CN102520176A - 一种定量检测白介素8的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了定量检测白介素8的诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒包含白介素8磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物。本发明试剂盒采用免疫磁微粒分离技术与竞争酶联免疫技术结合，具有更高的检测灵敏度和特异性，并且大大缩短了检测时间，可以在10分钟内检测数个生物样本，对于尿液、血清等样本可以不需前处理直接进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及测定一种定量检测白介素8的诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术
白介素，全称白细胞介素是指在白细胞或免疫细胞间相互作用的细胞因子，在传递信息、激活与调节免疫细胞介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。白介素8(IL-8)的细胞来源主要是单核细胞、组织巨噬细胞。其他如肝细胞、成纤维细胞、间皮细胞、上皮细胞、内皮细胞、中性粒细胞、滑膜液细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸粒细胞等也可以产生IL-8。IL-8是趋化性细胞因子超家族的一员，人IL-8基因定位于第4号染色体。IL-8分子耐热，分子量为8-10k，在pH为2.4到9时保持活性，对巯基化合物敏感，其活性可被IL-8抗体中和。白介素8参与了多种体内的生物学过程，还与一些临床某些疾病的病变程度有关，例如冠心病急性心肌梗死(AMI)、癌症、结肠炎、脑膜炎以及哮喘等等，临床上可通过检测白介素8等生化指标来分析疾病的发生程度。
过去以放免为代表的检测肿瘤坏死因子的检测试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。
磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统ELISA相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种定量检测白介素8的诊断试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行白介素8检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。
本发明提供的试剂盒，其包含的试剂有白介素8磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物。
所述的磁分离试剂含有标记有白介素8单克隆抗体的磁性微球。
所述的酶标抗体是含有辣根过氧化物酶标记的白介素8单克隆抗体。
所述的增强剂是含有Tris的缓冲液。
所述的校准品及控制品是含有一定量的白介素8抗原的溶液。
所述浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液。
所述的底物为酶促化学发光底物。
本发明白介素8的定量检测试剂盒，优选通过如下步骤制备而成：
第一步：磁分离试剂的制备步骤：
1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg白介素8单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；
2、用移液枪吸取步骤1中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
3、将步骤2抗体溶液加入到浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；
4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
5、每次加入1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤3获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；
6、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；
7、每次加入1.5ml PH 7.20.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。
9、将步骤8获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂；所述磁珠缓冲液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
第二步：酶标抗体制备步骤：
1、2.5mg白介素8单克隆抗体溶于1.0ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1ml的10mg/ml辣根过氧化物酶水溶液和1.3mg碳化二亚胺，1小时后将1.0ml 20mg/ml的碳化二亚胺加入，混合物不断搅拌，4℃过夜；
2、将步骤1的溶液装入透析袋中，对0.15M的PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；然后加入10ml浓度为15mg/ml的BSA溶液，4℃储存备用；最后将收集到的辣根过氧化物酶与白介素8单克隆抗体的偶联物用酶标抗体稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶标抗体；所述酶标抗体稀释液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
第三步：增强剂配制步骤：
1、称取TRIS1.56g和NaCl4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制PH在7.35-7.45之间；
3、称取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。
第四步：
校准品和控制品的配制：
校准品浓度分别为0.10、0.20、0.40、0.80、1.60ng/ml；控制品浓度分别为0.20、0.80ng/ml。
第五步：
浓缩液配制步骤，配制1L：
1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
2、称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
5、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；
6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。
第六步：
底物配制步骤，配制1L：
1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO30.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；
2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在7.95-8.05之间；
3、加入250ml Lumi-Phos 530后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
本发明的主要创新之处在于：
1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
2、本发明公开了一种新的专用增强剂以及浓缩液，使得反应过程更加稳定可靠，实验数据灵敏有效，可精确到0.01ng，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本；
3、本试剂盒中的白介素8磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。
4、本试剂盒采用免疫磁微粒分离技术与竞争酶联免疫技术结合，与现有技术的试剂盒相比，大大缩短了检测时间，可以在10分钟内检测数个生物样本，对于尿液、血清等样本可以不需前处理直接进行检测。
具体实施方式
实施例1、
一、磁分离试剂的配制：1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg白介素8单克隆抗体(Santa Cruz公司产品)溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；
2、用移液枪吸取步骤1中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
3、将步骤2的溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；
4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；磁珠为本领域常用磁珠，优选浓度25mg/mL，直径为800nm。
5、每次加入1.5ml PH9.50.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；
6、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；
7、每次加入1.5ml PH 7.20.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的白介素8磁分离试剂；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。
9、将步骤8获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得本发明试剂盒中磁分离试剂；所述磁珠缓冲液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
实施例2
一、酶标抗体的制备步骤：
1、2.5mg白介素8单克隆抗体(Santa Cruz公司产品)溶于1.0ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1ml的10mg/ml辣根过氧化物酶水溶液和1.3mg碳化二亚胺，1小时后将1.0ml 20mg/ml的碳化二亚胺加入，混合物不断搅拌，4℃过夜；
2、将步骤1的溶液装入透析袋中，对0.15M的PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；然后加入10ml浓度为15mg/ml的BSA溶液，4℃储存备用；最后将收集到的辣根过氧化物酶与白介素8单克隆抗体的偶联物用酶标抗体稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶标抗体；所述酶标抗体稀释液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
实施例3
增强剂配制步骤：
1、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制PH在7.35-7.45之间；
3、称取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。Mak33是罗氏公司的商品化的试剂。
实施例4
校准品和控制品的配制步骤：
1、最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A，B，C，D，E，F，配制V体积的溶液时，需加入原料的体积为分别为：表1
| 浓度 | 加入校准品稀释液体积 | 加入X体积 |
| A | V-A*V/X | A*V/X |
| B | V-B*V/X | B*V/X |
| C | V-C*V/X | C*V/X |
| D | V-D*V/X | D*V/X |
| E | V-E*V/X | E*V/X |
| F | V-F*V/X | F*V/X |
2、白介素8定量检测试剂盒白介素8校准品原料(购于Santa Cruz公司)用纯化水配制成浓度点为0.10、0.20、0.40、0.80、1.60ng/ml；控制品用纯化水配制的浓度点为0.20、0.80ng/ml。
3、完全溶解后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。
实施例5：
浓缩液配制步骤：
1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
2、称取5g Tween-20于100ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
5、用HCL或NaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；
6、最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；
实施例6
底物配制操作步骤：
1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；
2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCl或NaOH调PH，测量其范围在7.95-8.05之间；
3、加入250ml Lumi-Phos 530后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。
本发明试剂盒的使用方法如下：
1、加15μl白介素8校准品、质控品、待测标本至对应试管底部。
2、加25μl酶标抗体至每一试管中。
3、加25μl增强剂至每一试管中。
4、加25μl磁分离试剂至每一试管中。
5、多管混匀器轻轻振荡放有试管的试管架30s后，置37℃水浴30分钟。
6、试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟，然后缓慢的倒转分离器倒出上清液。
7、浓缩液用纯化水稀释10倍后，加100μl稀释后的浓缩液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s。
8、加100μl底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。
临床试验：
病例：市人民医院临床确诊的支气管哮喘患者56例，男29例，女27例，年龄46-67岁，依据中华医学会呼吸病学分会哮喘组2003年制定的哮喘诊断标准(中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南.中华结核和呼吸杂志，2003年)。
急性发作组(急性期条件：反复发作、喘息、呼吸困难、胸闷或咳嗽病史，支气管舒张实验阳性，符合哮喘急性期的诊断标准)：38例。病情缓解组(缓解期标准：经过治疗或未经治疗症状、体征消失，呼吸道功能恢复到急性发作前水平并维持10天以上)：18例。对照组：均经病史调查、胸部x线摄片、肺功能测定排除患有肺部疾病可能，所有病例均排除恶性肿瘤、活动性肺结核、风湿性疾病，实验室检查，确认无心血管、呼吸及肝、肾、代谢和内分泌疾病，近2个月无感染史的健康人群)：18例，男10例，女8例；年龄48-72岁。
用SPSSl0.0统计软件对数据进行处理，所测数据用均数±标准差(X±s)表示，各组血清白介素8水平，组间比较用t检验；P≤0.05时为差异有统计学意义。
| 组别 | 对照组(ng/ml) | 急性发作组(ng/ml) | 缓解组(ng/ml) |
| 白介素8含量 | 0.169±0.023 | 0.643±0.096 | 0.307±0.061 |
由此证明细胞因子白介素8在哮喘的病理生理过程中起着十分重要的调节作用。本实验对支气管哮喘患者血清中的白介素8水平变化较正常对照组和缓解组有了显著性变化，P≤0.05。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种定量检测白介素8的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含白介素8磁分离试剂，酶标抗体，增强剂，校准品、控制品，浓缩液以及底物；所述试剂盒按照如下方法制备而成：
第一步：白介素8磁分离试剂的制备步骤：
1)将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg白介素8单克隆抗体溶于PH 9.5的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；
2)用移液枪吸取步骤1中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
3)将步骤2获得的溶液加入到浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0.5ml；
4)取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
5)加入步骤3获得的抗体溶液，混匀后室温反应4小时；
6)加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；
7)加入1.5ml PH 7.20.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清；
8)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶；磁珠保存液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存；
9)将步骤8获得的溶液用磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得磁分离试剂；所述磁珠缓冲液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
第二步：酶标抗体制备步骤：
1)2.5mg白介素8单克隆抗体溶于1.0ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1ml的10mg/ml辣根过氧化物酶水溶液和1.3mg碳化二亚胺，1小时后将1.0ml 20mg/ml的碳化二亚胺加入，混合物不断搅拌，4℃过夜；
2)将步骤1的溶液装入透析袋中，对0.15M的PH7.4PBS透析，4℃过夜，收集保留液；然后加入10ml浓度为15mg/ml的BSA溶液，4℃储存备用；最后将上述溶液用酶标抗体稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶标抗体；所述酶标抗体稀释液为浓度是1mol/L的TRIS-HCl缓冲液。
第三步：增强剂配制步骤：
1)称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
2)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH在7.35-7.45之间；
3)称取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。
第四步：
校准品和控制品的配制：
将白介素8配制浓度分别为0.10、0.20、0.40、0.80、1.60ng/ml的校准品；将白介素8配制成浓度分别为0.20、0.80ng/ml的控制品。
第五步：
浓缩液配制步骤，配制1L：
1)称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；
2)称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；
3)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；
4)用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；
5)调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；
6)最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。
第六步：
底物配制步骤，配制1L：
1)称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na2SO3 0.002g和Proclin-3000.2ml于1L烧杯中；
2)用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH在7.95-8.05之间；
3)加入250ml Lumi-Phos 530后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下：
1)、加15μl白介素8校准品、白介素8控制品、待测标本至对应试管底部；
2)、加25μl酶标抗体至每一试管中；
3)、加25μl增强剂至每一试管中；
4)、加25μl磁分离试剂至每一试管中；
5)、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟；
6)、然后放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟，倒转分离器倒出上清液；
7)、浓缩液用纯化水稀释10倍后，加100μl稀释后的浓缩液至每一试管中，置多管混匀器上轻轻振荡混匀30s；
8)、加100μl底物溶液至试管中混匀3秒，发光检测仪检测。
3.如权利要求1或者2所述的试剂盒在诊断疾病中的应用。
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