JPS5935144A - 腎糸球体基底膜抗原感作ラテツクス - Google Patents

腎糸球体基底膜抗原感作ラテツクス

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JPS5935144A
JPS5935144A JP14672582A JP14672582A JPS5935144A JP S5935144 A JPS5935144 A JP S5935144A JP 14672582 A JP14672582 A JP 14672582A JP 14672582 A JP14672582 A JP 14672582A JP S5935144 A JPS5935144 A JP S5935144A
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JP
Japan
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latex
gbm
antigen
basement membrane
sensitized
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JP14672582A
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English (en)
Inventor
Tetsuo Tomiyama
哲雄 富山
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SOGO SEIBUTSU IGAKU KENKYUSHO KK
Original Assignee
SOGO SEIBUTSU IGAKU KENKYUSHO KK
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Pending legal-status Critical Current

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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

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  • Health & Medical Sciences (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は腎糸球体基底膜抗原(以下G B’M抗、原と
略記する)感作ラテツクスに関する。さらに詳しくは、
カップリング剤を介してGBM抗原を感作させだGBM
抗原感作ラテックス粒子を含有する感作ラテツクスおよ
び更に安定剤を含有する013M抗原感作ラテックスに
関する。
ヒトの腎炎のうち糸球体腎炎は最も重要な腎疾患の一つ
である。もしも、何らかの機序により腎糸球体の構成成
分であるGBM抗原(非コラーゲン性基底膜糖蛋白)に
対する自己抗体が産生され、これが腎糸球体基底膜に固
着すると、補体の活性化がおこり、激しい増殖性糸球体
腎炎がおこる。
このよう々免疫機序でおこる糸球体腎炎が抗GBM抗体
腎炎であることは周知の通りである。又、グッドパスチ
ーアー症候群 (goodpasture  syndrome)、急
速進行性腎炎、移植後の再発腎炎の々かにも同一免疫機
序により生ずるものが存在することが明らかにされてい
る。このような成因による糸球体腎炎患者に対しては、
抗GBM抗体の産生を抑制する治療が主体となり、強力
なステロイド療法、免疫抑制剤などが使用されなければ
ならず、又、このような抗体産生抑制療法を進める為に
は抗GBM抗体の力価を指標としていかなければ々らな
い0 しかし、抗GBM抗体腎炎には、臨床的に特徴的な所見
に乏しく、診断には抗GBM抗体の測定が必須であるこ
とは云をまだない。又、治療効果の判定や予後の予測に
も欠かすことができない。
現在、抗GBM抗体の測定法として各種の方法が開発さ
れているが、最も高い感度を示し、臨床的にも最も有用
な方法とされているのはラジオイムノアッセイ (Ra
dio;rnmunoas5aン、  RTA)法であ
る。しかしRTA法を行うためには、アイソトープを使
用する為に特別の設備を要し、又頻雑な手技を用いる為
に多大の労力と時間を要し、臨床検査に応用するのは容
易ではない。
本発明者は、これら従来法の難点を解決し、抗GBM抗
体を容易に特異的に比較的短時間で測定する方法を開発
すべく鋭意研究を重ねた結果、塩化クロムを介してGB
M抗原をラテックス粒子に感作してGBM抗原感作ラテ
ックスを製造し、これを用いて試別を何ら前処理するこ
となく体液中の抗GBM抗体を受身ラテックス凝集反応
により測定することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
すなわち、本発明の目的はGBM抗原感作ラテックスお
よびGBM抗原感作ラテックス粒子組成物を提供するこ
とにある。
次に本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の感作ラテツクスを製造するだめに用い(3) るラテックスは、ポリスチレン、カル、1!キシル化ポ
リスチレン、アミノ基を有するカル号!キシル化ポリス
チレン、カルボ゛キシル化スチレンーブタジェン共重合
体、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、等の合成高
分子ラテックス粒子からなるラテックスである。上記し
た合成高分子ラテックスのなかでもポリスチレンラテッ
クスが好ましい。
ラテックス粒子の粒径は、01〜10μであるが、分析
試験結果の再現性を良くするためには、粒径分布の幅が
狭いものが望ましい。また、使用されるラテックス粒子
の比重は0.9〜1.4である。
GBM抗原の調製法はすでに多くの文献があり確立され
ている。(例えば、RoG、  5piro 。
Journal  of  Biological  
Chemistry  、  242巻1915ページ
、1967)すなわち、腎臓よシ糸球体基底膜を分離し
、超音波処理をした後これにコラゲナーゼ(colla
genase )又はトリプシン(trypsin )
を作用させ、超遠心しだ上清を抗原とする。
腎臓はヒト、ウシ、ブタその他種々の哺乳動物(4) のものが使用できるが、安価に大量に入手できるという
意味でブタ又はウシが使い易い。
次に’I GBM抗原をラテックス粒子に感作させる為
には、当該ラテックス粒子とGBM抗原−塩化クロム混
合液を水、生理食塩水、pH5,5〜10、好ましくは
pH6,4〜7.6の各種緩衝液等の中で、0.05〜
1チのラテックス粒子と0.2〜1係の塩化クロムおよ
び最適濃度のGBM抗原を各等量ずつ混合し、4〜40
℃において30分〜24時間ゆるやかに撹拌し々から接
触させることによって行なう。緩衝液としては、例えば
リン酸塩緩衝食塩水、グリシン緩衝食塩水ベロナール緩
衝食塩水々どある。感作終了後は水性溶媒、例えばこれ
ら緩衝液で洗浄することにより、ラテックス粒子に吸着
されない抗原を完全に除去する。さらにこのラテックス
は希釈液に懸濁させてラテックス粒子の抗原未感作部分
を蛋白質で飽和しておくとよい。
稀釈液としては、グリシン緩衝食塩水、リン酸塩緩衝食
塩水等に牛血清アルブミン(以下BSAと略す)約01
%を加えたものを用い、約0.1チのナトリウムアジド
(NaN、H: )を、防腐剤として加えておく。
このようにして得られだ感作ラテツクスは025重量%
程度に希釈液に懸濁させた状態で氷室に保存してもよい
し、凍結乾燥しておいてもよい。
凍結乾燥する為には希釈液に安定剤として各種アミノ酸
類、特にグリシン、グルタミン酸すトリウムおよびテキ
ストランをそれぞれ02〜2重量係および03〜3重量
係を加えて液体窒素あるいは液体空気中々どで急速凍結
してから凍結乾燥する。
凍結乾燥によシ保存期間はさらに延長され、通常2年以
上安定である。
本発明のGBM抗原感作ラテックスは抗GBM抗体によ
り凝集されるので、人の体液もしくはその希釈液と感作
ラテツクスを接触させると、体液中まだはその希釈液中
に抗GBM抗体が存在する場合には感作ラテツクスは凝
集、し逆に体液中に抗GBM抗体が存在し々い場合には
、感作ラテツクスは凝集しない0この反応をマイクロク
イター法で行なう場合、マイクロプレート上に管底凝集
像として認めることができる。すなわち、プレートに一
定量の希釈液を適下分注し、次いで第1穴目に一定量の
体液を加え、グイリュータ−で順次希釈する。これに抗
原感作ラテツクスを滴下分注し、一定時間後に管底凝集
像を判定し、試料の最大希釈倍数の逆数をもって抗体価
とすることができる。
又、この凝集は光学的に測定することもできる。
一定量、例えば0.025 ml  の希釈血清に一定
量、例えば0.5%の感作ラテックス0.025 ml
  を加え、室温〜37°Cで10〜60分反応させて
生じた凝集に、例えば緩衝液1〜2 ml  を加えて
、分光光度計(波長400〜500 nm>又は積分球
式濁度計を用いて光学的密度又は濁度を測定すれば、一
定基準値の抗体による標準曲線から、抗体価としてよみ
とることができる。
あるいは、スライドグラス上で血清と感作ラテツクスを
混合し、1〜5分ゆっくりゆり動かすことにより、生じ
た凝集の有無により抗体の有無を定性的に測定すること
ができ、スクリーニング検査としても有用である。
(7) 本発明の感作ラテツクスは次の点で極めて太き々利点を
有している。すなわち、体液中にはラテックスそのもの
に対する非特異的凝集素、すなわち担体に対する抗体が
全く存在しえず、また実際に発見されていないので被検
体液を何隻前処理する必要がなく、またその為の確認試
験も必要としない。従って、たとえばマイクロプレート
のウェルに体液もしくはその希釈液を入れ、これに感作
ラテツクスを滴下するだけでよい。すなわち抗GBM抗
体の定量は極めて容易かつ簡便であり、特別の技術を全
く要しない。しかも感度は人体液中の測定に全く不足は
ないし、同時に多数の検体の定性およびまたは定量を行
なうことができる。
又、光学的測定法によれば、高い精度で抗体価を測定で
きる。
本発明の感作ラテツクスを用いれば、従来極めて複雑な
ラジオイムノアッセイ法に頼っていた体液中の抗GBM
抗体濃度を短時間に容易かつ簡便に定量することができ
、腎炎患者の病因解析を正確に行なうことができるほか
治療結果の判定、予(8) 後の予測を行なうこともできる。
現在までにGBM抗原をラテックスに感作した例を記載
した文献および塩化クロムを用いる抗原ラテックス感作
法の文献は全くなく、抗原感作ラテツクスを用いる凝集
反応は全く新規である。
次に調製例および実施例をあげて本発明を更に詳しく説
明する。
調製例 GBM抗原の調製 50 %(容量%)のウシGBMを生理食塩水中で冷し
乍ら3分間201<c  で超音波処理した。これに1
00分の1重量%のコラゲナーゼを加え、37°Cの水
浴中で18時間処理した。超遠心機を用いて40.OO
Orpm  60分遠心し、上清をGBM抗原としだ。
実施例I GBM抗原感作ラテックスの調製 1、 / 15 M燐酸塩緩衝液(pH7,2) 1容
と生理食塩液3容との混合液(以下PBSと略す)ラテ
ックス〔武田薬品工業株製、5DL59 (比重1.1
8、粒径09μ)〕をその粒子濃度が025係になるよ
うに懸濁し、これに、等量の0.5係塩化クロムおよび
等量の1:50GBM抗原を加え、室温に3時間保ち、
3000rpmで10分遠心分離してラテックス粒子を
分取し、PBS、次いで希釈液で洗浄した後、希釈液に
0.25%になるように懸濁してGBM抗原感作ラテッ
クスを得だ。この感作ラテツクスは、抗GBM抗体とマ
イクロプレート上で凝集しだが、抗GBM抗体にGBM
抗原を加えて中和しだ後GBM抗原感作ラテックスを加
えても凝集しなかった。またGBM抗原又は塩化クロム
又は両者で処理し々いラテックスは同一の条件で抗GB
M抗体を加えても凝集しなかった。すなわち、との感作
ラテツクスは抗GBM抗体に特異的に反応して凝集する
ことが確認できた。
希釈液は1. /60  M 、 I)H7,2のリン
酸塩緩衝食塩水にBSAを01%に々るように加えたも
のである。
実施例2 GBM抗原感作ラテックスの凍結乾燥 実施例1で調製した感作ラテツクスを、安定剤としてグ
リシン05重量係、デキストラン(M光純薬株式会召つ
0.7重量係含有した希釈液に25%に浮遊させ、液体
窒素中に浸漬して急速凍結させてから凍結乾燥した。
実施例3 抗GBM抗体の測定 ■型マイクロプレートの各穴に希釈液を080257n
lずつ分注し、第1穴目に血清を0.025m1加える
。グイIJ、−ターで順次倍数希釈する。これに実施例
1で得られたGBM抗原感作ラテックスを0.0257
716ずつ分注し、マイクロミキサーでよく混和した後
、室温に10時間静置し、凝集の終末点を測定し、最終
希釈倍数の逆数を抗体価としだ。この方法によってヒト
血清中杭GBM抗体濃度を測定した結果は表の通りであ
った。
患者陥    診 断 名    抗GBM抗体価1 
  グソドパスチュアー症候群    25,6002
                    6.4−0
03  急速進行性腎炎      1.2,8004
                6.4.005  
             1.2,8006    
           51.2007  移植後再発
腎炎      25.6008  急性糸球体腎炎 
     〈409〈40 1.0                 <401.
1                 (4012慢性
腎炎          〈4013        
         < 401.4         
        (4,01,5<40 以上の結果から明らか々如く、血中抗GBM抗体濃度は
特定の腎炎の時にのみ異常高値を示したのに対し、他の
腎炎ではすべて陰性を示した。すなわち、抗GBM抗体
の力価を測定することは腎炎の診断に極めて有用である
といえる。また病変の程度を知ることや治療効果の判定
にも応用できる0 本発明の感作ラテツクスを用いれば微量の試料で、しか
も何の前処理も要せずに極めて容易に抗GBM抗体の力
価を定量することができるので臨床診断に特に適してい
ると云える。
特許出願人 株式会社相互生物医学研究所代理人 弁理
士 若 1)勝 −

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)表面にカンプリング剤を介して腎糸球体基底膜抗
    原を担持したラテックス粒子を含有する抗腎糸球体基底
    膜抗体定量用腎糸球体基底膜抗原感作ラテックス。
  2. (2)  ラテックス粒子が平均粒径0.1〜10μの
    ラテックス粒子である特許請求の範囲第1項記載の腎糸
    球体基底膜抗原感作ラテツクス。
  3. (3)  ラテックス粒子の比重が09〜1.4である
    特許請求の範囲第1項記載の腎糸球体基底膜抗原感作ラ
    テツクス。
  4. (4)  カップリング剤が塩化クロムである特許請求
    の範囲第1項記載の腎糸球体基底膜抗原感作ラテツクス
  5. (5)表面に腎糸球体基底膜抗原を担持したラテックス
    粒子を含有するラテックスにさらに安定剤を加えた特許
    請求の範囲第1項記載の腎糸球体基底膜抗原感作ラテツ
    クス。
  6. (6)安定剤がグリシンおよびデキストランであること
    を特徴とする特許請求の範囲第5項記載の腎糸球体基底
    膜抗原感作ラテツクス。
  7. (7)希釈液に対するグリシンおよびデキストランの濃
    度が0.2〜2重量%および0.3〜3重量%である特
    許請求の範囲第6項記載の腎糸球体基底膜抗原感作ラテ
    ツクス。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61140865A (ja) * 1984-12-14 1986-06-27 Toyo Jozo Co Ltd 抗ネフリテイス・ストレイン・アソシエイテツド・プロテイン抗体の測定法
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JP2017181492A (ja) * 2016-03-24 2017-10-05 三洋化成工業株式会社 粒子組成物、免疫測定用試薬及び免疫測定方法

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