JPS63122957A - 抗ストレプトコツカスデオキシリボヌクレアーゼｂを検出するためのラテツクス凝集法 - Google Patents
抗ストレプトコツカスデオキシリボヌクレアーゼｂを検出するためのラテツクス凝集法Info
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
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- Y10S436/823—Immunogenic carrier or carrier per se
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はストレプトコッカスＤＮアーゼＢの安定化され
た溶液、およびストレプトコッカスＤＮアーゼＢに対す
る抗体を検出するための凝集法におけるその使用に関す
る。
た溶液、およびストレプトコッカスＤＮアーゼＢに対す
る抗体を検出するための凝集法におけるその使用に関す
る。
ストレプトコッカスＤＮアーゼはランスフィールド（Ｌ
ａｎｃｅｆ’１ｅｌｄ）によるストレプトコッカスＡ群
の細胞外代謝産物である。Ａ群のストレプトコッカスは
４種類の異なるデオキシリボヌクレアーゼ（ストレプト
ドルナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｄｏｒ−ｎａｓｅ））を産
生じ、これらはカラムクロマトグラフィー、電気泳動お
よび血清学的方法により相互に区別されうる。これらイ
ソ酵素はＡ、Ｂ。
ａｎｃｅｆ’１ｅｌｄ）によるストレプトコッカスＡ群
の細胞外代謝産物である。Ａ群のストレプトコッカスは
４種類の異なるデオキシリボヌクレアーゼ（ストレプト
ドルナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｄｏｒ−ｎａｓｅ））を産
生じ、これらはカラムクロマトグラフィー、電気泳動お
よび血清学的方法により相互に区別されうる。これらイ
ソ酵素はＡ、Ｂ。
ＣおよびＤと同定されるが、これはＬａｎｃｅｒ １ｅ
ｌｄによるストレプトコッカスの分類とは関係ない。
ｌｄによるストレプトコッカスの分類とは関係ない。
ストレプトコッカスＤＮアーゼＢはヒトに特異的な抗体
の生成を誘発する抗原である。ヒトの血液中におけるこ
れら抗体の濃度を知ることは診断上重要である。
の生成を誘発する抗原である。ヒトの血液中におけるこ
れら抗体の濃度を知ることは診断上重要である。
抗ストレプトリジンＯの測定に比較して抗ＤＮアーゼの
測定（ストレプトコッカスＤＮアーゼＢに対する抗体の
測定）は診断上有利である。とりわけ、皮膚感染におい
て抗ストレプトリジンＯ含量が高まることはめったにな
く、−方抗ＤＮアーゼＢ力価については強度の上昇が観
察される（ ｒ Ｊ 、 Ｃ１１ｎ、 Ｉｎｖｅｓ
ｔ、 Ｊ ４９． １４０５（１９７０））。急性リウ
マチ熱、糸球体腎炎、および上部気道感染（こおいては
ストレプトコッカスＤＮアーゼＢに対する抗体の濃度の
上昇が著明であり、かつ長期持続性である。それゆえス
トレプトコッカスＤＮアーゼＢに対する抗体を迅速に診
断用に測定できる手段に対しての要求が存在していた。
測定（ストレプトコッカスＤＮアーゼＢに対する抗体の
測定）は診断上有利である。とりわけ、皮膚感染におい
て抗ストレプトリジンＯ含量が高まることはめったにな
く、−方抗ＤＮアーゼＢ力価については強度の上昇が観
察される（ ｒ Ｊ 、 Ｃ１１ｎ、 Ｉｎｖｅｓ
ｔ、 Ｊ ４９． １４０５（１９７０））。急性リウ
マチ熱、糸球体腎炎、および上部気道感染（こおいては
ストレプトコッカスＤＮアーゼＢに対する抗体の濃度の
上昇が著明であり、かつ長期持続性である。それゆえス
トレプトコッカスＤＮアーゼＢに対する抗体を迅速に診
断用に測定できる手段に対しての要求が存在していた。
抗ＤＮアーゼＢの簡単で迅速な免疫学的測定法はこれま
で記載されていない。
で記載されていない。
知られている酵素法は時間がかかり、特別の注意を要す
るかまたは非常に精巧な装置を必要とする。
るかまたは非常に精巧な装置を必要とする。
一般に、抗原または抗体の簡単で迅速に実施できる検出
または測定法としてはラテックス凝集試験が知られてい
る。ある実施形は、抗体が結合したラテックス粒子の分
散液に、一定量の対応する抗原、および含有される同じ
抗体の量を測定すべき試料を添加することからなる。
または測定法としてはラテックス凝集試験が知られてい
る。ある実施形は、抗体が結合したラテックス粒子の分
散液に、一定量の対応する抗原、および含有される同じ
抗体の量を測定すべき試料を添加することからなる。
ＤＮアーゼ抗体が粒子に結合するとこのものはＤＮアー
ゼとの反応に対し「感作」され、ＤＮアーゼと反応して
粒子を凝集させよう。しかしながら、ＤＮアーゼに対す
る抗体を含有する検査すべきヒトの血清をこの感作され
た粒子およびＤＮアーゼと混合すると、ＤＮアーゼ量が
血清中の抗ＤＮアーゼ量を超過しないようにＤＮアーゼ
量を選択するならば、前記抗体はＤＮアーゼと反応しそ
して何ら粒子の凝集が起こらない。
ゼとの反応に対し「感作」され、ＤＮアーゼと反応して
粒子を凝集させよう。しかしながら、ＤＮアーゼに対す
る抗体を含有する検査すべきヒトの血清をこの感作され
た粒子およびＤＮアーゼと混合すると、ＤＮアーゼ量が
血清中の抗ＤＮアーゼ量を超過しないようにＤＮアーゼ
量を選択するならば、前記抗体はＤＮアーゼと反応しそ
して何ら粒子の凝集が起こらない。
従ってストレプトコッカスＤＮアーゼＢに対する抗体を
測定するには、相当する試験系が実際上の目的にとって
充分な期間使用されうるに充分に酵素がその中で安定に
存在しうるようなこの酵素の溶液が使用される。すなわ
ちこのことはこの酵素が水溶液中では活性を失うことか
ら生ずる。それゆえ知られた抗ＤＮアーゼＢ試験法では
ＤＮアーゼを凍結乾燥し、そしてかかる凍結乾燥物を水
溶液中に溶解させることにより得られる酵素溶液を製造
者の注意書きに従い約４８時間以内に使用せねばならな
い。
測定するには、相当する試験系が実際上の目的にとって
充分な期間使用されうるに充分に酵素がその中で安定に
存在しうるようなこの酵素の溶液が使用される。すなわ
ちこのことはこの酵素が水溶液中では活性を失うことか
ら生ずる。それゆえ知られた抗ＤＮアーゼＢ試験法では
ＤＮアーゼを凍結乾燥し、そしてかかる凍結乾燥物を水
溶液中に溶解させることにより得られる酵素溶液を製造
者の注意書きに従い約４８時間以内に使用せねばならな
い。
ＤＮアーゼ酵素調製物への添加剤としてはＭｇＣＱ ！
、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４Ｎ Ｃａ ＣＱ ｔおよびＰＨ８
のイミダゾール−ＨＣｆ２緩衝溶液中のウシ血清アルブ
ミン、ならびにゼラチンおよびポリヒドロキシ化合物例
えばデキストランまたは糖が記載されている。
、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４Ｎ Ｃａ ＣＱ ｔおよびＰＨ８
のイミダゾール−ＨＣｆ２緩衝溶液中のウシ血清アルブ
ミン、ならびにゼラチンおよびポリヒドロキシ化合物例
えばデキストランまたは糖が記載されている。
今、プロテアーゼ阻害剤好ましくはベンズアミジニウム
塩を添加することにより、完全な免疫活性を有する安定
なりＮアーゼＢ溶液が調製されうろことが見出された。
塩を添加することにより、完全な免疫活性を有する安定
なりＮアーゼＢ溶液が調製されうろことが見出された。
それゆえ本発明はストレプトコッカスデオキシリボヌク
レアーゼＢに対する抗体が懸濁液または分散液の粒子上
に存在しており、そしてかかる懸濁液または分散液をス
ト１／ブトコツカスＤＮアーゼＢ溶液および測定すべき
試料と混合することによりストレプトコッカスデオキシ
リボヌクレアーゼＢに対する抗体を検出するだめのラテ
ックス凝集法において、ストレプトコッカスＤＮアーゼ
溶液がプロテアーゼ阻害剤を含有しており、そしてスト
レプトコッカスＤＮアーゼが場合により架橋されている
ことを特徴とする方法に関する。
レアーゼＢに対する抗体が懸濁液または分散液の粒子上
に存在しており、そしてかかる懸濁液または分散液をス
ト１／ブトコツカスＤＮアーゼＢ溶液および測定すべき
試料と混合することによりストレプトコッカスデオキシ
リボヌクレアーゼＢに対する抗体を検出するだめのラテ
ックス凝集法において、ストレプトコッカスＤＮアーゼ
溶液がプロテアーゼ阻害剤を含有しており、そしてスト
レプトコッカスＤＮアーゼが場合により架橋されている
ことを特徴とする方法に関する。
この方法により水溶液中におけるストレプトコッカスデ
オキシリボヌクレアーゼＢに対する抗体を高い特異性を
以って簡単で迅速に測定することができ、その際試薬は
従来法のものに比較して使用可能期間が改良されている
。
オキシリボヌクレアーゼＢに対する抗体を高い特異性を
以って簡単で迅速に測定することができ、その際試薬は
従来法のものに比較して使用可能期間が改良されている
。
プロテアーゼ阻害剤はベンズアミジニウム塩が好ましく
、特に塩酸塩が好ましい。
、特に塩酸塩が好ましい。
本発明はさらに、ＤＮＮアーゼ抗体が存在する粒子の懸
濁液または分散液好ましくはポリスチレン−ラテックス
粒子の分散液、および場合により架橋されていてもよい
ストレプトコッカスＤＮアーゼＢの安定化された水溶液
からなる凝集試薬にも関する。
濁液または分散液好ましくはポリスチレン−ラテックス
粒子の分散液、および場合により架橋されていてもよい
ストレプトコッカスＤＮアーゼＢの安定化された水溶液
からなる凝集試薬にも関する。
ＤＮアーゼ抗体が負荷されたかかる粒子を調製するには
、動物好ましくは家兎をストレプトコッカスＤＮアーゼ
Ｂで免疫しそしてこのＤＮアーゼに対する抗体を取得す
る。ストレプトコッカスＤＮアーゼＢに対するこれら抗
体は、これらＤＮアーゼ抗体の溶液を粒子と接触させる
ことにより懸濁粒子（ラテックス、懸濁された赤血球）
に結合される。
、動物好ましくは家兎をストレプトコッカスＤＮアーゼ
Ｂで免疫しそしてこのＤＮアーゼに対する抗体を取得す
る。ストレプトコッカスＤＮアーゼＢに対するこれら抗
体は、これらＤＮアーゼ抗体の溶液を粒子と接触させる
ことにより懸濁粒子（ラテックス、懸濁された赤血球）
に結合される。
免疫化に適するストレプトコッカスＤＮアーゼＢ１１１
製物は、例えば発酵により得られたＤＮＮアーゼを硫酸
アンモニウムを用いて沈澱させ、残留物を透析しそして
カラムクロマトグラフィー法または等電点電気泳動法に
より精製することにより、それ自体知られた方法に従っ
て調製されうる。かかる精製されたＤＮアーゼＢ酵索調
製物を用いてＤ ＮアーゼＢに対する抗体を哺乳動物に
おいて取得できる。場合により存在する非特異性は知ら
れた方法（免疫吸着）に従い除去されうる。
製物は、例えば発酵により得られたＤＮＮアーゼを硫酸
アンモニウムを用いて沈澱させ、残留物を透析しそして
カラムクロマトグラフィー法または等電点電気泳動法に
より精製することにより、それ自体知られた方法に従っ
て調製されうる。かかる精製されたＤＮアーゼＢ酵索調
製物を用いてＤ ＮアーゼＢに対する抗体を哺乳動物に
おいて取得できる。場合により存在する非特異性は知ら
れた方法（免疫吸着）に従い除去されうる。
しかしまた知られた方法により調製されうるモノクロー
ナル抗体も適する筈である。
ナル抗体も適する筈である。
粒子懸濁液としては特にポリマーラテックス好ましくは
ポリスチレン分散液が適当である。
ポリスチレン分散液が適当である。
例をあげれば、スチレンまたはその誘導体例えばメチル
スチレン、エチルスチレンまたはクロロスチレンあるい
はアクリル酸またはそのエステル例えばメチルアクリレ
ートまたはエチルアクリレート、あるいはメタクリル酸
またはその誘導体例えばエチルメタクリレート、アクリ
ロニトリルまたはアクリルアミド、ジエン例えばブタジ
ェン、クロロプレンまたはイソプレン、塩化ビニル、塩
化ビニリデンまたは酢酸ビニル、のホモポリマーおよび
コポリマーからなるラテックスである。
スチレン、エチルスチレンまたはクロロスチレンあるい
はアクリル酸またはそのエステル例えばメチルアクリレ
ートまたはエチルアクリレート、あるいはメタクリル酸
またはその誘導体例えばエチルメタクリレート、アクリ
ロニトリルまたはアクリルアミド、ジエン例えばブタジ
ェン、クロロプレンまたはイソプレン、塩化ビニル、塩
化ビニリデンまたは酢酸ビニル、のホモポリマーおよび
コポリマーからなるラテックスである。
これらのうち、スチレン、アクリル酸またはメチルメタ
クリレートのホモポリマーまたはコポリマーのラテック
スが使用されるのが好都合である。
クリレートのホモポリマーまたはコポリマーのラテック
スが使用されるのが好都合である。
粒径的０．０５〜ｌμ１１特に０．１〜０．６μ肩を有
するラテックスが好ましい。
するラテックスが好ましい。
安定化された赤血球も担体として使用されうる。
粒子への抗体の負荷は以下の方法で実施されうる。すな
わち、抗体を含有する抗血清から慣用の方法でガンマグ
ロブリンフラクションを沈澱させ、これをｐＨ７〜９を
有する０、００５〜０．２モル緩衝液中に０．０１〜４
９／ １００ｘＱの濃度で溶解させる。緩衝液としては
好都合にはグリシン／Ｎ ａ ＣＱ ｓ燐酸塩、イミダ
ゾールまたはホウ酸塩緩衝液が用いられる。ｐＨ８，２
の０４１５モル／ａのグリシン／ＮａＣＱ緩衝溶液が好
ましい。濃度０．１〜ＩＯｇ／１００ｔｆ２を有するラ
テックス粒子の懸濁液をガンマグロブリン溶液に加えそ
してこの混合物を室温で１〜２０時間または３５〜５６
℃で０．５〜１６時間放置または撹拌する。次に結合し
なかったタンパク質を除去するためにこの懸濁液を遠心
分離する。
わち、抗体を含有する抗血清から慣用の方法でガンマグ
ロブリンフラクションを沈澱させ、これをｐＨ７〜９を
有する０、００５〜０．２モル緩衝液中に０．０１〜４
９／ １００ｘＱの濃度で溶解させる。緩衝液としては
好都合にはグリシン／Ｎ ａ ＣＱ ｓ燐酸塩、イミダ
ゾールまたはホウ酸塩緩衝液が用いられる。ｐＨ８，２
の０４１５モル／ａのグリシン／ＮａＣＱ緩衝溶液が好
ましい。濃度０．１〜ＩＯｇ／１００ｔｆ２を有するラ
テックス粒子の懸濁液をガンマグロブリン溶液に加えそ
してこの混合物を室温で１〜２０時間または３５〜５６
℃で０．５〜１６時間放置または撹拌する。次に結合し
なかったタンパク質を除去するためにこの懸濁液を遠心
分離する。
抗体はまた、知られた方法に従い粒子物質に共有結合さ
せることもできる。
せることもできる。
抗体を負荷されたラテックス粒子は、緩衝溶液好ましく
はグリシン／ＮａＣＱまたはイミダゾール緩衝溶液、特
に３９／ １００ｇ（好ましくは１〜２ｇ／ＬＯＯｚ（
ｌのヒトまたはウシ血清アルブミンを含有しうる０、１
〜０．３モルグリシン／ＮａＣρ緩衝溶液中に、好まし
くは懸濁液中におけるラテックス濃度が０．６〜１．２
ｇ／１００スＱとなるように懸濁する。
はグリシン／ＮａＣＱまたはイミダゾール緩衝溶液、特
に３９／ １００ｇ（好ましくは１〜２ｇ／ＬＯＯｚ（
ｌのヒトまたはウシ血清アルブミンを含有しうる０、１
〜０．３モルグリシン／ＮａＣρ緩衝溶液中に、好まし
くは懸濁液中におけるラテックス濃度が０．６〜１．２
ｇ／１００スＱとなるように懸濁する。
本発明による試薬に適する安定化されたストレプトコッ
カスＤＮアーゼ溶液は０．１〜２ｇ／１００峠のベンズ
アミジニウム塩酸塩、０．１〜１．５ｇ／ １００ｉ（
１００１（２ｆ７）、０．５〜２ｓＦ／１００ｍｌノフ
ルブミンおよび／またはＯ＝ １９／ １００ｘＱのゼ
ラチン誘導体（これはゼラチンを限定して加水分解しそ
してフラグメントを二官能性試薬を用いて架橋させるこ
とにより得られうる）例えばボリゼリン（ｐｏｌｙｇｅ
ｌｉｎｅ）、および場合により０．１ｇ／１００ｚＱの
防腐剤例えばナトリウムアジドを１〜１００１１９／１
００ｊＩＱのストレプトコッカスＤＮアーゼＢを含有す
る水溶液中に添加することにより得られうる。
カスＤＮアーゼ溶液は０．１〜２ｇ／１００峠のベンズ
アミジニウム塩酸塩、０．１〜１．５ｇ／ １００ｉ（
１００１（２ｆ７）、０．５〜２ｓＦ／１００ｍｌノフ
ルブミンおよび／またはＯ＝ １９／ １００ｘＱのゼ
ラチン誘導体（これはゼラチンを限定して加水分解しそ
してフラグメントを二官能性試薬を用いて架橋させるこ
とにより得られうる）例えばボリゼリン（ｐｏｌｙｇｅ
ｌｉｎｅ）、および場合により０．１ｇ／１００ｚＱの
防腐剤例えばナトリウムアジドを１〜１００１１９／１
００ｊＩＱのストレプトコッカスＤＮアーゼＢを含有す
る水溶液中に添加することにより得られうる。
ＤＮアーゼを二官能試薬、例えばグルタルジアルデヒド
を用いて予め架橋させると、その溶液は特に好ましい安
定化性質を有しそしてラテックス粒子を凝集させた場合
に試験においてより容易に視認しうる凝集パターンを生
ずる。
を用いて予め架橋させると、その溶液は特に好ましい安
定化性質を有しそしてラテックス粒子を凝集させた場合
に試験においてより容易に視認しうる凝集パターンを生
ずる。
酵素の濃度は、それが約２５００ Ｕ ／ ｘＱの酵素
活性を有するかまたは試験１回当たり５０単位を有する
ように調整される。ストレプトコッカスＤＮアーゼＢは
骨の折れる物理的方法により精製される必要はない。硫
酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる沈澱および
酵素の透析で充分である。
活性を有するかまたは試験１回当たり５０単位を有する
ように調整される。ストレプトコッカスＤＮアーゼＢは
骨の折れる物理的方法により精製される必要はない。硫
酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる沈澱および
酵素の透析で充分である。
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例 ｌ
抗ＤＮアーゼＢの粒子への負荷
家兎の抗ストレプトコッカスＤＮアーゼＢ血清から得ら
れた５０９／（ｌを含有するガンマグロブリンフラクシ
ョン４５ｍｌをｐＨ８゜２の０．１５モルグリシン／Ｎ
ａＣＱ緩衝溶液中の粒径０．２〜０．３μのポリスチレ
ンラテックス（固形物質１００ｙ／ ＆）５００峠と混
合し、そしてこの混合物を水浴上５６℃で３時間インキ
ュベーションした。約１４６００Ｘｇで遠心分離し、デ
カンテーションし、そしてそれぞれ１５００〜１７００
Ｍｆ２のグリシン／ＮａＣＱ緩衝溶液中に再懸濁させて
洗浄する操作を３回反復することにより固形物質を単離
し、そして次にこれをグリシン／ＮａＣＱ緩衝溶液中の
１（１／ｆ２ウシ血清アルブミン溶液４５００ｉ１７中
に再懸濁させた。
れた５０９／（ｌを含有するガンマグロブリンフラクシ
ョン４５ｍｌをｐＨ８゜２の０．１５モルグリシン／Ｎ
ａＣＱ緩衝溶液中の粒径０．２〜０．３μのポリスチレ
ンラテックス（固形物質１００ｙ／ ＆）５００峠と混
合し、そしてこの混合物を水浴上５６℃で３時間インキ
ュベーションした。約１４６００Ｘｇで遠心分離し、デ
カンテーションし、そしてそれぞれ１５００〜１７００
Ｍｆ２のグリシン／ＮａＣＱ緩衝溶液中に再懸濁させて
洗浄する操作を３回反復することにより固形物質を単離
し、そして次にこれをグリシン／ＮａＣＱ緩衝溶液中の
１（１／ｆ２ウシ血清アルブミン溶液４５００ｉ１７中
に再懸濁させた。
ストレプトコッカスＤＮアーゼＢ溶液の調製ストレプト
コッカスＤＮアーゼＢの溶液５００■をｐＨ７，１の燐
酸塩緩衝された食塩溶液（ＰＢＳ）１００Ｉ１２中に溶
解させ、そしてベンズアミジニウムクロライド１ｇおよ
びＭｇ５Ｏ＋ ２ ｆＦを加えた。これにｐＨ７，１の
燐酸塩緩衝された食塩溶液１０ＯｘＱ中のボリゼリン１
０ｇおよびアルブミン２ｇを添加し、モしてＰＢＳを用
いて容量を１０００ｚＱとなした。次にこの溶液にナト
リウムアジド０．５ｇを加えた。
コッカスＤＮアーゼＢの溶液５００■をｐＨ７，１の燐
酸塩緩衝された食塩溶液（ＰＢＳ）１００Ｉ１２中に溶
解させ、そしてベンズアミジニウムクロライド１ｇおよ
びＭｇ５Ｏ＋ ２ ｆＦを加えた。これにｐＨ７，１の
燐酸塩緩衝された食塩溶液１０ＯｘＱ中のボリゼリン１
０ｇおよびアルブミン２ｇを添加し、モしてＰＢＳを用
いて容量を１０００ｚＱとなした。次にこの溶液にナト
リウムアジド０．５ｇを加えた。
血清中１における抗ＤＮアーゼＢを検出するための操作
検査すべきヒト血清１滴（５０μｇ）をテストプレート
の１区分に入れ、これに安定化されたストレプトコッカ
スＤＮアーゼＢ溶液２５μｅおよびストレプトコッカス
ＤＮアーゼＢ−ラテックス２５μＱを加えた。撹拌棒を
用いて充分に混合したのちテストプレートを揺り動かし
、そして５分後に凝集について検査した。
の１区分に入れ、これに安定化されたストレプトコッカ
スＤＮアーゼＢ溶液２５μｅおよびストレプトコッカス
ＤＮアーゼＢ−ラテックス２５μＱを加えた。撹拌棒を
用いて充分に混合したのちテストプレートを揺り動かし
、そして５分後に凝集について検査した。
以下の表によりこの方法の信頼性を示す。
ｌ ５〇 −
２３００＋
３ ６００ ＋
４ ６００ ＋
７ １２００ ＋
９ ５〇 −＋凝
集なし； −凝集あり １年間までの安定性検査では、使用されたストレプトコ
ッカスＤＮアーゼＢ溶液は少なくともこの期間内は安定
であることが示された。
集なし； −凝集あり １年間までの安定性検査では、使用されたストレプトコ
ッカスＤＮアーゼＢ溶液は少なくともこの期間内は安定
であることが示された。
実施例 ２
実施例！記載の方法により調製された抗ＤＮアーゼラテ
ックスを下記方法で調製されたストレプトコッカスＤＮ
アーゼＢ調製物と一緒に検査に用いた。
ックスを下記方法で調製されたストレプトコッカスＤＮ
アーゼＢ調製物と一緒に検査に用いた。
酵素調製物１００１ｇを等張食塩溶液１０００πＱ中に
硫酸マグネシウム２．５ｇと一緒に溶解させ、これにボ
リゼリン１０ｇ、ベンズアミジニウム塩酸塩２９および
ナトリウムアジドｔｙを加えた。この溶液を希釈して活
性度約２５００Ｕ／渭Ｃ１：Ｉ整した。
硫酸マグネシウム２．５ｇと一緒に溶解させ、これにボ
リゼリン１０ｇ、ベンズアミジニウム塩酸塩２９および
ナトリウムアジドｔｙを加えた。この溶液を希釈して活
性度約２５００Ｕ／渭Ｃ１：Ｉ整した。
実施例 ３
家兎の抗ストレプトコッカスＤＮアーゼＢ血清から得ら
れる、４５ｇ／Ｑガンマグロブリンフラクシヨン２０
ｘｃＪｆ：ｐＨ８，２の０．１５モルグリシン／ Ｎ
ａ ＣＱ緩衝溶液中の粒径０．４μを有するポリスチレ
ンラテックス（固形物質ｔｏｏ９／ Ｑ） １５０峠ト
混合しそしてこの混合物を水浴中３７℃で１６時間イン
キュベーションした。約１４６００Ｘ ｇで遠心分離し
、デカンテーションしそして１５００Ｍ＋２ずつのグリ
シン／’ＮａＣＱ緩衝液に再懸濁させることにより洗浄
する操作を３回反復することにより固形物質を単離し、
そして次にこれをグリシン／ＮａＣＱ緩衝溶液中の１０
９／Ｑヒトアルブミン溶液１５００Ｘ１２中に再懸濁さ
せた。
れる、４５ｇ／Ｑガンマグロブリンフラクシヨン２０
ｘｃＪｆ：ｐＨ８，２の０．１５モルグリシン／ Ｎ
ａ ＣＱ緩衝溶液中の粒径０．４μを有するポリスチレ
ンラテックス（固形物質ｔｏｏ９／ Ｑ） １５０峠ト
混合しそしてこの混合物を水浴中３７℃で１６時間イン
キュベーションした。約１４６００Ｘ ｇで遠心分離し
、デカンテーションしそして１５００Ｍ＋２ずつのグリ
シン／’ＮａＣＱ緩衝液に再懸濁させることにより洗浄
する操作を３回反復することにより固形物質を単離し、
そして次にこれをグリシン／ＮａＣＱ緩衝溶液中の１０
９／Ｑヒトアルブミン溶液１５００Ｘ１２中に再懸濁さ
せた。
ストレプトコッカスＤＮアーゼＢ１００ｘｙをｐＨ７，
５〜８の燐酸塩緩衝溶液１００ｘ１２中に溶解させ、２
ｇ／１００ｍｌグルタルジアルデヒド溶液０ 、５ｚＱ
を加えた。この溶液を４°Ｃで５時間撹拌後、この溶液
に蒸留水２００３！１２中に溶解された硫酸マグネシウ
ム２．５９、およびポリゼリン１０ｇ、ベンズアミジニ
ウムクロライド２ｇおよびナトリウムアジド１ｇを加え
た。この溶液量を約Ｉｌｌ！となして、その１ｘＱ当た
りが約２５００Ｕ／ＩＩＪのＤＮ７−ゼＢ活性を含有す
るようにした。
５〜８の燐酸塩緩衝溶液１００ｘ１２中に溶解させ、２
ｇ／１００ｍｌグルタルジアルデヒド溶液０ 、５ｚＱ
を加えた。この溶液を４°Ｃで５時間撹拌後、この溶液
に蒸留水２００３！１２中に溶解された硫酸マグネシウ
ム２．５９、およびポリゼリン１０ｇ、ベンズアミジニ
ウムクロライド２ｇおよびナトリウムアジド１ｇを加え
た。この溶液量を約Ｉｌｌ！となして、その１ｘＱ当た
りが約２５００Ｕ／ＩＩＪのＤＮ７−ゼＢ活性を含有す
るようにした。
かくして調製された溶液を検査に用いた。この目的には
患者の未希釈血清１部をＤＮＮアーゼ調製物０．５部と
混合した（例えば患者の血清１０ｈ１２＋ Ｄ Ｎ ７
−ゼＢＲ製物５０μ（り。次ニコノ血清試料を室温で５
〜ｌＯ分間放置した。血清／酵素調製物５０μｅをテス
トプレートの１区分に入れ、ＤＮＮアーゼ−ラテックス
２５μｅを加えた。撹拌器を用いて良（混合したのちテ
ストプレートを５分間揺り動かした。
患者の未希釈血清１部をＤＮＮアーゼ調製物０．５部と
混合した（例えば患者の血清１０ｈ１２＋ Ｄ Ｎ ７
−ゼＢＲ製物５０μ（り。次ニコノ血清試料を室温で５
〜ｌＯ分間放置した。血清／酵素調製物５０μｅをテス
トプレートの１区分に入れ、ＤＮＮアーゼ−ラテックス
２５μｅを加えた。撹拌器を用いて良（混合したのちテ
ストプレートを５分間揺り動かした。
実施例 ４
実施例１に従い調製されたラテックス試薬を以下のよう
にして調製されたストレプトコッカスＤＮアーゼＢ製剤
と一緒に検査に用いた。
にして調製されたストレプトコッカスＤＮアーゼＢ製剤
と一緒に検査に用いた。
酵素調製物１０００Ｘ９を２．５９の硫酸マグネシウム
を含有するｐＨ７，５の燐酸塩緩衝溶液１０００１１２
中に溶解させ、これに水１００ａＮ２中のグルタルジア
ルデヒド２ｇの溶液１ 、５ｉ１２を加えた。この溶液
を４℃で５時間撹拌後、混濁および綿状物を濾過または
遠心分離により除去した。この溶液にボリゼリン１０９
およびベンズアミジニウム塩酸塩２ｇを加え、次にナト
リウムアジドｔｇを加えた。
を含有するｐＨ７，５の燐酸塩緩衝溶液１０００１１２
中に溶解させ、これに水１００ａＮ２中のグルタルジア
ルデヒド２ｇの溶液１ 、５ｉ１２を加えた。この溶液
を４℃で５時間撹拌後、混濁および綿状物を濾過または
遠心分離により除去した。この溶液にボリゼリン１０９
およびベンズアミジニウム塩酸塩２ｇを加え、次にナト
リウムアジドｔｇを加えた。
この溶液の活性を標準物と比較して、等張食塩溶液を用
いて希釈することにより２５００Ｕ／ＩＩ（！に調整し
た。かくして調製された溶液を実施例１記載のようにし
て検査に用いた場合、比較的多数の被験者の血清収集物
（５００件）において９０％より多くがトルイジンブル
ー法と一致していた。
いて希釈することにより２５００Ｕ／ＩＩ（！に調整し
た。かくして調製された溶液を実施例１記載のようにし
て検査に用いた場合、比較的多数の被験者の血清収集物
（５００件）において９０％より多くがトルイジンブル
ー法と一致していた。
手続補正書
昭和６２年１２月４ 日
特許庁長官 小 川゛ 邦 夫 殿１、事件の表示
昭和６２年特許願第２７５８８３号
２、発明の名称
抗ストレプトコッカスデオキシリボヌクレアーゼＢ住所
ドイツ連邦共和国マルブルク／ラーン（番地なし）名
称 ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼルシャフト４
、代理人 ｌ補正の内容 ｊ）第１６頁第６行の「ストレプトコッカス」。
ドイツ連邦共和国マルブルク／ラーン（番地なし）名
称 ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼルシャフト４
、代理人 ｌ補正の内容 ｊ）第１６頁第６行の「ストレプトコッカス」。
の前に「抗」を加入します。
２）第１９頁第１５行の「ＤＮアーゼ」の前に「抗」を
加入します。
加入します。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ストレプトコッカスデオキシリボヌクレアーゼＢに
対する抗体が懸濁液または分散液の粒子上に存在してお
り、そしてかかる懸濁液または分散液をストレプトコッ
カスＤＮアーゼＢ溶液および測定すべき試料と混合する
ことによりストレプトコッカスデオキシリボヌクレアー
ゼＢに対する抗体を検出するためのラテックス凝集法に
おいて、ストレプトコッカスＤＮアーゼ溶液がプロテア
ーゼ阻害剤を含有しておりそして、ストレプトコッカス
ＤＮアーゼが場合により架橋されていることを特徴とす
る方法。 ２）プロテアーゼ阻害剤がベンズアミジニウム塩である
ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３）安定化されたＤＮアーゼＢ調製物が０．１〜１ｍｇ
／ｍｌのＤＮアーゼＢ、２ｇ／１００ｍｌまでの分解さ
れ架橋されたゼラチン、３ｇ／１００ｍｌまでのベンズ
アミジニウムクロライドおよび０〜５ｇ／１００ｍｌの
マグネシウム塩を含有することを特徴とする、特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ４）安定化されたストレプトコッカスＤＮアーゼＢ調製
物が３ｇ／１００ｍｌまでのアプロチニン、２ｇ／１０
０ｍｌまでの分解され架橋されたゼラチンおよび０〜５
ｇ／１００ｍｌのマグネシウム塩を含有することを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５）ストレプトコッカスＤＮアーゼＢ調製物が、二官能
性試薬で処理されたストレプトコッカスＤＮアーゼＢを
含有することを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載
の方法。 ６）ラテックスがポリスチレンラテックスであることを
特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７）抗体が哺乳動物から得られるものであることを特徴
とする、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８）抗体が家兎から得られるものであることを特徴とす
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９）ＤＮアーゼＢ抗体が存在する粒子の懸濁液または分
散液、およびプロテアーゼ阻害剤を含有するストレプト
コッカスＤＮアーゼＢの水溶液からなる凝集試薬。 １０）粒子がポリスチレンラテックスからなることを特
徴とする、特許請求の範囲第９項記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19863637253 DE3637253A1 (de) | 1986-11-03 | 1986-11-03 | Latex-agglutinations-verfahren zum nachweis von anti-streptokokken-desoxyribonuclease b |
| DE3637253.6 | 1986-11-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63122957A true JPS63122957A (ja) | 1988-05-26 |
| JP2661664B2 JP2661664B2 (ja) | 1997-10-08 |
Family
ID=6312968
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP62275883A Expired - Lifetime JP2661664B2 (ja) | 1986-11-03 | 1987-11-02 | 抗ストレプトコッカスｄｎアーゼｂを検出するためのラテックス凝集法および凝集試薬 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5055395A (ja) |
| EP (1) | EP0266686B1 (ja) |
| JP (1) | JP2661664B2 (ja) |
| AT (1) | ATE77885T1 (ja) |
| AU (1) | AU611651B2 (ja) |
| CA (1) | CA1302877C (ja) |
| DE (2) | DE3637253A1 (ja) |
| ES (1) | ES2033766T3 (ja) |
Families Citing this family (7)
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| US7005510B1 (en) | 1993-06-23 | 2006-02-28 | Beckman Instruments, Inc. | Recombinant DNase B derived from Streptococcus pyogenes |
| EP0660874B1 (en) * | 1993-06-23 | 2003-09-03 | Beckman Coulter, Inc. | Recombinant dnase b derived from streptococcus pyogenes |
| JP3742896B2 (ja) * | 1994-08-18 | 2006-02-08 | ベックマン コールター インコーポレイテッド | ストレプトコッカスピオジェンスから誘導される組換えｄｎアーゼｂ |
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-
1986
- 1986-11-03 DE DE19863637253 patent/DE3637253A1/de not_active Withdrawn
-
1987
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- 1987-10-30 DE DE8787115947T patent/DE3780123D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-30 ES ES198787115947T patent/ES2033766T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-30 EP EP87115947A patent/EP0266686B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-30 AT AT87115947T patent/ATE77885T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1987-11-02 CA CA000550787A patent/CA1302877C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-02 AU AU80595/87A patent/AU611651B2/en not_active Ceased
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1302877C (en) | 1992-06-09 |
| JP2661664B2 (ja) | 1997-10-08 |
| AU611651B2 (en) | 1991-06-20 |
| ATE77885T1 (de) | 1992-07-15 |
| EP0266686A3 (en) | 1989-10-04 |
| EP0266686A2 (de) | 1988-05-11 |
| ES2033766T3 (es) | 1993-04-01 |
| US5055395A (en) | 1991-10-08 |
| EP0266686B1 (de) | 1992-07-01 |
| DE3637253A1 (de) | 1988-05-05 |
| DE3780123D1 (de) | 1992-08-06 |
| AU8059587A (en) | 1988-05-05 |
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