JPS60224066A - 抗ヒトラクトフエリン抗体感作ラテツクス及びそれを用いたヒトラクトフエリンの検出方法 - Google Patents

抗ヒトラクトフエリン抗体感作ラテツクス及びそれを用いたヒトラクトフエリンの検出方法

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JPS60224066A
JPS60224066A JP8008784A JP8008784A JPS60224066A JP S60224066 A JPS60224066 A JP S60224066A JP 8008784 A JP8008784 A JP 8008784A JP 8008784 A JP8008784 A JP 8008784A JP S60224066 A JPS60224066 A JP S60224066A
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JP
Japan
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latex
antibody
human
human lactoferrin
particles
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JP8008784A
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Tetsuo Tomiyama
哲雄 富山
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SEINAN SOGO KAIHATSU KK
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SEINAN SOGO KAIHATSU KK
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗ヒトラクトフエリン抗体感作ラテックス及
びそれを用いたヒトラクトフェリンの検出方法に関する
更に詳しくはヒト由来のラクトフェリンを用いて調製し
た抗ヒトラクトフエリン抗体をラテックスに感作せしめ
た抗ヒトラクトフエリン抗体感作ラテックス及び該感作
ラテツクスを用いたヒトラクトフェリンの検出方法に関
する。
ラクトフェリン(Lactoferrin;以下rLf
J、と略記する)は、ヒトの母乳をはじめ各種の体液に
含まれる分子量7〜8万の鉄を含む糖蛋白、で、消化管
における鉄の吸収に何らかの役割を果たしていると思わ
れているが、その他の役割などについてはよく解明され
ていない。
しかし、ヒトでは、慢性膵炎になるとLfの膵液中濃度
が870〜11400 (平均231.0) ng/m
f1.と非常に高い値を示すのに対し、正常人や膵癌患
者ではlO〜387(平均1105)n/muと低値し
か示さないことが知られている(S、S、Fedail
 et al、;Lancet。
jl 、181−182.1978)。現在、膵癌の早
期診断は容易ではなく、特に、慢性膵炎との鑑別診断は
非常に難しい問題であったが、膵液中のLfを測定する
ことにより明解に両者を鑑別できるようになった。
現在、LfB度はラジオイムノアッセイ法(以下rRI
 AJと略記する)で測定されているが、この方法は、
優れた感度を有し、極く微量°のLfをも測定しうる利
点を有するが、反面、放射性物質という危険物質を取扱
うための危険性があり、そのために充分な設備と管理を
必要とし、従って充分な設備と管理態勢の整備したとこ
ろでなでなければ実施できないという難点がある。
検体数は増加の一途をたどり、日常の検査業務の激化か
ら、より簡便で、かつ感度が高く、精度も高く、信頼性
も高い測定法がめられている臨床検査の現況から、本発
明者は、これら難点を排し、簡便で、かつ高感度で、臨
床的に有意義なヒ1− L fの測定法を開発すべく鋭
意研究を進めた。
その結果、抗ヒ)Lf抗体感作ラテックスを製造するこ
とに成功し、更にこれを用いた簡便かつ高感度のヒトL
f測定法を確立することに成功し、本発明を完成するに
至った。
即ち、本発明の目的は、膵疾患の診断上有用な指標とな
るヒトLf測定用の抗ヒトLf抗体感作ラテックスを提
供することにあり、更にはそれを用いたヒ)Lfの検出
方法を提供することにある。
即ち、本発明は、ラテックス粒子の表面に抗ヒ)Lf抗
体を結合して成る抗ヒトLf抗体感作ラテックス、並び
に、該感作ラテツクスをマイクロタイター法に従って被
検液もしくはその希釈液と接触させ、ラテックス管底凝
集像を観察することを特徴とするヒ)Lfの検出方法に
関するものである。
次に、本発明を更に詳細に説明する。
本発明において用いるヒ)Lf調製用の原料としては、
ヒト初乳がもっとも適している。
その調製法は周知の通りであり(B、G、Johans
on;Acta Chem、 5cand、、14,5
10.1980)、また市販品も入手できる。
このヒトLfをモルモット、ウサギ、ヤギなど抗体産生
能のある動物を用い、通常の方法に従って免疫した後、
採血し、抗体を得ることができる。
この場合に用いる動物は抗体産生能のある動物であれば
何れを用いても差し支えないが、大量の抗体を得るには
大きい動物を用いるのが好ましい。通常、ウサギ、ヤギ
を用いるが、これらに限定されるものではない。
これら動物から得られた抗ヒトLf抗体を含む抗血清か
ら抗ヒトLf抗体を精製するには、通常用いられる何れ
の方法によっても行うことができ、例えば、抗血清を硫
安塩析し、不溶化抗原を用いて吸着、解離を繰返して精
製する方法、硫安塩析後、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過によって精製する方法などがある。
本発明の感作ラテツクスを製造するために用いるラテッ
クスは、ポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、
アミノ基を有するカルボキシル化ポリスチレン、ポリビ
ニルトルエン、スチレン−ブタジェン共重合体、カルボ
キシル化スチレン−ブタジェン共重合体、スチレン−ジ
ビニルベンゼン共重合体、ビニルトルエン−第三ブチル
スチレン共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポ
リメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、アクリロニト
リル−ブタジェン−スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニル
アクリレート、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル−ア
クリレート共重合体等の合成高分子ラテックス粒子から
なるラテックスであり、更にこれらの合成高分子ラテッ
クス粒子の表面を非イオン界面活性剤等で処理したもの
であってもよい。上記した合成高分子ラテックスのなか
でもポリスチレンラテックスが好ましい。ラテックス粒
子の粒径は、通常0.05〜10gであり、好ましくは
 0.1〜1.07tであるが、分析試験結果の再現性
をよくするためには、粒径分布の幅が狭いもの、例えば
、±5%以下のものが望ましい。
また、使用されるラテックス粒子の比重は0.8〜1.
4であることが好ましい。
次に、抗ヒ)Lf抗体をラテックス粒子に感作させるた
めには、当該ラテックス粒子と抗体とを、生理食塩水及
び/又はpH5,5〜1o、好ましくはp)I 6.4
〜7.6の各種緩衝液等の中で、濃度0.05〜3%の
ラテックス粒子と抗体とを4〜40’Oにおいて30分
〜24時間ゆるやかに攪拌しながら接触させることによ
って行う。緩衝液としては、例えば、リン酸塩緩衝食塩
水、グリシン緩衝食塩水等が挙げられる。感作終了後、
水性溶媒、例えば、これら緩衝液で洗浄することにより
、ラテックス粒子に吸着されない抗体を完全に除去する
。更に、このラテックスは希釈液に懸濁させてラテック
ス粒子の抗体未感作部分を蛋白質で飽和しておくとよい
希釈液としては、例えば、グリシン緩衝食塩水、リン酸
塩緩衝食塩水等に牛血清アルブミン(以下rBSAJと
略記する)約0.1%を加えたものヲ用い、0.01〜
0.5%のアジ化ナトリウム(N a N 3 )を加
えておく。
このようにして得られた感作ラテツクスは0.25重量
%程度に希釈液に懸濁させた状態で氷室に保存してもよ
いし、凍結乾燥しておいてもよい。
本発明の抗ヒトLf抗体感作ラテックスを用いるヒトL
fの測定法では1ril当りl ng以上のヒトLfが
存在すればこれを測定することができ、本発明の検出方
法は、極めて高い感度を示し、通常の分析で最も感度の
高い方法といわれるラジオイムノアッセイと同等あるい
はそれ以上の感度であるといえる。
次に本発明を調製例及び実施例によって更に詳細に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施
例によって限定されるものではない。
ヒ)Lf(ヘキスト社)を1mjL当り 4mgになる
ように生理食塩水に溶かし、等量のコンプリート・フロ
イント・アジュバントと混合した後、体重的2.3〜2
.5 kgの健康なウサギ4羽を用い、それぞれの四肢
の足踏に前記混合液を0.1mjLずつ皮下注射し、次
いで、1週間毎に前記混合液を3回往射した後、更に1
週間後に0.1%ヒ)Lf生理食塩溶液1ms!、を注
射した。最後の注射から3週間後にウサギの頚動脈から
全採血を行い、常法に従って遠心分離し、得られた血清
を56℃に30分間保ち、抗血清約200mQを得た。
得られた抗血清は、抗原とオフタロニー法及び免疫電気
泳動法によって一木の沈降線を形成することから、単一
抗体であることが確認された。
ヒトLf5mgを0.2M酢酸塩緩衝液(pH5,0)
5aJ1に溶かし、 5%B S A tIJo、5x
lを加えた後、 5%グルタルアルデヒドを沈澱が生ず
るまで滴下する。沈澱を分取、ホモジナイズし、1/1
5 Nリン酸塩緩衝液(pH7,2)l容と生理食塩液
3容との混合液(以下rPBsJと略記する)で洗浄し
、グリシン−塩酸緩衝液(pH2,8)で洗浄後、更に
PBSで洗浄し、−20℃に保存した。
抗血清に等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を加え、充分
に混和して室温に30分放置し、生じた沈澱を遠心分離
して分取し、 0.5飽和硫酸アンモニウム溶液で洗浄
後、PBSに対して透析した。次いで、透析内液に不溶
性ヒ)Lfを加えて室温に30分放置し、遠心分離して
上清と沈渣に分け、上清に再び不溶性ヒトLfを加えて
同様に処理し、両沈渣を合せ、PBSで洗浄後、グリシ
ン−塩酸緩衝液(pH2,8)を加え、5分間振盪後、
遠心分離し、沈渣を再びグリシン−塩酸緩、衝液で同様
に処理し、得られる上清を合せ、PBSに対して透析し
て精製抗体を得た。
PBSにラテックス[武田薬品工業輛製、5DL59(
比重1.18、粒径0.8用)]をその粒子濃度が0.
25%になるように懸濁し、これに、更にPBSを用い
て1:40になるように希釈した調製例3の抗ヒ)Lf
抗体を等量加え、室温に3時間保ち3.00Orpmで
10分遠心分離してラテックス粒子を分取し、PBS、
次いで希釈液で洗浄した後、希釈液に0.25%になる
ように懸濁して抗ヒ)Lf抗体感作ラテックスを得た。
この感作ラテツクスは、ヒトLfとマイクロプレート」
二で凝集した。
また、抗体を感作しないラテックスは同一の条件でヒト
Lfを加えても凝集しなかった。即ち、この感作ラテツ
クスはヒトLfに特異的に反応して凝集することが確認
できた。
なお、希釈液としては、1/80 M、pH7,2のリ
ン酸塩緩衝食塩水にBSAo、1%及びアジ化ナトリウ
ム0.1%を加えたものを用いた。
V型マイクロプレートの各穴に希釈液を0.025m文
ずつ分注し、第1六目に希釈液で10倍に希釈した膵液
0.025mJ1を加え、グイリュータ−で順次希釈し
た。他方1m1当り84ngのヒトLfを含む標準液を
別の列の第1穴目に同じ< 0.025mJL加え、同
様に希釈した。次いで、各穴に抗ヒ)Lf抗体感作ラテ
ックス液を0.025mfLずつ分注し、充分に混和し
て室温に10時間以上放置し、凝集の終点を観察した。
抗原Φ抗体反応を生じている場合には管底全面にラテッ
クスが分散−しており、生じていない場合は穴の中心部
にラテックスが集まっていることから、容易に凝集の終
点が判断できる。
上記の方法に従って、慢性膵炎患者、膵癌患者の膵液中
Lfを測定したところ、表に示す結果を得た。
表から明らかな如く、慢性膵炎患者の膵液中Lf量は、
膵癌患者のそれに比べて非常に高い値を示した。従って
、膵液中のヒトLf量を測定することによって、これら
の疾患の鑑別診断に極めて有用であるといえる。
本発明の抗ヒトLf抗体感作ラテックスを用いれば0.
03m1以下という極〈微量の試料(ヒトの膵液)があ
れば短時間内に容易にLf含量を測定することができる
。しかも感度は極めて高く検体1m1当り lngのL
f量まで測定することができる。このことから、慢性膵
炎と膵癌とを極めて明確に鑑別することができる。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)ラテックス粒子の表面に抗ヒトラクトフエリン抗
    体を結合して成る抗ヒトラクトフエリン抗体感作ラテッ
    クス。
  2. (2)ラテックス粒子の表面に抗ヒトラクトフエリン抗
    体を結合して成る抗ヒトラクトフエリン抗体感作ラテッ
    クスをマイクロタイター法に従って被検液もしくはその
    希釈液と接触させ、ラテックス管底凝集像を観察するこ
    とを特徴とするヒトラクトフェリンの検出方法。
JP8008784A 1984-04-23 1984-04-23 抗ヒトラクトフエリン抗体感作ラテツクス及びそれを用いたヒトラクトフエリンの検出方法 Pending JPS60224066A (ja)

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JP8008784A JPS60224066A (ja) 1984-04-23 1984-04-23 抗ヒトラクトフエリン抗体感作ラテツクス及びそれを用いたヒトラクトフエリンの検出方法

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62129758A (ja) * 1985-11-30 1987-06-12 Norin Suisansyo Sanshi Shikenjiyou 微粒子病原虫胞子の判別法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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