JPH0313863A - 免疫学的ラテックス凝集反応をもちいた糞便中のα１‐アンチトリプシンの測定方法および該方法に使用する試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 未発−明は、糞便中のα１−アンチトリプシンの測定方
法および該方法に使用する試薬に関するものである。

糞便中の潜在性血液（以下、潜血という）を調べること
は、消化器出血の存在を証明する重要な検査であり、消
化管出血を伴なう消化器疾患１例えば大１揚癌等のスク
リーニング法として広く用いられている。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］従来、
公知の糞便中の潜血Ｊｗ足としては、血液中に含まれる
ヘモグロビンを検出する方法が行なわれている。

これらの方法としては、フェノールフタレイン法、オル
））リジン法９ベンチジン法、グアヤツク法等があり、
一般的にオルトトリジン法とグアヤツク法とを組み合わ
せた試験紙による簡易検査法が利用されていた。

これらの潜血測定法の原理は、血液中に含まれるヘモグ
ロビンのペルオキシダーゼ様触媒作用で過酸化物を分解
し、この際発生する酸素で色原体を酸化呈色せしめるこ
とに基づいている。従って摂取した動物性食品中のヘモ
グロビンや、酸化あるいは還元作用を有す各種薬剤の投
与による反応の促進または阻害により非特異反応が生じ
る等の問題があった。

現在では、上記問題を解決する為に、ヒトヘモグロビン
のみを特異的に検出しうる免疫学的測定法も行なわれて
いる。

ヒトヘモグロビンの免疫学的測定法としては、ヒトヘモ
グロビンをヒト以外の動物に免疫して抗ヒトヘモグロビ
ン抗体を得、これを用いて一次元免疫拡散法にて糞便中
のヘモグロビンを測定する方法（シンゲスターｅｔ　ａ
ｌ、、Ｃａｎｃｅｒ、４５，１０９９゜１９８０）や、
放射性同位元素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を用
いる方法、放射性同位元素の代りに酵素を標識したエン
ザイムイムノアッセイ法による方法等が知られている。

しかしながら、これらの方法は、測定操作が複雑であっ
たり、測定に長時間を要する等、実用化には問題を有す
るものであった。

本発明者等は、先に特異的、かつ簡便・迅速にヒト糞便
中のヘモグロビンを測定しうる方法として、抗ヒトヘモ
グロビン抗体感作ラテックスよりなる検出試薬および、
これを用いたＩ！１１１定方法を見出し特許出願（特願
昭５８−３２６号）した。

しかしながら、これら従来の糞便中の潜血の指標として
、血液中に含まれるヘモグロビンを検出する際、出血部
位によっては消化管に存在する消化酵素や細菌によりヘ
モグロビンが分解され、正確な検査結果を得ることがで
きない場合があることが判明した。

本発明は、上記従来技術における問題点を解決するため
のものである。

［、！２！題を解決するための手段］ 本発明者等は、ヘモグロビンに代る糞便中の潜血の指標
となリラる血液成分を鋭意模索したところ、血中のαｌ
−アンチトリプシンが、他の血中蛋白と異なり、消化管
に存在する消化酵素や細菌による分解を受けにくいこと
を知見し末完１１を完成するに至った。

本発明の目的は、糞便中の潜血を測定するための特異的
、簡便・迅速、かつ信頼性の向上した免疫学的測定方法
および該方法に使用する試薬を提供するものである。

糞便中のＣ１−アンチトリプシンを測定した各種の報告
に−ルＰ、　ｅｔ　ａｌ、、↑ｂｅ　ＬＡＮＧＥＴ、Ｍ
ａｒｃｈ　２９゜７１１．１９８０．ダニエルＷ、　ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｇｅｇｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏ−ｇｙ、８
０，７７６−７８２，１９８１；　７０−　レントＣ，
ｅｔ　ａｌ、。

Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇ２．８１，７７７−７
８０　、１９８１　；　グレゴリ−Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、
、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎ
ｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、８３，３２６−３３０
．１９８５；　　キグレーＭ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏ
ｌｏｇｙ、４０．６１−６６．１９８７）が知られてい
る。これらは、いずれも内因性マーカーとしてのα！−
アンチトリプシンを測定することにより蛋白損失性腸疾
患の診断を目的とするものであり、免疫拡散測定法、免
疫比ろう法あるいはローレルのロケット法により測定さ
れている。

しかしこれらの糞便中のαｌ−アンチトリプシンの測定
方法は、糞便からのαｌ−アンチトリプシンの抽出操作
が煩雑であったり、測定に長時間を要す等の問題があり
、スクリーニング法としては適していないものであった
。

本発明者等は、消化管に存在する消化酵素や細菌による
分解を受けにくいヒトα１−アンチトリプシンを糞便中
の潜血の指標とし、簡便・迅速、かつ信頼性を向上すべ
く、その方法を鋭意研究の結果、ヒトαｌ−アンチトリ
プシンに対する特異抗体をラテックス粒子に結合させた
特異抗体結合ラテックスよりなる試薬の製造に成功し、
更にこれを用いてヒト糞便中のＣ１−アンチトリプシン
の簡便・迅速、かつ信頼性の向上した免疫学的測定方法
および該方法に使用する試薬を確立することに成功し、
本発明を完成した。

本発明によれば、ヒト糞便中の潜血を免疫学的ラテック
ス凝集反応で迅速・簡便に検出できる上に、更にヒトα
ｌ−アンチトリプシンの特異抗体を使用することにより
、ヘモグロビン等の従来の血中蛋白のような、消化管に
存在する消化ＷＪ素や細菌による分解を受けにくいので
、出血部位に関係なく広い範囲での消化管における出血
を正確に検出しうる特徴を有する。

本発明に使用する抗体の製造に用いるヒトα１アンチト
リプシンは通常市販されているものを、そのまま用いる
ことができるが、その品質はできるだけ単一の蛋白標品
であることが望ましい。

例えば、市販ヒトα１−アンチトリプシンを抗原として
モルモット、ヤギ、ウサギなど抗体産生能のある動物を
用い、通常の方法に従って免疫した後、採血し抗体を得
ることができる。

この場合に用いる動物は抗体産生能のある動物であれば
、いずれを用いてもさしつかえないが。

大量の抗体を得るには、大きい動物を用いるのが好まし
い０通常はウサギ、ヤギを用いるがこれらに限定される
ものではない、これらの動物から得られる抗ヒトαｌ−
アンチトリプシン抗体を含む血清から抗ヒトαｌ−アン
チトリプシン抗体を精製するには１通常よく用いられる
方法（例えば、硫酸アンモニウムによる塩析等）による
。

本発明に用いられる抗ヒトαｌ−アンチトリプシン抗体
結合ラテックスを製造するために用いるラテックスはポ
リスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、アミ７基を
有するカルボキシル化ポリスチレン、ポリビニルトルエ
ン、スチレン−ブタジェン共重合体、カルボキシル化ス
チレン−ブタジェン共重合体、スチレン−ジビニルベン
ゼン共重合体、ビニルトルエン−第三ブチルスチレン共
重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリ
ル酸、ポリアクリロニトリル、アクリロニトリル−ブタ
ジェン−スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレー
ト、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル−７クリレ一ト
共重合体、等の合成高分子ラテックス粒子からなるラテ
ックスであり、さらにこれらの合成高分子ラテックス粒
子の表面を非イオン界面活性剤で処理したものであって
もよい。

ラテックス粒子の粒径は、好ましくは０．１〜０．９　
ｐであるが、分析試験結果の再現性を良くするためには
粒径分布の幅が狭いものが望ましい。

ラテックス粒子に抗ヒトα１−アンチトリプシン抗体を
結合（感作）させるには通常、ｐＨ６，５〜８．０の緩
衝液中、濃度０．１〜２．Ｏｚのラテックス粒子と濃度
０．０１〜１ｚの抗体とを４〜３７℃で３０分〜２時間
ゆるやかに攪拌しながら接触させることにより行なう。

緩衝液としては、例えばアンモニア緩衝食塩水、リン酸
緩衝食塩水、グリシン緩衝食塩水を用いる。

また、非特異的あるいは自然染集を防ぐため、抗体溶液
中に０．Ｏ１〜２．Ｏｚのウシ血清アルブミン（以下、
ＢＳＡという）等の反応に関与しない不活１性蛋白質を
加える。

反応終了後は、アンモニア緩衝液、リン酸緩衝液または
グリシン緩衝液等の中性付近の塩溶液中で遠心分離ある
いは濾過することによって数回洗浄し、最後に希釈液に
ラテックス粒子を懸濁し抗ヒトαｌ−アンチトリプシン
抗体結合ラテックス試薬とする。

希釈液は、アンモニア緩衝液、リン酸緩衝液またはグリ
シン緩衝液等にＢＳＡ０．Ｏ１〜２．０　！　、好まし
くは約１．０　＄を加えたものを用い、更に防腐剤とし
て例えば０．０１〜０．５ｚのナトリウムアジドを加え
ておくとよい。

また、グリシン、デキストランなどの安定剤を加えた希
釈液にラテックス粒子を懸濁した後、凍結乾燥してもよ
い、このとき添加するグリシンおよびデキストランの量
はラテックス粒子１重量部に対してそれぞれ１．２〜４
．０　、１．５〜５．０重量部である。この場合抗体結
合ラテックスは１年以上安定である。

このようにして得られた抗ヒトαｌ−アンチトリプシン
抗体結合ラテックスを用い、スライドガラス板法により
スライド板上での凝集像を判定する方法や、凝集反応の
速度を光学的または電気的に測定する方法によって、ヒ
トαｌ−アンチトリプシン量を測定することができる。

スライド板法による方法は、特別な装置を必要とせず肉
眼で判定できるため非常に簡便であり、また凝集反応の
速度を光学的または電気的に測定する方法は、ＬＡ−２
０００（商品名：ｐ、ｘｃ社製）、ＬＸ−３０００（商
品名：ＡＩＣ社製）、ＯＣ−センサー（商品名：多摩精
機社製）等の自動分析機を用いることにより、多数の試
料の測定が可能である。いずれの方法によっても短蒔間
で測定結果が得られるので、スクリーニングに適した方
法といえる。

又、糞便を検体とする場合、そのままでは試料として測
定に供せないので、糞便中の可溶性成分の抽出等の処理
操作が必要となる。

従来、行なわれている一例は、糞便５ｇを採増し、ホモ
ジナイザーで５分間、脱イオン水と均一化させた後、そ
の１５１を凍結乾燥する。凍結乾燥した検体を生理食塩
水５１で溶解し、１時間激しく振とうした後、　１００
０　ｒｐ腸で１０分間遠心分離しその上清を測定用試料
とする操作（キグレーＭ、ｅｔａ１．．Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、４０
．６１−６６゜１９８７）が挙げられる。

上記のように、従来の煩雑な糞便の処理操作を簡略化す
るための改良された採便器具がある。

この改良された採便器具によれば、先端にくぼみを付け
た付属の採便棒で糞便の数ケ所を突き刺して採便し、そ
の採便棒を採便容器に刺しこみ、容器内部に備えられた
擦り切りゴムにより一定量の糞便を採便容器内の一定量
の緩衝液中に採り、容器を強く振ることによって抽出後
、容器内の濾過層を介して測定用試料液が滴下されると
いう、検体の採取と抽出処理操作を、はぼ同時に簡便に
行なうことができる０本発明の実施に際しては、前記の
ような採便器具を用いることが好ましい。

本発明の測定試薬は、ラテックスの粒径、ラテックスへ
の特異抗体の結合量、試料と特異抗体結合ラテックスの
混合比等を種々選択することによって、測定濃度範囲や
反応速度を調節することができ、スライド板法によるス
ライド板上での凝集像を判定する方法や、凝集反応の速
度を光学的または電気的に測定する方法の、いずれにも
使用可能である。光学的測定に於る光学系も透過光、散
乱光のいずれにも使用可能であるため１本発明の応用範
囲は非常に広いものである。

例えば本発明の試薬および方法により、透過光方式の自
動分析機であるＬＡ−２０００を使用する場合、先の採
便器具により抽出処理された試料液を、採便容器からサ
ンプルカップに滴下し、以下自動的に測定する。すなわ
ち、サンプル８０μと抗ヒトαｌ−アンチトリプシン抗
体結合ラテックス３００−を混和し、波長５８５ＩＩＩ
ｍで４０秒後の吸光度を測定し、その時点から更に１０
０秒後の吸光度を測定し、両者の吸光度の差を求める。

この値は、サンプル中のαｌ−アンチトリプシン濃度に
依存するので、あらかじめ濃度既知の標準液で得た標準
曲線より、サンプル中のαｌ−アンチトリプシン濃度を
測定する。

又、散乱光方式の自動分析機であるＬＸ−３０００やＯ
Ｃ−センサーを用いても、はぼ同様に測定することがで
きる。

［実施例］ 以下、実施例に基づき１本発明の詳細な説明するが、こ
れにより本発明の範囲が限定されるものではない。

実施例１゜ 抗ヒトα１−アンチトリプシン抗体結合ラテックスの調
製 ヒトα！−アンチトリプシンの精製は、クロフォードの
方法（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、
１５６．５１９７３）により行なった。この精製ヒトα
１−アンチトリプシン２　Ｂを生理食塩水１１に溶解し
その　１１と等畦のフロイントコンプリートアジュバン
トを混合し、懸濁液を調製する。その懸濁液１１を家兎
の背部皮下に２週間間隔で８回注射する。最終皮下注射
後３週間目に採血し、抗ヒトα１−アンチトリプシン抗
血清を得る。この抗血清から、Ｉｍｍｕｒ＋ａｃｈｅｍ
ｉｓｔｒ７８，６９５，１９７１の方法によりイムノア
トソーベントを使用して特異的な抗ヒトαｌ−アンチト
リプシン抗体を精製した。

精製抗ヒトαｌ−アンチトリプシン抗体とラテックス粒
子との結合は、以下のように行なった。

抗ヒトαｌ−アンチトリプシン抗体の０．２Ｍアンモニ
ウム緩衝液１ｍｌに、平均粒径０．２３６１ｆｆｉのポ
リスチレンラテックス（ダウケミカル社製：固形分濃度
１０％）　１ｍｌを加え、室温で３０分間攪拌した後、
５〜ｌＯ℃の冷却下に２０分間遠心分離（ＩＩ、０００
ｒｐ■）を行なった。上清を傾斜除去し、沈殿を分離し
た抗ヒトα１−アンチトリプシン抗体結合ラテックス粒
子を、０．５＄　ＢＳＡを含有するアンモニウム緩衝液
（ｐＨ８，２）に懸濁させ、抗ヒトαｌ−アンチトリプ
シン抗体結合ラテックスが０．２ｚになるよう調製した
。

実施例２゜ 健康人の糞便ｔｇに全血５００　ｄを添加したものとし
ないものの各々について、採便器具を用い処理し、得た
試料液を採便容器から２滴スライド板上に滴下する。

その上に、実施例１．で調製した抗ヒトαｌ−アンチト
リプシン抗体結合ラテックス　１滴を滴下し、撹拌棒で
円を描くようにしてスライド板上の枠内に広げる。混和
液が枠内を回るようにスライド板を前後左右に３分間ゆ
るやかに動かした後、スライド板上の凝集像の有無、あ
るいは凝集の程度を観察する。その結果、全血を添加し
たものは肉眼的に凝集が認められ（陽性）、添加しない
ものは凝集が認められなかった（陰性）、従って、この
方法で糞便中のαｌ−アンチトリプシンの測定が可能で
あり、糞便中の潜血を検出しうろことを確認した。

実施例３゜ 実施例２．と同様に、健康人の糞便１．に全血５００−
を添加したものとしないものの各々について、採便器具
を用い処理し、得た試料液を採便容器からサンプルカッ
プへ数滴滴下し、測定用試料とする。この試料について
、透過光検出方式の自動分析機であるＬＡ−２０００（
ＡＩＣ社製）を用いて測定した。

その結果、全血を添加した試料の測定値は０．６２ＩＩ
ｇ１ｇ便、添加していない試料では検出感度以下で測定
不渣であった。従って、この方法で糞便中のαｌ−アン
チトリプシンの測定が可鋤であり、糞便中の潜血を検出
しうろことを確認した。

実施例４゜ 消化管での出血を伴なう疾患をもつ患者の糞便Ａ、Ｂの
２例について、それぞれ０　、０．１５．０．３０　、
０．６０　、１．２０．２．４０鵬ｇ／ｇ便の希釈列で
全血を添加した各々を、実施例２および実施例３と同様
の採便器具を用い処理し、得た各試料を、散乱光検出方
式の自動分析機であるＱＣ−センサー（商品名：多摩精
機社製）を用いて測定した。

その結果を、同−検体毎に第１表並びに第２表に示す、
なお、測定値（Ｊ）の他に理論値（Ｒ）も示し、更に回
収−１（Ｊ／Ｒ）　、平均回収率を百分率％で表わした
結果も併せて表示した。

以下余白 第１表 第２表 ［発１月の効果］ 上述の如く、本発明のαｌ−アンチトリプシンの測定方
法は免疫学的ラテックス凝集反応を用いること、更に改
良された採便器具と併用し、試料の調製をも短縮するこ
とによる、簡易・迅速な方法である。更に消化管内の消
化酵素や細菌による分解をうけにくいα１−アンチトリ
プシンを特異的に測定するので、部位に関係なく、広い
範囲の消化−前に由来する潜血を高い信頼性で検出でき
るため大Ｉ１ｇ癌等の消化管からの出血を伴なう疾患の
スクリーニング検査に有用である。

抗ヒトαｌ−アンチトリプシン抗体を結合したラテック
ス粒子は従来知られておらず、本発明の糞便中のαｌ−
アンチトリプシンの測定試薬は、全く新規なものである
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）ヒトα１−アンチトリプシンに対する特異抗体をラ
   テックス粒子に結合させた特異抗体結合ラテックスと糞
   便中のα１−アンチトリプシンとを反応させ、免疫学的
   凝集反応により該糞便中のα１−アンチトリプシンを測
   定することを特徴とする糞便中のα１−アンチトリプシ
   ンの測定方法２）ヒトα１−アンチトリプシンに対する
   特異抗体をラテックス粒子に結合させた特異抗体結合ラ
   テックスよりなる糞便中のα１−アンチトリプシンの測
   定試薬