を得た。

次に、前記にて調製したウシ胎児血清溶解溶液中にヒト
ヘモグロビン濃度を変えて溶解し、さらに健常大便を４
■／ｄ濃度で溶解し、この溶液８０μｌと前記ラテック
ス試薬２０μｌとをウェル内で混合、撹拌して、１０分
後の凝集像を肉眼にて観察した。その結果を第１表に示
す。

第１表から明らかなように、高感度でヒトヘモグロビン
を検出できることが判明した。

次に、前記ヒトヘモグロビン溶解液を２５℃で６日間放
置した後、再び前記ラテックス試薬と混合して、凝集像
を観察した。その結果を第２表に示す。

比較例 ウシ胎児血清を添加しなかった以外は実施例１と同様に
してラテックス凝集反応を行い凝集像を観察した。その
結果を第１表および第２表に併記した。

〔凝集判定基準〕

＋十二非常に強い凝集かみられた ＋：強い凝集かみられた ±：弱い凝集がみられた ：凝集がみられない 第１表 第２表

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ヒトヘモグロビン抗体を用いたヒトヘモグロビ
   ンの検出において、ヒト以外の動物血清を被検液中に添
   加することを特徴とするヒトヘモグロビンの検出方法。
2. （２）ヒトヘモグロビンの検出に用いる、ヒト以外の動
   物血清を含有することを特徴とする、被検体を溶解する
   ための便溶解用緩衝液。