JPS6243138B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、免疫学的試験法に関する。さらに詳
しくは、本発明は、生理流体、細胞抽出液や組織
抽出液中の免疫学的に活性な物質の定量のための
免疫学的試験法に関する。 免疫学的試験法は抗原−抗体反応に基づく。し
かしながら、従来開発された免疫学的試験法は、
感度が比較的低く、簡単な試験法（凝集試験また
は沈殿試験）の場合において定量的または準定量
的結果を与えるだけであるか、あるいは非常に経
費のかかる（免疫けい光試験、放射線免疫試験、
酵素免疫試験）という欠点を有する。 さて、本発明によれば、非常に高い感度（大き
さの程度：ng／ml）をもちかつ定量的結果を与
えると同時に、簡単かつ急速に実施できる免疫試
験法が発見された。 さらに詳しくは、本発明によれば、感作された
重合体の担体粒子の助けにより測定できるように
された免疫学的に活性な物質と免疫学的反応の相
手との間の免疫学的反応の速度〔動力学的測定、
すなわち抗原抗体相互作用の進行速度〕を吸光の
増加として測定し、そして免疫学的に活性な物質
の濃度をこの免疫学的反応の速度から計算するこ
とを特徴とする分析試料中の免疫学的に活性な物
質の定量法が提供される。 「免疫学的に活性な物質」として、それらが存
在する生理流体、細胞抽出液や組織抽出液中のす
べての成分を挙げることができ、あるいは免疫学
的反応の相手を形成できる。それらには、第１ア
ミン、アミノ酸、ペプチド、たんぱく質、脂肪た
んぱく質、グリコプロテイン、ステロール、ステ
ロイド、リポイド、核酸、酵素、ホルモン、ビタ
ミン、多糖類およびアルカロイドが属する。好ま
しい免疫学的に活性な物質またはそれらの免疫学
的反応の相手を、下表にまとめる： 表 微生物によつて生成する抗原 バクテリア １ グラム陽性球菌 連鎖球菌（Streptococci）〔化膿連鎖球菌
（pyogenes）、大便連鎖球菌（fecalis）及び緑
色連鎖球菌（viridans）〕 葡萄球菌（Staphylococci）〔黄色葡萄球菌
（aureus）及び白色葡萄球菌（albus）〕 肺炎球菌（Pneumococci）〔デイー・ニユー
モニアエ（D.pneumonia）〕 ２ グラム陰性球菌 ナイセリア属（Neisseria）〔淋菌
（gonorrhoeae）及び〓膜炎菌
（meningitidis）〕 ３ グラム陽性好気性バチルス（aerobic
bacilli） 炭疽菌（Bacillus anthracis） ジフテリア菌（Corynebacterium
diphtheriae） エリシペロトリツクス属（Erysipelothrix） 単球症リステリア（Listeria
monocytogenes） ４ グラム陽性嫌気性バチルス（anaerobic
bacilli） クロストリジウム属（Clostridia）〔（ボツリ
ヌス菌（botulinum）、ウエルチ菌Ａ型
（perfringens）、ウエルチイ（wellchii）及び破
傷風菌（tetani）〕 ５ グラム陰性嫌気性バチルス（anaerobic
bacilli） バクテロイデス（Bacteroides） ６ グラム陰性腸内バチルス（intestinal
bacilli） エシエリヒア属（Escherichia） クレブシエラ属（Klebsiella） エンテロバクター（Enterobacter） プロテウス属（Proteus） プソイドモナス属（Pseudomonas） サルモネラ属（Salmonella） 赤痢菌属（Shigella） ７ グラム陰性非腸内バチルス（nonintestinal
bacilli） パスツレラ属（Pasteurlla）〔ペスト菌
（pestis）及び野兎病菌（tularensis）〕 インフルエンザ菌（Hemophilus
influenzae） ブルセラ属（Brucella）〔マルタ熱菌
（melitensis）、ウシ流産菌（abortus）及びブ
タ流産菌（suis）〕 ボルデテラ・ペルツスシス（Bordetella
pertussis） マレオミケス属（Malleomyces） ８ スピロヘータ（Spirochetae） 梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum） レプトスピラ属（Leptospira） ボレリア属（Borrellia） ９ マイコプラズマ（Mycoplasma） 10 ミコバクテリウム属（Mycobacteria） 11 ビブリオ属（Vibrio） 12 放線菌属（Actinomyces） 原虫類（Protozoa） １ 腸内原虫類（Intestinal Protozoa） アメーバ（Amebae） ２ フラゲラーテス（Elagellates） トリコモナス属（Trichomonas） レーシユマニア（Leishmania） トリパノソーマ（Trypanosomes） トキソプラズマ（Toxoplasma） ３ 胞子虫類（Sporozoa） プラズモジウム属（Plasmodia）〔ビバツク
ス（vivax）、熱帯熱マラリア原虫
（falciparum）、四日熱原虫（malariae）及び卵
形マラリア原虫（ovale）〕 菌類（Eungi） １ スポロトリカム属（Sporotrichum） ２ クリプトコツクス属（Cryptococcus） ３ 分芽菌属（Blastomyces） ４ ヒストプラズマ属（Histoplasma） ５ コクシジオイデス（Coccidioides） ６ カンジダ属（Candida） ヴイルス（Viruses）及びリケツチア
（Rickettsia） １ リケツチア ２ ヴイルス カニンヘパチチス（Canine hepatitis） シヨープ乳頭腫（Shope papilloma） インフルエンザＡ及びＢ 鳥禽ペスト（Fowl plague） 単純疱疹（Herpes simplex） アデノウイルス（Adenoviruses） ポリオーマ（Polyoma） ラウス家鶏肉腫（Rous sarcoma） ワクシニア症（Vaccinia） 灰白炎ウイルス（polio virues） 麻疹（German measles） カニン・デイステンバー（Canine
distemper） 白血病（Leukemia） おたふくかぜ（Mumps） ニユーキヤツスル病（New castle
disease） せんだい（Sendai） イー・シー・エツチ・オー（ECHO） フート及びマウス病（Foot and mouth
disease） 鸚鵡病（Psitta−cosis） 狂犬病（Rabies） エキストロメリア（Extromelia） アーボー・ウイルス（Arbor viruses） 異種抗原 多糖類 ヒアルウロン酸分解酵素 破傷風毒素 卵アルブミン 羊血清アルブミン 人間の血漿ガンマアルブミン 人間の血清アルブミン 天然抗原 １ ホルモン 下垂ホルモン（Pituitary hormones） インシユリン グルカゴン サイロイドホルモン 絨毛膜ゴナドトロピン（Chorionic
gonadotropin） 絨毛膜生長ホルモン〔Chorionic growth
hormone−プロラクチン（prolactin）〕 ２ 酵素 〓臓キモトリプシノゲン（Pancreas
chymotrypsinogens） プロカルボキシペプチターゼ
（Procarboxypeptidases） デオキシリボヌクレアーゼ リボヌクレアーゼ カタラーゼ クレアチンホスホキナーゼ ３ 器管の固有の抗原 腎臓 肝臓 皮膚 心臓（ミオグロビン） 胃腸管 前立腺 エンブリオ抗原（たとえば、CEA抗原） 腫脹抗原 ４ 結合組織の成分 筋肉 コラーゲン アミロイド ５ 血球抗原、血液群物質及び他の同種抗原 小板（platelets） 巨核球（Megakaryocytes） アルフア白血球（Leucocytes） 赤血球 血液群物質 フオルスマン抗原（Forsman antigen） ６ 血漿たんぱく質 フイブリンおよびフイブリノイド プラスミノーゲンおよびプラスミン ７ 病理グロブリン 骨髄腫、高分子グロブリン血症およびグロブ
リン 異常症のたんぱく質 リウマトイド因子 Ｃ反応性たんぱく質 天然抗体 １ 天然ガンマグロブリン 天然抗体−腎臓毒性抗体成分 ２ 自抗体 抗核因子 甲状腺自抗体 副腎自抗体 悪性貧血の場合の胃空腔壁細胞の自抗体 精子の自抗体 神経組織の自抗体 繊維組織および血管成分に対する自抗体 小板および巨核球に対する自抗体 トロホブラストに対する自抗体 ３ 次のものに対する誘発自抗体： 免疫グロブリンのクラスIgG，IgM，IgAま
たは変種 ハプテン化合物 オピアムアルカロイド（モルフイネ） アルチピリン バルピツール酸 ことに好ましい免疫学的に活性な物質は人間の
絨毛ゴナドトロピン、リウマトイド因子、トキソ
プラズマ、カンジダ、トリパノソーマ、CEA抗
原およびミオグロビンである。 「感作した重合体の担体粒子」とは、定量すべ
き免疫学的に活性な物質またはその免疫学的反応
の相手を有する免疫学的に不活性な重合体の担体
粒子を包含する。 免疫学的に不活性な重合体の担体は、水不溶性
の微細な重合体からなり、その比重は水の比重に
ほぼ相当し、免疫学的に不活性であり、その上に
免疫学的に活性な物質またはその免疫学的反応の
相手（抗源または抗体）を物理的におよび／また
は化学的に結合できる。約0.05〜0.9μの粒度を
もつ担体粒子は、本発明の目的にことに好まし
い。 ことに適当な担体粒子はラテツクス懸濁液であ
り、たとえば次のものである：粒度0.05〜0.9μ
の重合したスチレン樹脂、粒度0.07〜0.9μのポ
リメタクリル樹脂、粒度0.05〜0.9μのポリスチ
レン、ブタジエンとスチレンとの共重合体、スチ
レンとブタジエンとのカルボキシル化共重合体、
カルボキシル化ポリスチレン、アミノ基含有カル
ボキシル化ポリスチレン、アクリル酸重合体、メ
タクリル酸重合体、アクリロニトリル、ブタジエ
ンおよびスチレンの混合重合体、ポリビニルアセ
テートアクリレート、ポリビニルピリジン、塩化
ビニルアクリレートなど。 概して、0.1〜15.0重量％の抗原または抗体が
免疫学的に不活性な重合体の担体に結合する。し
かしながら、各個々の免疫学的に活性な物質は担
体と、特定の必要条件に最も適した比率で結合す
る。 本発明における試験法において、感作した重合
体の担体粒子は免疫学的反応の指示体として作用
する。したがつて、適切に感作した重合体の担体
粒子と分析試料とを混合したのち、非常に少量の
免疫学的に活性な成分は吸光を増加し、この吸光
の増加は測光でき、これらから分析試料中の免疫
学的に活性な物質の濃度を計算できることがわか
つた。 感作した重合体の担体粒子は、反応混合物中に
変化量で存在できる。しかしながら、担体の濃度
は、有利には、免疫反応中の吸光の増加が正確に
測光できるようにえらぶ。 ラテツクス粒子を使用するとき、反応混合物中
の担体の濃度は好ましくは0.06〜0.9mg／ml、こ
とに0.3〜0.5mg／mlである。 免疫学的反応は最適PH値を観測しながら適当な
緩衝系中で実施する。最適PH値は５〜10、好まし
くは７〜8.5であることができる。好ましい緩衝
剤の例は、リン酸塩緩衝剤、トリス緩衝剤〔トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕、トリエ
タノールアミン緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤またはグ
リシン緩衝剤である。 免疫学的反応は０〜40℃の温度において実施す
ることが好ましい。25〜37℃の温度はことに有利
である。 感作した担体粒子の安定化ならびに不特定反応
の排除に、さらに注意することができる。 本発明によれば、免疫学的に活性な物質の定量
は、直接試験法のみならず、かつまた間接（阻
害）試験法で実施できる。 免疫学的に活性な物質の定量に対する直接試験
法においては、分析試料と対応する免疫学的反応
の相手で感作した担体粒子とを混合し、免疫学的
反応の速度を適当な方法において反応混合物の吸
光の増加の測定により定量する。 免疫学的に活性な物質の定量に対する間接（阻
害）試験法の場合においては、分析試料を一定量
の対応する免疫学的反応の相手と混合し、次いで
この混合物に免疫学的に活性な物質で感作して担
体粒子を加える。反応混合物の吸光の増加から、
免疫学的反応の速度を定量する。 本発明による試験法において、免疫学的反応自
体は吸光の増加を示し、これは測光できる。分析
試料中の定量すべき免疫学的に活性な物質の濃度
は、この吸光の増加から計算する。 免疫学的反応の速度を測定するには、本発明に
よる試験法においては、反応の初期、好ましくは
反応の最初の30秒〜５分間、ことに１〜２分間の
吸光の増加を測定できる。この期間内に、少なく
とも２回の測定時点を選ばなければならない。 直接試験法の場合、免疫学的反応の開始時の時
間間隔当りの吸光の増加は、分析試料中の免疫学
的に活性な物質の濃度に正比例する。間接（阻
害）試験法の場合、免疫学的反応の速度は分析試
料中の免疫学的に活性な物質の増加とともに減少
し、そして免疫学的反応の初期相の間に測定し
た、時間間隔当りの吸光の増加は分析試料中の免
疫学的に活性な物質の濃度に反比例する。 自動試験法において、吸光の増加およびそれと
ともに反応の道筋を連続的に追跡でき、そして免
疫学的に活性な物質の濃度は、たとえば、コンピ
ユーターによつて計算できる。 吸光の測定は、400nm〜1000nmの波長範囲に
おいて実施できる。しかしながら、この測定は長
い波長、すなわち500〜750nmにおいて実施する
ことが好ましい。本発明による試験法は、好まし
くは光学試料容器を用いて実施し、そして吸光の
増加は測色計、分光光度計、比濁計などを用いて
定量できる。 免疫学的試験は、手動分析器または自動分析器
を用いて実施できる。免疫学的反応の速度を検出
できる装置は、いずれも、本発明の目的に適す
る。 分析試料として、体の流体、たとえば血清、血
漿、体液、尿、唾液または細胞および組織の抽出
液を使用できる。 本発明による光学的反応速度の試験法は、次の
ものについて使用できる： −感作担体粒子の質的コントロール、 −免疫学的試験システムの最適反応条件の迅速な
設定、 −間接免疫試験用の抗血清の定量的標定、 −生理流体、細胞抽出液および組織抽出液中の免
疫学的に活性な物質の定量、これによつて従来
の分析試料の滴定の代りに、単一の試験試料を
用いて定量を実施して、定量的結果が得られ
る、 −従来の凝集試験では検出されなかつたような低
い濃度において分析試料中に存在する免疫学的
に活性な物質の定量、 −反応速度測定装置に適した自動分析器による免
疫学的に活性な物質の定量。 次の実施例により、本発明を説明する。 実施例 １ 20ml（0.1モル／）のトリス（HCl（PH7.5））
を、13mgｌ／mlのスチレンとブタジエンとからの
カルボキシル化ラテツクスを含有する75μｌのラ
テツクス懸濁液と混合し、これに人間の絨毛ゴナ
ドトロピン（HCG）を共有結合させ、次いでこ
れに0.10mlのHCG抗血清（うさぎ）を加える。
HCG抗血清を希釈して、試験試料中にHCG血清
について次の力価を与える（１：4000，１：
8000，１：16000，１：32000，１：64000，１：
128000）。各試験試料における１分間当りの吸光
の増加（△Ｅ）を、37℃および波長578nmにおい
て直ちに測定する。 結果を下表に要約する。：

【表】

【表】 表が示すように、１分間当りの吸光の増加は
血清の希釈度１：4000〜１：128000の抗HCG濃
度に対して正比例する。 実施例 ２ 各場合1.0mlのHCG抗血清（希釈度１：2000）
に、次のHCG含量をもつ1.0mlのHCG溶液を加え
る：0ng／ml、、10ng／ml、15ng／ml、30ng／
ml。得られた混合物を37℃で２分間培養したの
ち、各試験試料に13.5mg／のスチレンとブタジ
エンとからのカルボキシル化ラテツクスを含有す
る75μのラテツクス懸濁液を加える。このラテ
ツクスにはHCGが共有結合している。各試試験
試料における１分間当りの吸光の増加を、37℃お
よび波長578nmにおいて直ちに測定する。 結果を表に要約する：

【表】 表が示すように、2ng／mlのHCGさえ信頼性
をもつて検出できる。 実施例 ３ 1.5ml（0.1モル／）のトリス／HClに、変性
したガンマアルブミンを共有結合させたアクリロ
ニトリルラテツクスを含有するラテツクス懸濁液
（Ｒ_fラテツクス〓）0.5mlを加える。0.1mlのリウ
マトイド因子血清（Rf血清）を希釈して、0.1ml
のRf血清とラテツクス懸濁液とを混合したの
ち、試験試料中にRf血清に対する次の力価を与
えるようにする：１：200，１：400，１：800，
１：1600。各試験試料における１分間当りの吸光
の増加を、37℃および波長578nmにおいて直ちに
測定する。 結果を表に要約する：

【表】 実施例 ４ 1.0ml（0.1モル／）のトリス／HCl（PH8.2）
に、モルヒネを共結合させたスチレンとブタジエ
ンとからのカルボキシル化ラテツクスを含有する
0.1mlのラテツクス懸濁液を加える。このラテツ
クス懸濁液に５，10，20、および50μの抗モル
ヒネ血清（希釈度：60）を加え、各試験試料にお
ける１分間当りの吸光の増加を、37℃および波長
578nmにおいて測定する。 結果を表に要約する：

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 感作された重合体の担体粒子の助けにより測
   定できるようにされた免疫学的に活性な物質と免
   疫学的反応の相手との間の免疫学的反応の速度を
   吸光の増加として反応開始後少なくとも２回測定
   し、そして免疫学的に活性な物質の濃度をこの免
   疫学的反応の速度から計算することを特徴とする
   分析試料中の免疫学的に活性な物質の定量法。 ２ 分析試料は感作された重合体の担体粒子を含
   有する免疫学剤と直接に一緒にし、該担体粒子は
   定量すべき物質の免疫学的反応の相手を有する免
   疫学的に不活性な重合体の担体のばらばらの粒子
   であり、吸光の増加を測定し、そしてそれから定
   量すべき免疫学的に活性な物質の濃度を測定する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 分析試料は、定量すべき免疫学物質とその免
   疫学的反応の相手とを混合したのち、定量すべき
   免疫学的に活性な物質を有する免疫学的に不活性
   な担体のばらばらの粒子を感作した重合体の担体
   粒子として含有する、免疫剤と一緒にし、吸光の
   増加を測定し、そしてそれから定量すべき免疫学
   的に活性な物質の濃度を計算する特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ４ ラテツクス懸濁液を担体として使用する特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 測光を反応の初期相の間に行う特許請求の範
   囲第１項、第２項、第３項又は第４項記載の方
   法。