CN104090112B - 肾小球基底膜抗体(GBM-Ab)定量测定试剂盒 - Google Patents
肾小球基底膜抗体(GBM-Ab)定量测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于临床免疫学检测技术领域，公开了一种肾小球基底膜抗体(GBM-Ab)定量测定试剂盒，包括磁分离试剂、酶标记试剂、校准品、清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂。本发明还公开了上述试剂盒的制备方法。本发明还公开了上述试剂盒的检测方法。本发明制备的试剂盒精确度、灵敏度以及稳定性较好，并且成本低廉，操作简单，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于临床免疫学检测技术领域，具体涉及一种肾小球基底膜抗体(GBM-Ab)定量测定试剂盒及其检测方法。
背景技术
肺出血-肾炎综合征又称抗基膜性肾小球肾炎、Goodpasture综合征或Goodpasture病。它是由抗基膜抗体导致的肾小球和肺泡壁基膜的严重损伤，临床表现为肺出血、急进性肾小球肾炎和血清抗肾小球基膜（GBM）抗体阳性三联征。多数患者病情进展迅速，预后凶险。Goodpasture于1919年首先作了在一次暴发性流感中的肾小球损伤合并肺出血的报道。Stanton和Tange于1958年又报道一组肺出血合并新月体性肾小球肾炎的病例，并命名为Goodpasture综合征。我国于1965年首次报道并正式列入医学文献。确定本病有肾小球和肺泡壁的毛细胞血管基膜有线状免疫球蛋白沉积，1967年确定了抗基膜抗体在本病发病机制中所起的重要作用。肺出血-肾炎综合征治疗采取综合疗法。血浆置换与皮质激素和环磷酰胺等合并使用，即可清除和降低血清抗肾基膜抗体浓度，同时可清除对体内组织有损伤的物质α、β补体等，从而减轻和改善肾和肺的病变。血浆置换和激素免疫抑制剂无效病例，可考虑双肾切除。肺出血明显者以腹膜透析为宜。透析过渡几个月或半年以上，一但血液内抗肾基膜抗体消失后可施行肾移植，可避免移植肾复发肾炎发生。
肾小球基底膜(GBM)在解剖学构造上是上皮细胞和结缔组织之间的屏障，VI胶原蛋白是GBM特有的胶原蛋白，它和其他分子(如层连蛋白、副层连蛋白)一起构成基质。六条α-链(多肽，含超过1650个氨基酸)中，每3条形成一个螺旋体，构成了VI胶原蛋白结构的亚单位。古德帕斯丘综合征特异性抗肾小球基底膜抗体作用于肾小球基底膜VI型胶原蛋白的29kDaNC1端。目前，通过证实肾小球肾炎、肺出血和抗肾小球基底膜VI胶原蛋白α-3链抗体三联症的存在可以诊断古德帕斯丘综合征。
临床检测抗肾小球基底膜抗体的常见方法包括放射免疫分析法以及间接免疫荧光法等。但这些方法都存在着不足之处。放射免疫分析法是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应，是一种在无须采用生物测定方法的情况下用于检测抗原的实验室测定方法。该法极其敏感而又极其特异，但其却需要具备尖端复杂的设备，且成本也不低。同时，还需要特殊的预防措施，因为其要用到放射性物质。因此，如今放射免疫分析法在很大程度上已经被ELISA所取代。间接免疫荧光法的基本原理是用特异性的抗体与载玻片中的抗原结合后形成抗原抗体复合物，继用荧光抗体与抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。该方法在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别；操作相对复杂，需要价格较昂贵的荧光显微镜，只能进行定性检测，不能进行定量测定。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种具备较佳的准确度、精密度和稳定性的试剂盒。本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种肾小球基底膜抗体(GBM-Ab)定量测定试剂盒，包括磁分离试剂、酶标记试剂、校准品、清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂；
其中，上述磁分离试剂的制备步骤如下：
一、磁微粒缓冲液配制过程，以配制1L为例：
1）、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris12.1g和NaCl8.5g加入容器中，充分搅拌至完全溶解；
2）、称取BSA5g，量取新生牛血清50mL，Proclin3000.2mL至容器中，充分搅拌至完全溶解；
3）、用4M的HCl调pH，控制pH在7.9-8.1之间；
4）、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用。
二、磁分离试剂的制备过程
1）、取100mg含羧基活性基团的磁微粒，直径在0.5-2μm之间，然后添加0.025mol/L，pH4.5-5的MES缓冲液10mL混悬；
2）、加入0.5-1mL浓度为10mg/mL的EDC水溶液，室温混悬30-60min；
3）、磁分离，吸去上清，用0.025mol/L,pH4.5-5MES缓冲液10mL重悬；
4）、加入0.02-0.1mg的GBM抗原，室温混悬120-240min；
5）、磁分离，吸去上清，用磁微粒缓冲液重悬至1mg/mL，完成磁分离试剂的制备。
上述酶标记试剂的制备步骤如下：
一、酶标记试剂稀释液配制过程，以配制1L为例：
1）、量取800mL纯化水于容器中，称取Hepes6.06g、NaCl8.5g加入容器中，充分搅拌至完全溶解；
2）、称取BSA5g，Zncl20.1g、Proclin-3000.2mL和MgCl20.1g于容器中，充分搅拌至完全溶解；
3）、用4M的HCl调pH，控制pH在7.5-8.0范围内；
4）、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用。
二、碱性磷酸酶（ALP）与GBM抗体的偶联：
1）、取1mgGBM抗体，加入10mg/mL的偶联剂2-IT（2-亚胺四氢噻吩）溶液2-4μL，室温静置20min，加入0.1moL/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min；随后用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；
2）、取1.5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的ALP，2-8℃保存备用；
3）、将上述活化的GBM抗体与活化的ALP混合，2-8℃条件下静置12-24h，用Superdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得GBM抗体-ALP连接物浓溶液，2-8℃保存备用。
4）、将GBM抗体-ALP连接物浓溶液用含酶标记物稀释液稀释到0.02-0.1μg/mL，即得酶标记试剂。
上述校准品的制备步骤如下：
一、校准品稀释液的配制：
1）、量取600mL纯化水于容器中，称取200mL新生牛血清加入容器中，充分搅拌混合均匀；
2）、称取磷酸氢二钾3.4g、磷酸二氢钾0.36g、Proclin3000.02mL加入容器中，充分搅拌至完全溶解；
3）、用4M的HCl调pH，控制pH在7.0-7.5之间；
4）、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用。
二、校准品的配制：用校准品稀释液将GBM抗体分别配制为0、5、20、50、150、300U/mL共6个浓度点。
上述清洗浓缩液的制备步骤如下：以配制1L为例：
1）、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris12.1g和NaCl8.5g于容器中，充分搅拌至完全溶解；
2）、称取Tween-205g、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)5g，充分搅拌，直至完全混匀；
3）、用4M的HCl调pH，控制pH在7.5-8.0之间；
4）、最后定容1000mL，2-8℃保存。
上述底物溶液的制备步骤如下：以配制1L为例：
1）、称取NaCl8.87g、Tris3.72g、Na2SO30.003g和Proclin-3000.4ml于1L烧杯中；
2）、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在7.5－8.0之间；
3）、加入250mlLumi-Phos530后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
上述稳定剂的制备步骤如下：以配制1L为例：
1）、称取乙二胺四乙酸二钠2.3g和氯化镁1.4g于1L烧杯中；
2）、用量筒量取900ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.2－7.8之间；
3）、加入50ml甘油后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
本发明的主要创新之处主要在于：
1、本发明试剂盒提供了一种接近均相的反应体系，与该试剂盒现有间接法ELISA技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和线性范围，并且样本不需要稀释，反应过程只需要一步清洗，在出结果时间上大大缩短，实验操作简便可靠，并达到了较佳的性能参数。并且竞争法相对间接法试剂工作浓度要低很多，大大降低了试剂成本。
2、本发明公开了一种测定GBM抗体的新技术，使得反应过程更加快速可靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本；
3、试剂盒中的磁分离试剂，酶标记物，校准品、清洗液浓缩液等组份均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
4、本发明试剂盒的精确度、灵敏度以及稳定性均优于市场同类产品，并且成本低廉，操作简单，应用前景广阔。
具体实施方式
以下将采用具体的实施例来对本发明作进一步的解释，但是不应当看作是对本发明创新精神的限制。
实施例1、磁分离试剂的制备：
一、磁微粒缓冲液配制过程，以配制1L为例：
1、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris12.1g和NaCl8.5g加入容器中，充分搅拌至完全溶解；
2、称取BSA5g，量取新生牛血清50mL，Proclin3000.2mL至容器中，充分搅拌至完全溶解；
3、用4M的HCl调pH，控制pH在7.9-8.1之间；
4、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用。
二、磁分离试剂的制备过程
1、取含羧基（COOH）活性基团的磁微粒，每克（g）磁微粒（干重）羧基含量不低于0.3毫摩尔（mmoL），具有超顺磁性，直径在0.5-2μm之间。
2、GBM抗原：可以为天然抗原或重组抗原，纯度应超过95%。
3、2-吗啉乙磺酸（MES）、碳二亚胺（EDC）、TRIS、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）和其他试剂应达到化学纯。
4、取100mg磁微粒，添加0.025mol/L，pH4.5-5的MES缓冲液10mL混悬；
5、加入0.5-1mL新鲜配制的浓度为10mg/mL的EDC水溶液，室温混悬30-60min；
6、磁分离，吸去上清，用0.025mol/L,pH4.5-5MES缓冲液10mL重悬；
7、加入0.02-0.1mg的GBM抗原，室温混悬120-240min；
8、磁分离，吸去上清，用磁微粒缓冲液重悬至1mg/mL，完成磁分离试剂的制备。
实施例2、酶标记试剂的制备：
一、酶标记试剂稀释液配制过程，以配制1L为例：
1、量取800mL纯化水于容器中，称取Hepes6.06g、NaCl8.5g加入容器中，充分搅拌至完全溶解；
2、称取BSA5g，Zncl20.1g、Proclin-3000.2mL和MgCl20.1g于容器中，充分搅拌至完全溶解；
3、用4M的HCl调pH，控制pH在7.5-8.0范围内；
4、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用。
二、碱性磷酸酶（ALP）与GBM抗体的偶联：
1、GBM抗体，购自北京久峰润达生物技术有限公司，纯度超过95%；
2、碱性磷酸酶纯度应超过95%，比活性应超过1000U/mg，浓度超过5mg/mL；
3、取1mgGBM抗体，加入10mg/mL的偶联剂2-IT（2-亚胺四氢噻吩）溶液2-4μL，室温静置20min，加入0.1moL/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min；随后用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；
4、取1.5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的ALP，2-8℃保存备用；
5、将上述活化的GBM抗体与活化的ALP混合，2-8℃条件下静置12-24h，用Superdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得GBM抗体-ALP连接物浓溶液，2-8℃保存备用。
6、将GBM抗体-ALP连接物浓溶液用含酶标记物稀释液稀释到0.02-0.1μg/mL，完成酶标记试剂的制备。
实施例3、校准品的制备：
一、校准品稀释液的配制：
1、量取600mL纯化水于容器中，称取200mL新生牛血清加入容器中，充分搅拌混合均匀；
2、称取磷酸氢二钾3.4g、磷酸二氢钾0.36g、Proclin3000.02mL加入容器中，充分搅拌至完全溶解；
3、用4M的HCl调pH，控制pH在7.0-7.5之间；
4、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用。
二、校准品的配制：
1、用校准品稀释液将GBM抗体分别配制为0、5、20、50、150、300U/mL共6个浓度点。
实施例4：清洗浓缩液的制备：
清洗浓缩液配制过程，以配制1L为例：
1、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris12.1g和NaCl8.5g于容器中，充分搅拌至完全溶解；
2、称取Tween-205g、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)5g，充分搅拌，直至完全混匀；
3、用4M的HCl调pH，控制pH在7.5-8.0之间；
4、最后定容1000mL，2-8℃保存。
实施例5：底物溶液的制备：
底物溶液配制步骤，配制1L：
1、称取NaCl8.87g、Tris3.72g、Na2SO30.003g和Proclin-3000.4ml于1L烧杯中；
2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在7.5－8.0之间；
3、加入250mlLumi-Phos530后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
实施例6稳定剂的制备：
1、称取乙二胺四乙酸二钠2.3g和氯化镁1.4g于1L烧杯中；
2、用量筒量取900ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.2－7.8之间；
3、加入50ml甘油后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
实施例7
本发明的测试方法如下
1、检测管内依次加入20μL样本（或标准品）、50μL磁分离试剂、50μL酶标记试剂以及稳定剂2μL，混合均匀，37±0.5℃条件下反应10min；
2、检测管放至磁分离器上，静置2分钟；倒出上清液；
3、清洗浓缩液用纯化水稀释15倍后（即为清洗液）使用，加300μL清洗液至检测管中，置混匀器上振荡混匀30s。
4、再重复步骤2、3、2两遍。
5、加150μL底物溶液至检测管中混匀后进行检测。
实施例8
本发明实施例1-6制备的试剂盒的分析性能评价：
（1）灵敏度评价
检测“0”浓度样本，重复检测20次，计算相对发光强度（RLU）的平均值（M）和标准差（SD），并计算M-2SD值，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M-2SD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。本方法的灵敏度不大于0.5U/mL。其中，A点发光值参见表1：
表1
A点发光均值X=1248411
SD=16744
X-2SD=1214923
B点发光值参见表2。
B点发光均值X=788190
表2
| GBM-Ab -STD-B(RLU) |
| 799744 |
| 776635 |
计算得到灵敏度=0.364U/mL。
（2）精密度评价
①分析内精密度
将实施例1中的试剂盒分别测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定，结果参见表3，得出批内变异系数为4.21%～6.43%。
表3分析内精密度测试
| 测定血清浓度（U/mL） | 测定次数 | 分析内CV(%) |
| 4.35 | 10 | 6.43 |
| 47.33 | 10 | 4.90 |
| 228.69 | 10 | 4.21 |
②分析间精密度
将实施例的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定低、中、高三种不同浓度的血清，10孔平行测定。每份血清得到30个浓度测值，参见表4，统计分析间变异系数，为4.76%～6.99%。
表4分析间精密度测试
（3）准确度评价
在2例混合血清样本中添加不同量人GBM-Ab标准品，形成3个浓度水平的血清添加样本，添加物体积小于总体积的10%。检测样本浓度，按下述公式计算回收率。本方法血清基质回收率在90-110%之间。数据参见表5。
R：回收率；
V：加入标准溶液的体积；
V0：人源样品的体积；
C：人源样品加入标准溶液后的检测浓度；
C0：人源样品的检测浓度；
Cs：标准溶液的浓度。
表5准确度评价—添加回收实验数据
（4）试剂盒特异性评价
取1份GBM-Ab含量为0的样本，加入人血清白蛋白，使样本中人血清白蛋白浓度为5000ng/mL，使用该试剂盒对该样本进行检测，测定样本中的GBM-Ab含量。结果见表6，本法与人血清白蛋白无交叉反应。
表6特异性实验
| 交叉反应物 | 实验浓度(ng/mL) | GBM-Ab测定浓度（U/mL） |
| 人血清白蛋白 | 5000 | ＜0.5 |
（5）热稳定性评价
对试剂盒分别进行4℃12个月和37℃7天的稳定性实验，结果表明试剂盒标准品发光强度的变化、批内和批间精密度、准确性等指标均在正常范围之内，试剂盒有效期可达24个月；而不添加稳定剂的同类试剂盒的有效期仅为12个月左右。
Claims (1)
1.一种肾小球基底膜抗体定量测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括磁分离试剂、酶标记试剂、校准品、清洗浓缩液、底物溶液以及稳定剂；
所述磁分离试剂的制备步骤如下：
一、磁微粒缓冲液配制过程，
1)、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris12.1g和NaCl8.5g加入容器中，充分搅拌至完全溶解；
2)、称取BSA5g，量取新生牛血清50mL，Proclin3000.2mL至容器中，充分搅拌至完全溶解；
3)、调pH，控制pH在7.9-8.1之间；
4)、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用；
二、磁分离试剂的制备过程
1)、取100mg含羧基活性基团的磁微粒，直径在0.5-2μm之间，然后添加0.025mol/L，pH4.5-5的MES缓冲液10mL混悬；
2)、加入0.5-1mL浓度为10mg/mL的EDC水溶液，室温混悬30-60min；
3)、磁分离，吸去上清，用0.025mol/L,pH4.5-5MES缓冲液10mL重悬；
4)、加入0.02-0.1mg的GBM抗原，室温混悬120-240min；
5)、磁分离，吸去上清，用磁微粒缓冲液重悬至1mg/mL，完成磁分离试剂的制备；
所述酶标记试剂的制备步骤如下：
一、酶标记试剂稀释液配制过程：
1)、量取800mL纯化水于容器中，称取Hepes6.06g、NaCl8.5g加入容器中，充分搅拌至完全溶解；
2)、称取BSA5g，ZnCl20.1g、Proclin-3000.2mL和MgCl20.1g于容器中，充分搅拌至完全溶解；
3)、调pH，控制pH在7.5-8.0范围内；
4)、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用；
二、碱性磷酸酶与GBM抗体的偶联：
1)、取1mgGBM抗体，加入10mg/mL的偶联剂2-亚胺四氢噻吩溶液2-4μL，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min；随后用G-25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，2-8℃保存备用；
2)、取1.5mg的ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液10-20μL，室温静置30min，用G-25凝胶柱除盐，收集活化后的ALP，2-8℃保存备用；
3)、将上述活化的GBM抗体与活化的ALP混合，2-8℃条件下静置12-24h，用Superdex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得GBM抗体-ALP连接物浓溶液，2-8℃保存备用；
4)、将GBM抗体-ALP连接物浓溶液用酶标记试剂稀释液稀释到0.02-0.1μg/mL，即得酶标记试剂；
所述校准品的制备步骤如下：
一、校准品稀释液的配制：
1)、量取600mL纯化水于容器中，称取200mL新生牛血清加入容器中，充分搅拌混合均匀；
2)、称取磷酸氢二钾3.4g、磷酸二氢钾0.36g、Proclin3000.02mL加入容器中，充分搅拌至完全溶解；
3)、调pH，控制pH在7.0-7.5之间；
4)、最后用纯化水定容至1L，2-8℃保存待用；
二、校准品的配制：用校准品稀释液将GBM抗体分别配制为0、5、20、50、150、300U/mL共6个浓度点；
所述清洗浓缩液的制备步骤如下：
1)、量取800mL纯化水于容器中，称取Tris12.1g和NaCl8.5g于容器中，充分搅拌至完全溶解；
2)、称取Tween-205g、TritonX-1005g，充分搅拌，直至完全混匀；
3)、调pH，控制pH在7.5-8.0之间；
4)、最后定容1000mL，2-8℃保存；
所述底物溶液的制备步骤如下：
1)、称取NaCl8.87g、Tris3.72g、Na2SO30.003g和Proclin-3000.4ml于1L烧杯中；
2)、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在7.5－8.0之间；
3)、加入250mlLumi-Phos530后，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得；
所述稳定剂的制备步骤如下：
1)、称取乙二胺四乙酸二钠2.3g和氯化镁1.4g于1L烧杯中；
2)、用量筒量取900ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.2－7.8之间；
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN101361001A (zh) * | 2006-01-20 | 2009-02-04 | 马赛奎斯诊断和治疗有限公司 | 诊断肾病的方法和标志物 |
| CN102520176A (zh) * | 2011-12-06 | 2012-06-27 | 李守玮 | 一种定量检测白介素8的试剂盒 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
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Effective date of registration: 20240204 Address after: Room 107, 1st Floor, Building 1, No. 20 Chuangzhan Road, Daxing District, Beijing, 102600 Patentee after: BEIJING BEIER BIOENGINEERING Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 101111 Building 8, yard 29, Jinghai 2nd Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing Patentee before: Beijing Bell Medical Equipment Co.,Ltd. Country or region before: China |
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