JPH0450653A - 癌の検出方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫学的方法を用いた癌の検出方法及び検出用
キットに関する。

〔従来の技術〕

従来、癌の検出方法には種々の方法がとられており、例
えば癌化したと思われる細胞、組織を取出し、これを染
色して検出する方法や、癌細胞が産生ずるいわゆる癌マ
ーカーを免疫学的に検出する方法がある。この癌マーカ
ーには癌胎児性抗原（ＣＥＡ）　、アルファフェトプロ
ティン（ＡＦＰ）、癌関連糖鎖抗原・Ｃ＾１９−９など
がある。更に最近、尿中に出現するフィブロネクチン（
以下ＦＮと略称する）の細胞接着ドメインを主体とする
フラグメントが癌マーカーの一つとして用いられること
が見比されている〔カタヤ７　（Ｋａｔａｙａｍａ）ら
、医学のあゆみ、第１５０巻、第６９５〜６９６頁（１
９８９）］。

本発明者らは先に抗体を用いたＦＮフラグメントの測定
方法を已願した（特開昭６３−２６９０５７号）。

一方、高塚らは、天然型ＦＮに対するポリクローナル抗
体を用いたラテックス凝集方法が癌の検出に有用である
ことを見出した〔タカツカ（Ｔａｋａｔｓｕｋａ）ら、
最新医学、第４１巻、第２２７５〜２２８０頁（１９８
６）　）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、上記ＦＮフラグメント測定方法では酵素免疫測
定方法が用いられており、大量試料が処理される集団検
診にはその簡便性、大量処理能力、コストの点で問題が
あった。更に、ヒト尿中に、疾患により出現するＦＮフ
ラグメントにも疾患により若干の違いがあり、上記天然
型ＦＮに対するポリクローナル抗体を用いたラテックス
凝集方法で尿中ＦＮフラグメントを測定しても、癌由来
のものか他の良性疾患由来のものか区別がつかず、集団
検診の場においてはスクリーニング後の精密検査の労力
、コストの面で大きな問題があった。

本発明の目的は、精度が高く、癌の診断効率が高く、か
つ簡便で大量試料が処理できる安価な癌の検出方法及び
キットを提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は癌の検出方
法に関し、ヒト尿試料を、ＦＮの細胞接着ドメインに対
する抗体を感作した担体粒子と混合し、担体粒子の凝集
状態を判定することを特徴とする。また、第２の発明は
癌の検出用キットに関し、ＦＮの細胞接着ドメインに対
する抗体を感作した担体粒子を含有することを特徴とす
る。

本発明者らは、上記現状にかんがみて鋭意研究を重ね、
逆受身凝集反応を利用した尿中のＦＮ細胞接着ドメイン
含有フラグメントの検出方法を開発し、この方法が癌の
検出方法及びスクリーニング方法として適当であること
を見出して本発明を完成した。

本発明で用いられる試料は、ヒト尿から得られるもので
あり、通常は尿そのものを、また場合によっては一定量
のろ紙などの吸収材に染みこませ、ここから抽出する方
法などによって調製し用いることもできる。

抗体を作成するための抗原としてのＦＮ細胞接着ドメイ
ンは、天然型ＦＮから酵素処理、化学処理によって、ま
た癌患者の尿から調製することもできるが、遺伝子工学
的に組換え体によって製造することがコスト的にも、ま
た品質の均一性においても適している。本発明のＦＮ細
胞接着ドメインとは、例えば天然型ＦＮをサーモリシン
処理して得られる分子量１４万のフラグメントだけでは
なく、細胞接着活性をもつＦＮ分子由来の７ラグメント
であればよく、例えば、特開平１−１８０９００号、同
１２０６９９８号、同２−９７３９７号各公報及び特願
昭６３−３０５８２０号明細書中に記載されている組換
えＦＮ細胞接着フラグメントを免疫原として用いても良
い。

抗体は、ウサギ、ヤギ、馬、モルモット、ニワトリなど
の温血動物に体重１　ｋｇ当り０．３〜２ｍｇ程度の上
記ＦＮ細胞接着ドメインを１〜数回背中皮下、フットパ
ッド、大腿筋等にアジュバントと共に注射して当該動物
の体内に形成させる。抗体は十分に精製して用いるのが
良く、この精製方法としてはアフィニティークロマトグ
ラフィーが特に有効である。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として、公知の方
法で取得することもできる。その場合には、マウスに前
述のいずれかの抗原をアジュバントと共に数回腹腔等に
注射１．２、膵臓細胞を取出してポリエチレングリコー
ル等を用いてマウスミエローマ細胞ど融合させる。そし
て、融合細胞の中から当該抗体を産生ずるものをクロー
ニングし、増殖させ、マウス腹腔内で培養することによ
りモノクローナル抗体を大量に製造することができる。

担体粒子は間接凝集反応用のものを用いれば良く、例え
ばヒツジ、ニワ）　ＩＪ等の動物の赤血球、セラチア菌
などの微生物菌体、ゼラチン粒子、ポリスチレンラテッ
クス、カオリン、炭素束などを使用することができる。

Ｆ’　Ｎ細胞接着ドメインに対する抗体を担体に感作す
る方法も一般の抗体を感作する公知の方法によれば良く
、例えば、タンニン酸、グルタルアルデヒド、ビスジア
ゾベンジジン、カルボジイミド類、キノン類、塩化クロ
ム類等のいわゆるカップリング剤を使用する方法、ある
いは物理吸着させる方法などによって行うことができる
。

こうして得られた感作粒子は通常は懸濁液で、又は常法
により凍結乾燥標品とし、必要に応じ、例えば希釈用液
、未感作担体、非特異反応吸収剤、標準液などと組合せ
、癌検出用キットとして用いる。

このようなキットを用いて尿中ＦＮ細胞接着ドメイン含
有フラグメントを測定する方法は逆受身反応、ラテック
ス凝集方法に通常用いられる方法によれば良く、例えば
マイクロプレートのウェルに被検試料を入れてその希釈
系列をつくり、各ウェルに前菖己の感作粒子を加えて混
合し、通常１〜２時間静置し、この感作粒子の凝集像を
観察し、判定すれば良い。この方法のほか、例えば被検
試料と感作粒子をスライド板上で混ぜ合せ、１〜２分後
の凝集状態を判定することもできる。

これらの場合、感作粒子が凝集するときを陽性、凝集を
認めないときを陰性とする。また、この凝集状態は光電
管を利用して自動的に判定させることもできる。その場
合においては、感作粒子の凝集速度が、例えば健常人尿
試料での平均凝集速度より大きいときを陽性とすれば良
い。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例により限定されるものではない。

実施例１ 特開平２−９７３９７号公報記載の遺伝子工学的に製造
されたＦＮ細胞接着フラクメント（ｒＦＮ２７４　：宝
酒造社製）　０．５　ｍｇ／　１回をウサギに計５回、
常法に基づき注射、免疫し、抗血清を得た。

次に該抗血清をリン酸緩衝生理食塩水で予と平衡化した
プロティンＡ−セファロース４Ｂカラム（ファルマシア
社製）に流し、抗体を吸着させた後、吸着成分を溶出さ
せた。次に、このｍ　分ヲｒＰＮ２７４−セファロース
４Ｂカラム（宝酒造社製）に流し、次いで吸着成分を溶
出しリン酸緩衝生理食塩水に透析し、感作原の抗体を調
製し、次にこの抗体をラテックス粒子（種水化学社製）
に常法により感作した。

実施例２ 実施例１で調製した感作ラテツクスを用いて尿中ＦＮ細
胞接着ドメイン含有フラグメント測定キットを作製した
。

キラ）（７）内容（１回分）を以下に示す：（１）抗体
感作ラテックス　　　　　２５μβ実施例３ 実施例２で調製したキットを用いて健常人又は良性疾患
４者及び癌患者の尿中ＦＮ細胞接着ドメイン含有フラグ
メント量を測定した。なお、同一試料について従来方法
である酵素免疫測定方法（特開昭６３−２６９０５７号
公報記載）によっても測定し、両方法の関係を検討した
。

キットの操作方法は以下のようにして行った。

（１）試料希釈液で試料の２ｎ倍希釈系列を調製し、そ
の１０μｌをスライド板上のサークル内にとる。

（２）抗体感作ラテックス試薬を軽く振り均一にしてか
ら、スライド板のサークル内に２５μｍ滴下する。

（３）　　かくはん棒でよくかくはん混合後、振とう装
置にのせ、振とう開始３分後に凝集の有無を判定する。

（４）同時に標準液を用いて同様に操作を行い、試料中
の抗原濃度を決定する。

その結果、第１図に示すように、本発明による測定方法
は、従来の酵素免疫測定方法と良好な相関性を示し、本
発明の検出方法により癌患者の尿中に高濃度のＦＮ細胞
接着ドメイン含有フラグメントを検出することができた
。第１図は健常人又は良性疾患４者２０例、癌患者２１
例の尿中細胞接着ドメイン含有フラグメン）　（［ＩＦ
Ｎ）の酵素免疫測定方法による測定値を横軸に、ラテッ
クス凝集方法において、凝集状態が判定される、試料の
最大希釈倍率を縦軸に示し、本発明の検出方法と、従来
の測定方法の相関性を示す図である。

ＵＦＮの１ユニツトは、天然型ＦＮの４ｐｍｏｌｅに相
当する凝集活性を示すＦＮ細胞接着ドメイン量を表す単
位である。

ラテックス凝集方法において、ラテックス粒子は標準物
質ｒＦＮ２７４が０．５ユニット／−以上の場合に凝集
する。したがって、例えば希釈倍率８倍までの各試料希
釈液で凝集がみられ、１６倍希釈液で凝集がみられない
場合、試料中には４、０〜Ｂ、　０　ニー’−ット／ｒ
ｎｌのｒＦＮ２Ｔ４に相当するＦＮ細胞接着ドメインを
含有するフラグメントが存在すると検出される。実際に
、第１図中において、ラテックス凝集方法でＵＦＨ４，
０〜８．０ユニツト／ｒｎｌの値を示す試料は、酵素免
疫測定方法で測定値４．４ユニット／−を示す。また、
他の試料においても、本発明の簡便なラテックス凝集方
法によるＵＦＨの測定値は、従来の高感度な酵素免疫測
定方法による測定値とよく対応している。

〔発明の効果〕

本発明の方法及びキットを用いることにより、尿試料中
のＦＮ細胞接着ドメイン含有フラグメントを高感度でか
つ正確に簡便に検出することができる。その結果、短時
間に大量の試料の測定が可能となり、集団検診等におけ
る癌の一次スクリーニングの労力、コストが軽減される
。

【図面の簡単な説明】

第１図は尿中のＦＮ細胞接着ドメインを含有するフラグ
メントの測定結果を、本発明方法と従来方法と対比して
示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト尿試料を、フィブロネクチンの細胞接着ドメイ
   ンに対する抗体を感作した担体粒子と混合し、担体粒子
   の凝集状態を判定することを特徴とする癌の検出方法。 ２、癌の検出用キットであって、フィブロネクチンの細
   胞接着ドメインに対する抗体を感作した担体粒子を含有
   することを特徴とする癌の検出用キット。